專利名稱：：載體包裝細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種增加靶細(xì)胞中載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。本發(fā)明提供一種重組工程化的包裝(packaging)細(xì)胞系，其能夠表達(dá)一種或多種有助于結(jié)合到靶細(xì)胞和靶細(xì)胞活化的膜蛋白?；蛘?，本發(fā)明提供重組工程化的細(xì)胞，其內(nèi)源性將一種或多種此類膜蛋白表達(dá)入包裝細(xì)胞系。通過使用此類細(xì)胞系而包裝入病毒顆粒中的載體將包含含有這些蛋白的外包膜。這些顆粒將特異性適用于結(jié)合和靶向靶細(xì)胞以促進(jìn)該靶細(xì)胞被所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。靶細(xì)胞也可在不存在外源補(bǔ)充的刺激分子的情況下同時(shí)被包裝的載體活化或刺激。
背景技術(shù)：
：已證明慢病毒載體通常轉(zhuǎn)導(dǎo)不分裂的細(xì)胞如神經(jīng)元，這類載體在沒有細(xì)胞分裂的情況下將基因遞送到靶細(xì)胞的能力是基于慢病毒的載體的限定特征和優(yōu)點(diǎn)之一(Naldini等，1996-1；Naldini等，1996-2)。然而，以一種協(xié)調(diào)的方式驅(qū)動一群分裂的細(xì)胞使其活化將有助于整個(gè)細(xì)胞群以高水平被同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Humeau等，2004；Park等，2000)。最初慢病毒在T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在20-40％之間(Schroers等，2002；Costello等，2000；Ranga等，1998；Mitsuasu等，2000)，加入cPPT/CTS序列以增加前病毒序列的核易位率可將轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著提高到60-75％(Manganini等，2002；Follenzi等，2000；Cavalieri等，2003)。以前的這些報(bào)道所用的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法包括spinoculation以對靶細(xì)胞濃縮載體從而增加基因轉(zhuǎn)移的幾率，或預(yù)刺激細(xì)胞(一般為3天)，然后一次或多次加入載體(Levine等.，1997；Levine等.，2000)。這些方法在培養(yǎng)系統(tǒng)為封閉式的臨床環(huán)境中很難應(yīng)用，后續(xù)操作也很困難。最近開發(fā)出的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法包括同時(shí)加入載體、細(xì)胞和T細(xì)胞刺激性分子CD3和CD28(驅(qū)動細(xì)胞分裂)(Lu等，2004；Humeau等，2004)。以前已證明，加入載體之前用CD3和CD28預(yù)刺激細(xì)胞時(shí)，與CD3和CD28的接觸可增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Costello等，2000)。這種組合性轉(zhuǎn)導(dǎo)和培養(yǎng)起始方法產(chǎn)生最大為99％的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并將達(dá)到該轉(zhuǎn)導(dǎo)水平所需的時(shí)間減少至3天(Lu等，2004)。這些研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞刺激在達(dá)到治療受益所需的足夠高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率中的重要作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的培養(yǎng)時(shí)間的減少還有助于保留被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的天然效力。慢病毒的一個(gè)獨(dú)特性質(zhì)是它們不需要細(xì)胞細(xì)胞分裂就可實(shí)現(xiàn)基因插入。這有助于基因治療中的靜息(quiescent)細(xì)胞靶，包括巨噬細(xì)胞、初級造血祖細(xì)胞和循環(huán)的初級T淋巴細(xì)胞，本發(fā)明可靶向這些細(xì)胞，如下文詳述。因?yàn)檫@些細(xì)胞靶保留了在體內(nèi)發(fā)揮長期功能的特殊效力，所以它們在臨床上尤其有用。離體用細(xì)胞因子或其它刺激分子進(jìn)行廣泛刺激可導(dǎo)致細(xì)胞在體內(nèi)的效力發(fā)生改變(Maurice等，2002；Soares等，1998)。因此，采用基于HIV的載體時(shí)，在靜息T細(xì)胞中誘導(dǎo)G0至G1b的瞬時(shí)轉(zhuǎn)變可有助于載體的整合而不促進(jìn)導(dǎo)致原始特征喪失的擴(kuò)增(Dardalhon等，2000)。類似地在造血干細(xì)胞中，最小的刺激將促進(jìn)有效的基因轉(zhuǎn)移而不誘導(dǎo)血液重建潛能的喪失。雖然本領(lǐng)域最近開發(fā)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法與早先的方法相比代表了重大改進(jìn)，但用外源共刺激分子進(jìn)行細(xì)胞活化這一需要與發(fā)展可注射入體內(nèi)以促進(jìn)有效的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因治療載體是相悖的。對于是否能夠成功地在體內(nèi)同時(shí)給予刺激分子和載體作為治療方案還不確定。此外，即使是在離體基因轉(zhuǎn)移的應(yīng)用中，培養(yǎng)過程中對外源刺激分子的需要也引起了其它的質(zhì)量控制和安全問題。上述文獻(xiàn)的引用不意于認(rèn)可其中任何一篇是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。對這些文獻(xiàn)的日期的描述或?qū)ζ鋬?nèi)容的引用均基于申請人可獲得的信息，不構(gòu)成對這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容正確性的認(rèn)可。發(fā)明概述本發(fā)明提供改進(jìn)的包裝(packaging)和生產(chǎn)(producer)細(xì)胞系，以及包含它們的組合物和方法，以改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供具有改進(jìn)的結(jié)合和刺激特性的慢病毒顆粒以促進(jìn)被顆粒靶向的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)和增殖。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞的方法，而不只是依賴高滴度的病毒顆粒和/或用外源補(bǔ)充的刺激因子來刺激。因此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于其可應(yīng)用于離體或體外，不需要可溶性刺激因子或輔助性細(xì)胞提供的因子。此外，本發(fā)明可用于體內(nèi)，直接注射以遞送載體或病毒顆粒的“有效負(fù)荷”(″payloads″)到對象中。在第一方面，本發(fā)明提供了一種通過將能夠結(jié)合靶細(xì)胞和/或刺激所述細(xì)胞的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的分子摻入到載體包膜中而改進(jìn)慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向的方法。已證明，刺激細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的能力可增加轉(zhuǎn)導(dǎo)，在一些體外和離體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法中，這種能力是CD3和CD28配體的功能。例如，本領(lǐng)域其它研究人員已將抗人CD3/CD28耦合的珠子用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)中(Lu等，2004和Levine等，1997和2000)。其它研究小組已工程化了含有重組包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這些重組包膜蛋白模擬共刺激分子例如IL-2和IL-7(Maurice等，1999和Verhoeyen等，2003)或單鏈抗-CD3抗體(Maurice等，2002)。本發(fā)明部分地基于這樣一種認(rèn)識，即，將細(xì)胞表面蛋白和分子摻入到逆轉(zhuǎn)錄載體的包膜表面將在不存在外源共刺激分子的情況下調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本發(fā)明提供了一種制備慢病毒載體的新構(gòu)思，所述載體含有優(yōu)化的包膜，便于在所選擇的靶細(xì)胞中的結(jié)合和后續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)移。這不是通過產(chǎn)生含有重組包膜蛋白的載體(Verhoeyen等，2003；Maurice等，1999和2002)來實(shí)現(xiàn)的，而是通過設(shè)計(jì)和采用工程化的、在載體表面上表達(dá)感興趣的膜相關(guān)蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞系來實(shí)現(xiàn)的。隨后在該細(xì)胞系中產(chǎn)生的載體將具有膜相關(guān)蛋白，這些蛋白具有結(jié)合和活化靶細(xì)胞的能力，從而對于向這些細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移來說是優(yōu)化的。這些包膜蛋白可以是在生產(chǎn)細(xì)胞或其它細(xì)胞中天然存在的，作為非限定性例子，包括單獨(dú)的CD49d、CD54、CD80和CD86或其中兩種、三種或所有四種的組合。因此，本發(fā)明減少或消除了加入外源分子進(jìn)行共刺激的需要，有利于在缺少外源提供的因子的情況下提供轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。這可擴(kuò)展轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的可能用途和應(yīng)用。本發(fā)明還提供了用于離體轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)基因遞送的簡化的、更適合臨床應(yīng)用的方法。本發(fā)明也可用于減少用包裝的顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時(shí)一些伴隨的問題。作為一個(gè)示范性實(shí)施方式，可將慢病毒載體工程化為含有最大程度模擬形成于天然細(xì)胞宿主的天然HIV包膜且差別僅在于病毒包膜蛋白的包膜。通過在載體顆粒中包含蛋白例如但不限于CD86和CD54(單獨(dú)或組合)，這些顆粒可有利地被用于刺激靶CD4T細(xì)胞(通過CD86)和/或通過細(xì)胞-載體相互作用而增加載體與細(xì)胞的結(jié)合(通過CD54)。因此，可以想像到用體內(nèi)天然結(jié)合于靶細(xì)胞的細(xì)胞來包裝載體。例如，T細(xì)胞含有結(jié)合并活化淋巴組織中的其它T細(xì)胞的分子。因此，T細(xì)胞或相關(guān)T細(xì)胞系可直接用作或經(jīng)修飾后用作包裝細(xì)胞，然后用作載體生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生可用于結(jié)合T細(xì)胞的載體。另一個(gè)例子是用間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)生產(chǎn)/包裝載體來靶向和轉(zhuǎn)導(dǎo)造血祖細(xì)胞，因?yàn)樵隗w內(nèi)MSC為這些細(xì)胞提供支持基質(zhì)。除了非修飾性細(xì)胞的可能用途之外，本發(fā)明提供一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，其包含第一核酸分子，該分子在所述細(xì)胞中表達(dá)或能夠表達(dá)至少一種膜相關(guān)性非病毒配體。所述配體在有些實(shí)施方式中是非內(nèi)源的(或相對所述細(xì)胞是異源的，或在所述細(xì)胞中非正常表達(dá))，雖然在本發(fā)明實(shí)施中也可采用包含能增加內(nèi)源性膜相關(guān)性非病毒配體的核酸構(gòu)建物的重組細(xì)胞。非病毒配體可以是天然存在的細(xì)胞表面分子，其能夠結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子。所述第一核酸分子可以被瞬時(shí)導(dǎo)入所述細(xì)胞或預(yù)先被穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子包括在本發(fā)明實(shí)施方式中。在有些實(shí)施方式中，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體通過結(jié)合于所述細(xì)胞表面分子而在細(xì)胞-細(xì)胞粘著中起作用，和/或在結(jié)合于細(xì)胞的細(xì)胞表面分子之后發(fā)揮作用來活化或刺激細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致或不導(dǎo)致生長和/或增殖。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，細(xì)胞包含至少兩種此類配體，例如一種配體在細(xì)胞-細(xì)胞粘著中起作用，一種活化或刺激細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。在本發(fā)明其它實(shí)施方式中，所述配體是共刺激分子，該共刺激分子結(jié)合T細(xì)胞表面分子，以在所述T細(xì)胞的CD3/TCR復(fù)合體被天然或人工配體結(jié)合或被特異性抗體(Ab)結(jié)合時(shí)激活T細(xì)胞增殖。其它非限制性配體是那些從造血細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的配體。包裝細(xì)胞的重組以及包裝特性提示，該細(xì)胞包含表達(dá)或能夠表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝所需的一種或多種病毒因子的至少一種異源核酸分子。所述一種或多種因子是以反式起作用而允許逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸包裝入病毒粒子或病毒顆粒的因子。在一些實(shí)施方式中，這些因子是一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，如基質(zhì)、衣殼或核衣殼蛋白，和/或一種或多種病毒輔助蛋白。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所認(rèn)可的，包裝細(xì)胞和將被包裝的載體可看作一種包裝系統(tǒng)，其中，反式作用所需的包裝組分可由來自于包裝細(xì)胞和來自于載體的核酸序列的組合表達(dá)。所述至少一種異源核酸分子可瞬時(shí)導(dǎo)入所述細(xì)胞或預(yù)先被穩(wěn)定導(dǎo)入細(xì)胞。穩(wěn)定導(dǎo)入的分子包括在本發(fā)明的實(shí)施方式中。病毒因子可支持慢病毒載體的包裝。任何一種或多種因子的組合都可由包裝細(xì)胞中的核酸序列編碼，不以這種方式編碼的任何因子由載體中的核酸序列編碼。在某些實(shí)施方式中，所述因子包括病毒包膜蛋白和其它反式因子，例如慢病毒載體中的各種輔助蛋白，以及GAG或POL蛋白。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的包裝細(xì)胞表達(dá)或能夠表達(dá)能包裝慢病毒載體以產(chǎn)生能轉(zhuǎn)導(dǎo)特定的靶細(xì)胞的顆粒的病毒包膜蛋白。在其它實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞表達(dá)或能夠表達(dá)結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子的病毒配體。在本發(fā)明一個(gè)示范性實(shí)施方式中，病毒因子是保持或介導(dǎo)病毒或載體顆粒與靶細(xì)胞膜融合的蛋白。換句話說，該因子的作用是介導(dǎo)含有所述病毒配體的細(xì)胞膜與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。非限制性例子包括靶向或結(jié)合于結(jié)合素-1的因子，例如野生型單純皰疹病毒(HSV)-1包膜蛋白。其它非限制性例子是病毒和非病毒因子，如靶向或結(jié)合CD34+、CD33+和/或CD14+細(xì)胞的因子，如靶向CD155/PVR或CD112(CD34+細(xì)胞上存在的結(jié)合素-2)的CD226(DNAM-1)蛋白。包裝細(xì)胞的重組以及包裝特性也提示，不存在待包裝的載體序列時(shí)，細(xì)胞不產(chǎn)生病毒顆粒。載體序列可看作該細(xì)胞中的第二核酸分子，來自于慢病毒的、具有長末端重復(fù)(LTR)區(qū)域和/或慢病毒包裝或二聚化信號的載體是本發(fā)明的實(shí)施方式。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明靶細(xì)胞包括但不限于，抗原呈遞細(xì)胞(APC)、造血譜系細(xì)胞、干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(包括T細(xì)胞和B細(xì)胞，如淋巴結(jié)生發(fā)中心的T細(xì)胞和B細(xì)胞)、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和非造血干細(xì)胞。包裝細(xì)胞的膜相關(guān)性非病毒配體在摻入載體包膜之后，用于將病毒粒子顆粒導(dǎo)向這些靶細(xì)胞。在有些實(shí)施方式中，所述配體是跨膜蛋白，但是它們也可以是位于包裝細(xì)胞膜的外表面上的蛋白。所述配體可以是高等真核細(xì)胞的蛋白、基于高等真核細(xì)胞蛋白的合成或嵌合(融合)分子、單鏈抗體或其結(jié)合片段、或微生物蛋白。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的包裝細(xì)胞的組合物。這種組合物包括包裝細(xì)胞和待包裝載體的組合。載體可已被引入所述細(xì)胞。在有些實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體是已被除去編碼輔助蛋白的核酸的載體，例如但不限于，缺少能夠表達(dá)慢病毒輔助蛋白的功能序列的慢病毒載體。這些蛋白可通過包裝細(xì)胞以反式形式提供。其它組合物包括包裝細(xì)胞和用于所述細(xì)胞增殖的合適培養(yǎng)基和/或孵育裝置。在第二方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的包裝細(xì)胞的方法。所述方法包括引入核酸分子，所述核酸分子在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)或能夠表達(dá)如本文所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和/或復(fù)制所需的病毒基因產(chǎn)物；和引入至少一種核酸分子，其在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)或能夠表達(dá)至少一種如本文所述的膜相關(guān)性非病毒配體。在第三方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)或包裝本發(fā)明的病毒載體顆粒的方法。所述方法包括將編碼或包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的核酸分子引入如本文所述的重組包裝細(xì)胞中。然后在一定條件下培養(yǎng)這種細(xì)胞，在所述條件下所述細(xì)胞將所述載體包裝入包含至少一種如本文所述的膜相關(guān)性非病毒配體的顆粒中。在第四方面，本發(fā)明提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細(xì)胞，通過引入編碼如本文所述的病毒包裝因子的核酸分子使所述包裝細(xì)胞成為重組細(xì)胞。所述細(xì)內(nèi)源性表達(dá)能夠結(jié)合到靶細(xì)胞或組織的細(xì)胞表面分子的至少一種膜相關(guān)配體。在有些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是非貼壁性細(xì)胞(例如，能夠在懸浮狀態(tài)下增殖)和/或在體內(nèi)與靶細(xì)胞或組織相互作用或結(jié)合的細(xì)胞。非限制性實(shí)施方式包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞，其包裝以造血干細(xì)胞作為靶細(xì)胞的載體。或者，所述細(xì)胞可以是表達(dá)結(jié)合到CD34+細(xì)胞表面的整合蛋白的細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞可表達(dá)選自SDF-I、VLA-4、VLA-5或LFA-1的配體，因此，被包裝的載體結(jié)合的造血干細(xì)胞為a)CD34+和CD38-/CXCR4+或b)CD34+和CD38low/CXCR4+。本發(fā)明還提供包含所述包裝細(xì)胞的組合物，任選與本文所述的載體組合，以及制備所述細(xì)胞的方法和如本文所述的使用所述細(xì)胞包裝載體的方法。在第五方面，本發(fā)明提供包含由本發(fā)明的細(xì)胞、組合物和方法產(chǎn)生的病毒顆粒的載體。這些顆粒將具有含有如本文所述配體和來自包裝細(xì)胞的其它分子的外部。定義本文所用術(shù)語“重組”指用遺傳工程和/或分子生物學(xué)技術(shù)來生產(chǎn)生物產(chǎn)品，如蛋白質(zhì)或核酸。在要表達(dá)重組核酸分子的情況下，該術(shù)語一般指含有天然情況下不存在的序列的非天然存在的分子。當(dāng)然，這種分子可用于表達(dá)天然存在的或合成的生物分子。在重組細(xì)胞的情況下，該術(shù)語一般指表達(dá)或能夠表達(dá)非內(nèi)源性蛋白的細(xì)胞，或表達(dá)或能夠表達(dá)非內(nèi)源水平的內(nèi)源蛋白的細(xì)胞。術(shù)語“病毒顆粒”或“載體顆?！被颉安《玖Ｗ印被蚱渥凅w指通常包裹或包含本文所述病毒或載體核酸的大分子復(fù)合物。這些顆粒通常包裹在脂質(zhì)雙層膜中，所述脂質(zhì)雙層膜是在由本發(fā)明生產(chǎn)和包裝細(xì)胞以及方法產(chǎn)生病毒顆粒的過程中獲得的。附圖簡述圖1顯示通過采用在表達(dá)CD54的細(xì)胞中包裝的病毒載體，能夠增加初級人CD4+T淋巴細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)導(dǎo)水平)。在細(xì)胞膜中表達(dá)或不表達(dá)CD54蛋白的細(xì)胞中產(chǎn)生了基于HIV的慢病毒載體。在存在或不存在retronectin的情況下轉(zhuǎn)化細(xì)胞之后，通過采用基于TaqManTM的PCR介導(dǎo)的檢測來評價(jià)靶細(xì)胞中的(載體)拷貝數(shù)來比較載體的基因轉(zhuǎn)移。n＝3。圖2顯示分離自正常人血液成份部分清透(apheresis)成分的CD4+-富集的T細(xì)胞在暴露于以下三種條件之一時(shí)的細(xì)胞生長曲線僅培養(yǎng)基(nada)，可溶性抗-CD3抗體(CD3)或抗CD3/28抗體包被的珠子(B)。感染復(fù)數(shù)(MOI)為20時(shí)，將三種條件下各組的細(xì)胞暴露于5種不同載體制劑之一僅載體緩沖液(NV)，未修飾的對照載體(CV)，或在細(xì)胞表面表達(dá)CD54的細(xì)胞中包裝的載體(54)、或在細(xì)胞表面表達(dá)CD86(86)或CD54和CD86兩者(54/86)的細(xì)胞中包裝的載體。在21天的時(shí)間內(nèi)，用Z2庫爾特粒度儀監(jiān)測細(xì)胞擴(kuò)增。n＝3。圖3顯示分離自正常人血液成份部分清透(apheresis)成分的CD4+-富集的T細(xì)胞在暴露于以下三種條件之一時(shí)的細(xì)胞生長曲線僅培養(yǎng)基(nada)，可溶性抗-CD3抗體(CD3)或抗CD3/28抗體包被的珠子(B)。MOI為20時(shí)，將三種條件下各組的細(xì)胞暴露于5種不同載體制劑之一；僅載體緩沖液(NV)，未修飾的對照載體(CV)，由組合了CD54(54)或CD86(86)或兩者(54/86)的293F細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的載體。在21天的時(shí)間內(nèi)，用Z2庫爾特粒度儀監(jiān)測細(xì)胞擴(kuò)增。n＝3。圖4顯示相較于表面僅表達(dá)CD54的293細(xì)胞，與表面表達(dá)CD86和CD54的293細(xì)胞共培養(yǎng)之后，通過檢測活化標(biāo)記CD25表達(dá)的增加，檢測到分離自正常人血液成份部分清透產(chǎn)品的初級CD4+富集的T細(xì)胞活化的增強(qiáng)。不存在刺激性抗-CD3抗體或抗-CD3抗體濃度為5μg/ml-20μg/ml的情況下被孵育細(xì)胞。培養(yǎng)開始后4天檢測CD25的表達(dá)(頻率和平均熒光)。n＝3，顯示了與平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5顯示相較于表面僅表達(dá)CD54的293細(xì)胞，與表面表達(dá)CD86和CD54的293細(xì)胞共培養(yǎng)之后，通過檢測活化標(biāo)記CD69表達(dá)的增加，檢測到分離自正常人血液成份部分清透產(chǎn)品的初級CD4+富集T細(xì)胞活化的增強(qiáng)。不存在刺激性抗-CD3抗體或抗-CD3抗體濃度為5μg/ml-20μg/ml的情況下孵育細(xì)胞。培養(yǎng)開始后4天檢測CD69的表達(dá)(頻率和平均熒光)。n＝3，顯示了與平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6顯示暴露于表達(dá)GFP作為標(biāo)記基因的未修飾或經(jīng)修飾的慢病毒載體之后，對于分離自正常人血液成份部分清透產(chǎn)品的初級CD4+富集T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。細(xì)胞不暴露于刺激性分子(nada)，或暴露于可溶性抗CD-3抗體(CD3)或抗-CD3/28抗體包被的珠子(B)。然后在MOI為20時(shí)將三種條件下的各組暴露于幾種載體之一，這幾種載體包括未修飾的對照載體(CV)，或表達(dá)CD54(54)或CD86(86)或二者(54/86)的細(xì)胞系產(chǎn)生的載體。除檢測到的GFP表達(dá)水平(表示為經(jīng)修飾的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))之外，還顯示了相對的CD25和CD69蛋白水平。n＝3，顯示了與平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖7顯示暴露于表達(dá)GFP作為標(biāo)記基因的未修飾或經(jīng)修飾的慢病毒載體之后，對于分離自正常人血液成份部分清透產(chǎn)品的初級CD4+富集T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。細(xì)胞不暴露于刺激性分子(nada)，或暴露于可溶性抗CD-3抗體(CD3)或抗-CD3/28抗體包被的珠子(B)。然后在MOI為20時(shí)將三種條件下的各組暴露于幾種載體之一，這幾種載體包括未修飾的對照載體(CV)，或瞬時(shí)表達(dá)CD54(54)或CD86(86)或二者(54/86)(的細(xì)胞)產(chǎn)生的載體。除檢測到的GFP表達(dá)水平(表示為經(jīng)修飾的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))之外，還顯示了相對的CD25和CD69蛋白水平。n＝1。發(fā)明實(shí)施方式詳述本發(fā)明提供逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞和含有它們的載體包裝系統(tǒng)。所述細(xì)胞和系統(tǒng)可用于制備包裝的載體顆粒，這些載體顆?？捎糜谵D(zhuǎn)導(dǎo)多種靶細(xì)胞。如上所述，本發(fā)明有多種實(shí)施方式。非限制性實(shí)施方式包括所用細(xì)胞類型、所包裝的載體類型、所表達(dá)的配體類型、用于表達(dá)配體的構(gòu)建物和方法、以及被包裝的載體靶向的細(xì)胞類型。當(dāng)然，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以理解的是，包裝細(xì)胞包含至少一種異源核酸分子，該核酸分子表達(dá)或能夠表達(dá)載體包裝所需的一種或多種病毒因子。所述一種或多種因子以反式發(fā)揮作用以允許將病毒核酸載體包裝到病毒粒子或病毒顆粒中。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含第一核酸分子的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，所述核酸分子能夠在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)結(jié)合于靶細(xì)胞細(xì)胞表面分子的至少一種膜相關(guān)性非病毒配體。在有些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在不存在第二核酸分子的情況下不產(chǎn)生病毒顆粒，所述第二核酸分子表達(dá)病毒因子，或者表達(dá)、或者是載體序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細(xì)胞，其內(nèi)源性表達(dá)能夠結(jié)合靶細(xì)胞或組織的細(xì)胞表面分子的至少一種膜相關(guān)性配體?？刹捎枚喾N細(xì)胞來實(shí)施本發(fā)明。實(shí)施方式包括哺乳動物細(xì)胞，雖然也可采用支持逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體包裝的其它類型的真核細(xì)胞。細(xì)胞類型包括懸浮細(xì)胞，以及例如但不限于COS、TE671、HT1080、Mv-1-Lu和人293細(xì)胞系等細(xì)胞。也可用上述細(xì)胞的衍生物或天然存在的細(xì)胞的衍生物。在其它實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞表達(dá)病毒包裝所需的一種或多種反式作用病毒蛋白。在有些實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞包括i)能夠表達(dá)病毒或非病毒配體的異源核酸分子，所述病毒或非病毒配體結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子并且任選地發(fā)揮作用以介導(dǎo)含有所述病毒配體的細(xì)胞膜與靶細(xì)胞結(jié)合或融合和/或刺激從Gp至G1b的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換；或ii)能夠表達(dá)CD226(DNAM-1)、野生型單純皰疹病毒(HSV)-1包膜蛋白、或其它病毒包膜蛋白的異源核酸分子。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞包含ii)時(shí)，靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞；CD34+、CD33+、CD14+或表達(dá)結(jié)合素1或結(jié)合素樣蛋白的細(xì)胞；T細(xì)胞；淋巴結(jié)生發(fā)中心的樹突狀細(xì)胞或B細(xì)胞；或成纖維細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的包裝細(xì)胞衍生自體內(nèi)與靶細(xì)胞或組織相互作用的細(xì)胞。反式作用蛋白的非限制性例子包括結(jié)構(gòu)蛋白、包膜(env)蛋白、輔助蛋白、有助于與靶細(xì)胞膜融合的蛋白，和任何逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的Gag和/或Pol蛋白，這些病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、魯斯肉瘤病毒、RD114、BaEV、GALV、SSAV、FeLV-B、兼嗜性(amphotropic)鼠白血病病毒(MLV-A)、人免疫缺陷型病毒、禽類白細(xì)胞增生病毒和NZB病毒。GAG和/或POL蛋白也可以是經(jīng)修飾的、合成的、或嵌合的GAG/POL構(gòu)建物。包膜蛋白的例子包括但不限于，兼嗜性包膜、親嗜性(ecotropic)包膜或異嗜性(xenotropic)包膜，或可以是包括兼嗜性和親嗜性部分的包膜。所述蛋白也可以是上述任何逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的蛋白?；蛘?，env蛋白可以是經(jīng)修飾的、合成的或嵌合的env構(gòu)建物，或獲自非逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如水泡性口膜炎病毒和HVJ病毒。具體的非限制性例子包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、魯斯肉瘤病毒和貓科的內(nèi)源性病毒RD114的包膜；長臂猿白血病病毒(GALV)包膜；狒狒內(nèi)源性病毒(BaEV)包膜；猿猴肉瘤相關(guān)病毒(SSAV)包膜；兼嗜性鼠白血病病毒(MLV-A)包膜；人免疫缺陷型病毒包膜；禽類白細(xì)胞增生病毒包膜；內(nèi)源的嗜異性NZB病毒包膜；和副粘病毒科的包膜，例如但不限于，HVJ病毒包膜。被包裝的載體類型包括基于任何病毒的載體。一些非限制性例子是衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包括禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(鴨感染性貧血病毒、脾壞死病毒、Twiehaus株網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒、C型逆轉(zhuǎn)錄病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒Hungary-2(REV-H-2))和貓白血病病毒(FeLV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組已被修飾以用作載體(Cone&Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816349-6353，(1984))?？捎米鞅景l(fā)明載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒科成員的非限制性例子包括慢病毒，如人免疫缺陷型病毒(HIV-1和HIV-2)、貓免疫缺陷型病毒(FIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、梅迪/維斯那病毒、羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)；禽C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，如禽類白細(xì)胞增生病毒(ALV)；HTLV-BLV逆轉(zhuǎn)錄病毒，如牛白血病病毒(BLV)、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)和猴嗜T淋巴細(xì)胞病毒；哺乳動物B型逆轉(zhuǎn)錄病毒，如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)；哺乳動物C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒(MLV)、貓肉瘤病毒(FeSV)、鼠肉瘤病毒、長臂猿白血病病毒、豚鼠C型病毒、豬C型病毒、絨毛猴肉瘤病毒和蝰蛇逆轉(zhuǎn)錄病毒；泡沫病毒(泡沫病毒群)，如人泡沫病毒(HSRV)、貓合胞體形成病毒(FeSFV)、人合胞病毒(humanfoamyvirus)、猴泡沫病毒(simianfoamyvirus)和牛合胞病毒(bovinesyncytialvirus)；D型逆轉(zhuǎn)錄病毒，如梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、松鼠猴逆轉(zhuǎn)錄病毒和葉猴病毒。術(shù)語“載體”或“質(zhì)?！敝改軌蛟诓煌?xì)胞或遺傳環(huán)境之間運(yùn)送核酸序列的核酸分子。非限制性載體包括能夠自主復(fù)制和表達(dá)其中存在的核酸序列的載體。載體也可任選地包含與所用的細(xì)胞系統(tǒng)相容的可選擇性標(biāo)記。用于實(shí)施本發(fā)明的一種載體類型是以游離體存在的載體，它是一種能夠在染色體外復(fù)制的核酸。另一種載體類型是能夠穩(wěn)定整合到它所轉(zhuǎn)入的細(xì)胞的基因組中的載體。本發(fā)明的載體可包含編碼“有效負(fù)荷”的遺傳物質(zhì)，所述“有效負(fù)荷”在包裝細(xì)胞中表達(dá)和/或在載體遞送入靶細(xì)胞之后在靶細(xì)胞中表達(dá)。載體被包裝入顆粒也允許“有效負(fù)荷”或由編碼“有效負(fù)荷”的遺傳物質(zhì)表達(dá)而產(chǎn)生的生物物質(zhì)摻入將被遞送到靶細(xì)胞中的被包裝顆粒中。本發(fā)明中的一種“有效負(fù)荷”是由載體“基因組”編碼的治療性物質(zhì)。當(dāng)然，多肽或核酸(如RNA)“有效負(fù)荷”除在靶細(xì)胞中表達(dá)之外，也可在包裝細(xì)胞中表達(dá)，并在被包裝顆粒中物理性存在，或者不在靶細(xì)胞中表達(dá)而在包裝細(xì)胞中表達(dá)，并在被包裝顆粒中物理性存在。在一些實(shí)施方式中，“有效負(fù)荷”對所用的包裝細(xì)胞無毒性或者毒性極小。編碼治療性物質(zhì)的遺傳物質(zhì)的非限制性例子包括，編碼腫瘤壞死因子(TNF)基因如TNF-α的多核苷酸；編碼干擾素如干擾素-α、干擾素-β和干擾素-γ的基因；編碼白介素如IL-1、IL-1β和白介素2-14的基因；編碼GM-CSF的基因；編碼腺苷脫氨酶或ADA的基因；編碼細(xì)胞生長因子如淋巴因子(淋巴細(xì)胞的生長因子)的基因；編碼表皮生長因子(EGF)和角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(KGF)的基因；編碼可溶性CD4的基因；因子III；因子IX；細(xì)胞色素b；葡萄糖腦苷脂酶；T細(xì)胞受體；LDL受體、ApoE、ApoC、ApoAI和參與膽固醇運(yùn)輸和代謝的其它基因；α-1抗胰蛋白酶(α1AT)基因；胰島素基因；次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶基因；CFTR基因；負(fù)選擇性標(biāo)記或“自殺”基因，如病毒胸苷激酶基因，如單純皰疹病毒胸苷激酶基因，細(xì)胞巨化病毒胸苷激酶基因，和水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因；抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Fc受體，抑制病毒復(fù)制的反義序列，如抑制乙肝病毒或非甲非乙肝炎病毒復(fù)制的反義序列；反義c-myb寡核苷酸；以及編碼抗氧化劑的基因，抗氧化劑例如但不限于，錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、過氧化氫酶、銅-鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)，和谷胱甘肽還原酶；多藥耐藥性(MDR)基因；編碼核酶的多核苷酸；反義多核苷酸；編碼作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管平滑肌鈣通道或腎上腺素能受體的競爭性抑制劑的分泌型多肽的基因，和編碼破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淀粉樣蛋白斑的酶的多核苷酸。也可使用編碼以下物質(zhì)的遺傳物質(zhì)組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)；泌尿纖維蛋白溶酶原激活劑(尿激酶)；水蛭素；苯丙氨酸羥化酶基因；神經(jīng)元一氧化氮合酶；內(nèi)皮一氧化氮合酶；血管活性肽；血管生成肽；抗-血管生成肽；多巴胺基因；抗肌萎縮蛋白基因；β-球蛋白基因；α-球蛋白基因；HbA基因；原癌基因如ras、src和bcl基因；腫瘤抑制基因如p53和Rb；LDL受體；heregulin-α蛋白基因，用于治療乳腺癌、卵巢癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌；以及對T細(xì)胞抗原受體的β鏈內(nèi)所含的表位具有特異性的單克隆抗體。然而應(yīng)理解，本發(fā)明的范圍不限于任何具體的治療物質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，有效負(fù)荷可以是編碼凝固因子(可用于治療血友病，例如，因子VIII或因子IX)的基因，或可編碼具有其它治療效果的一種或多種產(chǎn)品的基因。合適基因的例子包括編碼細(xì)胞因子如TNF、白介素(白介素1-12)、干擾素(α、β和γ干擾素)的基因，編碼T細(xì)胞受體蛋白和用于結(jié)合抗體的Fc受體的基因。本發(fā)明的載體可用于治療多種疾病，包括但不限于，感染性疾病，如病毒感染病如HIV和皰疹感染，遺傳性疾病，如癌癥、腺苷脫胺酶缺陷、鐮狀細(xì)胞性貧血、地中海貧血、血友病、糖尿病、α-抗胰蛋白酶缺陷，腦疾病如阿耳茨海默病，和其它疾病如生長疾病和心臟疾病，例如膽固醇代謝通路發(fā)生改變和免疫系統(tǒng)缺陷造成的疾病。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體可包括負(fù)選擇性標(biāo)記，如病毒胸苷激酶基因如單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因。此類載體可體內(nèi)施用于人患者的癌癥細(xì)胞(具體是腫瘤細(xì)胞)或離體使用。然后，載體轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞。載體轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞之后，給予患者相互作用制劑，如更昔洛維或阿昔洛維，它們與負(fù)選擇性標(biāo)記所表達(dá)的蛋白相互作用以殺傷所有被編碼負(fù)選擇性標(biāo)記的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的、正在復(fù)制的細(xì)胞(即癌癥或腫瘤細(xì)胞)。本發(fā)明載體被設(shè)計(jì)以結(jié)合并感染特定的靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，靶細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)、造血譜系細(xì)胞、干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞，或腫瘤細(xì)胞。當(dāng)靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞時(shí)，包裝細(xì)胞任選地是骨髓基質(zhì)細(xì)胞。造血干細(xì)胞靶可以是CD34+和CD38-/CXCR4+，或CD34+和CD38low/CXCR4+。其它干細(xì)胞包括從胎兒組織如骨髓或肝分離出的CD34+細(xì)胞，CD34+前體人胚胎干細(xì)胞(hESC)，造血來源或上述其它來源的CD133+干細(xì)胞，或側(cè)群(sidepopulation，SP)表型的細(xì)胞。配體任選地是SDF-I、VLA-4、VLA-5或LFA-1。本發(fā)明還包括用整合蛋白作為配體來靶向CD34+細(xì)胞。可用多種天然存在或工程化的膜相關(guān)性配體來實(shí)施本發(fā)明，所述膜相關(guān)性配體結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子并有助于靶細(xì)胞的病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述配體可發(fā)揮功能以介導(dǎo)含有所述配體的細(xì)胞膜與靶細(xì)胞細(xì)胞膜融合。實(shí)施方式包括已知在細(xì)胞-細(xì)胞粘著中起作用的任何配體分子，或?qū)Π屑?xì)胞具有活化或刺激(包括進(jìn)入或轉(zhuǎn)換全部或部分細(xì)胞周期、或細(xì)胞增殖或細(xì)胞生長)活性的任何配體分子。包括已知當(dāng)CD3/TCR復(fù)合物被天然配體或特異性抗體(Ab)結(jié)合時(shí)對T細(xì)胞增殖具有增效作用的共刺激分子。因此，當(dāng)所述T細(xì)胞的CD3/TCR復(fù)合物被天然或人工配體或特異性Ab結(jié)合時(shí)，結(jié)合T細(xì)胞表面分子以活化T細(xì)胞增殖的共刺激分子可用于實(shí)施本發(fā)明。在一些實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞表達(dá)至少兩種此類配體，如但不限于，一種配體有助于細(xì)胞-細(xì)胞粘著，另一種配體有助于靶細(xì)胞刺激。在其它實(shí)施方式中，所述膜相關(guān)性非病毒配體是造血細(xì)胞的膜相關(guān)性非病毒配體或是跨膜蛋白。膜相關(guān)性配體的其它非限制性例子是抗體，包括嵌合的、人源化的、單克隆、單鏈形式的抗體，及其片段，它們作為如上所述的膜相關(guān)性配體發(fā)揮作用。非限制性例子包括結(jié)合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d或CD43的抗體或抗體片段。其它非限制性例子是作為如上所述配體的微生物成分。結(jié)合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d或CD43的微生物蛋白代表了非限制性例子。配體的具體示范性非限制性例子包括CD28；CD28BP(見Lazetic等，J.Biol.Chem.，277(41)38660-38668(2002))；B7-H1、B7-H2(也稱為ICOS-L，B7RP-1，GL50)、B7-H3、B7-H4、和其它相關(guān)B7分子；PD-1結(jié)合分子，如PD-L2和PD-L1；結(jié)合OX40/CD134)的OX40配體(CD154)；結(jié)合4-1BB/CD137的4-1BB配體；LFA-1(CD11a和CD18的復(fù)合物)結(jié)合分子，如ICAM-1/CD54、ICAM-2/CD102、ICAM-3/CD50、ICAM-4/LW或ICAM-5/端腦特異性膜蛋白(telencephalin)；結(jié)合LFA-1、CD11a、CD18、CD11b、CD11c、CD11d或CD43的抗體或微生物分子；CD2(LFA-2)的分子，如CD15、CD48、CD58或CD59；CD5的配體，如CD72；和CD58(LFA-3)的配體，如CD2。當(dāng)然，這些配體的任何組合也可用于實(shí)施本發(fā)明。其它示范性和非限制性例子包括結(jié)合靶T細(xì)胞以及其它細(xì)胞表面的配體，所述其它細(xì)胞包括B細(xì)胞(例如，通過CD40)，表達(dá)CD34的造血祖細(xì)胞(例如通過CD62L)，和對逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或慢病毒感染/復(fù)制敏感的其它細(xì)胞。用作配體的細(xì)胞表面分子的其它例子包括LFA-3(也稱為CD58)；FasL(Fas配體)；CD70；B7-H1(也稱為PD-L1)；B7-H2；B7-H3(也稱為B7RP-2)；B7-H4；CD2；CD3或CD3/TCR復(fù)合物；CD11a；CD26；CD27；CD28；CD30L；CD32；CD38；CD40L(也稱為CD154)；CD45；CD49；CD50(也稱為ICAM-3)；CD54(也稱為ICAM-1)；CD80(也稱為B7.1)；CD86(也稱為B7.2)；CD100；CD122；CD137L(也稱為4-IBB配體)；CD153；CTLA-4(也稱為CD152)；ICOS；OX40L(也稱為CD134)；PD-1；PD-L2(也稱為B7-DC)；SLAM(也稱為CD150)；TIM-1；TIM-2；TIM-3；TIM-4；和2B4(也稱為CD244)。一些配體可任選地與MHCII類共表達(dá)。當(dāng)然，這些配體的任何組合也可用于實(shí)施本發(fā)明。可用已知的任何合適的或方便的方法來獲得或制備編碼可用于本發(fā)明的配體或病毒因子的核酸，所述方法包括已知序列的PCR擴(kuò)增。一種類型的配體分子是刺激或共刺激分子，如結(jié)合CD28的B7-1(以前稱為B7，也稱為CD80)和B7-2(也稱為CD86)。B7-1和B7-2是相關(guān)的同型二聚糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的一部分。其它刺激或共刺激分子是抗-CD28抗體或其功能性部分，包括結(jié)合CD28的Fab部分。在一些實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞表達(dá)CD86但不表達(dá)CD54作為配體。另一種類型的配體是細(xì)胞-細(xì)胞粘著分子。這些分子包括各種ICAM分子，包括細(xì)胞內(nèi)粘著分子(ICAM)ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(LFA)LFA-1和LFA-3。ICAM相關(guān)性成員均結(jié)合于T細(xì)胞整合蛋白，LFA-1。除在APC包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)之外，ICAM-1和ICAM-2還在內(nèi)皮(細(xì)胞)表達(dá)，因此介導(dǎo)細(xì)胞粘著和本發(fā)明被包裝載體的可能的轉(zhuǎn)導(dǎo)。ICAM-3只在白細(xì)胞上表達(dá)，因此可作為靶被本發(fā)明的配體結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，包裝細(xì)胞表達(dá)CD86但不表達(dá)ICAM-1(CD54)、ICAM-2或ICAM-3作為配體。已觀察到，ICAM-1、-2和-3之間的相互作用與LFA-3(CD58)和LFA-2(CD2)與LFA-1(CD11a和CD18)之間的第二結(jié)合作用具有協(xié)同性。因此，這些ICAM分子可與CD58、CD11a和CD18、或CD2共表達(dá)，以允許靶向含有結(jié)合CD58、CD11a和CD18、或CD2的表面分子的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，LFA-1、LFA-2或LFA-3不與CD86共表達(dá)。本發(fā)明實(shí)施中還可采用存活分子作為配體。存活分子定義為在細(xì)胞應(yīng)答(范圍包括從細(xì)胞死亡的刺激到誘導(dǎo))中起作用的分子。存活分子可以是暴露在細(xì)胞表面的蛋白，或者其它細(xì)胞表面大分子如糖或脂。這些細(xì)胞表面分子也稱為細(xì)胞表面的受體?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的存活分子包括Fas配體。其它分子包括TNF受體、TNF、和CD70(一種II型跨膜蛋白，是結(jié)合于CD27的TNF家族的成員)。CD27在休眠的T細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)，而CD70在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞上表達(dá)。CD70與其受體CD27結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激，這種相互作用可能對于從未引發(fā)的(unprimed)T細(xì)胞庫中募集T細(xì)胞很重要。在其它某些條件下，TNF激活TNF受體導(dǎo)致類似的反應(yīng)。其它非限制性細(xì)胞表面結(jié)合分子是FLT-3配體、TPO和Kit配體受體的抗體或配體，它們使表達(dá)這些受體的細(xì)胞(如造血干細(xì)胞)更容易接受載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。其它非限制性細(xì)胞表面結(jié)合分子是GM-CSF和IL-4受體的抗體或配體，它們使以下細(xì)胞更容易接受載體轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞或它們的前體，如單核細(xì)胞，CD34陽性干細(xì)胞，或它們在樹突狀細(xì)胞譜系上的分化的祖細(xì)胞。其它的細(xì)胞表面結(jié)合分子包括在細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的、結(jié)合于其它細(xì)胞表面的分子。細(xì)胞表面結(jié)合分子的其它例子包括多肽、核酸、糖、脂和離子，均任選與其它物質(zhì)復(fù)合。在一些實(shí)施方式中，所述分子與在血細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的因子結(jié)合，如CD1a，CD1b，CD1c，CD1d，CD1e，CD2或CD2R，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CDw12，CD13，CD14，CD15，CD15u，CD16a，CD16b，CDw17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD32，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD39，CD40，CD41，CD42a，CD42b，CD42c，CD42d，CD43，CD44，CD44R，CD45或CD45R或CD45RO或CD45RA或CD45RB或CD45RC，CD46，CD47，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD51，CD52，CD53，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD59，CD60a，CD60b，CD60c，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64，CD65，CD65s，CD66a，CD66b，CD66c，CD66d，CD66e，CD66f，CD68，CD69，CD70，CD71，CD72，CD73，CD74，CD75，CD75s，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD87，CD88，CD89，CD90，CD91，CDw92，CDw93，CD94，CD95，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD102，CD103，CD104，CD105，CD106，CD107a，CD107b，CD108，CD109，CD110，CD111，CD112，CD113，CD114，CD115，CD116，CD117，CD118，CDw119，CD120a，CD120b，CD121a，CDw121b，CD122，CD123，CD124，CDw125，CD126，CD127，CDw128a，CDw128b，CD129，CD130，CD131，CD132，CD133，CD134，CD135，CDw136，CDw137，CD138，CD139，CD140a，CD140b，CD141，CD142，CD143，CD144，CDw145，CD146，CD147，CD148，CDw149，CD150，CD151，CD152，CD153，CD154，CD155，CD156a，CD156b，CD156c，CD157，CD158，CD159a，CD159b，CD160，CD161，CD162，CD162R，CD163，CD164，CD165，CD166，TCRζ，CD167a，CD168，CD169，CD170，CD171，CD172a，CD172b，CD172g，CD173，CD174，CD175，CD175s，CD176，CD177，CD178，CD179a，CD179b，CD180，CD181，CD182，CD183，CD184，CD185，CDw186，CD191，CD192，CD193，CD195，CD196，CD197或CDw197，CDw198，CDw199，CD200，CD201，CD202b，CD203c，CD204，CD205，CD206，CD207，CD208，CD209，CDw210，CD212，CD213a1，CD213a2，CDw217，CDw218a，CDw218b，CD220，CD221，CD222，CD223，CD224，CD225，CD226，CD227，CD228，CD229，CD230，CD231，CD232，CD233，CD234，CD235a，CD235b，CD235ab，CD236，CD236R，CD238，CD239，CD240CE，CD240D，CD240DCE，CD241，CD242，CD243，CD244，CD245，CD246，CD247，CD248，CD249，CD252，CD253，CD254，CD256，CD257，CD258，CD261，CD262，CD263，CD264，CD265，CD266，CD267，CD268，CD269，CD271，CD272，CD273，CD274，CD275，CD276，CD277，CD278，CD279，CD280，CD281，CD282，CD283，CD284，CD289，CD292，CDw293，CD294，CD295，CD296，CD297，CD298，CD299，CD300a，CD300c，CD300e，CD301，CD302，CD303，CD304，CD305，CD306，CD307，CD309，CD312，CD314，CD315，CD316，CD317，CD318，CD319，CD320，CD321，CD322，CD324，CDw325，CD326，CDw327，CDw328，CDw329，CD331，CD332，CD333，CD334，CD335，CD336，CD337，CDw338，和CD339。小寫字母(例如“a”或“b”)表示該CD分子是復(fù)合的CD分子，所述復(fù)合的CD分子由多個(gè)基因產(chǎn)物組成或者屬于結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白家族。符號“w”表示還沒有完全確證的、推定的CD分子。更完全的CD分子列表可見http://mpr.nci.nih.gov/prow/。當(dāng)然，這些配體的任何組合都可用于實(shí)施本發(fā)明。其它非限制性例子的分子與淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞和白細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的因子結(jié)合，如CD2，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD11a，CD18，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD37，CD38，CD39，CD43，CD44，CD45R，CD46，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD53，CD54，CD56，CD57，CD58，CD59，CDw60，CD62L，CD68，CD69，CDw70，CD71，CD73，CDw75，CDw76，CD84，CD85，CD86，CD87，CD89，CD90，CD94，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD103，CD107a，CD107b，CDw108，CDw109，CD118，CD119，CD120b，CD121a，CD122，CDw124，CDw127，CDw128a，CDw130，CD132，CD134，CDw137，CD140a，CD140b，CD143，CD146，CD148，CD152，CD153，CD154，CD155，CD161，CD162，CD165，CD166，和TCRζ。當(dāng)然，這些配體的任何組合都可用于實(shí)施本發(fā)明。很多構(gòu)建物和方法可用于表達(dá)本發(fā)明的病毒因子和配體。非限制性構(gòu)建物包括含有適于在所用包裝細(xì)胞中調(diào)控配體表達(dá)的啟動子的構(gòu)建物。這些包括可操作性連接于編碼本文所述的病毒因子和配體的核酸序列的誘導(dǎo)型和組成型啟動子。本發(fā)明的實(shí)施可采用能夠表達(dá)本文所述配體和病毒因子的、基本為純化形式的質(zhì)粒表達(dá)載體。因此，編碼配體和病毒因子的序列被用于產(chǎn)生相應(yīng)的重組蛋白。能夠指導(dǎo)這些序列表達(dá)的輔助性載體在本文中也可稱為“表達(dá)載體”或“表達(dá)質(zhì)?！薄１磉_(dá)載體含有位于調(diào)控區(qū)域的啟動子序列，該序列(與插入的序列可操作性相連)有助于插入的核酸序列在宿主中的轉(zhuǎn)錄。所述序列可編碼本發(fā)明的配體或“有效負(fù)荷”。載體可含有誘導(dǎo)型啟動子序列，以減少組成型表達(dá)啟動子序列的細(xì)胞所承受的選擇壓力。表達(dá)載體通常含有復(fù)制起始位點(diǎn)以及允許對被轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行表型選擇的特定基因?？刹僮餍赃B接指核酸序列之間的共價(jià)連接，從而產(chǎn)生功能性元件之間的聯(lián)合，如調(diào)控區(qū)的相應(yīng)元件與上述啟動子和編碼序列的連接。可用于本發(fā)明的載體可以是與真核細(xì)胞相容的載體。真核細(xì)胞表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，其含有用于表達(dá)編碼本發(fā)明配體和病毒因子的序列的啟動子。這些表達(dá)載體也可含有進(jìn)行精確和有效的聚腺苷酸化所需的不同的序列元件，以及任選用于產(chǎn)生成熟的mRNA的剪接信號。它們也可任選地含有病毒復(fù)制子以增加所編碼基因的表達(dá)水平。采用誘導(dǎo)型啟動子也可實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)，所述啟動子包括但不限于，金屬硫蛋白(metallothionine)IIA啟動子和熱休克啟動子。本發(fā)明還提供一種制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞的方法。所述方法包括將以下物質(zhì)引入細(xì)胞，1)能夠在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和/或復(fù)制所需的病毒基因產(chǎn)物的核酸分子，和2)能夠在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)至少一種膜相關(guān)性非病毒配體的至少一種核酸分子，所述膜相關(guān)性非病毒配體結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子。另一種方法包括將以下物質(zhì)引入細(xì)胞，1)能夠在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和/或復(fù)制所需的病毒基因產(chǎn)物的核酸分子，和2)能夠在所述包裝細(xì)胞中增加至少一種膜相關(guān)性非病毒配體表達(dá)的至少一種核酸分子，所述膜相關(guān)性非病毒配體結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以長期、大量地產(chǎn)生重組配體和病毒因子。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染指遺傳物質(zhì)整合入細(xì)胞基因組，從而在細(xì)胞復(fù)制和分裂的后續(xù)周期中所述遺傳物質(zhì)不會丟失?；蛘撸伤矔r(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，可在細(xì)胞復(fù)制和分裂的后續(xù)周期中從細(xì)胞中丟失?？捎帽缓线m表達(dá)控制元件(例如，啟動子和增強(qiáng)子序列，轉(zhuǎn)錄終止子，聚腺苷酸位點(diǎn)等)控制的cDNA和任選的可選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化包裝細(xì)胞。所述可選擇性標(biāo)記賦予細(xì)胞選擇抗性，允許細(xì)胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合入其染色體，并生長以形成可擴(kuò)增成細(xì)胞系的克隆。本發(fā)明還關(guān)注在同一種載體中存在一種以上配體和/或病毒因子編碼序列，并處于一個(gè)或獨(dú)立的(任選地為多個(gè))調(diào)控元件如啟動子控制之下的情況。因此，用于在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的重組配體和/或病毒因子蛋白的輔助性載體構(gòu)建物的所有可能組合均被考慮在內(nèi)。被包裝的載體靶向的細(xì)胞類型(或靶細(xì)胞)包括但不限于，初級細(xì)胞，包括血細(xì)胞，其包括所有形式的成核血細(xì)胞及其祖細(xì)胞和前體；肝細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞；淋巴細(xì)胞；和腫瘤細(xì)胞，包括惡性和非惡性腫瘤細(xì)胞。當(dāng)給予這些細(xì)胞時(shí)，可通過離體或體內(nèi)技術(shù)將包裝的載體給予動物，如人。此外，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生或包裝病毒載體的方法。所述方法包括1)向本發(fā)明包裝細(xì)胞中引入編碼或包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的核酸分子，和2)在所述細(xì)胞將所述載體包裝成顆粒的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述顆粒含有所述包裝細(xì)胞的一種或多種膜相關(guān)性非病毒配體。所述配體如本文所述，因此可結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子。在一些實(shí)施方式中，編碼或包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的核酸分子是引入包裝細(xì)胞的“第二”核酸?，F(xiàn)在已總體描述了本發(fā)明，通過參考以下實(shí)施例將能夠更容易地理解本發(fā)明，除非另有具體說明，實(shí)施例只是用于闡釋本發(fā)明，不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1慢病毒載體膜中摻入的CD54介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)VRX494是最小的基于HIV的慢病毒載體，含有cppt/CTS序列、937堿基的反義有效負(fù)荷(靶向HIV包膜基因)和GFP標(biāo)記基因(在其它實(shí)施方式中可除去)。后兩種核酸序列都在LTR啟動子控制下表達(dá)。根據(jù)發(fā)表的用于產(chǎn)生G蛋白準(zhǔn)型(pseudotyped)病毒顆粒的方法(Lu等，2004)，VRX494是在存在一個(gè)輔助性質(zhì)粒的情況下由293FT細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的(因此是基于293的包裝細(xì)胞)。為了檢測CD54在包裝細(xì)胞表面上的表達(dá)是否導(dǎo)致其在載體膜上的表達(dá)并因此增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo)，制備了表達(dá)CD54的構(gòu)建物(VRX588)。在存在或不存在VRX588的情況下制備VRX494，產(chǎn)生在病毒顆粒包膜表面含有或不含有CD54的載體。在各個(gè)間隔收集含有載體的上清，富集并離心。在緩沖液中重建載體團(tuán)塊，然后根據(jù)已發(fā)表的方法(Lu等.，2004)滴加在HeLa-tat細(xì)胞上。CD4+T淋巴細(xì)胞通過MACS陽性篩選分離自人PBMC。在CD3/CD28刺激性珠(3珠/細(xì)胞)存在下，純化的細(xì)胞以1×106/孔的濃度在T細(xì)胞培養(yǎng)基中(Xvivo15，加有10mMNAC，5％人血清，100單位/毫升IL-2，和慶大霉素)培養(yǎng)過夜，所述CD3/CD28刺激性珠可能影響CD11a/CD18(LFA-1)的構(gòu)象使其對載體顆粒上的CD54(ICAM-1)的結(jié)合更敏感。在存在或不存在retronectin時(shí)，以MOI20一式三份進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在載體存在下，37℃5％CO2中孵育培養(yǎng)物3天。洗去未使用的載體，然后以0.5×106細(xì)胞/毫升重新裝板。通過在合適的容器中擴(kuò)大培養(yǎng)基體積，使細(xì)胞維持在此濃度至第7天。在第7天，收集培養(yǎng)物，在PBS中洗滌兩次，計(jì)數(shù)，干燥并將細(xì)胞團(tuán)塊分成106細(xì)胞/瓶，用于測定每細(xì)胞平均載體拷貝數(shù)(使用根據(jù)SOP的TaqManPCR)。存在retronectin(已知該化合物可增強(qiáng)轉(zhuǎn)導(dǎo))時(shí)，與不存在CD54的對照相比，CD54的存在使靶初級CD4T淋巴細(xì)胞中的(載體)拷貝數(shù)增加約7倍。不存在retronectin時(shí)，相對于沒有CD54的對照，CD54增加靶拷貝數(shù)10倍。在存在或缺少retronectin時(shí)，在CD54陽性載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞之間獲得了相似的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平(圖1)。這說明retronectin對于轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有相對較小的陽性作用，而CD54的存在具有較大作用。實(shí)施例2用包裝的、載體膜上表達(dá)有CD86的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后增強(qiáng)的細(xì)胞刺激和擴(kuò)增通過用編碼CD54蛋白、CD86蛋白或二者的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，以修飾293F細(xì)胞使其含有所述蛋白。在幾個(gè)點(diǎn)用流式細(xì)胞儀檢測被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以確定在細(xì)胞表面表達(dá)正確的蛋白。用抗-CD54-PE或抗-CD86-PE和碘化丙錠染色細(xì)胞以檢測細(xì)胞活力。同種型對照抗鼠IgG1-PE和抗鼠IgG2a用來檢測基線染色。為了評價(jià)細(xì)胞刺激和擴(kuò)增，將冷凍的CD4+T細(xì)胞(分離自人血液成份部分清透產(chǎn)物，然后通過CD4+富集(采用Miltenyi設(shè)備)進(jìn)行CD4T細(xì)胞純化)培養(yǎng)在X-vivo15培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有5％人AB血清、50μg/ml慶大霉素、100U/mlIL-2和1.6mg/mLN-乙酰半胱氨酸(NAC)。以1×106細(xì)胞/毫升的濃度將細(xì)胞接種在以下三種條件之一中無添加、濃度為5mg/ml的抗-CD3抗體(OKT-3克隆)、或濃度為3珠/細(xì)胞的抗-CD3/CD28微珠。對于這三種條件的每一種，檢測了無載體、對照載體或膜中含有CD54、CD86或同時(shí)含有這兩種蛋白的對照載體。在第1天和第2天，溫和重懸所有孔中的細(xì)胞以打碎任何細(xì)胞團(tuán)塊。第3天，洗滌細(xì)胞兩次，并用庫爾勒粒度儀計(jì)數(shù)和測量大小。第7天，再次計(jì)數(shù)細(xì)胞和測量大小，并分析綠色熒光蛋白(GFP，由所用的慢病毒載體表達(dá)的標(biāo)記基因)的表達(dá)。同時(shí)還檢測了活化標(biāo)記CD25和CD69的表達(dá)，采用抗-CD25-PE或抗-CD69-PE和碘化丙錠，IgGK1-PE同種型對照作為基線染色。進(jìn)行了兩組試驗(yàn)。第一組使用上述293細(xì)胞系產(chǎn)生的載體。第二組使用用簡單的瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染技術(shù)在細(xì)胞中產(chǎn)生的載體，沒有事先建立細(xì)胞系。這些試驗(yàn)的擴(kuò)增結(jié)果分別示于圖2和3。相對于用正常(未修飾的)載體處理的細(xì)胞，表面表達(dá)CD86的慢病毒載體結(jié)合可溶性抗CD-3抗體處理的細(xì)胞顯示出顯著增強(qiáng)的生長。CD54沒有顯示出在增強(qiáng)或阻滯細(xì)胞生長中起作用。在用293F細(xì)胞系產(chǎn)生的載體或通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的載體處理的細(xì)胞之間，未觀察到顯著差異。相對于只表達(dá)CD54的293細(xì)胞，表達(dá)CD86和CD54的293細(xì)胞共培養(yǎng)物增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞上活化標(biāo)記CD25和CD69的表達(dá)(示于圖4&5)。這些結(jié)果支持一種發(fā)現(xiàn)，即暴露于表達(dá)CD86的細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增增加是細(xì)胞活化的結(jié)果。最后，在第7天，對于上述293細(xì)胞系產(chǎn)生的載體和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的載體，載體表面CD86的表達(dá)增強(qiáng)了GFP表達(dá)水平(圖6和7)。雖然之前已證明CD54聯(lián)合CD86可增加每細(xì)胞中載體插入的拷貝數(shù)，但這個(gè)試驗(yàn)中，與僅有CD86相比較，CD54未顯示出對被載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的總百分?jǐn)?shù)有影響。單獨(dú)的CD86的存在將轉(zhuǎn)導(dǎo)百分?jǐn)?shù)從小于10％增加到約30％。所有這些數(shù)據(jù)非常有說服力地證明，在載體顆粒的表面中摻入刺激性配體確實(shí)能夠增強(qiáng)細(xì)胞刺激和生長。本文引用的所有文獻(xiàn)，包括專利、專利申請和出版物，不管之前是否具體納入，均全文納入本文作為參考?，F(xiàn)在已充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員將理解，可在廣泛范圍的等價(jià)參數(shù)、濃度和條件下實(shí)施本發(fā)明而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，并且不需要過多試驗(yàn)。雖然結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，可對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步改動。本發(fā)明包括總體上按照本發(fā)明原則的對本發(fā)明所進(jìn)行的任何改動、使用或變動，包括不在本發(fā)明公開范圍內(nèi)但屬于本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或常規(guī)技術(shù)的任何改動、使用或變動，以及適于本文上述基本特征的任何改動、使用或變動。參考文獻(xiàn)1.BarbeauB.，F(xiàn)ortinJ-F.，GenoisN.，和TremblayMJ.通過新的基于熒光的合胞體定量檢測測定的LFA-1的構(gòu)象狀態(tài)對人免疫缺陷型病毒I型-誘導(dǎo)的合胞體形成的調(diào)節(jié)(Modulationofhumanimmunodeficiencyvirustype1-inducedsyncitiumformationbytheconformationalstateofLFA-1determinedbyanewluciferase-basedsyncytiumquantitativeassay).J.Virol.72，7125-7136(1998)。2.CavalieriS.等.缺少TCR活化的情況下被慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的人T淋巴細(xì)胞保持完整的免疫能力(HumanTlymphocytestransducedbylentiviralvectorsintheabsenceofTCR-activationmaintainanintactimmunecompetence).Blood102，497-505(2003)。3.ConeR.D.，和MulliganR.C.對哺乳動物細(xì)胞的高效基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生具有廣泛哺乳動物宿主范圍的無輔助性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(High-efficiencygenetransferintomammaliancellsgenerationofhelper-freerecombinantretroviruswithbroadmammalianhostrange).Proc.Natl.Acad.Sci81，6349-6353(1984)。4.CostelloE.，MunozM.，BuettiE.，MeylanP.R.A.，DiggelmannH.&ThaliM.通過HIV-1衍生的慢病毒載體對刺激的和未刺激的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移(GenetransferintostimulatedandunstimulatedTlymphocytesbyHIV-1-derivedlentiviralvectors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細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體是i)共刺激分子，當(dāng)T細(xì)胞的CD3/TCR復(fù)合物被天然或人工配體或特異性Ab結(jié)合時(shí)，所述共刺激分子結(jié)合所述T細(xì)胞表面分子以活化T細(xì)胞增殖，和/或ii)通過結(jié)合于所述細(xì)胞表面分子而在細(xì)胞-細(xì)胞粘著中起作用的分子。8.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體在結(jié)合于所述細(xì)胞表面分子后活化所述靶細(xì)胞使其增殖。9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體包括兩種所述配體。10.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是造血細(xì)胞的膜相關(guān)性非病毒配體。11.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是跨膜蛋白。12.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是CD28或CD28BP或CD40或CD62L或CD80(B7-1)或CD86(B7-2)或Fas配體(FasL)或CD70或LFA-3(CD58)或B7-H1(PD-L1)或B7-H2或B7-H3(B7RP-2)或B7-H4或CD2或CD3或CD3/TCR復(fù)合物或CD11a或CD26或CD27或CD28或CD30L或CD32或CD38或CD40L(CD154)或CD45或CD49或CD50(ICAM-3)或CD54(ICAM-1)或CD100或CD122或CD137L(4-1BB配體)或CD153或CTLA-4(CD152)或ICOS或OX40L(CD134)或PD-1或PD-L2(B7-DC)或SLAM(CD150)或TIM-1或TIM-2或TIM-3或TM-4或2B4(CD244)，或它們的組合。13.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是B7相關(guān)性分子，如B7-H1、B7-H2(也稱為ICOS-L、B7RP-1和GL50)、B7-H3，和B7-H4。14.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體結(jié)合LFA-1、或CD11a和CD18的復(fù)合物，如ICAM-1(CD54)、ICAM-2(CD102)、ICAM-3(CD50)、ICAM-4(LW)和ICAM-5(端腦特異性膜蛋白)。15.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是PD-1配體，如PD-L2或PD-L1；結(jié)合OX40(CD134)的OX40配體；結(jié)合4-1BB(CD137)的4-1BB配體；結(jié)合LFA-2(CD2)的配體，如CD15、CD48、CD58或CD59；結(jié)合CD5的配體，如CD72；或結(jié)合LFA-3(CD58)的配體，如CD2。16.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是結(jié)合LFA-1、CD18、Cd11b、Cd11c、Cd11d和CD43的抗體或抗體片段。17.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是結(jié)合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d和CD43的微生物蛋白。18.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞。19.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述靶細(xì)胞是CD34+、CD33+、CD14+或表達(dá)結(jié)合素1的細(xì)胞。20.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述靶細(xì)胞是T細(xì)胞。21.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述靶細(xì)胞是淋巴結(jié)生發(fā)中心的B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。22.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其特征在于，所述靶細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。23.一種制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞的方法，所述方法包括向細(xì)胞中導(dǎo)入能夠在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝和/或復(fù)制所需的病毒基因產(chǎn)物的核酸分子，和至少一種核酸分子，其能夠在所述包裝細(xì)胞中表達(dá)與靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子結(jié)合的至少一種膜相關(guān)性非病毒配體。24.一種包裝病毒載體的方法，所述方法包括將編碼或包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的第二核酸分子導(dǎo)入如權(quán)利要求1或2或4或5所述的重組細(xì)胞中，和在所述細(xì)胞將所述載體包裝成顆粒的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述顆粒包含與靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子結(jié)合的所述膜相關(guān)性非病毒配體。25.如權(quán)利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述病毒基因產(chǎn)物結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子并任選地發(fā)揮作用以介導(dǎo)含有所述病毒配體的細(xì)胞膜與所述靶細(xì)胞融合。26.如權(quán)利要求23或24或25所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)、造血譜系細(xì)胞、干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。27.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體是i)共刺激分子，當(dāng)T細(xì)胞的CD3/TCR復(fù)合物被天然或人工配體或特異性抗體結(jié)合時(shí)，所述共刺激分子結(jié)合所述T細(xì)胞表面分子以活化T細(xì)胞增殖，和/或ii)通過結(jié)合于所述細(xì)胞表面分子而在細(xì)胞-細(xì)胞粘著中起作用的分子。28.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體在結(jié)合于所述細(xì)胞表面分子后活化所述靶細(xì)胞使其增殖。29.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述至少一種膜相關(guān)性非病毒配體包括兩種所述配體。30.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是造血細(xì)胞的膜相關(guān)性非病毒配體。31.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是跨膜蛋白。32.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是CD28或CD28BP或CD40或CD62L或CD80(B7-1)或CD86(B7-2)或Fas配體(FasL)或CD70或LFA-3(CD58)或B7-H1(PD-L1)或B7-H2或B7-H3(B7RP-2)或B7-H4或CD2或CD3或CD3/TCR復(fù)合物或CD11a或CD26或CD27或CD28或CD30L或CD32或CD38或CD40L(CD154)或CD45或CD49或CD50(ICAM-3)或CD54(ICAM-1)或CD100或CD122或CD137L(4-1BB配體)或CD153或CTLA-4(CD152)或ICOS或OX40L(CD134)或PD-1或PD-L2(B7-DC)或SLAM(CD150)或TIM-1或TIM-2或TIM-3或TM-4或2B4(CD244)，或它們的組合。33.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述病毒基因產(chǎn)物是脊髓灰質(zhì)炎病毒受體CD155、野生型單純皰疹病毒(HSV)-1包膜蛋白、或其它病毒包膜蛋白。34.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是B7相關(guān)性分子，如B7-H1、B7-H2(也稱為ICOS-L、B7RP-1和GL50)、B7-H3，和B7-H4。35.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體結(jié)合LFA-1、或CD11a和CD18的復(fù)合物，如ICAM-1(CD54)、ICAM-2(CD102)、ICAM-3(CD50)、ICAM-4(LW)和ICAM-5(端腦特異性膜蛋白)。36.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是PD-1配體，如PD-L2或PD-L1；結(jié)合OX40(CD134)的OX40配體；結(jié)合4-1BB(CD137)的4-1BB配體；結(jié)合LFA-2(CD2)的配體，如CD15、CD48、CD58或CD59；結(jié)合CD5的配體，如CD72；或結(jié)合LFA-3(CD58)的配體，如CD2。37.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是結(jié)合LFA-1、CD18、Cd11b、Cd11c、Cd11d和CD43的抗體或抗體片段。38.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相關(guān)性非病毒配體是結(jié)合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d和CD43的微生物蛋白。39.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞。40.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是CD34+、CD33+、CD14+或表達(dá)結(jié)合素1的細(xì)胞。41.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是T細(xì)胞。42.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是淋巴結(jié)生發(fā)中心的B細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。43.如權(quán)利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。44.一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細(xì)胞，其包括內(nèi)源性表達(dá)能夠結(jié)合靶細(xì)胞或組織的細(xì)胞表面分子的至少一種膜相關(guān)性配體的細(xì)胞。45.如權(quán)利要求63所述的包裝細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞在體內(nèi)與所述靶細(xì)胞或組織相互作用。46.如權(quán)利要求64所述的包裝細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是骨髓基質(zhì)細(xì)胞，所述靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞。47.如權(quán)利要求63或64所述的包裝細(xì)胞，其特征在于，所述配體是整合蛋白，所述靶細(xì)胞是CD34+細(xì)胞。48.如權(quán)利要求66所述的包裝細(xì)胞，其特征在于，所述配體是SDF-1VLA-4、VLA-5或LFA-1，所述造血干細(xì)胞是CD34+和CD38-/CXCR4+，或CD34+和CD381o/CXCR4+。49.如權(quán)利要求63所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，其特點(diǎn)為包含能夠表達(dá)病毒配體的異源核酸分子，所述病毒配體結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面分子并任選地發(fā)揮作用以介導(dǎo)含有所述病毒配體的細(xì)胞膜與所述靶細(xì)胞融合。全文摘要本發(fā)明涉及一種增加靶細(xì)胞中載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。本發(fā)明提供一種重組工程化的包裝細(xì)胞系，其能夠表達(dá)一種或多種有助于結(jié)合到靶細(xì)胞和靶細(xì)胞活化的膜蛋白。本發(fā)明還提供重組工程化的細(xì)胞，其內(nèi)源性將一種或多種此類膜蛋白表達(dá)入包裝細(xì)胞系。通過使用此類細(xì)胞系而包裝入病毒顆粒中的載體將包含含有這些蛋白的外包膜。這些顆粒將特異性適用于結(jié)合和靶向靶細(xì)胞以促進(jìn)該靶細(xì)胞被所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。靶細(xì)胞也可在不存在外源補(bǔ)充的刺激分子的情況下同時(shí)被包裝的載體活化(刺激)。文檔編號C12N5/10GK101072880SQ200580022623公開日2007年11月14日申請日期2005年6月30日優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日發(fā)明者L·休繆,V·斯德普西金,B·帕什克特,倪亞瑾申請人:VIRxSYS股份有限公司