專利名稱：：非胚胎干細胞分化成具有胰腺表型的細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及非胚胎多能干細胞領(lǐng)域，具體地涉及非胚胎多能干細胞提供胰腺細胞的用途以及產(chǎn)生和使用它們的方法。
背景技術(shù)：
：胰腺是一個位于腹腔的左上側(cè)背面的狹長錐形器官。從解剖學(xué)上描迷，它包含三個主要部分，包括一個頭部(位于十二指腸附近的最寬的末端)、一個主體和一個尾部(位于脾臟附近的細端)。這個器官包含兩種主要的組織類型外分泌組織——包括腺泡細胞和導(dǎo)管細胞；以及內(nèi)分泌組織——包括產(chǎn)生送遞到血流中的激素(即胰烏素)的細胞。所述胰腺外分泌部分構(gòu)成大約95%的胰腺質(zhì)量，它為一種包含雉狀分泌細胞蔟(被稱為腺泡)的泡腺，所述錐狀分泌細胞產(chǎn)生消化酶(即淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶、彈性蛋白酶和各種其他蛋白質(zhì))。通過由立方導(dǎo)管細胞構(gòu)成的導(dǎo)管將這些酶送遞到消化系統(tǒng)，立方導(dǎo)管細胞還因消化目的而產(chǎn)生碳酸氫鹽。位于分泌腺泡和管狀導(dǎo)管之間的是被稱為泡心細胞的連接細胞成分。所述內(nèi)分泌胰腺部分僅構(gòu)成大約1-2%的胰腺質(zhì)量，包含被稱為朗格漢斯胰島(胰島細胞負責通過分泌胰島素維持血糖水平)的激素產(chǎn)生細胞簇。這些簇由至少七種細胞類型組成，包括但不限于產(chǎn)生胰島的p細胞、產(chǎn)生胰高血糖素的a細胞、產(chǎn)生促生長素抑制素的S細胞和產(chǎn)生胰多肽的PP細胞(Edlund，H.，2002)。另外，最近描述了一種4皮稱為￡-細胞的內(nèi)分泌細胞的亞群(1^1161"，化8.，6131.，2005)。這些細胞的發(fā)現(xiàn)是基于它們產(chǎn)生生長素釋放肽(ghrelin)，生長素釋放肽是一種已知由消化道的腸內(nèi)分泌細胞分泌的食欲刺激肽。內(nèi)分泌胰腺和B細胞分化的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)內(nèi)胚層特化、前腸和中腸內(nèi)胚層特化和隨后的胰特化通過補充轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控(圖1)。具體地說，小鼠中初始內(nèi)胚層的特化涉及Soxl7(Kanai-Azuma，M.etal.，2002)以及Gata-5和Gata-6(Weber,H.etal"2000;Bossard，P.和Zaret，K.S.1998)和Mixer/Mix.3(Henry，G.L.和Melton,D.A.1998)的表達。其次，預(yù)期的前腸和中腸內(nèi)胚層發(fā)育需要肝細胞核因子Hnf3p/Foxa2(Ang,S丄.，eta1.，1993)。接著，其他轉(zhuǎn)錄因子使所述前腸和中腸內(nèi)胚層定向到肝內(nèi)胚層、甲狀腺內(nèi)胚層、肺內(nèi)胚層、胃內(nèi)胚層、十二指腸內(nèi)胚層和胰內(nèi)胚層。在小鼠中，胰部分地是來自腹側(cè)和背側(cè)前腸內(nèi)胚層，腹側(cè)和背側(cè)前腸內(nèi)胚層隨后融合形成成熟器官。胰腺定向與轉(zhuǎn)錄因子Hlxb9和Pdx-l表達有關(guān)。Hlxb9(Hentsch，B.etal"1996)或Pdx-l(Offield，M.F.etal"1996)的缺失會分別導(dǎo)致背胰或整個胰發(fā)育不全，盡管在Pdx-l缺陷的胚胎中可以檢測到背胰芽。在Hkb9缺陷型胚胎中，腹胰的形成相對正常，然而背胰特化有缺陷。這些表型說明，背胰和腹胰的初始特化之間是不同的。因為不管去除兩個轉(zhuǎn)錄因子的哪一個都會形成胰芽，所以在Hlxb9或Pdx-l表達之前可能存在胰定向的其他信號。進一步的外分泌胰腺定向和內(nèi)分泌胰腺定向分別與Ptfla/p48(Ahlgren，U.etal.，1998)和Ngn3(Gradwohl，Getal.，2000)的表達有關(guān)。眾所周知地，在更早期即在腹胰芽的特化過程中也似乎需要Ptfla/p48，(Kawaguchi，Y.etal.，2002)。胰腺內(nèi)胚層特化需要Pdx-l，與之類似，胰腺內(nèi)胚層特化成內(nèi)分泌譜系需要Ngn3,并且內(nèi)分泌細胞被認為衍生自Ngn3表達細胞。Ngn3也在中柩神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中表達，并且將這個轉(zhuǎn)錄因子缺失不僅影響內(nèi)分泌胰腺的發(fā)育，而且還影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。體內(nèi)進一步的(3-細胞定向與Pax4(Sosa-Pineda,B.etal，.1997)、Pax6(Sander,M.etal"1997)、Nkx2.2(Sussel，L.etal"1998;人mRNA序列的登記號NMJ)02509)和Nkx6.1(Sander,M.etal.，2000)的表達相關(guān)。內(nèi)分泌胰腺和B-細胞分化中的細胞外信號在發(fā)育過程中，內(nèi)胚層的特化需要多種因子的聯(lián)合作用，所述因子包括TGF卩和Wnt家族的成員。Wnt3在原條和發(fā)育中的中胚層中表達，并且Wnt3缺失型小鼠不形成中胚層或內(nèi)胚層(Liu，P.etal.，1999)。Nodal在上胚層和原條的前區(qū)表達(Zhou,X.etal.，1993)，并且與Wnt3缺失型胚胎類似，Nodal缺失型胚胎也不能形成中胚層和內(nèi)胚層。通過非洲蟾蜍的動物帽分析(animalcapassay)也顯示出TGF家族的另一個成員激活素A(activin-A)可以以一種劑量依賴的方式"^秀導(dǎo)中胚層和內(nèi)胚層兩者的特化，高濃度的激活素A誘導(dǎo)背側(cè)中胚層和內(nèi)胚層，低濃度誘導(dǎo)腹側(cè)中胚層(McDowell,N.etal.，1997)。接著的胰定向和內(nèi)分泌胰腺定向也由TGF卩和Wnt家族的成員以及FGF和猬因子(hedgehog)家族成員調(diào)控。初始內(nèi)胚層特化需要Wnt3等信號，但與初始內(nèi)胚層特化相比，Wnt家族因子可能會抑制胰腺內(nèi)胚層的特化。事實上，受Pdx-l啟動子調(diào)控的Wntl或Wnt5a的表達可以9改變前腸區(qū)，現(xiàn)在的前腸區(qū)類似于胃的后部伸展部分而不是正常地包含臨近的十二指腸，并且伴隨著胰腺的縮小或完全發(fā)育不全。與這個觀察結(jié)果一致，可以在小鼠胚胎胰腺中到檢測幾種Wnt信號傳導(dǎo)抑制因子，包括sFRP-l、-2、-3和-4以及Dkk(Heller,R.S.etal.，2002)。來自腹前腸內(nèi)胚層以及背前腸內(nèi)胚層的胰腺定向被音猬因子(sonichedgehog,SHH)(Hebrok,M.etal"2000)抑制。通過消除SHH受體Patched(Ptc)可以導(dǎo)致更廣泛地分化成胰腺上皮。來自脊索的激活素A(Maldonado，T.S.etal.，2000)和/或FGF2(Hardikar，A.A.etal，.2003)信號被認為在前胰內(nèi)胚層中起到抑制SHH表達的作用。在腹腸內(nèi)胚層中，與肝的特化相比，胰的特化至少部分地由臨近的心臟中胚層產(chǎn)生的FGF2決定(Jung,J.etal.，1999),FGF2可抑制胰的特化，但低劑量的FGF2對于胰從背前腸內(nèi)胚層進行分化可能仍很重要(Hardikar，A.A.etal"2003)。另夕卜，胰的特化和分化受到Notch信號傳導(dǎo)的調(diào)控(Jensen,J.etal,2000)。去除Notch通路的組成成分(例如DH-1或Hes-1)可以導(dǎo)致加速分化成胰上皮。與胰腺外分泌部分的分化不同，胰腺內(nèi)分泌部分的分化受內(nèi)胚層-中胚層相互作用的調(diào)節(jié)(Gittes，GK.etal.,1996)，并由細胞-細胞外基質(zhì)(ECM)相互作用和生長因子BMP家族的成員(包括激活素和TGFP)部分地介導(dǎo)。內(nèi)胚層-中胚層相互作用在胰腺內(nèi)分泌部分的分化中有雙重功能。這些相互作用對于在E9.5和10.5之間用于誘導(dǎo)胰腺定向很關(guān)鍵，而胰腺定向的內(nèi)胚層和層粘連蛋白(由間充質(zhì)產(chǎn)生)之間的相互作用接著會引導(dǎo)分化成一種外分泌表型(Sanvito，F(xiàn).etal.,1994)。另外，由間充質(zhì)產(chǎn)生的TGFp成員(例如BMP2)可以阻止內(nèi)分泌特化，同時在體內(nèi)有助于胰腺外分泌部分的分化。間充質(zhì)細胞產(chǎn)生的FGF(例如FGF10)也發(fā)揮作用。FGF10似乎在Pdx-l+胰祖細胞的增殖中發(fā)揮作用(Bhushan,A.etal"2001)。糖尿病糖尿病是一種以可變且持續(xù)的高血糖水平(高血糖癥)為特征的醫(yī)學(xué)病癥。糖尿病是一種嚴重的破壞性疾病，它在工業(yè)化國家和發(fā)展中國家都達到流行性疾病的程度。在1985年，全世界有大約三千萬人患有糖尿病，在1995年增加了一億三千五百萬，并且預(yù)計到2050年將再增加約50%。糖尿病在美國是第五大死亡原因。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(AmericanDiabetesAssociation)，在2002年，美國在糖尿病方面的花費是1320億美元，包括920億美元的直接花費。預(yù)計這個數(shù)字到2020年會超過1卯0億美元。通常，糖尿病可以細分成兩種不同類型l型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病的特征是循環(huán)的胰島素很少或沒有，并且在兒童或早期青少年中最為常見。它是由胰島的產(chǎn)生胰島素的P-細胞的破壞引起的。為了生存，1型糖尿病的病人必須每天進行多次胰島素注射，并且每天多次檢測他們的血糖水平。然而，每天多次的胰島素注射并不能足夠地模擬人體中每一分鐘的胰島素的產(chǎn)生和葡萄糖代謝的精確控制。血糖水平經(jīng)常高于正常值會引起并發(fā)癥，包括失明、腎衰竭、非愈合外周血管潰瘍、過早形成心臟病或中風、壞疽和截肢、神經(jīng)損害、陽萎，并且它會減少患者的整個預(yù)期壽命10年至20年。2型糖尿病通常在中年或者中年之后出現(xiàn)，并且特別容易影響那些體重超重的人。在2型糖尿病中，在正常情況下需要胰島素的體細胞失去其敏感性，并且不能正常地對胰島素產(chǎn)生應(yīng)答。這種胰島素抗性在許多年內(nèi)可以通過胰腺P-細胞產(chǎn)生過量的胰島素克服。然而，P-細胞最終會逐漸地被耗盡，因為為了升高的血糖水平它們不得不產(chǎn)生大大過量的胰島素。最終，過度工作的P-細胞會死亡并且停止分泌胰島素，從而引起血糖同時升高到足夠高的水平以至于只能靠外源地注射胰島素控制。高血壓和異常的膽固醇水平通常伴隨著2型糖尿病。這些病癥與高血糖一起會增加心臟病發(fā)作、中風和導(dǎo)致截肢的腿部的循環(huán)系統(tǒng)阻塞的風險。還存在第三種類型的糖尿病，這種糖尿病是由遺傳缺陷引起，所述遺傳缺陷例如青春晚期糖尿病(MODY)。MODY是由于胰島素產(chǎn)生細胞中的一種遺傳缺陷導(dǎo)致的，這種遺傳缺陷限制了所迷細胞處理通過一種特殊的葡萄糖受體進入該細胞的葡萄糖的能力。MODY患者中的p-細胞不能與葡萄糖正確應(yīng)答產(chǎn)生胰島素，從而導(dǎo)致高血糖并且需要治療，并且所述治療最終也需要胰島素注射?，F(xiàn)有的對于胰島素依賴的糖尿病的醫(yī)學(xué)治療局限于胰島素給藥、胰腺移植(或者是整個胰腺或者是部分胰腺)和胰島移植。胰島素治療遠比胰腺移植和胰島移植更為普遍。然而，對血糖的控制并不簡單。雖然需要嚴格地注意保持健康的飲食、運動療法和始終注射適當量的胰島素，但是其他因素也可以不利地影響病人的血糖控制，所述因素包括應(yīng)激、激素變化、年齡階段、疾病或感染和疲勞。糖尿病的病人必須時刻注意威脅生命的血糖過低的(低血糖)和血糖過高的(高血糖)反應(yīng)。與胰島素給藥相比，全胰腺移植或部分胰腺的移植被認為可以治愈患者的糖尿病。然而，由于需要終生的免疫抑制治療，通常僅僅當需要腎移植的時候才進行移植，這使得單純的胰腺移植的手術(shù)相對稀少。雖S至不再需i進行胰島素注射的水平，并且減少長期并發(fā)癥，但是^胰腺移植仍有許多缺點。最重要地，進行胰腺移植涉及一項大手術(shù)，并且需要終生使用免疫抑制藥來預(yù)防身體免疫系統(tǒng)對作為異源移植物的胰腺的破壞。如果沒有這些藥物，所述胰腺在數(shù)天內(nèi)就會被破壞。而服用這些免疫抑制藥物的危險是增加感染和腫瘤的發(fā)病率，二者都會危及生命。與全胰腺移植相比，胰島移植是更筒單并且更安全的方法，并且通過P-細胞的替代可以獲得相同的效果。然而，缺乏用于移植的胰島細胞仍然是胰島細胞移植中一個未解決的問題。因為胰島僅僅占整個胰腺的大約2%,從將它們與不產(chǎn)生胰島的胰腺的其余部分分離開需要花費大約6個小時。和以前需要5-6個器官進行一次移植相比，雖然已經(jīng)有自動分離的方法使得可以從一個胰腺中分離出足夠的胰島用于一名患者的移植，但是對胰島的需求仍然超過現(xiàn)在可以從尸體中獲得器官的供應(yīng)量。另外，經(jīng)常無法實現(xiàn)對糖尿病癥狀的長效解決。作為胰島素注射的替代，胰腺移植和胰島移植可能會滿足巨大的公共健康的需求。千細胞胚胎干(ES)細胞具有無限自我更新的能力，且可以分化成為所有的組織類型。ES細胞來自植入后胚胎的胚泡或原始生殖細胞的內(nèi)細胞群(胚胎生殖細胞或EG細胞)。ES(和EG)可以通過抗SSEA1(小鼠)抗體和抗SSEA4(人)抗體的陽性染色來識別。在分子水平上，ES和EG細胞表達這些未分化細胞特有的轉(zhuǎn)錄因子。這些轉(zhuǎn)錄因子包括Oct-4和rex-l。Rex的表達依賴于Oct-4。還發(fā)現(xiàn)了LIF-R(小鼠中)和轉(zhuǎn)錄因子sox-2和rox-l。Rox-1和sox-2也在非ES細胞中表達。ES細胞的另一個標志為存在端粒酶，它為這些細胞提供了在體外無限自我更新的潛力。從可長期擴增的千細胞群中產(chǎn)生功能性胰島細胞的能力將會提供用于糖尿病患者移植的P-細胞源。被考慮使用的一種這類的群是胚胎干(ES)細胞。當在體外使胚胎干細胞形成胚胎體的時候，可以在內(nèi)胚層的細胞類型中檢測到少量具有p-細胞特征的細胞。最近的研究已經(jīng)證明小鼠和人ES細胞可以相對特定地分化為肝內(nèi)胚層或胰腺內(nèi)胚層。使用高濃度的激活素處理可以使ES細胞特化為內(nèi)胚層(Kubo,A.etal.，2004)。大量的研究已表明，使用多種不同的策略，可以從ES細胞獲得胰島素陽性的細胞(Lumdsky，N.etal.，2001;Hori，Y.etal.，2002;Soria，B.etal.，2000;Kahan，B.W.etal.，2003)。然而，這些研究中有一些并沒有說明所檢測到的胰島素是胰島素-1還是胰島素-2,胰島素-2還存在于在神經(jīng)細胞和胚外內(nèi)胚層中(SipioneS.，etal.，2004)。另一個復(fù)雜的情況是大部分的研究將ES細胞培養(yǎng)在含有胰島素的培養(yǎng)基中，并且?guī)讉€研究組已經(jīng)證明細胞可以從這種培養(yǎng)基中吸收胰島素(VacaP.etal.,2005;RajagopalJ.etal.，2003;HanssonM.etal.，2004)。另外一個問題，也是ES細胞衍生的p-樣細胞在臨床應(yīng)用中必須克服的問題是未分化的ES細胞——即使是少量存在時——形成畸胎瘤的能力(Bjorkhmdetal.，2002)。因為糖尿病在全世界達到了一種流行的狀態(tài)，所以很明顯需要新的和治愈性的療法。盡管出現(xiàn)了作為1型糖尿病的潛在治療方法的胰島移植，但是供體胰腺的缺乏已經(jīng)成為一個限制因素。因此，需要一種豐富的、適合臨床的細胞源用作胰島素注射、胰腺移植和胰島移植的替代療法。"多能成體祖細胞"(MAPC)是可以分化成一種或多種外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型的非胚胎(非ES)、非生殖且非胚胎生殖(非EG)細胞。MAPC呈端粒酶陽性、Oct-3A(Oct-3/4)陽性或它們的組合陽性。端粒酶或Oct-3/4已經(jīng)被認為是在未分化狀態(tài)下的初始產(chǎn)物的基因。端粒酶是無復(fù)制性衰老情況的自我更新所需。來自人、小鼠、大鼠或其他哺乳動物的MAPC似乎是唯一迄今為止已知甚至在晚期傳代細胞中表達端粒酶活性的正常非惡性體細胞(即非生殖細胞)。在MAPC中的端粒的長度不會持續(xù)地縮短。MAPC在核型上是正常的。MAPC也可以表達SSEA-4和imiiog。所述Oct-4基因(在人類中為Oct-3)在人體中可#1轉(zhuǎn)錄為至少兩個剪接變體即Oct3A和Oct3B。Oct3B剪接變體存在于^午多分化細胞中，而有報道稱Oct3A剪接變體(以前也稱為Oct3/4)是未分化的胚胎干細胞特有的(Shimozakietal.2003)。Oct-4(在人類中為Oct-3)為原腸胚形成前期胚胎、卵裂早期胚胎、胚泡內(nèi)細胞群細胞和胚胎癌(EC)細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子(NicholsJ.，etal1998)，并且當細胞被誘導(dǎo)分化時下調(diào)。Oct-4的表達在確定胚胎發(fā)生和分化的早期步驟方面起到重要作用。Oct-4與Rox-l—起引起鋅指蛋白Rex-l的轉(zhuǎn)錄激活，Oct-4還是維持ES的未分化狀態(tài)所需的(RosfjordandRizzinoA.1997;Ben-ShushanE，etal.1998)。此夕卜，也需要sox隱2與Oct-4—起維持EC/ES的未分化狀態(tài)，sox-2在ES/EC和其他更高分化的細胞中表達(UwanoghoDetal.1995)。鼠ES細胞和原始生殖細胞的維持需要LIF。MAPC具有體外和體內(nèi)再生所有的原胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的能力。MAPC在本文中等同于胚胎干細胞并且不同于間充質(zhì)干細胞，間質(zhì)干細胞也是從骨髓中分離的。已經(jīng)在各種動物模型(包括小鼠、大鼠和人干細胞對大鼠或NOD/SCID小鼠的異種移植)中中證明了MAPC的生物學(xué)潛能(Reyes,M.andCM.Verfaillie2001;Jiang,Y.etal.2002)。已經(jīng)證明了這種細胞群的克隆潛能。將單遺傳標記的MAPC注射到小鼠的胚泡(植入的胚泡)中并且胚胎發(fā)育至足孕(Jiang，Y.etal.2002)。對出生后的嵌合體動物的分析顯示出所有組織和器官(包括肝臟)發(fā)生重建。雙染色實驗證明，基因標記的MAPC促4吏在這些動物中產(chǎn)生顯著比例的明顯功能性心肌病。這些動物在胚胎階段或者在成體階段都沒有表現(xiàn)出任何的心臟異常或不規(guī)律。在所有這些動物中都沒有觀察到異常和器官功能障礙。MAPC能夠進行擴大培養(yǎng)且不會失去分化潛能，并且在NOD-SCID小鼠中顯示出能有效、長期移植并分化為多重發(fā)育譜系，并且沒有形成畸胎瘤的跡象(Reyes,M.andCM.Verfaillie2001)。其中包括內(nèi)皮譜系分化(Verfaillie,2002;Jahagirdar，etal.2001)。
發(fā)明內(nèi)容一個實施方案給出了通過可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞，提供胰島素表達細胞及其祖細胞的組合物和方法。例如，當可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞接觸激活素A和一種SHH抑制因子的時候，會產(chǎn)生Pdx-l表達升高的細胞。當這些Pdx-l表達升高的細胞接觸EGF或HGF(或者兩者同時)的時候，會產(chǎn)生Ngn3表達升高的細胞。當這些Ngn3表達升高的細胞接觸煙酰胺、exendin或者這兩者的時候，會產(chǎn)生胰島素表達升高的細胞。因此，本發(fā)明涉及如下的組合物和方法。一個實施方案提供一種組合物，所述組合物包含一種笫一試劑、一種第二試劑和可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎千、非生殖、非胚胎生殖細胞，其中所述第一試劑是激活素A，其中所述第二試劑抑制音猬因子。所述組合物也可以包含BMP4。另一個實施方案提供一種組合物，所述組合物包含EGF或HGF和Pdx-l表達升高的細胞，其中所述的Pdx-l表達升高的細胞的制備是通過將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的、非胚胎千、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑、一種第二試劑和——任選地——BMP4相接觸以產(chǎn)生Pdx-l表達升高的細胞來實現(xiàn)的，其中所述第一試劑是激活素A，其中所述第二試劑抑制音猬因子(SHH)活性。另一個實施方案提供一種組合物，所述組合物包含煙酰胺或exendin4這兩者中的一種或這兩者和Ngn3表達升高的細胞，其中Ngn3表達升高的細胞的制備通過以下方法實現(xiàn)a)將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑、一種第二試劑；和——任選地——BMP4相接觸以產(chǎn)生Pdx-l表達升高的細胞，其中所述第一試劑是激活素A,其中所述第二試劑抑制音猬因子(SHH)活性；并b)將所述的Pdx-l表達升高的細胞與EGF或HGF接觸以產(chǎn)生Ngn3表達升高的細胞。在一個實施方案中，所述組合物進一步包含GDF11或p-細胞素(betacellulin)這兩者中的一種或這兩者。另一個實施方案提供一種組合物，所述組合物包含細胞培養(yǎng)基或一種可藥用的載體和表達胰島素或者胰島素表達升高的細胞，所述細胞的制備是通過以下方法實現(xiàn)的a)將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑、一種第二試劑和——任選地——BMP4相接觸以產(chǎn)生Pdx-l表達升高的細胞，其中所述第一試劑是激活素A，其中所述第二試劑抑制音猬因子(SHH)活性，b)將所述的Pdx-l表達升高的細胞與EGF或HGF接觸以產(chǎn)生Ngn3表達升高的細胞，并c)將Ngn3表達升高的細胞與煙酰胺或exendin4這兩者中的一種或這兩者相接觸以產(chǎn)生表達胰島素的細胞。在一個實施方案中，將所述的Ngn3表達升高的細胞與GDF11或(5-細胞素的一種或多種相接觸。在一個實施方案中，所述組合物包含細胞培養(yǎng)基或可藥用的載體(例如一種可藥用的介質(zhì))。例如，一個實施方案提供了一種包含Pdx-l表達升高或Ngn3表達升高的細胞和細胞培養(yǎng)基或一種可藥用的載體(例如一種可藥用的介質(zhì))。在一個實施方案中，所迷第二試劑是環(huán)王巴明(cyclopamine)或一種抗SHH抗體。一個實施方案提供了一種方法，所述方法包含將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎千、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑和一種第二試劑相接觸以產(chǎn)生Pdx-l表達升高的細胞，其中所述笫一試劑是激活素A，其中所述第二試劑抑制音猬因子(SHH)活性。在一個實施方案中，所述的非胚胎千、非生殖、非胚胎生殖細胞還與BMP4相接觸。在一個實施方案中，將Pdx-l表達升高的細胞與EGF或HGF接觸以產(chǎn)生Ngn3表達升高的細胞。在另一個實施方案中，Ngn3表達升高的細胞中的NeuroD表達也升高。在一個實施方案中，將Ngn3表達升高的細胞與煙酰胺或exendin4這兩者的一種或這兩者相接觸以產(chǎn)生表達胰島素的細胞。在一個實施方案中，所述胰島素表達量升高且超過所述表達Ngn3的細胞的表達量。在一個實施方案中，將所述Ngn3表達升高的細胞與GDF11或p-細胞素這兩者中的一種或這兩者相接觸。一個實施方案提供了將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞分化的方法，所述方法包含以下步驟a)將所述的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑相接觸，其中所述第一試劑是激活素'A(持續(xù)大約1天至大約9天或更長，包括大約3天或大約6天)；b)將步驟a)中獲得的細胞與激活素A和一種第二試劑相接觸，其中所述笫二試劑抑制音猬因子活性(持續(xù)大約1天至大約9天或更長，包括大約3天或大約6天)；c)將步驟b)中獲得的細胞與EGF或HGF相接觸(持續(xù)大約1天至大約9天或更長，包括大約6天)；和d)將步驟c)中獲得的細胞與煙酰胺或exendin4這兩者中的一種或這兩者相接觸(持續(xù)大約1天至大約9天或更長，包括大約6天)以產(chǎn)生表達胰島素的細胞。在一個實施方案中，步驟a)、步驟b)或者兩者進一步包含將所述細胞與BMP4相接觸。在另一個實施方案中，步驟d)進一步包含將所述細胞與GDF11或(3-細胞素這兩者中的一種或這兩者相接觸。在一個實施方案中，所述第二試劑是環(huán)王巴明或一種抗SHH抗體。在一個實施方案中，在體外(例如在培養(yǎng)中)進行所述接觸。在一個實施方案中，所述接觸是順序的。在一個實施方案中，所述接觸同時發(fā)生。在一個實施方案中，所述的表達胰島素或者胰島素表達升高的細胞分泌胰島素(例如胰島素-l)、C肽或者它們的組合。在一個實施方案中，所述的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞是哺乳動物細胞(例如人細胞)。在另一個實施方案中，用一種胰腺轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)所述的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞(或者它們分化的后代)。在一個實施方案中，所述胰腺轉(zhuǎn)錄因子包括Ngn3、NeuroD、Pdx-l、Pax4、Ptfla/p48、Pax6、Nkx6.1、Nkx2.2或它們的組合。在另一個實施方案中，所述胰腺轉(zhuǎn)錄因子包括Pdx-l、Ngn3或它們的組合。一個實施方案提供一種為有需要的受試者提供胰腺細胞的方法，所述方法包含a)將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑和一種第二試劑相接觸以產(chǎn)生Pdx-l表達升高的細胞，其中所述第一試劑是激活素A，其中所述第二試劑抑制音猬因子(SHH)活性；并b)將所述Pdx-l表達升高的細胞給予所述受試者，以為之提供胰腺細胞。在一個實施方案中，所述的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞還與BMP4相接觸。在另一個實施方案中，在給予所述受試者之前，將所述的Pdx-l表達升高的細胞與EGF或HGF接觸以產(chǎn)生Ngn3表達升高的細胞。在另一個實施方案中，在給予所述受試者之前，將所述的Ngn3表達升高的細胞與煙酰胺或exendin4這兩者中的一種或這兩者相接觸以產(chǎn)生表達胰島素或胰島素表達升高的細胞。在一個實施方案中，將所述的Ngn3表達升高的細胞與GDF11或p-細胞素這兩者中的一種或這兩者相另一個實施方案提供一種為有需要的受試者提供胰島素表達細胞的方法，所述方法包含a)將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑相接觸，其中所述第一試劑是激活素A;b)將步驟a)中獲得的細胞與激活素A和一種第二試劑相接觸，其中所述第二試劑抑制音猬因子活性；c)將步驟b)中獲得的細胞與EGF或HGF相接觸；d)將步驟c)中獲得的細胞與煙酰胺或exendin4這兩者中的一種或兩種相接觸以產(chǎn)生表達胰島素或胰島素表達升高的細胞；并e)將所述表達胰島素或胰島素表達升高的細胞給予所述受試者。在一個實施方案中，步驟a)、步驟b)或者兩者進一步包含將所述細胞與BMP4相接觸。在另一個實施方案中，步驟d)進一步包含GDFll和p-細胞素這兩者中的一種或兩種。在一個實施方案中，所述受試者為哺乳動物(例如人)。在另一個實施方案中，所述受試者具有一種胰腺的病癥或損傷。在一個實施方案中，所述病癥包括糖尿病、肥胖癥、胰腺閉鎖、胰腺炎癥、al-抗胰蛋白酶缺乏癥、遺傳性胰腺炎、胰腺癌、胰酶缺乏癥或高胰島素血癥。在一個實施方案中，所述糖尿病是I型或者II型糖尿病。在另一個實施方案中，所述損傷由物理創(chuàng)傷、化學(xué)品、輻射、衰老、疾病或它們的組合引起。一個實施方案提供了本文公開的方法制備的細胞在制備一種治療胰腺病癥或損傷的藥劑中的用途。在一個實施方案中，所述藥劑進一步包含一種生理上可接受的載體或細胞培養(yǎng)基。圖1示出了通過補充特定的轉(zhuǎn)錄因子對內(nèi)胚層特化、前腸和中腸內(nèi)胚層特化和隨后的胰腺特化的調(diào)節(jié)。圖2示出了低02小鼠的MAPC的表型。在5%的02條件下獲取并培養(yǎng)mMAPC。(A)某些克隆表達的Oct-4mRNA水平是胚胎干細胞表達的5-40%(比在正常含氧量(20%02)條件下分離的MAPC的水平高>1，000倍)。(B)這被Oct-4蛋白的FACS和Oct-4的細胞內(nèi)染色證實。與ES細胞相比，MAPC可表達ES水平的Oct-4、Rex-l、Fbxl5、FoxD3、Egsl、Dnmt31和Ecat7，但是不表達該水平的Nanog、Sox-2、Fgf4、Utfl、Eras、Ecatl和GDF3。低02獲得的小鼠MAPC為Scal、Thyl、CD34、CD31、I類和II類MHC、CD44陰性，但是為cKit陽性。雖然小鼠MAPC表達與ESC相似水平的Oct-4mRNA，但是它們并不形成胚胎體或者畸胎瘤(5只棵鼠的皮膚下植入5x106個MAPC)。當在正常氧含量的條件下分離MAPC然后轉(zhuǎn)移至5%的02條件下的時候，沒有觀察到轉(zhuǎn)錄表型或細胞表面表型的變化，這說明低02條件下分離選出的是更原始的細胞群，并且所述表型在體外是不能誘導(dǎo)的。圖3A示出了一個胰腺分化的方案。3B和3C示出了MAPC向胰腺方向分化中應(yīng)用的各種因子，以及在所述分化過程中可能表達的各種轉(zhuǎn)錄因子。圖4示出了MAPC-p-細胞分化培養(yǎng)物的形態(tài)學(xué)外觀。至第15天，在附著層可以看到大片上皮樣細胞斑，其周圍是"間質(zhì)"樣細胞。至第18天的時候，這些斑開始形成三維的、形態(tài)分明的簇，并最終出芽至培養(yǎng)上清液中(21天)。圖5示出了向內(nèi)分泌胰腺分化21天的大鼠MAPC的Q-RT-PCR評估結(jié)果。使用圖3A中描述的順序的方案，將大鼠MAPC接種于基質(zhì)膠上。每3天收集培養(yǎng)物(第18、21和24天的數(shù)據(jù)僅僅代表非附著的簇的數(shù)據(jù))，提取RNA，并且將通過Q-RT-PCR測定的轉(zhuǎn)錄因子和激素的水平與作為對照的GAPDH比較，并且除了Ngn-3、Nkx2.2和Neuro-Dl之外，與初始大鼠胰腺中檢測到的水平相比較，而對于Ngn-3、Nkx2.2和Neuro-Dl,與胎鼠RNA水平相比較。結(jié)果顯示為3次實驗的平均值+/-SEM。圖6示出了簇的免疫組織學(xué)。上圖在第15和21天收集的簇，用胰蛋白酶解離并且用抗Pdx-l、c肽和胰高血糖素抗體染色。下圖在第21天收集的簇，并且用抗Pdx-l和p-肌動蛋白的抗體進行蛋白質(zhì)印跡。在兩圖中均以RIN細胞作為對照。圖7示出了在體外對18mM葡萄糖進行應(yīng)答的c肽分泌。用3nM葡萄糖培養(yǎng)細胞，并且從第16-24天，每天向培養(yǎng)物中加入lh的18nM的葡萄糖的脈沖，之后收集上清液并且用ELISA檢測產(chǎn)生的c肽。圖8示出了在(3樣細胞簇上的功能性K和Ca通道。左側(cè)為一個細胞簇的圖像，在所述細胞簇中加入fura-2AM并且將其置于倒置熒光顯微鏡上進行視頻成像。右側(cè)的曲線顯示了圖像中圓圏標出的區(qū)域中的細胞內(nèi)鈣離子的濃度([Ca"L的變化，該變化通過fura-2比率反映。通過將細胞外K離子濃度升高至50mM(從3mM)誘導(dǎo)([Ca"i的升高，并且此升高被L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平(nifedipine)(50jiM)抑制。圖9示出了在SZO處理的棵鼠中移植可分化內(nèi)分泌胰腺的大鼠MAPC。Y軸表示血糖水平(mg/dl);x軸是以天表示的時間。圖10示出了通過MAPC進行的造血重建。六周齡的NOD-SCID小鼠在275cGy輻射之后接受1百萬的Tg-GFPMAPCIV，并且在抗去唾液酸GM1注射(第l、11、21天)的保護之下進行。在16周之后，處死所述動物。通過FACS分析PB、BM和脾造血細胞中是否存在供體細胞和它們的i普系分化。1/21的移植小鼠的代表性實例。圖U示出了GFPMAPC移植的NOD-SCID小鼠中的GFP+月夷島素+供體胰島。六周齡的NOD-SCID小鼠在275cGy輻射之后接受1百萬的Tg-GFPMAPCIV，并且在抗去唾液酸GM1注射(第1、11、21天)的保護之下進行。在12周之后，處死所述動物。70%的PB、BM和脾造血細胞是GFP+。也存在7%的GFFT細胞。聯(lián)合使用抗-GFP-抗體和抗胰島素抗體對所述動物的胰腺進行分析。顯示的是來自相同的胰腺的一個GFP+胰島和一個GFP-胰島。(2個相同動物之一的實例。)具體實施方式定義本文使用的以下術(shù)語定義為如下的含義"MAPC，，為"多能成體祖細胞，，的縮寫。在本文中它用來指能夠產(chǎn)生(分化成)超過一種胚細胞系細胞類型的一種非胚胎干(非ES)、非生殖、非胚胎生殖(非EG)細胞。分化后它可以立即形成至少兩個胚層(即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細胞鐠系。MAPC相關(guān)術(shù)語"成體"沒有嚴格限制。它指非胚胎體細胞。術(shù)語"多能"是指產(chǎn)生超過一種胚細胞系細胞類型的能力。MAPC相關(guān)術(shù)語"多能"沒有嚴格限制。MAPC能夠形成全部三種原始胚層的(即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)細胞譜系?？s寫"MAPC"中所用術(shù)語"祖"沒有將這些細胞限制為特定的細胞謙系。"擴增，，是指細胞的繁殖而不分化。"祖細胞"是在干細胞分化過程中產(chǎn)生的、具有其終末分化子代細胞的某些而非全部特征的細胞。定義的祖細胞(如"胰腺祖細胞")凈皮定向到一種細胞系，而不是定向到具體的或終末分化的細胞類型。"自我更新"是指生成復(fù)制子代細胞的能力，所述子代細胞具有與產(chǎn)生它們的細胞相同的分化潛力。本文中用到的一個相似的術(shù)語是"增殖"。一種標記物(如Pdx-l、Ngn3、NeuroD或胰島素l)的"升高的表達"指(mRNA和/或蛋白)高于親代細胞(在所述處理(如與激活素A相接觸)和/或多個處理之前的細胞)的每個細胞的平均水平(例如，如果所述親代細胞不表達一種標記物而所述子代表達，即為表達升高；或者如果所述子代比所述親代細胞表達的所述標記物更多，也是表達升高)。例如，一種標記物(如Pdx-l)的升高的表達可以是，與親代細胞相比(以每個細胞的平均水平為基礎(chǔ))，表達升高至最多大約1.01倍、大約1.015倍、大約1.02倍、大約1.025倍、大約1.03倍、大約1.035倍、大約1.04倍、大約1.045倍、大約1.05倍、大約1.055倍、大約1.06倍、大約1.065倍、大約1.07倍、大約1.075倍、大約1.08倍、大約1.85倍、大約1.9倍、大約1.95倍、大約2倍(如2x)、大約3倍、大約4倍、大約5倍、大約6倍、大約7倍、大約8倍、大約9倍、大約10倍、大約15倍、大約20倍、大約25倍、大約30倍、大約35倍、大約40倍、大約45倍、大約50倍、大約55倍、大約60倍、大約65倍、大約70倍、大約75倍、大約80倍、大約85倍、大約90倍、大約95倍、大約100倍、大約150倍、大約200倍、大約250倍、大約300倍、大約350倍、大約400倍、大約450倍、大約500倍、大約600倍、大約700倍、大約800倍、大約900倍、大約1,000倍、大約2,000倍、大約3,000倍、大約4,000倍、大約5,000倍、大約6,000倍、大約7,000倍、大約8,000倍、大約9,000倍、大約10,000倍、大約15,000倍、大約20,000倍、大約25,000倍、大約30,000倍、大約35,0000倍、大約40,000倍、大約50,000倍、大約60,000倍、大約65,000倍、大約70,000倍、大約75,000倍、大約80,000倍、大約85,000倍、大約卯，OOO倍、大約100,000倍或更大。一種試劑(如激活素A,—種抑制SHH、EGF、HGF、煙酰胺、exendin4、GDF11或j5-細胞素的試劑)的有效量是指，當單獨使用或者與一種或多種其他試劑聯(lián)合使用的時候，使所述的細胞有效分化的量。"移植，，或"植入"是指細胞與所研究的現(xiàn)有組織或位點相接觸并將其引入其中的過程。在一個實施方案中，超過約5%、超過約10%、超過約15%、超過約20%、超過約25%、超過約30%、超過約35%、超過約40%、超過約45%、超過約50%、超過約55%、超過約60%、超過約65%、超過約70%、超過約75%、超過約80%、超過約85%、超過約卯％、超過約95%或約100%的所給予的MAPC或其衍生的子代植入到胰臟或其他組織中。持續(xù)性是指細胞在體內(nèi)抵抗排異反應(yīng)并隨時間(例如日、周、月、年)保持或增加數(shù)量的能力。因此，通過持續(xù)，MAPC或子代能夠占據(jù)胰腺或其他組織，或者以例如屏障裝置或其他微嚢的形式在體內(nèi)維持。"免疫耐受"是指外源(例如同種異體或異種的)組織、器官或細胞在受體受試者體內(nèi)的存活(按數(shù)量和/或時間長度計算)。這種存活通常是對移植受體進行免疫應(yīng)答能力的抑制，否則所述的免疫應(yīng)答可能會因引入的外源細胞而發(fā)生。免疫耐受可包括以日、周、月或年為單位計算的持續(xù)性免疫抑制。NK介導(dǎo)的免疫耐受包含于免疫耐受的定義之中。該術(shù)語也包括移植物耐受所述宿主的情況。術(shù)語"分離的"是指不與一個或多個細胞或者一個或多個細胞組分相連接的一個或多個細胞，所述一個或多個細胞或者一個或多個細月包組分在體內(nèi)是與該細胞相連接的。"富集群"指相對于體內(nèi)或原代培養(yǎng)物中一種或多種其他細胞類型(例如非MAPC細胞類型)，所研究的細胞(例如MAPC)的數(shù)量的相對增加。"細胞因子"是指誘導(dǎo)或增強細胞運動的細胞的因子，所述細胞運動例如MAPC或其他干細胞、祖細胞或分化細胞的歸巢。細胞因子還可能刺激這類細胞分裂或分化。"受試者，，或細胞源可以是指脊稚動物，包括哺乳動物，例如人。哺乳動物包括但不限于人、家畜、體育動物和寵物。狗、貓、魚、沙土鼠、豚鼠、倉鼠、馬、兔、豬、小鼠、猴類(如猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩)大鼠、綿羊、山羊、牛和鳥均包括在所述術(shù)語"動物"中。本文所用的"處理"、"治療"或"療法"包括治療、逆轉(zhuǎn)、預(yù)防、改22善或抑制損傷或疾病相關(guān)病癥或者損傷或疾病相關(guān)病癥的癥狀。"有效量"通常是指能夠提供所需的效果的量。例如，有效劑量是足夠?qū)崿F(xiàn)有益或所需效果(包括臨床效果)的量?？梢苑忠淮位蚨啻谓o予所述劑量，并且可以包括任何預(yù)選量的細胞。關(guān)于有效劑量是多少的準確確定應(yīng)該基于每個受試者的個體因素，包括體型、年齡、所要治療的損傷或疾病和從損傷發(fā)生或疾病發(fā)作開始至今的時間。本領(lǐng)域的技術(shù)人員，特別是醫(yī)師，應(yīng)該能夠確定構(gòu)成有效劑量的細胞數(shù)量。劑量可以隨給藥方式而變化，所述給藥方式例如局部的或全身的、單獨的或裝入膠嚢的。所述效果可以是植入或其他臨床的邊界點，例如糖尿病的逆轉(zhuǎn)或治愈。其他效果可以包括提供P-細胞、補充內(nèi)源細胞、引起血管發(fā)生和/或提供胰腺祖細胞。"共同給藥"可以包括兩種或多種藥劑的依次、同時和/或分開給藥。為了在受試者體內(nèi)提供胰腺細胞，有幾種途徑是可行的。在一個實施方案中，可以給予MAPC并且使得它在體內(nèi)提供胰腺細胞。如本文所述，這可以通過MAPC自身分化或通過其他如內(nèi)源細胞募集的方法來實現(xiàn)?；蛘?，可以給予更加成熟的細胞，這些細胞是在離體條件下從MAPC分化得來的。這類細胞包括所有分化階段的子細胞，包括能夠產(chǎn)生成熟胰腺細胞類型的胰腺祖細胞，不能形成全部的這些類型的定向的祖細胞，和包括p-細胞在內(nèi)的進一步分化的類型。術(shù)語"包含"、"包括，，及類似的術(shù)語具有美國專利法中所述的含義且可表示"含"、"含有"及類似含義。本文所用到的"包含，，(including)或"包括"或類似術(shù)語意為包括但不限于。MAPCMAPC是可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型的非胚胎(非ES)、非生殖和非胚胎生殖(非EG)細胞。MAPC可以為端粒酶陽性。它們也可以為Oct-3A(Oct-3/4)陽性。在體內(nèi)，MAPC可以分化形成胰腺細胞，例如p-細胞?；蛘?，離體時，MAPC可以分化成具有胰腺表型的子代細胞?？梢詫APC或其分化的子細胞給予受試者。美國專利7,015,037(PCT/US00/21387(以WO01/11011公布))和序列號為10/467,963(PCT/US02/04652(以WO02/064748公布))的美國專利申請中描述了來自骨髓的人MAPC，它們關(guān)于MAPC的說明內(nèi)容通過引用的方式納入本說明書。已經(jīng)在其他哺乳動物體內(nèi)鑒定出MAPC。例如，美國專利7，015，037和序列號為10/467,963的美國專利申請中也描述了鼠MAPC，它們關(guān)于鼠MAPC的說明內(nèi)容通過引用的方式納入本說明書。10/467,963中也描述了大鼠MAPC,其關(guān)于大鼠MAPC的說明內(nèi)容通過引用的方式納入本說明書。專利申請PCT/US2005/038979中描述了豬MAPC,其關(guān)于豬MAPC的說明內(nèi)容通過引用的方式納入本說明書。Claveletal.(2005)中也描述了食蟹猴(cynomologousmonkey)MAPC，其關(guān)于食蟹猴MAPC的說明內(nèi)容通過引用的方式納入本i兌明書。分離和生長美國專利7,015,037(PCT/US00/21387(以WO01/11011公布))和序列號為10/467,963(PCT/US02/04652(以WO02/064748)公布)的美國專利申請描述了人和小鼠的MAPC分離方法，這些方法以及其中所公開的MAPC的鑒定都通過引用的方式納入本說明書。MAPC最初是從骨髓中分離的，但隨后從包括大腦和肌肉在內(nèi)的其他組織中得到確認(Jiang，Y.，etal.，2002)。因此，MAPC能夠從多個來源分離得到，所述來源包括但不限于骨髓、胎盤、臍帶和臍帶血、肌肉、大腦、肝、脊髓、血液或皮膚。例如，MAPC可以來自骨髄穿刺物，骨髓穿刺物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的標準方法獲得(例如，參見Muschler，G.F"etal"1997;Batinic，D.，etal"1990)。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員目前能夠獲得骨髓穿刺物、大腦或肝活檢物和其他器官，并且根據(jù)這些細胞中表達(或不表達)的基因，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得的陽性或陰性篩選技術(shù)來分離細胞(例如，通過功能或形態(tài)學(xué)測定法，如上述申請中公開的那些方法，對于它們教導(dǎo)的這些測定法，通過引用的方式將它們納入本說明書)。如U.S.7,015,037中所述的來自人骨髓的MAPC從骨髓穿刺物獲得骨髓單核細胞，骨髓穿刺物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得的標準方法獲得(例如，參見Muschler,G.F.etal.1997;Batinic，D.etal.1990)。多能成體干細胞存在于骨髓(或其它器官如肝或腦)中，但不表達白細胞共同抗原CD45或成紅血細胞特異的血型糖蛋白-A(Gly-A)。細胞的混合群經(jīng)過FicollHypaque分離處理。然后用抗-CD45和抗-Gly-A抗體對細胞進行陰性篩選，除去CD45+和Gly-A+細胞群，然后回收剩下的大約0.1%的骨髓單核細胞。也可將細胞接種于纖連蛋白包被的孔中，按如下所述培養(yǎng)2-4周以除去CD45+和Gly-A+細胞群?；蛘撸梢岳眉毎禺愋詷擞浀慕M合、通過陽性篩選來分離細胞。陰性和陽性篩選技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的，且適用于陰性篩選的許多單克隆和多克隆抗體也是本領(lǐng)域可以獲得的(例如參見LeukocyteTypingV，Schlossman，etal"Eds.(1995)OxfordUniversityPress)并可以通過商業(yè)途徑從許多來源購得。例如，Schwartz等人的美國專利5,759,793(磁性分離)、Baschetal.1983(免疫親和色譜法)和WysockiandSato1978(熒光激活的細胞分選)中也描述了從細胞群混合物分離哺乳動物細胞的技術(shù)。將回收的CD457GlyA-細胞接種于用約5-115ng/ml(可以使用約7-10ng/ml)血清纖連蛋白或其他適合的基質(zhì)包被物包被的培養(yǎng)皿上。用達爾伯克氏必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco，sMinimalEssentialMedium,DMEM)或其他適合的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，添加約l-50ng/ml(可以使用約5-15ng/ml)血小板源生長因子-BB(PDGF-BB)、約l-50ng/ml(可以使用約5-15ng/ml)表皮生長因子(EGF)、約l-50ng/ml(可以使用約5-15ng/ml)胰島素樣生長因子(IGF)或約100-10,000IU(可以使用約1,000IU)LIF，添加約10-1()至10-8M地塞米+>或其他適合的類固醇，約2-10ng/ml亞油酸和約0.05-0.15nM抗壞血酸。其他適合的培養(yǎng)基包括，例如，MCDB、MEM、IMDM和RPMI。細胞可以在不含血清、含約1-2°/。胎牛血清或者例如含約l-2。/。人AB血清或自體血清的環(huán)境中培養(yǎng)。當約每3天以約2xl03個細胞/cii^的濃度重新接種時，一般可以獲得超過40次的細胞倍增，有些群經(jīng)過了超過70次的細胞倍增。起始的20-30次細胞倍增的細胞倍增時間為約36-48小時。之后，細胞倍增時間延長到了60-72小時之久。MAPC的端粒長度在約11-13KB之間，所述MAPC來自于5個供體(年齡在約2歲至約55歲之間)，以約2xl03個細胞/cm2的密度重新接種培養(yǎng)，經(jīng)過約23-26次細胞倍增。這比從相同供體獲得的血液淋巴細胞的端粒長度長約3-5KB。分別在約23和約25次細胞倍增后評估的來自2個供體的細胞端粒長度，以及約35次細胞倍增后再次評估的細胞端粒長度都沒有變化。這些MAPC的核型是正常的。處于U.S.7,015,037所述條件下的人MAPC的表型用FACS對約22-25次細胞倍增后獲得的人MAPC進行的免疫表型分析表明所述細胞沒有表達CD31、CD34、CD36、CD38、CD45、CD50、CD62E和-P、HLA-DR、Muc18、STRO-l、cKit、Tie/Tek;并且表達低水平的CD44、I類HLA和p2-微球蛋白，并表達CDIO、CD13、CD49b、CD49e、CDw90、Flkl(N>10)。一旦在以約2xl03/em2重新接種的培養(yǎng)物中細胞經(jīng)歷了超過40次的倍增，表型就變得更加同質(zhì)并且沒有細胞表達I類HLA或CD44(n=6)。當細胞以更高的匯合度培養(yǎng)時，它們會表達高水平的Mucl8、CD44、I類HLA和卩2-微球蛋白，這一點類似于針對MSC描述的表型(N=8)(Pittenger，1999)。免疫組織化學(xué)表明以約2xl03細胞/cm2的接種密度培養(yǎng)的人MAPC會表達EGF-R、TGF-Rl和-2、BMP-R1A、PDGF-RIA和-B，以及一'J、亞群(在約1和約10%之間)被抗SSEA4抗體(Kannagi，R1983)染色的MAPC。利用ClontechcDNA陣列測定了以約2xl03個細胞/cm2的接種密度培養(yǎng)的經(jīng)過約22和約26次細胞倍增的人MAPC的表達基因鐠:A.MAPC不表達CD31、CD36、CD62E、CD62P、CD44-H、cKit、Tie;IL1、IL3、IL6、ILll、GCSF、GM-CSF、Epo、Flt3曙L或CNTF的受體；和低水平的I類HLA、CD44-E和Muc-18mRNA。B.MAPC表達細胞因子BMP1、BMP5、VEGF、HGF、KGF、MCP1的mRNA;細胞因子受體FIkl、EGF-R、PDGF-Rla、gpl30、LIF-R、激活素-Rl和-R2、TGFR-2、BMP-R1A;粘著受體CD49c、CD49d、CD29和CDIO。C.MAPC表達hTRT和TRF1的mRNA;POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、sox-2(需要和Oct-4—起來維持ES/EC的未分化狀態(tài)，UwanoghoD.1995)、sox-ll(神經(jīng)發(fā)育)、sox-9(軟骨發(fā)生)(LefebvreV.1998);同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Hoxa4和-a5(頸和胸骨骼特化；呼吸道的器官發(fā)生)(Packer,A.I.2000),Hox-a9(成髓作用)(Lawrence,H.1997)、Dlx4(頭部前腦和周圍結(jié)構(gòu)的特化)(AkimenkoM.A.1994)、MSX1(胚胎中胚層、成體心臟和肌肉、軟骨發(fā)生和骨發(fā)生)(Foerst-Potts，L.1997)、PDX1(胰腺)(Offield，M.F.1996)。D.通過RT-PCR確認了Oct-4、LIF-R和hTRTmRNA的存在。E.此外，RT-PCR顯示MAPC中表達Rex-lmRNA和Rox醒lmRNA。MAPC也#皮證明為CD105和CD106陰性。來自人和鼠骨髓以及來自鼠肝和腦的MAPC中表達Oct-4、Rex-l和Rox-l。人MAPC表達LIF-R并且用SSEA-4染色為陽性。最后，人們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的超過30次細胞倍增的人MAPC中，Oct-4、LIF-R、Rex-l和Rox-lmRNA的水平升高，這會產(chǎn)生表型更加同質(zhì)的細胞。相比而言，以高密度培養(yǎng)的MAPC不表達這些標記物。這涉及到約40次細胞倍增前就發(fā)生衰老以及無法分化成為除成軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞外的細胞。如U.S.7,015,037所述培養(yǎng)MAPC根據(jù)本文所述分離的MAPC可以用本文和U.S.7,015,037中公開的方法來培養(yǎng)，U.S.7,015,037中關(guān)于這些方法的內(nèi)容通過引用的方式納入本文。簡言之，對于MAPC的培養(yǎng)來說，優(yōu)選用低血清或不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)以維持細胞處于非分化的狀態(tài)。如本文所述，用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基添加如表1所迷的添加物。人MAPC不需要LIF。表l胰島素約10-50ng/ml(約10pg/ml)*運鐵蛋白約0-10jig/ml(約5.5pg/ml)竭約2-10pg/ml(約5ng/ml)牛血清白蛋白(BSA)約0.1-5pg/ml(約0.5pg/ml)亞油酸約2-10^g/ml(約4.7/ml)地塞米爭》約0.005-0.15pM(約0.01nM)L-抗壞血酸-2-磷酸約0.1mM低葡萄糖DMEM(DMEM-LG)約40-60%(約60%)MCDB德約40-60%(約40%)胎牛血清約0-2%血小板源生長因子約5-15ng/ml(約10ng/ml)27<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*括號中示出了優(yōu)選濃度將約10ng/mLLIF加入到人MAPC中不會影響短期細胞生長(25次細胞倍增前的細胞倍增時間相同，Oct4(Oct3/4)表達的水平相同)。相比于使用人細胞所觀察到的結(jié)果，當將新鮮鼠骨髓單核細胞(在第0天除去CD45+細胞)接種于MAPC培養(yǎng)基中時，沒有觀察到生長。當接種鼠髓單核細胞并且培養(yǎng)14天后才缺失CD45+細胞的細胞時，細胞的形態(tài)和表型類似于人MAPC的情況。這表明需要造血細胞分泌的因子來支持鼠MAPC的初始生長。當單純用PDGF-BB和EFG培養(yǎng)時，細胞倍增緩慢(超過6天)而且培養(yǎng)物不能維持超過約IO次細胞倍增。加入約10ng/mLLIF可顯著增強細胞生長。一旦成熟培養(yǎng)，就可以用含約40。/oFCS和約10%DMSO的DMEM將細胞冷凍并儲存為冷凍儲液。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以獲得其他制備培養(yǎng)細胞冷凍儲液的方法。因此，可以在本領(lǐng)域可獲得的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并擴增MAPC。這類培養(yǎng)基包括但不限于達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基⑧(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium,DMEM)、DEMEF12培養(yǎng)基⑧、伊格爾氏基本必需培養(yǎng)基⑧(Eagle，sMinimumEssentialMedium)、F-12K培養(yǎng)基⑧、Iscove，s改良的達爾伯克氏培養(yǎng)基⑧(Iscove，sModifiedDulbecco'sMedium)、RPMI-1640培養(yǎng)基⑧。還可以獲得利用很多含有或不含丙酮酸鈉的低葡萄糖配方培養(yǎng)基。還考慮添加有哺乳動物血清的細胞培養(yǎng)基。血清通常含存活和擴增所需的細胞因子和組分。血清的實例包胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎牛血清(fetalcalfscrum,FCS)、新生牛血清(NCS)、山羊血清(GS)、馬血清(HS)、人血清、雞血清、豬血清、綿羊血清、兔血清、血清替代品和牛胚胎液。應(yīng)當理解的是如果認為需要滅活補體級聯(lián)成分，可以在約55-65。C下進行血清熱滅活?？梢杂欣乩闷渌砑游飦頌榧毎?yīng)微量元素以使其達到最優(yōu)生長和擴增。這類添加物包括胰島素、運鐵蛋白、竭化鈉和它們組合。這些組分可以被包含于鹽溶液中，例如但不局限于Hanks，平衡鹽溶液⑧(HBSS)、Earle，s鹽溶液⑧、抗氧化劑添加物、MCDB-201⑧添加物、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、抗壞血酸和抗壞血酸-2-磷酸，以及附加的氨基酸。許多細胞培養(yǎng)基本身就含有氨基酸，但是有一些需要在培養(yǎng)細胞前進行添加。這類氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定這些添加物的合適濃度?？股匾餐ǔ１挥糜诩毎囵B(yǎng)基中以減輕細菌、支原體和真菌污染。通常，所用的抗生素或抗霉菌化合物為青霉素/鏈霉素的混合物，但是也可以包括但不限于兩性霉素(兩性霉素B(Fungizone))、氨節(jié)西林、艮他霉素、博來霉素、潮霉素、卡那霉素、絲裂霉素、麥考酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龍霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、大觀霉素、四環(huán)素、泰樂菌素和Zeocin。抗生素和抗霉菌添加劑在一定意義上依與所進行的工作類型而定。一種可能出現(xiàn)的情況是含有抗生素但細菌仍舊存在于培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基，但是抗生素的作用是作為抑菌劑而不是殺菌機制。而且，抗生素能夠干擾某些細胞類型的代謝。激素也可以被有利地用于細胞培養(yǎng)中，激素包括但不限于D-醛固酮、二乙基己烯雌酚(DES)、地塞米松、p-雌二醇、氫化可的松、胰島素、促乳素、孕酮、促生長素抑制素/人生長激素(HGH)、促曱狀腺激素、甲狀腺素和L-曱腺原氨酸。根據(jù)細胞類型和最終的分化細胞，脂質(zhì)和脂質(zhì)載體也可以;陂用于添加到細胞培養(yǎng)基中。這類脂質(zhì)和載體可以包括但不限于環(huán)糊精((X、P、y)、膽固醇、與白蛋白綴合的亞油酸、與白蛋白綴合的亞油酸和油酸、未綴合的亞油酸、與白蛋白綴合的亞油酸-油酸-花生四烯酸、未與白蛋白綴合和與白蛋白綴合的油酸等等。還考慮使用祠養(yǎng)細胞層。飼養(yǎng)細胞被用于支持需要復(fù)雜營養(yǎng)來培養(yǎng)的細胞(包括干細胞)的生長。祠養(yǎng)細胞是用，射線失活的正常細胞。培養(yǎng)過程中，所述銅養(yǎng)層充當其他細胞的基底層和提供細胞因子，其本身不會進一步生長或分裂(Lim，J.W.andBodnar，A.，2002)。伺養(yǎng)層細胞的實例通常有人二倍體肺細胞、小鼠胚胎成纖維細胞、瑞士小鼠胚胎成纖維細胞，但也可以是任何有絲分裂期后的、能夠提供有助于實現(xiàn)干細胞的最優(yōu)生長、存活和擴增的細胞組分和因子的細胞。在許多情況下，飼養(yǎng)細胞層不是保持ES處于未分化的增殖態(tài)所必需的，因為白血病抑制因子(LIF)具有抗分化的性質(zhì)。因此，可以添加LIF來維持一些物種的MPAC的未分化態(tài)。培養(yǎng)的細胞可以被維持于在懸浮液中或附著到固體支撐物上，如細胞外基質(zhì)成分和合成的或生物聚合物。干細胞通常需要能促使它們附著到固體支撐物上的附加因子，如I型、II型和IV型膠原、刀豆素A、硫酸軟骨素、纖連蛋白、"超纖連蛋白"和纖連蛋白樣聚合物、明膠、層粘連蛋白、聚-D和聚-L-賴氨酸、凝血酶敏感素和玻璃粘連蛋白。千細胞的培養(yǎng)條件中也可以包括使得干細胞(如MAPC)維持于未分化形式的細胞因子。培養(yǎng)基含有表皮生長因子(EGF)、血小板源生長因子(PDGF)、白血病抑制因子(LIF;在選定的物種中)和其組合是有利于使細胞一定保持在自我更新的未分化態(tài)的條件。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，在分化前要從培養(yǎng)基中移除使細胞自我更新但不分化的添加物。千細胞系和其他細胞與另一種細胞類型共同培養(yǎng)是有益的。這類共同培養(yǎng)的方法源于一種現(xiàn)象，即某些細胞可以提供尚未識別的細胞因子，所述尚未識別的細胞因子可以使得所述干細胞分化成為特定的譜系或細胞類型。這些細胞因子也能夠誘導(dǎo)細胞表面受體的表達，其中某些可以很容易地被單克隆抗體識別。一般而言，選擇用于共同培養(yǎng)的細胞應(yīng)基于本領(lǐng)域技術(shù)人員希望誘導(dǎo)的細胞系類型，而且技術(shù)人員能夠選擇適合的用于共同培養(yǎng)的細胞。MAPC向胰腺細胞的分化MAPC和分化自MAPC的胰腺祖細胞可用作胰腺細胞源?？梢酝ㄟ^將MAPC與適合的因子或與基質(zhì)細胞或其他能夠分泌負責干細胞再生、定向和分化的因子細胞一起培養(yǎng)來促使MAPC成熟、增殖和分化，所述適合的因子包括但不限于激活素A(或TGFP家族的其他成員)、BMP4(或BMP家族的其他成員)、一種抑制音猬因子活性的試劑(包括^f旦不限于環(huán)王巴明和抗SHH抗體)、EGF或HGF(或其他有絲分裂蛋白)、煙酰胺(可能和煙酸)、exendin(包括但不限于exendin4和exenatide(—種與exendin-4很像的39-氨基酸肽)、GDF11(或骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉(zhuǎn)化生長因子P(BMP/TGF卩)超家族的其他成員)、p細胞素。一種抑制音猬因子(SHH)活性(如信號傳導(dǎo))的試劑包括任何的抑制音猬因子功能或表達(包括但不限于在早期胚胎的模式形成中提供信號，例如腹神經(jīng)管、前-后的肢軸和腹體節(jié)的模式形成)的試劑(例如肽、蛋白(包括抗體)、小分子、藥物、化學(xué)品或核酸(如DNA或RNA))。這些試劑包括但不限于抗-音猬因子抗體、環(huán)王巴明(CPA)、它們的類似物，例如環(huán)王巴明-4-烯-3-酮(cyclopamine-4-ene-3-one)或其他齒類生物堿。本文使用的"抑制，，是指，與不存在音猬因子活性抑制劑時的SHH活性相比，音猬因子活性的降低(例如約5%、約10°/。、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約卯％、約95%或約100%)。如后文中的實施例2所述，在體外將MAPC分化成胰腺祖細胞和p-細胞。簡述之，在含激活素A(大約0.5ng/mL至大約200ng/mL,例如大約50ng/mL至大約100ng/mL)、BMP-4(大約10ng/mL至大約100ng/mL，例如大約20ng/mL至大約30ng/mL或至大約50ng/mL)的培養(yǎng)基中將MAPC培養(yǎng)大約3天，之后進行六天在激活素A、BMP-4和環(huán)王巴明(例如，大約5至大約50nM，包括大約10pM)或一種抗-SHH抗體(大約10ng/mL)中培養(yǎng)大約六天。這樣得到的細胞隨后在包含EGF(例如，大約5至大約100ng/mL,包括大約50ng/mL)或HGF(例如，大約5至大約100ng/mL，包括大約50ng/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約6天。這樣獲得的細胞隨后在包含煙酰胺(大約5nM至大約50HM，包括大約10nM)或exendin4(例如，大約5nM至大約50nM，包括大約10nM)、GFD11(例如，大約10ng/mL至大約100ng/mL，包括大約50ng/mL)和p細胞素(例如，大約10ng/mL至大約100ng/mL，包括大約50ng/mL)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約6天。促進MAPC初始定向到胰腺內(nèi)胚層(在第9天，Pdx-l陽性細胞)的其他因子可以包括已知在內(nèi)胚層定向中起重要作用的因子，例如Wnt家族、TGF-p家族和FGF家族的成員。Wnt-3在內(nèi)胚層特化中起作用(Helleretal.，2002),因為Wnt3一小鼠不能形成內(nèi)胚層或中胚層(Helleretal.，2002)。胰腺(而非肝臟)內(nèi)胚層的特化受Wnt家族成員的調(diào)控。初始內(nèi)胚層特化可能依賴Wnt-3，但與初始內(nèi)胚層特化相比，Wnt可能會抑制胰腺內(nèi)胚層的特化。Dickkopf相關(guān)蛋白l(Dkk-l)是分泌蛋白Dkk蛋白家族的一個成員，Dkk-l通過直接高度親和性地結(jié)合到Wnt復(fù)合受體LRP5/6并抑制LRP5/6與Wnt-Frizzled復(fù)合體相互作用從而拮抗經(jīng)典的Wnt通路(Nusse2001)。因此，加入Dkk-l或者卩-連環(huán)蛋白抑制劑(例如一種GSK3抑制劑，例如GSKSp抑制劑IX)(Willertetal.，1998)可以增加MAPC產(chǎn)生Pdx-l陽性祖細胞的頻率。Nodal也在內(nèi)胚層特化中起作用，因為Nodal一小鼠不能形成內(nèi)胚層或中胚層。BMP-4和其他的TGF家族成員誘導(dǎo)中胚層而不是內(nèi)胚層的特化，因為BMP-4一胚胎在妊娠早期死亡，不能形成任何結(jié)構(gòu)分明的中胚層(Winnieretal.，1995)。評估ES細胞分化成內(nèi)胚層的體外研究表明，高濃度的激活素A將細胞特化為內(nèi)胚層，而不是中胚層。在隨后胰腺內(nèi)胚層特化所需的步驟中(Kuboetal"2004;D'Amouretal"2005)，激活素A(Maldonadoetal"2000)單獨或者與bFGF(Hardikaretal"2003)聯(lián)合可以抑制SHH表達，從而阻止胰腺內(nèi)胚層的特化。FGF-8可能在初始內(nèi)胚層特化中起作用。相似地，F(xiàn)GF-4至少在雞中已經(jīng)被確定在內(nèi)胚層特化中起作用(Wellsetal.，2000)。FGF-2在胰腺和肝臟特化中的作用更加復(fù)雜。如上文指出的，F(xiàn)GF-2可以抑制SHH的產(chǎn)生(Hardikaretal.,2003;Jungetal.,1999)，從而會引起胰腺的特化。因此，F(xiàn)GF-8、FGF4、FGF-2或它們的組合可以被應(yīng)用于分化MAPC的方法中(也可以與本文提到的其他因子組合)。來自腹側(cè)的以及背側(cè)的前腸內(nèi)胚層的胰腺定向被音猬因子(SHH)抑制(Hebroketal.，2000)。來自脊索的激活素A(Maldonadoetal.，2000)和/或FGF-2(Hardikaretal.，2003)信號在前胰內(nèi)胚層中起到抑制SHH表達的作用。或者，或進一步地，SHH可以被環(huán)王巴明或特異的抗SHH抗體阻斷。胰腺特化和分化在多個步驟中受Notch信號傳導(dǎo)的調(diào)控(Hardikaretal.,2003)。具體地，Notch信號傳導(dǎo)抑制定向到胰腺、到內(nèi)分泌胰腺和內(nèi)分泌Ngn3胰腺祖細胞的成熟。因此，Notch信號傳導(dǎo)的抑制因子可以-故應(yīng)用在分化MAPC的方法中。對于Pdx-l表達的誘導(dǎo)，雖然一些實驗指出激活素A和BMP4的組合優(yōu)于單獨使用激活素A,但是BMP4可能導(dǎo)致在培養(yǎng)物中還存在中胚層細胞。因此，BMP4可能不是必要的，可以被BMP2或BMP7替代，或者可以以更低的濃度使用或僅與BMP-4同時使用持續(xù)幾天后單用激活素A。另外，在分化的最初的三天中激活素A與Wnt-3聯(lián)合可以進一步地增強內(nèi)胚層的分化。因為Wnt可以抑制胰腺內(nèi)胚層分化，加入Wnt-3之后加入Dkk-l可以在笫9天內(nèi)誘導(dǎo)更大數(shù)量的Pdx-l陽性細胞。這可以被加入一種阻斷經(jīng)典的Wnt通路的GSK3抑制因子確證?？梢酝ㄟ^測量磷酸化的p-連環(huán)蛋白來證明Dkk-1或GSK3抑制因子的效果。之后，通過加入梯度劑量的FGF-8和/或FGF-2和梯度劑量的FGF-4和/或一種FGF-2的抑制劑(例如SU5402),可以確定不同的FGF(FGF-8、FGF-4和FGF-2)的作用。另外，通過例如使用一種Y-分泌酶的抑制劑(化合物E，Calbiochem)抑制Notch信號傳導(dǎo)，可以影響胰腺內(nèi)胚層(PdX-l+細胞)的誘導(dǎo)。所述，分泌酶的效果的評價可以通過評估Hesl和Herp的表達進行。在一個實施方案中，通過例如DNA、RNA或病毒轉(zhuǎn)染或者通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，用一種胰腺轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染所述細胞，所述轉(zhuǎn)錄因子包括但不限于Ngn3、NeuroD、Pdx-l、Pax4、Ptfla/p48、Pax6、Nkx6.1、Nkx2.2或一種它們的組合。這些轉(zhuǎn)錄因子的表達可以誘導(dǎo)MAPC的胰腺分化。另外，通過本領(lǐng)域已知的方法(例如同源重組(如U.S.5,641,670)、非同源重組(如U.S.6,602,686;RAGE(基因表達的隨機激活)技術(shù)；Athersys，Inc.(Cleveland,Ohio))或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的其他內(nèi)源表達技術(shù)(上面提及的專利中關(guān)于其中教導(dǎo)的內(nèi)源基因激活的方法的內(nèi)容，通過引用的方式納入本文)，可以在所述細胞中激活或增加所述內(nèi)源因子。除了本文所述的因子/基因之外，還可以在本發(fā)明的方法中使用或測定所述因子/基因的變體、同源物或直向同源物，其中所述變體、同源物或直向同源物具有與所述因子/基因相同的生物學(xué)功能/活性。例如，本發(fā)明中使用的變體、同源物或直向同源物可以與胰腺發(fā)生涉及的因子/基因(包括本文提供的那些因子/基因)同源或具有序列一致性(核苷酸或氨基酸序列)。測定一個因子/基因是否同源的檢測方法和程序是本領(lǐng)是已知的。識別分化的細胞并隨后將其與未分化的細胞分離的方法可以用本領(lǐng)域Z^知的和本文所述的方法實施。已經(jīng)祐^秀導(dǎo)分化的細胞可以通過在一定條件下選擇性地培養(yǎng)細胞來識別，所述一定條件是使得分化的細胞數(shù)目超過未分化的細胞的條件。類似地，分化的細胞可以通過形態(tài)改變和不存于未分化的細胞中的特征來識別，所述特征例如細胞大小、細胞過程(cellularprocess)的數(shù)目、胞內(nèi)細胞器分布的復(fù)雜度，以及對葡萄糖應(yīng)答時胰島素或C-肽的產(chǎn)生和胰島素或C-肽的分泌。還考慮了通過細胞表達的特異性細胞表面標記物(如細胞受體和跨膜蛋白)來識別分化細胞的方法。針對這些細胞表面標記物的單克隆抗體可以被用于識別分化的細胞?？梢酝ㄟ^熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來進行這些細胞的檢測。從特定基因轉(zhuǎn)錄的增量調(diào)節(jié)的觀點來看，分化細胞通常表現(xiàn)出與未分化細胞不同(niRNA或蛋白的表達升高或降低)的基因表達水平，例如胰島素-1、胰島素-2、胰高血糖素、促生長素抑制素、NeuroDl、Pdx-l、Ngn3、Nkx6.1、Nkx2.2。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)可以用于監(jiān)測分化過程中的這些基因表達變化。此外，使用微陣列技術(shù)的全基因組分析也可以用于識別分化細胞。因此，一旦分化細胞被識別出來，如果需要的話，就可以將它們與未分化的細胞分離。上面詳述的識別方法也提供了分離的方法，如FACS、細胞擇優(yōu)培養(yǎng)方法、ELISA、磁珠和它們的組合。本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案預(yù)想基于細胞表面抗原表達采用FACS識別和分離細胞。其他培養(yǎng)方法MAPC的培養(yǎng)密度可以在約100個細胞/cm2或約150個細胞/cm2到約10,000個細胞/cm2之間變化，包括從約200個細胞/112到約1500個細胞/112到約2000個細胞/cm2。所述密度在物種之間也是可變的。此外，最優(yōu)密度也可以根據(jù)培養(yǎng)條件和細胞源而變化。普通的技術(shù)人員能夠確定對于給定的一系列培養(yǎng)條件和細胞的最優(yōu)密度。而且，在具體的實施方案中，用于細胞分離、生長、擴增和/或分化的環(huán)境氣體氧濃度包括大約0.1%至大約10%的氧的氧濃度。在其他實施方案中，所述環(huán)境氣體氧濃度包括大約1%至大約9%的氧濃度。在其他實施方案中，所述環(huán)境氣體氧濃度包括大約1.5%至大約8%的氧濃度。在另外的實施方案中，所述環(huán)境氣體氧濃度包括大約2%至大約7%的氧的氧濃度。上述的范圍是用于培養(yǎng)Oct3/4陽性且可分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型的非-ES、非-EG、非-生殖細胞的環(huán)境氣體氧濃度的示例范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道，可以使用在這些范圍內(nèi)涵蓋的任一個氧濃度。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可將所述氧培養(yǎng)濃度設(shè)置在大約0.1%、0.5%、.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%，或在任何的這些百分比之間的任何其他氧濃度。在一個實施方案中，所述氧濃度是大約2%至大約7%,例如大約5%,這個濃度與生理氧濃度更加接近(GuytonandHall,inTextbookofMedicalPhysiology,W.B.SaundersCo"Philadelphia,pp.513-523(1996))。在培養(yǎng)過程中，所述氧濃度可以在一個給定的范圍內(nèi)變化。所述環(huán)境氣體的其他部分是常規(guī)的惰性氣體，例如氮氣、氬氣等等，以及二氧化碳。另外，本發(fā)明的細胞在大約5%至大約6%的<:02中培養(yǎng)。在5%的02下分離并培養(yǎng)MAPC顯示出產(chǎn)生的細胞發(fā)生異常更少。另外，所述條件導(dǎo)致MAPC表型輕微變化。當5%的02下分離并且培養(yǎng)嚙齒類MAPC的時候，通過免疫組織化學(xué)測定，Oct-4的轉(zhuǎn)錄物水平接近胚胎干(ES)細胞(50-80%)的水平，并且卯％以上的細胞表達核Oct-4蛋白。此外，5%-02條件下產(chǎn)生的嚙齒類MAPC的Rex-l表達水平接近ES細胞的表達水平。雖然小鼠MAPC表達與ES細胞水平相近的Oct-4mRNA,但是它們不形成胚胎體或畸胎瘤(5xl(^個MAPC植入5只棵鼠的皮膚下)。MAPC的培養(yǎng)中也可以存在GSK3抑制劑(例如一種6-溴餃紅(6-bromoindirubin)化合物，包括但不限于6-溴靛紅-3'肝(6-bromoindirubin-3'-oximeX也被稱作BIO);編號為60/703，823(2005年7月29日提交)和60/704,169(2005年7月29日提交)的美國臨時專利申請，以及PCT申請PCT/US2006/029736(2006年7月31日提交)和PCT/US2006/029547(2006年7月31日提交)中關(guān)于在一種GSK3抑制因子存在的情況下培養(yǎng)細胞的內(nèi)容，通過引用的方式納入本文)。MAPC和其子細胞的用途通過或者直接地被引入到損傷區(qū)域或者通過全身用藥(這種方式使得細胞可以歸巢到所述損傷區(qū)域)，本發(fā)明的胰腺祖細胞或P-細胞和/或MAPC可以被應(yīng)用于重建胰腺。因此，本發(fā)明提供對有需要的受試者進行治療的方法，包括將有效量的本發(fā)明的胰腺祖細胞或MAPC給予受試者。為實現(xiàn)本文所述的目的，可以將自身的、同種異體的或者異種的細胞給予患者以修復(fù)、取代或促進已有的和/或新的胰腺細胞的生長，所述細胞可為未分化的、終末分化的、或者部分分化的形式，可以是遺傳上改變的或未改變的，所述給予可以通過結(jié)合可藥用的載體直接引入目的位點(例如在一種可接受的基質(zhì)的表面之上或周圍)，或者通過全身的方式實現(xiàn)。一般而言，本發(fā)明提供治療胰腺病癥的方法。術(shù)語"胰腺病癥"或"胰腺疾病"指一種胰腺功能受損的狀態(tài)?？梢允褂帽景l(fā)明的組合物和方法治療的"胰腺病癥"或"胰腺疾病"的實例包括但不限于，糖尿病(包括1型、2型、MODY和其他遺傳病因引起的糖尿病)、肥胖癥、胰腺閉鎖、胰腺炎癥、al-抗胰蛋白酶缺乏癥、急性、慢性或遺傳胰腺炎、胰腺癌(包括胰腺的內(nèi)分泌腫瘤)、由于嚢性纖維化病或ShwachmanDiamond綜合癥引起的胰腺功能障礙、胰功能不全或胰酶缺乏、胰腺嚢腫、高胰島素血癥、胰腺消化性疾病、遺傳性外分泌胰腺障礙和胰腺損傷，所述胰腺損傷包括但不限于物理創(chuàng)傷(包括但不限于外科手術(shù))、化學(xué)品、輻射、衰老和/或疾病引起的損傷。MAPC或其分化子細胞的給藥試者:所述方法包括但e不限于局部'注射、導(dǎo)管t^、全身注射、腹膜內(nèi)注射、胃腸外給藥、動脈內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、經(jīng)血管注射、肌內(nèi)注射、外科注射到目的組織中(例如注射到胰腺中)或通過直接施用到組織表面(例如在外科手術(shù)過程中或在傷口上)。通過循環(huán)系統(tǒng)，MPAC可以外周或局部給藥。干細胞的"歸巢"會將移植的細胞集中到對它們的生長和功能有利的環(huán)境中。對患者進行的用細胞因子促進歸巢的預(yù)治療是本發(fā)明方法中考慮的另一種的替代方法。某些細胞因子(例如誘導(dǎo)或增強細胞運動的細胞因子，所述細胞運動如MAPC或其他干細胞、祖細胞或分化細胞的歸巢)能夠增強MAPC或其子細胞的遷移。細胞因子包括但不限于基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)、干細胞因子(SCF)、血管生成素-1、胎盤衍生生長因子(PIGF)和粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)。細胞因子也包括任何能促進內(nèi)皮勦附分子表達的因子，例如ICAM、VACM和其他能促進歸巢過程的因子?？梢酝ㄟ^血管生成作用來增強新形成組織的存活能力。促進血管生成的因子包括但不限于VEGF、aFGF、血管生成素、血管緊張素-1和腦2、p-細胞素、bFGF、X因子和Xa因子、HB-EGF、PDGF、血管調(diào)節(jié)素、促血管素、血管生成素-1、前列腺素E1和E2、類固醇、肝素、1-丁酰-丙三醇和尼克酰胺。能夠減少凋亡的因子也能促進新組織(例如胰腺組織)的形成。能夠減少凋亡的因子包括但不限于p-阻斷劑、血管緊張素-轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE抑制劑)、AKT、HIF、卡維地洛(carvedilol)、II型血管緊張素l型受體拮抗劑、半胱天冬酶抑制劑、卡立泊來德(cariporide)和依尼泊胺(eniporide)。外源因子(例如細胞因子、分化因子(例如細胞因子，如i秀導(dǎo)細胞系定向的生長因子或血管生成因子)、血管生成因子和抗凋亡因子)可以在給予MAPC或其分化子細胞之前、之后或者與其同時給藥。例如，一種同時給藥的形式包括在給藥前將所目的因子與MAPC懸浮液培養(yǎng)基混合。給藥形式是可變的，可以包括首次給藥后再進行后續(xù)給藥。一種潛在地增加細胞存活率的方法是將MAPC或子細胞摻入到生物聚合物或合成聚合物中。由于瘢痕形成或其他障礙，注射的位置可能證實不適于細胞接種和生長，這取決于患者的情況。生物聚合物的實例包括但不限于纖連蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、膠原和蛋白聚糖。其構(gòu)成可以包括或不包括細胞因子、分化因子、血管生成因子或抗凋亡因子。此外，這些都可以是懸浮液的形式。另一種替代品是細胞可包埋于細胞生物聚合物混合物的間隙中的三維凝膠。細胞因子、分化因子、血管生成因子、抗凋亡因子或它們的組合也可以包含于凝膠中。這些都可以經(jīng)由本文所述的各種途徑通過注射的方式來使用。所述細胞也可以被包裹在一種膠嚢中，所述膠嚢可以通透營養(yǎng)成分和氧，同時可使適當?shù)募毎a(chǎn)物(例如對于胰島細胞而言為胰島素)釋放到血流或鄰近組織中。在一個實施方案中，膠嚢材料具有足夠的限制能力以排除可能排斥和破壞植入物的免疫細胞或抗體。這種膠嚢化可以通過使用聚合物實現(xiàn)(Chang,2000)。這種聚合的膠嚢化系統(tǒng)包括但不限于藻酸鹽(例如藻酸鹽微球)、多糖水凝膠、殼聚糖、藻酸鈣或藻酸鋇、藻酸鹽和多聚賴氨酸的層狀基質(zhì)、可光聚合的聚(乙二醇)(PEG)聚合物(Novocell，Inc.)、一種稱之為Biodritin的聚陰離子材料(美國專利6,281,341)、聚丙烯酸酯、可光聚合的聚(乙二醇)聚合物和例如羥乙基異丁烯酸甲基異丁烯酸的聚合物。將細胞包入膠嚢的另一種方法涉及利用光刻技術(shù)，所述光刻技術(shù)是從半導(dǎo)體工業(yè)改變而來以在硅微嚢中裝入活細胞，所述硅微嚢具有僅幾個納米寬的孔(Desai2002)。也可以應(yīng)用于合適的免疫相容性聚陽離子將細胞裝入膠嚢，所述免疫相容性聚陽離子包括但不限于聚左旋賴氨酸(PLL)聚陽離子或聚左旋烏氨酸或聚(亞甲基-共-胍)氫氯化物。另外，可以用生物相容的半透膜對細胞進行包嚢以包裹被包嚢的細胞一一有時在一個毛細裝置內(nèi)一一從而形成一種微型的人造器官，所述器官例如可包含功能性胰腺或肝細胞的人造器官(例如一種肝臟或胰腺人工裝置)。它通常被稱作巨嚢(macroencapsulation)。它的膜允許葡萄糖、氧和胰島素從血流中進出，并且優(yōu)選地阻止免疫系統(tǒng)的抗體和T細胞，抗體和T細胞可能會破壞細胞(例如胰島)。這種膜可以被應(yīng)用于一種灌注裝置中，所述灌注裝置是一種被移植到與動脈相接從而直接與身體的循環(huán)血液相接觸的膠嚢；通過這種方式，所述裝置從所述血液中汲取營養(yǎng)成分并且將胰島素釋放到周身的循環(huán)中。另一種方法可以提供對一小群胰島細胞(巨嚢)或單個的胰島細胞(微嚢)進行包被，并且將它們植入到腹腔內(nèi)的方法。通過滲透到植入組織的體液，在這些裝置中可以進行營養(yǎng)成分和胰島素的交換。所給予的細胞量可隨所要治療的受試者而變化。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以給予人受試者每天約104至約108個千細胞，更優(yōu)選地約105至107個干細胞，最優(yōu)選地約3xl(T個干細胞和任選地約50至約500jiig/kg的細胞因子。然而，關(guān)于多少可以祐J人為是有效劑量的精確確定應(yīng)該基于每個患者的個體因素，包括他們的身高體重、年齡、疾病或損傷、損害程度、從損傷發(fā)生開始至今的時間長短和與送遞方式相關(guān)的因素(直接注射-較低劑量，靜脈內(nèi)-較高劑量)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域的常識可以很容易的確定劑量。干細胞或其子細胞應(yīng)用的一個問題是富集的或分離出的細胞群的純度。例如，骨髓細胞包括混合的細胞群，它可以被純化到足夠產(chǎn)生所需效果的程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用各種公知的方法能夠很容易地測定MAPC或子細胞在一個群中的百分比，所述>^知的方法例如熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)。含MAPC或其分化子細胞的群的優(yōu)選純度范圍為約50-55%、約55-60%和約65-70%。更優(yōu)選的純度范圍為約70-75%、約75-80%、約80-85%;最優(yōu)選的純度范圍為約85-90%、約90-95%和約95-100%。然而，較低純度的群也可能是有用的，如約25-30%、約30-35%、約35-40%、約40-45%和約45-50%。MAPC或其子代的純度可以根據(jù)一個群中的基因表達情況來確定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠很容易地調(diào)整劑量(例如純度的下降可能會需要劑量的增加)。中細胞和;壬選的添:口;:運載劑或載體的量。通常，添加劑(;了活性干細胞或細胞因子)在磷酸緩沖鹽水中的存在量為約0.001至約50wt。/o的溶液，并且活性成分以樣i:克級至毫克級存在，如約0.0001至約5wt"/。、優(yōu)選地約0.0001至約lwt。/o、最優(yōu)選地約0.0001至約0.05wt%或約0.001至約20wt。/o、優(yōu)選地約0.01至約10wty。和最優(yōu)選地約0.05至約5wt%。當然，因此對于要給予動物或人的任何組合物，以及對于任何特定的給藥方法，優(yōu)選地應(yīng)確定毒性——例如通過在適合的動物模型(例如嚙齒動物，如小鼠)中測定致死量(LD)和LD50——和組合物的劑量、其中組分的濃度和給予組合物周期，這些會引發(fā)適合的應(yīng)答。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識、本文的公開內(nèi)容和本文所引用的文獻，這些測定不會需要過多的實驗。而且，序貫給藥的時間的確定也不需要過多的實驗。當給予本發(fā)明的治療組合物時，通?？梢园纯勺⑸湫问?溶液、懸浮液、乳劑)的單位劑量來配制的。適合注射的藥物制劑包括無菌水性溶液和分散系。所述載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，所述分散介質(zhì)包括例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液體聚乙烯乙二醇等等)和它們適合的混合物。此外，可以加入各種增強組合物的穩(wěn)定性、無菌度和等滲性的添加劑，包括抗菌性防腐劑、抗氧劑、螯合劑和緩沖液。通過各種抗細菌和抗真菌試劑可以確保預(yù)防微生物的作用，所述抗細菌和抗真菌試劑例如對羥苯曱酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等等。在許多情況下，需要包括等滲劑，如糖、氯化鈉等等?？勺⑸渌幬镄问降难娱L吸收可以通過使用延緩吸收的試劑來實現(xiàn)，例如單硬脂酸鋁和明膠劑。然而，根據(jù)本發(fā)明，所用的任何運載劑、稀釋劑或添加劑都應(yīng)該是與細胞相容的。無菌的注射溶液可以通過將實施本發(fā)明過程中所用的細胞摻入所需量的適合溶劑中來制備，根據(jù)需要，所迷溶劑中可含有各種量的其他成份。在一個實施方案中，可以首次給予MAPC或其分化子細胞后，再通過進一步給予MAPC或其分化子細胞來維持。例如，MAPC可以通過一種注射的方法來給予，此后通過不同或相同類型的方法來進一步給予。應(yīng)當注意到的是，人受試者的治療時間通常要比犬類或其他實驗動物長，以使得治療時間與疾病過程的長短和療效成比例。劑量可以是幾天時間的單劑量或多劑量。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用本文公開的內(nèi)容和本文引述的文獻中的技術(shù)及本領(lǐng)域的公知常識，不需要過多實驗就可以從動物(例如大鼠、小鼠、犬類等等)實驗按比例放大以用于人。該療法時間通常與疾病過程的時間和治療效果成比例，并且與所治療的受試者相關(guān)。包含MAPC或其分化子細胞的組合物的實例包括用于給藥的液體制劑(包括懸浮液)和用于直接或靜脈內(nèi)給藥(例如可注射的給藥)的制劑，如無菌懸浮液或乳劑。這些組合物可以與適合的載體、稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖(dextrose)等等)混合。所述組合物也可以是低壓凍干的。根據(jù)給藥途徑和所需制劑，所述組合物可以包含輔助物質(zhì)如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、膠凝劑或增粘劑、防腐劑、芳香劑、顏料等等。標準教材(如"雷明登(Remington's)藥物科學(xué)"第17版，1985,通過引用的方式納入本文)可被用于查閱以制備適合的制劑而不需要過多的實驗。組合物可以方便地以液體制劑的形式來提供，例如等滲水性溶液、懸浮液、乳劑或粘稠組合物，所述液體制劑可以被緩沖到選定的pH。液體制劑通常比凝膠、其他粘稠組合物和固體組合物容易制備。此外，液體組合物在一定程度上更容易給藥，特別是通過注射。另一方面，粘稠組合物可以以適合的粘度范圍配制，以提供與特定組織的更長的接觸期。適合載體和其他添加劑的選擇將取決于給藥的確切途徑和具體劑型的性質(zhì)，所述劑型例如液體劑型(例如組合物是否被配制成為溶液、懸浮液、凝膠或另一種液體形式，如時間釋放形式或液體填充形式)。除細胞外，溶液、懸浮液和凝膠還通常含大量的水(優(yōu)選純化的無菌水)。也可存在少量的其他成分例如pH調(diào)節(jié)劑(例如，如NaOH等的堿)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑和膠凝劑(例如曱基纖維素)。所述組合物可以是等滲的，即它們可具有與血液和淚液相同的滲透壓。本發(fā)明組合物所需的等滲度可以使用氯化鈉或其他可藥用試劑來實現(xiàn)，所述可藥用試劑例如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其他無機或有機溶質(zhì)。對于含鈉離子的緩沖液來說，氯化鈉為特別優(yōu)選的。如果需要的話，可以使用可藥用的增稠劑來將組合物粘度維持在選定的水平。優(yōu)選曱基纖維素，因為它容易購得、價格便宜且容易使用。其他適合的增稠劑包括，例如，黃單胞菌膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆(carbomer)等等。優(yōu)選的增稠劑濃度取決于選定的試劑和所需的粘度。粘稠組合物通常通過在溶液中加入這類增稠劑來制備。可以使用可藥用的防腐劑或細胞穩(wěn)定劑來增加組合物的壽命。優(yōu)選地，如果需要防腐劑的話，選擇不會影響本發(fā)明所述的MAPC或子細胞的活力或功效的組合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能預(yù)期的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，應(yīng)當選擇化學(xué)惰性的組合物組分。對于化學(xué)原理和藥物原理領(lǐng)域的技術(shù)人員來說這不會存在問題，或者通過參考標準教材或簡單實驗(不包括過多的實驗)、本文公開的內(nèi)容和本文引用的文獻可很容易地避免存在的問題?？梢栽诳紤]到具體的患者的年齡、性別、體重和身體狀況這類因素和用于給藥的組合物形式(例如固體與液體)后，按照劑量并通過醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的技術(shù)來進行組合物給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文公開的內(nèi)容、本文所引用的文獻和本領(lǐng)域的常識，不需要過多的實驗就可以確定人或其他動物的劑量。用于首次給藥且進一步給藥或用于序貫給藥的適合方案也是可變的，可以包括首次給藥后進行隨后的多次給藥；但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文公開的內(nèi)容、本文所引用的文獻和本領(lǐng)域的常識可以確定給藥適合的方案。預(yù)防免疫排斥的移植方法在一些實施方案中，移植或給藥前可能需要對MAPC(或分化子細胞)進行處理或改變以降低激發(fā)宿主對移植細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的風險。可以采用本領(lǐng)域已知的降低激發(fā)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答風險的任何方法。下面提供了一些這類實例1.通用供體細胞對MAPC進行搡作^f吏其成為通用供體細胞。盡管未分化的MAPC不表達MHC-I或-II抗原，但是一些分化的子細胞可能表達這些抗原的一種或兩種均表達。通過消除MHC-I和MHC-II抗原并潛在地引入來自預(yù)期受體的MHC抗原，可以將MAPCM務(wù)飾成為通用供體細胞，從而使得細胞不會輕易變成NK介導(dǎo)的殺傷目標，或變得對不受限的病毒復(fù)制或惡性轉(zhuǎn)化易感。例如，可以通過同源重點突變以引入終止密碼子(如用嵌合體(chimeroplast))來實現(xiàn)MHC-抗原的消除。可以通過反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺伴隨病毒或其它病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過用MHC-抗原cDNA轉(zhuǎn)染耙細胞來實現(xiàn)宿主MHC抗原的轉(zhuǎn)移。2.子宮內(nèi)移植以防止發(fā)生免疫識別MAPC可用于子宮內(nèi)移植，所述子宮內(nèi)移植是用于修正遺傳異?；蛟诿庖呦到y(tǒng)發(fā)育前引入可被宿主耐受的細胞。這種方法可用于在動物中產(chǎn)生大量的人細胞，或者通過移植可產(chǎn)生正確蛋白或酶的細胞，它也可以被用于修正人胚胎的遺傳缺陷。3.造血嵌合和耐受誘導(dǎo)通過干細胞的使用可以帶來益處，所述干細胞能夠重建移植免疫系統(tǒng)，這種重建不會帶來移植物抗宿主應(yīng)答風險。所述移植物抗宿主反應(yīng)是由骨髓移植物中固有的污染T細胞導(dǎo)致的。盡管從骨髓中純化造血干細胞是常規(guī)手段，但它們在患者體內(nèi)的成功移植需要同時伴有42輔佐性T細胞。因此，要在T細胞的有益移植量與移植物抗宿主應(yīng)答的有害效應(yīng)之間達到重要的平衡。MAPC和ES細胞代表可送遞的且沒有移植物抗宿主應(yīng)答風險的干細胞群，因為它們可以自由地擴增而不僅限于造血細胞類型，包括T細胞。這極大的降低了臨床風險。在細胞給藥的急性期中的NK細胞活性的暫時消除使原始干細胞移植和造血功能重建的頻率增加到臨床可用閾值水平，且沒有長期的免疫抑制風險。隨著MAPC或ES移植并幫助造血，新形成的T細胞經(jīng)歷了與上迷宿主T細胞一致的胸腺和外周的自體與非自體訓(xùn)練。新形成的幼稚供體T細胞與宿主源T細胞的共同暴露會導(dǎo)致反應(yīng)活性細胞的相互消除，因此可以實現(xiàn)對來自MAPC或ES供體的表達同種異體抗原的T細胞的耐受。因此，使患者對MAPC或ES供體免疫系統(tǒng)的細胞組分和分子組分耐受，并且可以接受細胞、組織或器官移植物而不排斥。4.天然殺傷(NK)細胞功能可以使用任何的方法來預(yù)防免疫排斥、增加移植物移植或增加免疫耐受，例如使用能夠抑制NK細胞功能——包括將NK細胞從細胞群中去除一一的試劑。這種試劑包括抗NK細胞抗體、輻射或任何其他能抑制NK細胞功能的方法。NK功能抑制在2005年5月5日提交的PCT申請?zhí)枮镻CT/US2005/015740的專利申請中有進一步描述，該申請中關(guān)于在體內(nèi)抑制NK細胞以促進干細胞存活的方法的教導(dǎo)通過引用的方式納入本文。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以采用至少一種抑制NK細胞功能的方法，包括抑制NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性。可以使用遺傳的(受體為NK細胞缺陷型)或后天的(通過例如抗-NK抗體在體內(nèi)使其消耗/失活)方法，通過消耗NK來去除NK細胞的功能?？梢允褂萌魏文軌蛞种芅K細胞功能的物質(zhì)(例如，與T細胞或NK細胞表面上的P-選擇素糖蛋白1(PSGL-1)結(jié)合(美國專利公布文本No.2004/0116333)，或者調(diào)節(jié)含SH2的肌醇磷酸酶(SHIP)的表達或功能(美國專利公布文本No.2002/0165192)的多聚體復(fù)合物)。可以被用來抑制NK細胞功能的任何的方法/試劑包括但不限于，化學(xué)品(例如一種化合物，包括但不限于一種藥用的、藥物小分子)、蛋白質(zhì)(例如抗-NK細胞抗體)、肽、微生物、生物制品、核酸(包括編碼重組蛋白質(zhì)或抗體的基因)或遺傳構(gòu)建(例如載體，如表達載體，包括但不限于導(dǎo)致抗NK細胞活性的拮抗物表達的表達載體)。本領(lǐng)域中可以獲得幾個抑制NK細胞功能的抗體，包括但不限于抗-人胸腺細胞球蛋白(ATG;美國專利No.6，296，846)、TM-卩1(抗-IL-2受體p鏈抗體)、抗去唾液酸GM1(免疫原是糖脂GA1)、抗-NKl.l抗體或單克隆的抗NK細胞抗體(5E6;Pharmingen，Piscataway，NJ)。另夕卜，針對例如一種天然細胞毒性受體(NCR)(包括，例如NKp46)的抗體；或針對一種白細胞相關(guān)抗原樣受體家族(包括，例如LAIR-I)的抗體；或針對殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)家族(包括，例如KIR2DL1、KIR2DL2或KR2DL3)成員的抗體，是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的或者可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的方法制備，并且在本發(fā)明中是有用的。另夕卜，傳、吏NK細胞上的LAIR-1交聯(lián)的試劑之類的方法可以凈皮應(yīng)用于抑制NK細胞的功能。而且，輻射(致死的、亞致死的和/或局部輻射)可以被應(yīng)用于抑制NK細胞的功能。在一個實施方案中，抑制NK細胞的功能的方法是一種可以與天然殺傷細胞反應(yīng)的抗體。而且，抑制NK細胞的功能的方法可以包括調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的試劑，例如那些為免疫抑制開發(fā)的試劑。需要注意的是，任何的這些方法/試劑都可以單獨使用或組合使用。因此，本文還提供了增加受試者對MAPC和其他細胞的免疫耐受性的方法，包括給予受試者一群MAPC和有效量的一種能抑制天然殺傷細胞功能的試劑，使得與沒有給予所述抑制試劑的方法相比，對MAPC的免疫耐受性增加了。5.基因療法MAPC可以從體內(nèi)提取并分離，在培養(yǎng)基中以未分化狀態(tài)培養(yǎng)或在培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)分化，并且用各種技術(shù)(特別是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo))對MAPC進行遺傳改造?；蛭镔|(zhì)的吸收和表達是可證明的，且發(fā)育過程中外源DNA的表達是穩(wěn)定的。反轉(zhuǎn)錄病毒和其他用于在干細胞中插入外源DNA的栽體是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的(Mochizuki，H.etal.1998;Robbins，P.etal.1997;Bierhuizen,M.etal.1997;Douglas,J.etal.1999;Zhang,G.etal.1996)。一旦用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強的綠色熒光蛋白(eGFP)表達會持續(xù)存在于終末分化肌肉細胞、內(nèi)皮組織和來自分離的MAPC的c-Kit陽性細胞中，這表明引入到MAPC的逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體的表達存在于整個分化過程中。eGFP+細胞預(yù)先由逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)導(dǎo)并進行幾周的分選以進入初始MAPC培養(yǎng)階段，初始含有約10個eGFP+細胞的培養(yǎng)物,皮誘導(dǎo)終末分化。MAPC或其子細胞給藥后的受試者監(jiān)測移植之后，可以監(jiān)測所給予的MAPC或子細胞的生長或分化或者MAPC或子細胞的治療效果。例如，可以監(jiān)測血糖、血清葡萄糖和/或血清胰島素。給藥之后，受試者對所述MAPC或子細胞的免疫耐受性可用本領(lǐng)域已知的各種方法來檢測，以評估受試者對MAPC的免疫耐受性。如果當受試者的MAPC耐受性不是最優(yōu)是(例如受試者的免疫系統(tǒng)排斥外源MAPC)，可以對受試者進行治療性輔助免疫抑制療法，該療法是本領(lǐng)域已知的。遺傳修飾的MAPC或其衍生的分化子細胞MAPC或其衍生的分化子細胞可以在離體條件下被遺傳改造，以去除基因療法的一個最顯著的障礙。例如，可以獲得受試者的骨髓穿刺物，并從穿刺物中分離出MAPC。然后對MAPC進行遺傳改造以表達一種或多種需要的基因產(chǎn)物(例如胰腺基因，包括但不限于胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素或者編碼胰腺產(chǎn)生的消化酶的各種基因的任何基因)。然后對MAPC進行離體篩選或選擇以識別那些已經(jīng)被成功改造的細胞，并且可以將這些細胞引入受試者或者將這些細胞分化后再引入受試者，可局部地或全身地引入?；蛘?，MAPC可以,皮分化，然后在給藥前對分化的細胞進行遺傳改造。在兩者中任一種情況下，所述細胞提供了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的、能夠表達所需基因產(chǎn)物的細胞源。特別是當患者自身的組織(如骨髓)為MAPC源時，本方法提供了一種生產(chǎn)移植物的免疫安全方法。MAPC或分化子細胞的遺傳改造的方法用本文所述的方法分離的細胞或它們的分化子細胞，可以用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的方法通過在細胞內(nèi)引入DNA或RNA來進行遺傳修飾。這些方法一般會被分成四個主要的類別(1)病毒轉(zhuǎn)移，例如，包括DNA或RNA病毒載體的使用，如反轉(zhuǎn)錄病毒，例如包括慢病毒(Mochizuki，H.，etal"1998;Martin,F.，etal.1999;Robbins,etal.1997;Salmons,B.andGunzburg，W.H.，1993;Sutton，R.，etal"1998;Kafri，T.，etal.，1999;Dull,T.，etal"1998);猿猴病毒40(SV40);腺病毒(例如，參見Davidson,B丄.，etal"1993;Wagner,E.，etal"1992;Wold，W"AdenovirusMethodsandProtocols,HumanaMethodsinMolecularMedicine(1998)，BlackwellScience,Ltd.;Molin，M.，etal"1998;Douglas,丄，etal"1999;Hofma叫C，etal"1999;Schwarzenberger，P"etal"1997);a病毒，包括辛德比斯病毒(Sindbisvirus)(美國專利No.5,843,723;Xiong，C，etal"1989;Bredenbeek,P.J.，etal"1993;Frolov,I，etal"1996);皰滲病毒(Laquerre，S.，etal"1998)和牛乳頭瘤病毒；(2)化學(xué)轉(zhuǎn)移，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染和DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法；(3)膜融合轉(zhuǎn)移，例如，使用加有DNA的膜泡嚢例如脂質(zhì)體(Loeffler，J.andBehr，J.，1993)、紅細胞膜和原生質(zhì)體；和(4)物理轉(zhuǎn)移技術(shù)，例如J.Wolff的"基因療法"(1994)第195頁中的微注射、微發(fā)射(參見J.Wolff的"基因療法"(1994)第195頁；Johnston,S.A.，etal"1993;Williams,R.S.，etal"1991;Yang,N.S.，etal"1990)、電穿孔、核轉(zhuǎn)染或直接"棵露"的DNA轉(zhuǎn)移?？梢酝ㄟ^插入預(yù)選的分離的DNA，通過用預(yù)選的分離的DNA取代細胞基因組的一個區(qū)段或通過至少一部分所述細胞的基因組的缺失或失活來對細胞進行遺傳改造。至少一部分所述細胞的基因組的缺失或失活可以通過各種方法來完成，包括但不限于遺傳重組，例如，通過反義技術(shù)(可以包括使用核酸肽或PNA)或通過核酶技術(shù)。一種或多種預(yù)選的DNA序列的插入可以通過同源重組或通過將病毒整合到所述宿主細胞基因組中來完成。非同源重組的方法也是已知的，如美國專利6,623,958、6,602,686、6,541,221、6,524,824、6,524,818、6,410,266、6,361,972中所述，它們關(guān)于非同源重組的全部>^開內(nèi)容特別地通過引用的方式納入本文。還可以使用質(zhì)粒表達栽體和核定位序列來將所需的基因序列引入到細胞中，特別是引入到其細胞核中。用于將多核苷酸引導(dǎo)到細胞核的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，如Sebestyen，etal.(1998)中所述，信號肽可以與質(zhì)粒DNA連接，從而將所述DNA引導(dǎo)到細胞核中以實現(xiàn)更有效的表達。可以使用啟動子來引入遺傳物質(zhì)，所述啟動子應(yīng)會使得所研究的基因被某些化學(xué)物質(zhì)/藥物正向或負向誘導(dǎo)，在給予一種給定的藥物/化學(xué)物質(zhì)后被消除，或者可^皮標記使得它可以在特定的細胞區(qū)室(包括但不限于細胞膜)被化學(xué)物質(zhì)(包括但不限于他莫昔芬(tamoxifen)反應(yīng)性突變型雌激素受體)誘導(dǎo)。錄調(diào)控序列以激活所需的內(nèi)源基因。這可以通過同源(例如U.S.5,641,670)或非同源(例如IJ.S.6，602，686)重組來完成。這些專利關(guān)于內(nèi)源基因激活的方法的教導(dǎo)通過引用的方式納入本文。用遺傳標記物來證明。例如，力e《"ore"W"w/fl綠色熒光蛋白已經(jīng)4皮證明是一種識別和追蹤修飾過的造血細胞的有效標記物(Persons,D.，etal.，1998)。可選擇的替代標記包括p-Gal基因、截短的神經(jīng)生長因子受體、藥物選擇標記(包括但不限于NEO、MTX、潮霉素)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)當?shù)鞍踪|(zhì)與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)連接的時候，它們可以直接^:轉(zhuǎn)移至細胞，所述PTD是可自由、迅速穿過細胞膜的小陽離子肽結(jié)構(gòu)域。例如聚精氨酸(聚精氨酸介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo))和HIV-來源的Tat等幾個PTD已經(jīng)被鑒定，它們允許一種融合蛋白有效地穿過細胞膜。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個獨特的優(yōu)點是，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白在所述細胞中僅短暫地存在，這一特征依賴于所表達的蛋白的內(nèi)在周期。另外，可以通過加入不同量的蛋白質(zhì)來控制所轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)濃度。從MAPC中鑒定胰腺祖細胞為了從MAPC以及胰島素-1陽性細胞中鑒定中間祖細胞，可以在一種胰腺啟動子(例如Pdx-l、Ngn3、Pax4和胰島素啟動子)的控制下對來自轉(zhuǎn)基因小鼠的MAPC細胞系進行基因工程改造以表達例如熒光染料等的標記物，并且可以產(chǎn)生不同的雜交(例如，可以分離來自具有PDXl-GFP、Ngn3-YFP、Pax4-RFP和MIP-GFP的小鼠，以及Nkx6.1-GFP和PDX-1xNgn3小鼠的骨髓(BM)的MAPC)?？梢苑蛛x克隆群并且測試它們的多能性、表型、細胞遺傳學(xué)和分化成P-細胞樣細胞的能力(評估Pdxl、Ngn3、NeuroDl、Pax4、Nkx6.1和胰島素隨時間的表達)?？梢酝ㄟ^這些細胞系跟蹤分化，并從分化的培養(yǎng)物中選擇中間祖細胞。實施例下面提供的實施例目的在于證明和進一步說明本發(fā)明的某些實施方案和某些方面，且不應(yīng)被解釋為限制了本發(fā)明的范圍。實施例1MAPC在體內(nèi)分化成P-細胞如JiangYetal.(2002)中所述，用eGFP轉(zhuǎn)基因C57B1/6Thyl.l小鼠的骨髓細胞建立鼠MAPC細胞系。在約5%C02和約5%02的氣體濃度下，于10ng/cm2的人纖連蛋白(Sigma)包被的培養(yǎng)皿(Nunc)上，用60%DMEM-LG(GibcoBRL)和40%MCDB-201(Sigma)培養(yǎng)MAPC，其中40%MCDB-201(Sigma)含有1xSITE(Sigma)、1x亞油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)(Sigma)、0.1mM抗壞血酸-2-磷酸(Sigma)、1x化學(xué)成分明確的濃縮脂質(zhì)(Gibco)，0.05nM地塞米松、0.1mM卩-巰基乙醇(Sigma)、100U青霉素(Gibco)、1000U鏈霉素(Gibco)、1000U/mlLIF(Chemicon)、10ng/mlmEGF(Sigma)、10ng/mlhPDGF曙BB(R&Dsystems)、2%胎牛血清(FCS)(HycloneLaboratories)。接種的細胞密度為約100個細胞/cm2且每兩天進行一次細胞分JDL。通過尾靜脈注射，約0.03-1x106個5%02培養(yǎng)的eGFPC57B1/6低02的MAPC^皮移植到6-8周齡的以275cGy輻射后的NOD-SCID小鼠體內(nèi)(n=28)。在第-1、+10和+20天時腹膜內(nèi)注射抗去唾液酸GM1抗體(Wako)(20^1儲液稀釋于380nl1xPBS中)以降低NK活性。輸注后(5-20周)通過外周血(PB)定期評估造血功能的重建，之后處死動物。在所有被處死的動物中，評估血液、BM和脾中的eGFP造血細胞的存在，并且收集小腸、胰腺、肝、肺、皮膚、骨骼肌和腦以確定MAPC衍生細胞對非造血細胞鐠系的貢獻。如圖10中所述，28只小鼠中的21只具有MAPC-衍生的造血功能的指征。沒有顯示出植入的7只用具有低Oct-4水平(<l%mESC)的MAPC移植，而所有其他動物接受具有30-80%的mESC的Oct-4mRNA水平的MAPC。對淋巴造血組織的分析證明了多譜系植入(圖10)。PB、BM、脾和胸腺的FACS分析顯示出多鐠系的植入，包括所有的髓樣細胞、T-細胞、p-細胞和NK-細胞。eGFP分類的脾CD4/CD8T細胞能夠在混合淋巴細胞反應(yīng)培養(yǎng)物中與Balb/C來源的細胞反應(yīng)，并且能夠產(chǎn)生#1抗-CD3+抗-CD28單克隆抗體刺激的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未出示)。另外，約1%的GFP+細胞表達Scal+cKit或Thyl+cKit，表明從MAPC生成造血干細48胞(HSC)，與eGFP+CFU-Mix和BFU-E可以被培養(yǎng)的事實以及來自初級受者的BM重建致死輻射二級受者的造血系統(tǒng)的能力相一致。例如肺、胰腺、心臟、肝和小腸等的其他器官也可以進行是否存在MAPC衍生的子細胞的分析。在腸中觀察到了高水平的分布，并且分化成具有腸上皮的形態(tài)學(xué)特征和表型特征的細胞。有趣地是，在除位于隱窩的下層3-4個細胞之外的所有細胞中發(fā)現(xiàn)了植入，這與腸干細胞區(qū)室的植入相一致。這種情況已在12只小鼠中的2只中發(fā)現(xiàn)，這兩只動物在大約第5-6周的時候病得很重，但是通過抗生素給藥后獲得改善。在第13周的時候處死這兩只動物。在其他10只動物中，沒有觀察到在腸上皮中的植入。對于其他器官，主要在間充質(zhì)區(qū)室中觀察到了低水平的植入。在心臟中，檢測到200-300個GFP+心肌肌鉤蛋白+細胞。在MAPC移植之后的胰腺上進行胰島素和GFP的免疫焚光和GFP的免疫組織化學(xué)。首先，按如下所述進行胰腺上的GFP的免疫組織化學(xué)檢測。用10%的中性緩沖福爾馬林的PBS溶液于4'C下將胰腺固定24小時。用PBS洗滌兩次后，用石蠟包埋樣品。切6微米的切片并且置于SuperFrostPlus載玻片上。經(jīng)過標準的脫蠟和復(fù)水之后，用蒸餾水清洗切片三次，每次5分鐘。抗原回收通過利用0.01MpH6.0檸檬酸鹽緩沖液(Invitrogen)并使用一個家用電飯煲蒸20分鐘，接著進行20分鐘的冷卻步驟來實現(xiàn)。用蒸餾水快速沖洗之后，用PBS+0.05o/。的吐溫20進4亍5分鐘的切片透化處理。通過在含1.8%H202的蒸餾水和2.5%高碘酸(Sigma)水溶液中相繼孵育5分鐘來阻斷內(nèi)源的過氧化物酶，用流動的自來水清洗5分鐘進行分離。在5分鐘的流動的自來水清洗之后，用含0.02%的硼氫化鈉(Sigma)的蒸餾水將載玻片孵育2分鐘。在5分鐘的流動的自來水清洗之后，通過相繼與抗生物素蛋白和生物素(BiotinBlockingSystem,DakoCytomation)—起孵育15分鐘來阻斷內(nèi)源性生物素，用PBS+0.05。/o的吐溫20清洗5分鐘進行分離。在與生物素一起將育之后，用PBS+0.05。/。的吐溫20清洗切片5分鐘。通過在0.4%魚皮明膠的PBS溶液中孵育30分鐘來封閉非特異性結(jié)合位點。除去封閉緩沖液并且將用PBS+0.05%吐溫20+1%BSA稀釋的初級抗體加到切片上并且4。C下孵育過夜。兔抗-GFP來自Abcam(ab6556)并且使用0.67fig/ml的濃度。第二天早晨用PBS+0.05%的吐溫20清洗載玻片三次，每次五分鐘。以1:1500稀釋在PBS+0.05%的吐溫20中的生物素化的抗-兔F(ab，)2抗體被加到切片上并且孵育30分鐘。用PBS+0.05%的吐溫20清洗載玻片三次，每次五分鐘。根據(jù)制造商說明書制備的VectastainABC過氧化物酶復(fù)合體(VectorLaboratories)被加到切片上并且賻育30分鐘。用PBS+0.05。/o的吐溫20清洗載玻片三次，每次五分鐘。根據(jù)制造商的說明書，用DAB+(DakoCytomation)顯色。經(jīng)過標準的蘇木精復(fù)染、脫水和封固后，用NikonCoolpix4500數(shù)碼照相機拍攝照片，所述照相機安裝在ZeissAxioskop2上。在單染色實驗的兩只動物中觀察到GFP+胰島。接著，按如下所迷進行MAPC移植后的胰腺上的胰島素和GFP的免疫熒光檢測。用10。/。的中性緩沖福爾馬林的PBS溶液中于4'C下將胰腺固定24小時。用PBS洗滌兩次后，用石蠟包埋樣品。切6微米的切片并且置于SuperFrostPlus栽玻片上。經(jīng)過標準的脫蠟和復(fù)水之后，用蒸餾水清洗切片三次，每次5分鐘?？乖厥胀ㄟ^利用0.01M檸檬酸鹽緩沖液pH6.0(Invitrogen)中使用一個家用電飯煲蒸20分鐘，接著進行20分鐘的冷卻步驟來實現(xiàn)。用蒸餾水快速沖洗之后，用PBS+0.05。/。的吐溫20進行5分鐘的切片透化處理。通過在0.4%魚皮明膠的PBS溶液中孵育30分鐘來封閉非特異性結(jié)合位點。除去封閉緩沖液并且將用PBS+0.05%的吐溫20+1%BSA稀釋的初級抗體加到切片上并且4。C下孵育過夜。豚鼠抗胰島素來自于DakoCytomation(A0564)并且使用21.25Hg/ml的濃度。兔抗-GFP來自Abcam(ab6556)并且使用2ng/ml的濃度。第二天早晨用PBS+0.05。/o的吐溫20清洗載玻片三次，每次五分鐘。以l:125和l:450稀釋在含l:1000的TO-PRO-3-珙化物(Invitrogen)的PBS中的花青-2(Cyanine-2)標記的抗-豚鼠抗體和花青-3(cyanine-3)標記的抗-兔F(ab')2抗體(JacksonImmunoresearch)尋皮力口到切片上，并且賻育30分鐘。用PBS+0.05%的吐溫20清洗載玻片三次(每次五分鐘)之后，使用ProLongGold(Invitrogen)對載玻片進行封固。用BioRadRadiance2100獲得共聚焦激光掃描圖片，所述BioRadRadiance2100安裝在ZeissAxioskop2上。移植了未分化GFP+MAPC的NOD-SCID小鼠中，有至少兩只的胰腺中被檢測到GFP"胰島素+胰島(圖11)。實施例2嚙齒類MAPC在體外分化成p-祖細胞和|3-細胞MAPC定向至內(nèi)分泌胰腺系利用低02、高Oct-4(圖2;在一個實施方案中，高Oct-4是大鼠胚胎干細胞中Oct-4存在量或總mRNA的約5%至約25%，而低Oct-4通常大約少4個數(shù)量級)表達的小鼠MAPC和大鼠MAPC(如本文描述地分離和培養(yǎng))，可以確定已知在內(nèi)胚層一〉胰腺一〉內(nèi)分泌胰腺一〉P-生最終的表達胰島素-1mRNA的細胞群。例如，MAPC被i秀導(dǎo)表達卩-細胞的轉(zhuǎn)錄程序，并隨后當用激活素A和BMP4(第0-9天)、抗-SHH(第3-9天)、EGF(第9-15天)；煙酰胺(或exendin4)、卩-細胞素和GDF11(第15-21天)培養(yǎng)的時候，相繼表達轉(zhuǎn)錄因子(TF)Hnf3p、Hnf6、Pdx-l、Ngn3、NeuroDl、Pax4、Nkx61，以及胰島素-1、胰島素-2、胰高血糖素和促生長素抑制素的mRNA。用于嚙齒類MAPC的擴增和分化培養(yǎng)基(添加后文中描述的因子)在表2中描述。成份表2擴增培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基DMEM-LG(Gibco)MCDB(Sigma)FCS(Hyclone)ITS+1(Sigma)L-抗壞血酸(Sigma)青/鏈霉素(Gibco)地塞米松(Sigma)P-蔬基乙醇(Gibco)hPDGF(R&D)hEGF(Sigma)mLEF(Chemicon),300200mL(40o/o)10mL(2%)55mL(0.1mM)5mL100(0.05,500jiL(0.1mM)500pL(10ng/mL)500j_iL"0ng/mI^50|aL(1000XJ/mL)300mL200mL(40%)10mL(2%55mlL5mL(0.1mM)5mL500(iL(O.lmM)另夕卜，可以在室溫下用10ng/mL的纖連蛋白(FN)包被培養(yǎng)皿/瓶一個小時。細胞因子介導(dǎo)的分化經(jīng)過對不同的細胞因子和胞外基質(zhì)(ECM)組分的作用的多因子分析之后可以實現(xiàn)細胞因子介導(dǎo)的分化，所述細胞因子和胞外基質(zhì)組分已知在內(nèi)胚層、前腸、胰腺和內(nèi)分泌胰腺特化和分化中起重要作用。使用Q-RT-PCR測得未分化的大鼠MAPC并不表達顯著水平的Pdx-l、Ngn3、NeuroDl、Nkx6.1,Ins-l和Ins-2的轉(zhuǎn)錄物(少于35個循環(huán));低水平的Hnfl、Hnf3|i的轉(zhuǎn)錄物(30-35個循環(huán))；和可檢測水平的Nkx2.2和Glut2的轉(zhuǎn)錄物(<30個循環(huán))。對于本文描述的Q-RT-PCR反應(yīng)，引物序列在表3-5中示出并且使用如下的實驗方案用RNeasyMiniKit(Qiagen;ValenciaCA)從細胞中提取RNA，之后是用DNA-FreeTM(Ambion,Austin,TX)進行DNA酶處理。用TaqMan進4亍RNA的反轉(zhuǎn)錄(AppliedBiosystems,FosterCity,CA;第1步(孵育)25°C，10min;第2步(RT):48°C，30min;第3步(RT失活》95。C,10min)。反應(yīng)混合液在表6中示出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在反轉(zhuǎn)錄之后，按如下步驟進行定量實時PCR(Q-RT-PCR):第l步50°C，2min(孵育)；第2步95。C，10min(Taq激活)；第3步95。C,1Ss(變性)，之后⑩。C，lmin(延伸)，并重復(fù)訓(xùn)個循環(huán)；第4步95°C，15s(解離)；第5步60。C，20s(解鏈曲線)；第6步95。C，15s。Q-RT-PCR反應(yīng)混合物在表7中給出。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>總體積在初始的系列研究中，在6、12和18天后用Q-RT-PCR測定細胞密度(大約104-105個細胞/!12)、ECM成份(纖連蛋白、膠原、基質(zhì)膠)和不同濃度(10-100ng/mL)的bFGF(10-100ng/mL)、FGF2(10-100ng/mL)、激活素A(例如大約10ng/mL-大約100ng/mL)、BMP4(例如大約10ng/mL-大約50ng/mL)、視黃酸(大約1(T6M)、EGF(例如大約10-大約100ng/mL)、FGF10(例如大約50-大約150ng/mL，包括大約100ng/mL)、HGF(例如大約10-大約100ng/mL)、GDF11(例如大約50-大約150ng/mL)、環(huán)王巴明(例如大約10nM)、抗-SHH抗體(抗體；例如大約10ng/mL)、煙酰胺(例如5fiM-大約50jiM，包括大約10)、exendin4(大約5nM-大約50nM，包括大約10nM)、P_細胞素(例如大約50-大約150ng/mL)單獨或者其中兩者或三者的組合(以不同的時間順序組合)對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子、胰島素、胰高血糖素和促生長素抑制素表達水平的影響。激活素A、BMP4和環(huán)王巴明或抗-SHH抗體的組合引起Pdx-lmRNA的最大的升高(>100倍)。當細胞以大約50,000細胞/112接種于基質(zhì)膠上的時候，觀察到所述的Pdx-lmRNA的最大升高。然而，當細胞維持培養(yǎng)超過6天的時候，MAPC衍生的細胞出現(xiàn)死亡。單獨地或組合地測試后續(xù)加入的被認為在胰腺定向細胞進一步增殖和分化成成熟的內(nèi)分泌胰腺中起重要作用的因子，包括EGF(例如大約50ng/mL)、HGF(例如大約50ng/mL)和FGF10(例如大約100ng/mL)。這些研究證明，在第6天之后去除激活素A、BMP4和環(huán)王巴明或抗-SHH抗體并且將存在EGF或HGF但沒有FGF10的條件下培養(yǎng)細胞時，顯著地增強細胞的存活。EGF、HGF和/或FGF10組合沒有累加效應(yīng)。然而，當用EGF維持培養(yǎng)物的時候，超過12天的時候細胞也會出現(xiàn)死亡。在第12天后加入10pM煙酰胺(Sigma,St.Louis，MO)和10nM的Exendin4(Sigma,St.Louis，MO)支持細胞的更好的存活并且支持進一步分化成內(nèi)分泌胰腺，因為至第18天胰島素-1mRNA水平又增加2-4倍。當加入GDF11的時候，觀察到Insl和Ins2mRNA水平的進一步增加。通過調(diào)整分化過程中的不同步驟的持續(xù)時間，以及加入P-細胞素(50ng/mL),進行進一步優(yōu)化。在20%02以及Exendin4(或煙酰胺)、GDF11和p-細胞素條件下分化產(chǎn)生的胰島素1mRNA為胰腺水平的1%-3%。MAPC分化成胰腺細胞的示意圖在圖3中給出。根據(jù)這個分化的示意圖，將分化延續(xù)到第15-18天之后。至第18天，細胞簇從附著在皿底部的細胞中出芽(圖4)。所述培養(yǎng)物中以及從第18天開始在"間質(zhì)伺養(yǎng)層"之上的簇中的轉(zhuǎn)錄因子和激素mRNA的表達總結(jié)在圖5中。這些研究證明，從第3天開始，Hnf3a、Hnf6和Hnfla的mRNA表達有持續(xù)的早期的增加。Pdx-lmRNA從第3天開始增加，并且表達持續(xù)地增加至第21天。在第3天檢測到Ngn3的轉(zhuǎn)錄物，但是至第12-18天進一步增加10,000倍以上。它的下游耙標Neuro-D從第6天開始顯著地增加。從第15天開始觀察到Nkx2.2、胰島素-1和-2mRNA的顯著增加。在第18和21天的培養(yǎng)物上清液中收集的簇表達總大鼠胰腺的約1%的水平的胰島素-1mRNA、總大鼠胰腺的約1%的水平的胰島素-2mRNA、總大鼠胰腺的約0.5%的水平的胰高血糖素mRNA(未顯示)。仍然可以檢測到高水平的Ngn-3和Neuro-DmRNA,這說明在所述蔟中的細胞處于分化的不同階段。出人意料地是，某些轉(zhuǎn)錄因子(Ngn-3和Neuro-D以及至更小范圍的HNF3卩和HNF6)的水平在第12和/或18天表現(xiàn)出下降，之后該水平又再次升高。這可反映出該培養(yǎng)物是如何飼養(yǎng)的在第3、6、12、18和21天更換一半的培養(yǎng)基，而在第9和15天100%的培養(yǎng)基均被更換，此時細胞因子的混合物也被更換掉。因此，由于培養(yǎng)基完全改變，所述培養(yǎng)系統(tǒng)本身分泌的細胞因子或者細胞因子的突然改變可能起作用。在第18、21和24天，檢測所述附著"間質(zhì)"層細胞的內(nèi)胚層和中胚層特征。檢測到的Hnf水平與飼養(yǎng)細胞之上的簇中檢測到的水平?jīng)]有顯著差異。然而，在附著層中的Pdxl、Ngn3、Neuro-D、Insl和Ins2的mRNA水平比非附著簇中測定的水平低I，OOO-IO，OOO倍。另外，在所述間質(zhì)層中，存在有容易檢測的大量內(nèi)皮基因(Flkl、Fltl、VE-鈣粘蛋白和vWF)和平滑肌(SM22和aSMA)的轉(zhuǎn)錄物。內(nèi)皮的存在可能是有益的，因為有大量的證據(jù)表明胰腺(和肝)的發(fā)育依賴于內(nèi)皮的存在(Mats腿otoetal"2001;Lammertetal，2001)。除了內(nèi)分泌胰腺轉(zhuǎn)錄物，也檢測到低水平的外分泌胰腺轉(zhuǎn)錄物，包括淀粉酶。它們的水平比在新鮮胰腺組織中的水平低107-108倍(數(shù)據(jù)未顯示)。而且，其他外胚層基因——特別是肝細胞相關(guān)基因，包括AFP和白蛋白——也在以胰腺分化為目標的培養(yǎng)物中表達，表明所述分化條件不是100%胰腺特異的。在蛋白水平評估了表達的內(nèi)分泌胰腺標記物。對經(jīng)過胰腺分化條件(第0-9天，激活素A和BMP4;第3-9天，抗-SHH;第9-15天，EGF;第15-25天，煙酰胺、p細胞素、exendin4和/或GDF11)培養(yǎng)后約21天的培養(yǎng)大鼠MAPC進行免疫組織學(xué)檢查。對從間質(zhì)飼養(yǎng)層出芽的細胞簇進行胰高血糖素、c肽和Pdx-l的染色。如圖6中所示，10-20%的細胞對Pdx-l染色顯示出一種典型核型陽性；所述簇中l(wèi)-2V。的細胞對c肽染色顯示出一種典型的顆粒型陽性，所有這些細胞也為Pdx-l陽性；5-10%的細胞對胰高血糖素染色呈陽性，它們僅存在于細胞質(zhì)中；并且作為對照，也進行大鼠胰島素瘤(RIN)細胞的胰島素和胰高血糖素的染色。還檢測了在5%02或者在20%02下進行分化的效果。測得在20%02下的分化產(chǎn)生更高水平的Insl。轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)和任選地細胞因子介導(dǎo)的分化最近發(fā)表的文獻已經(jīng)證明，ES細胞(Miyazakietal，2004)或成體組織(腸上皮樣細胞；Yoshidaetal.，2002)中的胰腺鐠系轉(zhuǎn)錄因子PDX-1外源性表達，或者ES細胞(Dominguez-Bendalaetal.，2005)或成體組織(月夷管細胞；Heremansetal.，2002)中的次級轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)元素(neurogenin)-3的外源性表達可以上調(diào)這些細胞中胰島素。進行這樣的研究，在所述研究中用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)沿一種內(nèi)胚層胰腺通路方向誘導(dǎo)的大鼠MAPC，所述腺病毒載體表達鼠Pdx-1和鼠Ngn3cDNA。所述載體包含血凝素標記的小鼠神經(jīng)元素-3(Ad-Ngn3)或小鼠胰腺-和-十二指腸同源框-1(Ad-Pdxl)或增強的綠色熒光蛋白(Ad-GFP)編碼序列，所有它們都在巨細胞病毒(CMV)啟動子的調(diào)控下進行組成型表達(Heremans,Y.，etal.2002)。另夕卜，編碼Ngn3的腺病毒也包含另一個CMV啟動子下游的eGFPcDNA(Ad-Ngn3-GFP)。根據(jù)HeT-C.etal.1998描述的標準步驟擴增重組的復(fù)制缺陷型腺病毒。在0天；在激活素、BMP4和抗-SHH抗體初次處理后的第6天；或者在激活素、BMP4和抗-SHH抗體初次處理(接著用EGF處理6天)后的第12天進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在12孔的多孔板中進行腺病毒對培養(yǎng)細胞的感染。用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)(Cellgro)清洗所述細胞兩次。1個孔中的細胞被胰蛋白酶消化并且被應(yīng)用于測定細胞的數(shù)目。對于單次感染實驗，即Ad-GFP、Ad-Pdxl或Ad-Ngn3-GFP，用含1g/1葡萄糖(Cellgro)的低葡萄糖的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)將病毒稀釋到2500的感染復(fù)數(shù)(MOI)(每個細胞2500個感染的病毒顆粒)。在雙感染實驗中，即AdPdxl+AdNgn3GFP，兩種病毒都稀釋到1250的MOI。陰性對照由不含病毒的DMEM組成。在最后一次PBS清洗之后，去除細胞中的PBS并且每孔中加入0.35ml的病毒懸浮液，之后在37。C、7.5%C02的濕潤空氣(21%02)下培養(yǎng)細胞。在2小時后，去除病毒懸浮液，用PBS清洗細胞兩次，并且進一步用60%低葡萄糖的DMEM、40%MCDB-201(Sigma)(添加2。/o的胎牛血清(FCS))在37。C、7.5%C02的濕潤空氣(21%02)下培養(yǎng)細胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，所述細胞在沒有細胞因子或者存在有exendin、煙酰胺和/或GDF11條件下維持3天。在用所迷腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，鼠Pdx-l和Ngn3mRNA水平等于(PDX-I)或者顯著地高于(Ngn3)成熟鼠胰腺中檢測到的水平。當用抗Pdx-l和NeuroDl的抗體對用兩種腺病毒(Ad-Pdxl和Ad-Ngn3，每種以1:1250的MOI)轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)細胞進行染色時候，大部分的細胞染色呈陽性。在第0天的轉(zhuǎn)導(dǎo)沒有$I起被認為存在于Pdx-l和Ngn3下游的轉(zhuǎn)錄物(如NeuroD1)的任何變化。在第6天存在低水平的內(nèi)源的Pdx-l，這個時候的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致NeuroDl和Insl表達有一定程度的升高。單用Ad-Pdx-l對第12天的大鼠MAPC進行轉(zhuǎn)導(dǎo)可使NeuroDl的表達有小于100倍的增加，伴隨著對Insl和促生長素抑制素mRNA水平的最小限度的影響。單用Ad-Ngn3對第12天的大鼠MAPC進行轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)NeuroDlmRNA的表達增加10,000倍以上，伴隨著使促生長素抑制素mRNA增加100，000-倍和最小限度地增加胰島素-l和胰高血糖素mRNA水平。用Ad-Pdx-l和Ad-Ngn3的組合對第12天的大鼠MAPC進行轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致增加大鼠Pdx-lmRNA增加10倍，NeuroDlmRNA增加50倍，Pax-4mRNA增加100倍，伴隨著Insl增加10,000倍以上和促生長素抑制素mRNA增加3,000倍，并且沒有可檢測到的淀粉酶mRNA。更早期的內(nèi)胚層TF的水平，例如Hnf3p和Hnf6沒有4皮腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著影響，并且其他內(nèi)分泌胰腺TF(如Pax6和Nkx6.1)僅受最低限度的影響。這些研究證明，雖然僅使Ngn3過表達可增加NeuroDl和促生長素抑制素的水平，但觀察到它對胰島素-lmRNA僅有最低限度的作用。然而，Ngn3和Pdx-l的聯(lián)合不僅誘導(dǎo)NeuroDl的表達，而且還誘導(dǎo)胰島素-1的表達，這與NeuroDl和Pdxl(兩種胰島素-1增強子調(diào)控因子)都高水平存在時胰島素啟動子被最大程度的激活的發(fā)現(xiàn)一致。培養(yǎng)細胞中的Pdx-l、Neuro-Dl和胰島素的免疫組織化學(xué)按如下進行。細胞用PBS(Cellgro)洗兩次，并且用10%的中性緩沖福爾馬林(Sigma)的PBS溶液中固定10分鐘。用PBS洗兩次后，用PBS+0.05%的吐溫20進行15分鐘的細胞透化處理。用含3%H202(Sigma)的甲醇(Sigma)孵育30分鐘來阻斷內(nèi)源的過氧化物酶。用蒸餾水清洗2分鐘之后，通過相繼與抗生物素蛋白和生物素(BiotinBlockingSystem,DakoCytomation)—起孵育15分鐘以阻斷內(nèi)源性生物素，用PBS+0.05%的吐溫20清洗5分鐘進行分離。與生物素一起孵育之后，用PBS+0.05%的吐溫20清洗細胞5分鐘。通過與含0.4%魚皮明膠(Sigma)的PBS溶液一起孵育30分鐘以封閉非特異性結(jié)合位點。除去封閉緩沖液并且將用PBS+0.05%吐溫20+1%牛血清白蛋白(BSA)(JacksonImmunoresearch)稀釋的初級抗體加到細胞中并且4。C下孵育過夜。兔抗-Pdxl由C.Wright,VanderbiltUniversity,Nashville惠贈，并且以1:2000使用。兔抗-NeuroDl來自Chemicon(AB5686),并且使用0.67Hg/ml的濃度。豚鼠抗-胰島素來自于DakoCytomation(A0564),并且使用21.25jig/ml的濃度。兔和豚鼠同種型對照來自于JacksonImmunoresearch,并且使用與各自的初級抗體同樣的終濃度。第二天早晨用PBS+0.05。/o的吐溫20清洗細胞三次，每次五分鐘。以1:1500稀釋在PBS+0.05%吐溫20中的生物素化的抗-兔或抗-豚鼠F(ab')2抗體^L加到細胞中，并且孵育30分鐘。用PBS+0.05%吐溫20清洗細胞三次，每次五分鐘。才艮據(jù)制造商i兌明書制備的VectastainABC過氧化物酶復(fù)合體(VectorLaboratories):陂加到細胞中，并且孵育30分鐘。用PBS+0.05%的吐溫20清洗細胞三次，每次五分鐘。才艮據(jù)制造商的說明書，用DAB+(DakoCytomation)顯色。用NikonCoolpix4500數(shù)碼照相機拍攝照片，所述照相機安裝在ZeissAxioskop2上。石蠟包埋的懸浮細胞的C肽的免疫組織化學(xué)按如下進行。用PBS洗細胞兩次，并且用10。/o的中性緩沖的福爾馬林(Sigma)的PBS溶液固定10分鐘。用PBS清洗兩次之后，將細胞加入含2o/oVII型低溫膠凝瓊脂糖凝膠(Sigma)的PBS溶液中，并且進行石蠟包埋。切6微米的切片并且置于SuperFrostPlus載玻片(FisherScientific)上。經(jīng)過標準的脫蠟和復(fù)水之后，如上文在培養(yǎng)細胞Pdx-l、Neuro-Dl和胰島素的免疫組織化學(xué)中所述，染色并拍攝照片。兔抗-C-肽(abl043)來自BetaCellBiologyConsortium,并且以1:2000使用。借助超靈敏大鼠胰島素ELISA(UltrasensitiveRatInsulinELISA)試劑盒(Mercodia)和大鼠C-肽ELISA(RatC-peptideELISA)試劑盒(Wako),通過ELISA測量胰島素和C-肽。例如，大鼠FisherMAPC在用激活素A、BMP4和抗-SHH抗體分化6天，再用EGF分化6天后，，用Ad-Pdx-1和Ad-Ngn3(兩者的MOI都是1250)感染。在感染后三天，收集上清液以測量胰島素和C-肽的基礎(chǔ)水平。然后，用PBS清洗細胞兩次，并且使細胞與750nL的20mM的葡萄糖一起孵育。一個小時之后，測量這些細胞的上清液中的胰島素和C-肽的水平。還從這些細胞收集RNA樣品以評估胰島素和其他胰腺標記物的表達。表8總結(jié)了關(guān)于C-肽分泌的結(jié)果。通過連續(xù)加入細胞因子并用Pdx-l和Ngn-3腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所產(chǎn)生的細胞對20mM葡萄糖反應(yīng)分泌C-肽。表8分化成內(nèi)分泌胰腺的MAPC分泌的C-肽<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>(以匯合密度接種MAPC并且相繼用激活素、BMP4和抗-SHH抗體(第1-6天)、接著用EGF(第6-12天)處理。在第12天，用Ad-Pdx-l和Ad-Ngn3轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，并且在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持3天(FCS2%),或者在存在exendin和煙酰胺并且在有或者沒有GDF11的條件下維持3天。然后使細胞接觸0mM/mL的葡萄糖或20mM/mL的葡萄糖1小時，并且收集培養(yǎng)基進行C-肽的測量。使用一種大鼠特異的c-肽ELISA,值為ng/L。)所述數(shù)據(jù)證明，通過連續(xù)地添加細胞因子并用Pdx-l和Ngn-3腺病毒載體進行轉(zhuǎn)導(dǎo)所產(chǎn)生的細胞對20mM的葡萄糖反應(yīng)時會分泌C-肽。假定1fmol的C-肽含0.003325ng的C-肽，則檢測到150.97fmolC-肽/孔(0.6mL培養(yǎng)基/孔)。因此，這些研究證明，誘導(dǎo)表達InslmRNA和Pdx-lmRNA的MAPC也可以對葡萄糖反應(yīng)分泌胰島素，這是功能性P-細胞的顯著特征。也可以使用非病毒載體。例如，或者從RNA或者從基因組DNA(Invitrogen)擴增編碼PDX1和神經(jīng)元素-3(例如人或大鼠)的cDNA。使用標準的方法進行PCR擴增，使用的引物被設(shè)計成專門對所述基因的開放閱讀^f匡序列擴增，引入Kozak序列(ccaccATG)以增強翻譯起始并且引入獨特的HindIII(aagctt)和XhoI(ctcgag)側(cè)翼序列限制酶位點以利于進行所述cDNA的克隆。表9提供產(chǎn)生這些cDNA的引物。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>隨后，用HindIII和Xhol消化擴增的cDNA，并且克隆到市售的表達載體pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogencat.幷V870-20)的互補位點中。在進行細胞轉(zhuǎn)染之前用J/^I或5g/II將純化的載體線性化。通過化學(xué)轉(zhuǎn)染將線性化的cDNA轉(zhuǎn)染入MAPC。在含有潮霉素作為篩選劑的擴增培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。體外非轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞對葡萄糖反應(yīng)時的C-肽分泌測定在高葡萄糖影響下的MAPC-子細胞的胰島素產(chǎn)生。已經(jīng)確定，在20mM的葡萄糖影響下，高水平表達胰島素-1mRNA的樣品也向培養(yǎng)基中分泌胰島素，進一步表明MAPC可以分化成具有內(nèi)分泌胰腺特征的細胞。另外，測量C-肽分泌以確定所述釋放的胰島素不是從含有胰島素的培養(yǎng)基中吸收的(圖7)。在該評估中，在低葡萄糖(3nM)下培養(yǎng)4種培養(yǎng)物，并且在第16-24天，每天向培養(yǎng)物施加加入1小時18nM的葡萄糖脈沖，之后收集上清液并測定產(chǎn)生的c-肽。這些研究證明，在上述條件下培養(yǎng)的MAPC從培養(yǎng)開始的第18天開始每天分泌c-肽，在第20-22天^見察到最大分泌。通過ELISA測定胰島素和C-肽(Rajagopaletal.，2003;Hanssonetal"2004)。釣成像以評估通道的表達胰腺P細胞對升高的葡萄糖水平產(chǎn)生分泌胰島素的反應(yīng)。p細胞上載有用于實現(xiàn)該功能的葡萄糖轉(zhuǎn)運體、ATP-敏感的鉀離子通道和電壓激活的(L-型)鈣通道?？梢允褂贸上窈腿毎てQ研究，以確定干細胞衍生的胰腺p樣細胞是否具有類似的載體和通道以對升高的細胞外葡萄糖(3-20mM)有反應(yīng)。已經(jīng)確定，MAPC衍生的p細胞表達K通道和L-型電壓激活的4丐通道(用裝載有Fura-2應(yīng)答鈣指示劑的細胞進行鈣成像實驗)。圖8示出了一個細胞的應(yīng)答。在同一簇的另12個細胞中和以相同方式分化的另兩個簇中獲得了相同的結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，MAPC衍生的p細胞具有K通道，所述通道的開啟受條件的控制。胞外K濃度的增加引起一個導(dǎo)致電壓激活的Ca通道開啟的去極化。這些通道已知在對葡萄糖產(chǎn)生反應(yīng)并導(dǎo)致p細胞分泌胰島素中起重要作用。B細胞功能的體內(nèi)評估通過將細胞移植到SZO處理的棵鼠的腎被膜下，獲得了MAPC在體外衍生的p細胞與從成體小鼠中分離的p細胞在功能上等價的證據(jù)。通過尾靜脈單次靜脈注射鏈唑霉素(streptozotocin)(200-240mg/kg)使小鼠形成糖尿病。根據(jù)兩次連續(xù)的血糖值>400mg/dl確定糖尿病。用0.015ml/g體重的阿佛丁(Avertin)麻醉受體小鼠。通過側(cè)面的切口暴露左腎或右腎，在該腎的上極進行嚢切開術(shù)，并且使用一個細玻璃探針向所述腎的下部和前外側(cè)面延伸，將腎被膜與實質(zhì)分開形成一個嚢，并且將所述MAPC衍生的細胞緩慢地注入所述嚢中。沒有接受細胞的小鼠作為陰性對照，移植了300個成體胰島的小鼠被用作陽性對照(在l天內(nèi)進行高血糖校正)。由于小鼠在糖尿病狀態(tài)不會長期存活，植入胰島素小丸(LinBit，LinShin，Scarborough(Toronto),Ontario,Canada)以將血糖的水平降至約300mg/dL。當血糖水平連續(xù)3天〈200mg/dL的時候，逐步地除去胰島素小丸。或者，可以對沒有接受MAPC衍生的P細胞的那只腎進行腎被膜下的胰島的同系移植。這將使動物血糖正常。在移植MAPC衍生的P細胞/移植物之后大約2、4或6周去除所述胰島移植物。在一系列移植中，第21天的MAPC衍生的子細胞被移植到8只SZO處理的動物的腎被膜之下。在細胞移植之前5天以上，動物接受SZO。所有的動物具有^00mg/dL的血糖水平。在第-l天，皮膚下植入胰島素小丸(根據(jù)動物的體重移植胰島素小丸，例如第一個20克一個丸，接下來每5克增加一丸)。在第0天，將細胞植入腎被膜之下。在4只動物中，植入l百萬個懸浮簇(約10-20,000胰島素陽性細胞)。在另外的4只動物中，植入l百萬個懸浮簇(約10-20，000胰島素陽性細胞)+1百萬個附著的間質(zhì)細胞(富集表達內(nèi)皮的和平滑肌標記物、但內(nèi)胚層轉(zhuǎn)錄物和胰島素-1轉(zhuǎn)錄物的水平低的細胞)的組合。每1-2天評估動物的血糖水平。在約4周之后，去除胰島素小丸，并且觀察動物6-7天。處死連續(xù)2天具有〉600mg/dL的葡萄糖的動物。具有〈400mg/dL的血糖的動物保留6天，之后去除接受過植入的腎。然后繼續(xù)維持動物3-4天以評估血糖水平。圖9中顯示了該示意圖。如圖9中所示，僅接受上清液細胞的1只動物在去除胰島素小丸后，保持血糖基本正常(100-200mg/dL)。去除腎后，由于隔膜受損立即出現(xiàn)了一個外科手術(shù)問題。雖然進行了外科手術(shù)矯治，所述動物仍呈病態(tài)，并且不進食，因此無法評估腎切除術(shù)之后的葡萄糖水平。接受上清液細胞和附著的間質(zhì)細胞的組合的4只動物中有2只在去除胰島素小丸后保持350-450的葡萄糖，并且在腎切除術(shù)之后血糖增加到600mg/dL以上。這些研究表明，3/8的動物的腎移植細胞包含分泌胰島素的細胞，這使得血糖維持在150-450。參考文獻Abe,A""".':Kro/.1998;72:6159-6163.Ahlgren，U.，etal.，6^鵬"ev.簡;12:1763-1768.Akimenko,M.A.，/iVeMms"'1994;14:3475-86.AlterBP,O聰rC潔fCy豐打ef.1992;58:206-8;discussion209.Alvarez-DoiadoM.,etal.Atowm2003;425:968-973.Ang,S丄.，etal.,iPevd0;7附e:加1993;119:1301-1315.Apelqvist，A.，JV^w'eetal.,1999;400:877-881,AratigurenXL,etal.KeystoneSymposiumonstemcells.2005.Babcook,etal.,尸賦胸/,^ted"辟1996;93:7843-7848.BarkerJNandWagnerJE.JVCC塞e,,2003;3:526-532.BarkerJNetal.,2003;102:1915-1919,BarkerJNetal.,2004;ePub.BarnettMJetal.,1994;84:724-732，Basch,et.al.，J./畫wwo/.1983;56:269.Batinic,D.,etal.，5cmeMarnwrrcmip/tm亡1990;6(2):103-7,Beattie,G.M.，etal.，A'"&組1996;45(9):1223-8.Beattie,G.M.,etal.，Dz'Wetey.1999;4^5、'1013-9.Ben-ShushanEetal.,MoZCdZ^ioZ,1998;18:1866-1878.BertrandJYetal.，ProciVaf/4cadSa'C/Sil2005;102:134-139.BhardwajGetal.胸/讓歸/.2001;2:172-180.BhatiaMetal.，脂臉d1998;4:1038-1045.BhatiaRetal.,飾od1995;85:3636-3645.BhatiaRetal.，5Zood,2003;皿:4701-4707.BhatiaRetal.，/C7/"/"ve"1994;94:384-391.BhushanA,etal.Z)e油;卿"，2001;128:5109-5117.Bierhuizen，M.eta〗.，說W.1997;—):3304-3315.Bird,etal.,Sde打ce.1988;242:423-426.BittiraB,etal.及"VGmto/zoracSw"g.2003;24:393-398.BjorklimdLMea.P，淑"dmSa'C/".2002;99:2344-2349.Bodnar,A.G,，etal"Scie亂1998;279(5349):349-52.Boneva,R.S.andT.M.Folks,4miWk/.2004;36(7):504-17.BorueX,etal.爿m/尸加/zo/.2004;165:1767-1772.Bossard,P.,andZaret,K.S."《ve/印we加1998;125:4909-4917.Bredenbeek,P丄，&d,]^raZ.1993;67:6439-6446.Brice,G.T.，etal.,J,Xcgwir/mm.De力cjSy打c^iwmiefrovz>o/.1998;19:210-220.B薩nlee，M.，她加'e.2001;414(6865):813-20.BuckleySetal.，Ceto.2004,CaiZ.H.,etal.,乂^fOga肌1988;12(5):388-93.CamargoFDetal.,/C/z>zJ廳W.2004;113:1266-1270.C油na，K.,etal"2006;12(3):304-6.CarellaAMetal.，B/oodiev.1997;11:154-159.Cefalu,W.T.，Am/Mec/.2002;113Suppl6A:23S-35S.CerdanCetal.，Wood2004;103:2504-2512.ChambersIetal.,(>//■2003;113:643-655.Chang,5Z。odPw"y;2000;18:91-96.Chang,P.，etal.,JVe"&h說otec/z.1999;17:78-83.Chang，T.M,，勿z/Og趣，1992;16(l):71-4.ChoiKetal,，歷ocA微簡;76:947-956.ChoiKetal.,Dev鄉(xiāng)meW.1998;125:725-73;Clacksonetal.iVatore.1991;352:624-628.Clarke,Sc/ewce.2000;288:1660-3.ClavelC,etal.,KeystoneSymposiumonstemcells.2005.Clothiaetal.,J!iWo/.5zW.11985;186:651-66,1985..Coligan，etal.，CurrentProtocolsinLnmunologv,(1991and1992).Cras-Meneur,C.,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島素的細胞的方法，所述方法包含a)將可以分化成外胚層、內(nèi)胚層和中胚層細胞類型中的至少兩種的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖細胞與一種第一試劑相接觸，其中所述第一試劑是激活素A;b)將步驟a)中獲得的細胞與激活素A和一種第二試劑相接觸，其中所述第二試劑抑制音猬因子活性；c)將步驟b)中獲得的細胞與EGF或HGF相接觸；d)將步驟c)中獲得的細胞與煙酰胺或exendin4這兩者中的一種或這兩者相接觸以產(chǎn)生表達胰島素或胰島素表達升高的細胞；并e)將所述的表達胰島素或胰島素表達升高的細胞給予所述受試者。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述步驟a)、步驟b)或者兩者都進一步包含BMP-4。44.權(quán)利要求42或43的方法，其中所述步驟d)進一步包含GDF11或p-細胞素這兩者中的一種或這兩者。45.權(quán)利要求37=44任一項的方法，其中所述受試者是一種哺乳動物。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述哺乳動物是人。47.權(quán)利要求37-46任一項的方法，其中所迷受試者具有一種胰腺的病癥或損傷。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述病癥包括糖尿病、肥胖癥、胰腺閉鎖、胰腺炎癥、al-抗胰蛋白酶缺乏癥、遺傳性胰腺炎、胰腺癌、胰酶缺乏癥或高胰島素血癥。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述糖尿病是I型或者II型糖尿病。50.權(quán)利要求47的方法，其中所述損傷由物理創(chuàng)傷、化學(xué)品、輻射、衰老、疾病或它們的組合引起。51.權(quán)利要求l-17任一項的方法制備的細胞在制備一種治療一種胰腺的病癥或損傷的藥劑中的用途。52.權(quán)利要求51的用途，其中所述胰腺的病癥包括糖尿病、肥胖癥、胰腺閉鎖、胰腺炎癥、al-抗胰蛋白酶缺乏癥、遺傳性胰腺炎、胰腺癌、胰酶缺乏癥或高胰島素血癥。53.權(quán)利要求52的用途，其中所述糖尿病是I型或者II型糖尿病。54.權(quán)利要求51的用途，其中所述損傷由物理創(chuàng)傷、化學(xué)品、輻射、衰老、疾病或它們的組合引起。55.權(quán)利要求51-54任一項的用途，其中所述藥劑進一步包含一種生理上可接受的載體。全文摘要本發(fā)明提供將非胚胎多能干細胞向胰腺譜系分化的方法。本發(fā)明進一步提供非胚胎多能干細胞及其衍生的子代，從而為受試者提供胰腺細胞。文檔編號C12N5/071GK101310012SQ200680038298公開日2008年11月19日申請日期2006年10月16日優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日發(fā)明者C·維爾法伊,M·A·布拉杰·維利茲,Y·P·赫曼瑟申請人:明尼蘇達大學(xué)董事會