專利名稱：Vsig4和igrp雙基因共表達(dá)重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，特別涉及一種VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病 毒，還涉及該重組腺病毒的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，由于身體的免疫系統(tǒng)攻擊胰島β細(xì)胞破壞其 分泌胰島素的能力而引起。目前主要依賴胰島素和胰島移植進(jìn)行治療，雖然能夠降低患者 的死亡率，卻存在著大量副作用。隨著研究的深入，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的1型 糖尿病的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，特異性誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受對1型糖尿病是 一種很有希望的治療策略。在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，T細(xì)胞的活化不僅需要抗原肽與主要組織相容性復(fù) 合體(MHC)的復(fù)合刺激，而且需要Β7家族成員提供關(guān)鍵的共刺激信號。含V-set和免疫球 蛋白域4(V-set and Ig domain containing 4，VSIG4)又稱補(bǔ)體受體免疫球蛋白超家族分 子(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily, CRIg),是一禾中新發(fā)現(xiàn)的 B7家族相關(guān)蛋白。VSIG4的mRNA高表達(dá)于成人肺、胎盤、肝和心臟等組織，但VSIG4主要局 限表達(dá)于巨噬細(xì)胞，在單核細(xì)胞中幾乎沒有表達(dá)，并且當(dāng)巨噬細(xì)胞受外來刺激活化后VSIG4 表達(dá)下調(diào)。既往研究發(fā)現(xiàn)，VSIG4是巨噬細(xì)胞上的補(bǔ)體受體，可結(jié)合補(bǔ)體C3的降解片段C3b 和iC3b，對于病原體的吞噬起重要作用。最近研究顯示，VSIG4有抑制T細(xì)胞活化的作用， 且作用強(qiáng)于PD-Ls/PD-Ι途徑，是一個有力的T細(xì)胞活化負(fù)調(diào)節(jié)分子。葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)是一種胰島特異性T細(xì)胞自身抗原， 在1型糖尿病的發(fā)病過程中起著非常關(guān)鍵的作用，患者體內(nèi)有大量的IGRP特異性T細(xì)胞存 在。因此，在1型糖尿病的治療中，IGRP有可能成為誘導(dǎo)免疫耐受的重要分子?；蚵?lián)合治療的方式主要有兩種一是將多種分別攜帶不同基因的重組表達(dá)載體 同時轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，這種方式可以自由調(diào)節(jié)各重組表達(dá)載體的比例，但需要分別構(gòu)建攜帶不 同基因的重組表達(dá)載體，構(gòu)建工作繁瑣、費(fèi)時，影響因素多；此外，由于轉(zhuǎn)染過程具有一定隨 機(jī)性，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存在基因拷貝不均一的問題，既不利于目的基因的表達(dá)及后續(xù)治療，又 導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果難于評估分析；上述缺點(diǎn)限制了此種方式的進(jìn)一步應(yīng)用。二是將兩個或兩個 以上的基因由一個載體攜帶表達(dá)，這種方式可以通過多啟動子載體、多順反子載體或融合 基因等調(diào)控手段提高基因轉(zhuǎn)染效率，增加表達(dá)強(qiáng)度，并維持相對的表達(dá)比例，從而克服了前 一種方式的不足，近年來日益受到研究者的重視。樹突狀細(xì)胞不僅是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，可以有效激活初始T細(xì)胞 啟動免疫應(yīng)答反應(yīng)，而且樹突狀細(xì)胞本身具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)免疫耐受的作用。體外構(gòu) 建攜帶免疫抑制分子基因的重組病毒并轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞制成樹突狀細(xì)胞疫苗，再將其回輸 體內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)免疫耐受等方面的治療。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病 毒，能夠有效誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞耐受，并有效抑制胰島β細(xì)胞的破壞；目的之二在于提供所 述VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法；目的之三在于提供所述VSIG4和 IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
1、VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒，所述重組腺病毒基因組中包含一個 VSIG4和IGRP雙基因表達(dá)盒，所述VSIG4和IGRP雙基因表達(dá)盒由上游至下游依次包含CMV 啟動子、VSIG4全長編碼基因、終止子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES、IGRP全長編碼基因和終止子。2、所述VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，包括以下步驟
a、RT-PCR 擴(kuò)增 VSIG4 全長 cDNA ；b、RT-PCR 擴(kuò)增 IGRP 全長 cDNA ；C、將步驟a所得VSIG4全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，步驟b所得IGRP 全長cDNA插入pStar載體的IRES下游，得重組載體pStar_VSIG4-IRES_IGRP ；d、以步驟c所得重組載體pStar-VSIG4-IRES_IGRP為模板，PCR擴(kuò)增 VSIG4-IRES-IGRP片段并更換該片段兩端的酶切位點(diǎn)；e、將步驟d所得VSIG4-IRES-IGRP片段插入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV的CMV 啟動子下游，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP ；f、將步驟e所得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP與腺 病毒骨架載體PAdEasy-I在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，得重組腺病毒載體 pAd-VSIG4/IGRP ；g、將重組腺病毒載體pAd-VSIG4/IGRP在293細(xì)胞中包裝成重組腺病毒Ad-VSIG4/ IGRP。進(jìn)一步，步驟a的具體方法為提取人肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以巢 式PCR擴(kuò)增VSIG4全長cDNA 第一輪PCR以所得總cDNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列為上下游引物；第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 4所示序列為上下游引物；每輪PCR的循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然 后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘； PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4 ；進(jìn)一步，步驟b的具體方法為提取人胰腺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該 總cDNA為模板，以SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增IGRP全 長cDNA，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒， 72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy 載體，得重組載體pT-IGRP;進(jìn)一步，步驟c的具體方法為自重組載體pT-VSIG4中用Pst I和EcoR I雙 酶切出VSIG4全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接， 得重組載體pStar-VSIG4 ；再自pT-IGRP載體中用BamH I和Sal I雙酶切出IGRP全長 cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的pStar_VSIG4載體連接，得重組載體pStar-VSIG4-IRES-IGRP ；進(jìn)一步，步驟d的具體方法為以重組載體pStar-VSIG4-IRES-IGRP為模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No. 10所示序列為上下游引物進(jìn)行PCRjf VSIG4-IRES-IGRP片段兩端 的酶切位點(diǎn)更換為Sal I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5 分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸 10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入ρΤ-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4-IRES_IGRP ；進(jìn)一步，步驟e的具體方法為自重組載體pT-VSIG4-IRES-IGRP中用Sal I和Not I雙酶切出VSIG4-IRES-IGRP片段，經(jīng)純化后與同樣用Sal I和Not I雙酶切的腺病毒穿梭 載體pShuttle-CMV連接，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP ；進(jìn)一步，步驟f的具體方法為將重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP用Pme I酶切線性化，再與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι同 時電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，得重組腺病毒載體pAd-VSIG4/ IGRP ；進(jìn)一步，步驟g的具體方法為將人胚胎腎293細(xì)胞以40% 60%的細(xì)胞密度接 種至培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至30 % 50 %融合時，采用Lipofectamine 2000試劑將重組腺 病毒載體pAd-VSIG4/IGRP轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時離心收集細(xì)胞，用磷酸鹽 緩沖液重懸后，反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解，離心去除細(xì)胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重組 腺病毒 Ad-VSIG4/IGRP。3、所述VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒在制備抗1型糖尿病的樹突狀細(xì) 胞疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將胰島特異性抗原IGRP與新型免疫抑制分子 VSIG4進(jìn)行聯(lián)合表達(dá)，可以誘導(dǎo)IGRP特異性的淋巴細(xì)胞免疫耐受，使胰島細(xì)胞能局部性逃 逸免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，而其他正常組織和器官不會受到影響。將本發(fā)明的VSIG4和 IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞再回輸糖尿病易患性NOD小鼠，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，本發(fā)明的重組腺病毒能夠降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞因子 分泌能力，而且能夠延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間并降低發(fā)病率，表明本發(fā)明的重組腺 病毒能夠有效誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞耐受，并有效抑制胰島β細(xì)胞的破壞，可以用于制備抗1 型糖尿病的樹突狀細(xì)胞疫苗，在1型糖尿病治療領(lǐng)域具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。同時，本發(fā) 明重組腺病毒的制備方法簡單，成本低。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1顯示了 VSIG4全長cDNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(1泳道為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為PCR產(chǎn)物)；圖2顯示了 IGRP全長cDNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(1泳道為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為PCR產(chǎn)物)；圖3顯示了 VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)的免疫印跡(Western Blot)結(jié)果(1泳道 為Ad-VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞總蛋白，2泳道為空病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞總蛋白)；
圖4顯示了淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測結(jié)果；圖5顯示了淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的檢測結(jié)果；圖6顯示了 NOD小鼠糖尿病的平均發(fā)病率。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP的制備1、VSIG4 全長 cDNA 的克隆按Trizol試劑盒說明書提取人肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以巢式PCR 法擴(kuò)增VSIG4全長cDNA 第一輪擴(kuò)增以所得總cDNA為模板，以Fl :5，-ggtagcaggaggctgga agaaag-3，(SEQ ID No. 1)禾口 Rl :5，-tcagcagatcctggcctaatgg-3‘ (SEQ ID No. 2)為上下 游引物；第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以F2 :5’ -aatctgcaggccaccatggggatcttac tgggcctg-3，(SEQ ID No. 3，下劃線部分為 Pst I 酶切位點(diǎn))和 R2 5‘-tacgaattcttaacaga cacttttgccctcag-3' (SEQ ID No. 4，下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))為上下游引物；每輪 PCR體系為50 μ 1，循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50 秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒 定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定，將陽性克隆 質(zhì)粒命名為pT-VSIG4。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約1200bp處呈單一特異性條帶(圖1)，與預(yù) 期結(jié)果相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列(SEQ ID No. 5)與GenBank登錄 號為NM_007268的VSIG4全長cDNA序列一致。2、IGRP 全長 cDNA 的克隆按Trizol試劑盒說明書提取人胰腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總 cDNA 為模板，以 F3 :5，gatc￡g^￡ccaagatgatatgggtagc-3，(SEQ ID No. 6，下劃線部分為 BamH I 酶切位點(diǎn))和 R3 5' -acgc￡tcgactgtcaatgtggatccagtc-3' (SEQ IDNo. 7，下劃線部 分為Sal I酶切位點(diǎn))為上下游引物，PCR擴(kuò)增IGRP全長cDNA，PCR體系為50 μ 1，循環(huán)條 件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30 個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回 收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青 霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pT-IGRP。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在約IlOObp處呈單一特異性條帶(圖2)，與預(yù) 期結(jié)果相符；測序結(jié)果顯示陽性克隆質(zhì)粒的插入基因序列(SEQ ID No. 8)與GenBank登錄 號為NM_021176的IGRP全長cDNA序列一致。3、重組載體 pStar-VSIG4-IRES_IGRP 的構(gòu)建根據(jù)VSIG4和IGRP全長cDNA兩端所設(shè)計的酶切位點(diǎn)，首先將VSIG4全長cDNA 插入pStar載體的IRES上游，再將IGRP全長cDNA插入pStar載體的IRES下游。具體方法為先將PT-VSIG4載體用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠 回收純化后，與同樣經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，Pst I和EcoR I 雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pStar-VSIG4 ；再將pT_IGRP載體用BamH I和Sal I 雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切 的pStar-VSIG4載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素 的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，BamH I和Sal I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為 pStar-VSIG4-IRES-IGRP。4、重組載體 pShuttle-CMV-VSIG4-IRES_IGRP 的構(gòu)建以 pStar-VSIG4-IRES_IGRP 載體為模板，以 F4 :5，-acgcgtcgacgccaccatgggg-a tctta-3' (SEQ ID No. 9，下劃線部分為 Sal I 酶切位點(diǎn))和 R4 :5，-agaatcgcggccgc-tta acagacacttttgcc-3，(SEQ ID No. 10，下劃線部分為Not I酶切位點(diǎn))為上下游引物，PCR 擴(kuò)增VSIG4-IRES-IGRP片段并將該片段兩端的酶切位點(diǎn)更換為Sal I酶切位點(diǎn)和Not I 酶切位點(diǎn)，PCR體系和循環(huán)條件參數(shù)同前。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試 劑盒切膠回收純化后，與ρΤ-Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞， 用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，測序鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為 PT-VSIG4-IRES-IGRP。將pT-VSIG4-IRES-IGRP載體用Sal I和Not I雙酶切，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試 劑盒切膠回收純化后，與同樣經(jīng)Sal I和Not I雙酶切的pShuttle-CMV載體連接，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒， Sal I和Not I雙酶切鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒命名為pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP。5、重組腺病毒載體pAd_VSIG4/IGRP的構(gòu)建將pShuttle-CMV-VSIG4-IRES_IGRP 載體用 Pme I 酶切線性化，再與 pAdEasy-Ι 載 體同時電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，用含有卡那霉素的LB平板 培養(yǎng)，挑取較小菌落，用含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，Pac I酶切鑒 定，將陽性質(zhì)粒命名為pAd-VSIG4/IGRP。6、重組腺病毒載體pAd_VSIG4/IGRP的包裝將人胚胎腎293細(xì)胞以40% 60%的細(xì)胞密度接種至T_25培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生 長至30% 50%融合時棄去培養(yǎng)液，用Lipofectamine 2000試劑將pAd_VSIG4/IGRP載體 轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過顯微鏡觀察細(xì)胞病理改變，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)時離心收集細(xì)胞， 細(xì)胞沉淀用PBS重懸后，反復(fù)凍融4次使細(xì)胞裂解，離心去除細(xì)胞碎片，收集含病毒的上清 液，即得Ad-VSIG4/IGRP病毒原液；將病毒原液按1 10的比例重新感染293細(xì)胞，收集含 病毒的上清液，重復(fù)上述操作3次，得第四代重組腺病毒Ad-VSIG4/IGRP。二、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗的制備1、樹突狀細(xì)胞的分選取4周齡Balb/c小鼠，脫頸處死，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液浸泡5分鐘，無 菌條件下切開皮膚及皮下組織，分離小鼠股骨和脛骨，用濃度為0. Olmol/L的無菌PBS清洗 3 5次，剪斷股骨和脛骨兩端，用濃度為0. 01mol/L的無菌PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，制成單 細(xì)胞懸液，1000r/min離心5分鐘去掉脂肪層，細(xì)胞用濃度為0. 01mol/L的無菌PBS重懸，再緩慢加入等體積Percoll細(xì)胞分離液，3000r/min離心30分鐘，收集單核細(xì)胞，用濃度為0. Olmol/L的無菌PBS洗滌2次，再用含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，所得單細(xì)胞懸液接種于 T-25培養(yǎng)瓶內(nèi)，并補(bǔ)充粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)，置溫 度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日半量換液補(bǔ)充細(xì)胞因 子，第7天收獲細(xì)胞，即得樹突狀細(xì)胞。2、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞將樹突狀細(xì)胞以細(xì)胞濃度為IXlO6個/ml接種于6孔板，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為100 加入第四代重組腺病毒Ad-VSIG4/IGRP，感染后48小時收集細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸，即得 Ad-VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞。Western Blot檢測分別超聲裂解Ad_VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞和空病毒 轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后電轉(zhuǎn)印PVDF膜，洗膜，封閉， 加入兔抗人VSIG4或IGRP多克隆抗體，37°C孵育1小時，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37°C孵 育1小時，洗膜，顯色。結(jié)果見圖3，Ad-VSIG4/IGRP病毒在樹突狀細(xì)胞中可以表達(dá)VSIG4和 IGRP。三、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗抗1型糖尿病能力檢測取2月齡糖尿病易患性NOD小鼠，隨機(jī)分為兩組實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈 回輸Ad-VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞，連續(xù)回輸3次，每周1次，每次輸入1 X IO6個細(xì) 胞；對照組正常飼養(yǎng)。1、淋巴細(xì)胞增殖能力檢測末次回輸后1周，斷頸處死兩組小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網(wǎng)碾 磨成細(xì)胞懸液，用常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離獲得脾淋巴細(xì)胞，用含有 體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X IO6個/ml，接種至 96孔板，每孔100 μ 1，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入IGRP重組蛋白至終濃度為lmg/ml，置 溫度為37°C、CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96小時，再每孔加入0. Iml濃度為 IXlO3U Ci/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12小時，用PBS漂洗細(xì)胞3次， 甲醛固定10分鐘，再用溫度4°C預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入 0. 5ml濃度為0. 3mol/L的NaOH溶液，60°C水浴反應(yīng)30分鐘，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移入閃爍瓶中， 加入5ml閃爍液，用液體閃爍計數(shù)器計數(shù)每分鐘的閃爍次數(shù)(cpm)，測定DPM值(反映細(xì)胞 DNA合成速率)，重復(fù)測定3次。結(jié)果見圖4，實(shí)驗(yàn)組小鼠淋巴細(xì)胞的cpm值為30000士4200，而對照組小鼠淋巴細(xì) 胞的cpm值為50000 士4900，證實(shí)Ad-VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗能夠有效降低淋 巴細(xì)胞的增殖能力。2、淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力檢測末次回輸后1周，斷頸處死NOD小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨 成細(xì)胞懸液，用常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離獲得脾淋巴細(xì)胞，用含有體 積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X IO6個/ml，接種至96 孔板，每孔100 μ 1，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入IGRP重組蛋白至終濃度為lmg/ml，置溫度為 37CO2氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)96小時后，用ELISA法檢測白介素2(IL_2) 和干擾素-Y (IFN-y)的含量。
結(jié)果見圖5，實(shí)驗(yàn)組小鼠淋巴細(xì)胞的IL-2和IFN-Y含量分別為45. 2士5. 7pg/ ml和38. 7 士4. 9pg/ml,而對照組小鼠淋巴細(xì)胞的的IL-2和IFN- γ含量分別為 108. 5 士 12. 7pg/ml和107. 4 士 13. 6pg/ml，證實(shí)Ad_VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗能 有效降低淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。3、NOD小鼠糖尿病發(fā)病率檢測監(jiān)測實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的血糖水平。結(jié)果見圖6，實(shí)驗(yàn)組小鼠18周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率為 40%，而對照組小鼠14周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率高達(dá)80% ；證實(shí) Ad-VSIG4/IGRP病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞疫苗能夠有效延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間，并降 低糖尿病的發(fā)病率。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用<160>10<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Fl<400>1ggtagcagga ggctggaaga aag23<210>2
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Rl<400>2tcagcagatc ctggcctaat gg22<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
〈223〉引物 F2〈400>3aatctgcagg ccaccatggg gatcttactg ggcctg 36<210>4〈211〉<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 R2<400>4tacgaattct taacagacac ttttgccctc ag32<210>5<211>1200<212>DNA〈213〉 智人(homo sapiens)<400>5atggggatct tactgggcct gctactcctg gggcacctaa cagtggacac ttatggccgt 60cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc 120tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt 180ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca 240aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg 300agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct 360gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtccagaa actctctgtc 420tccaagccca cagtgacaac tggcagcggt tatggcttca cggtgcccca gggaatgagg 480attagccttc aatgccaggc tcggggttct cctcccatca gttatatttg gtataagcaa 540cagactaata accaggaacc catcaaagta gcaaccctaa gtaccttact cttcaagcct 600gcggtgatag ccgactcagg ctcctatttc tgcactgcca agggccaggt tggctctgag 660cagcacagcg acattgtgaa gtttgtggtc aaagactcct caaagctact caagaccaag 720actgaggcac ctacaaccat gacatacccc ttgaaagcaa catctacagt gaagcagtcc 780tgggactgga ccactgacat ggatggctac cttggagaga ccagtgctgg gccaggaaag 840agcctgcctg tctttgccat catcctcatc atctccttgt gctgtatggt ggtttttacc 900atggcctata tcatgctctg tcggaagaca tcccaacaag agcatgtcta cgaagcagcc 960agggcacatg ccagagaggc caacgactct ggagaaacca tgagggtggc catcttcgca 1020agtggctgct ccagtgatga gccaacttcc cagaatctgg gcaacaacta ctctgatgag 1080ccctgcatag gacaggagta ccagatcatc gcccagatca atggcaacta cgcccgcctg 1140ctggacacag ttcctctgga ttatgagttt ctggccactg agggcaaaag tgtctgttaa 1200<210>6<211>29<212>DNA
〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 F3<400>6gatcggatcc ccaagatgat atgggtagc29<210>7<211>29<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 R3<400>7acgcgtcgac tgtcaatgtg gatccagtc 29<210>8〈211>1068<212>DNA〈213〉智人(homo sapiens)<400>8atggatttcc ttcacaggaa tggagtgctc ataattcagc atttgcagaa ggactaccga 60gcttactaca cttttctaaa ttttatgtcc aatgttggag accccaggaa tatctttttc 120atttattttc cactttgttt tcaatttaat cagacagttg gaaccaagat gatatgggta 180gcagtcattg gggattggtt aaatcttata tttaaatgga tattatttgg tcatcgacct 240tactggtggg tccaagaaac tcagatttac ccaaatcact caagtccatg ccttgaacag 300ttccctacta catgtgaaac aggtccagga agtccatctg gccatgcaat gggcgcatcc 360tgtgtctggt atgtcatggt aaccgctgcc ctgagccaca ctgtctgtgg gatggataag 420ttctctatca ctctgcacag actgacctgg tcatttcttt ggagtgtttt ttggttgatt 480caaatcagtg tctgcatctc cagagtattc atagcaacac attttcctca tcaagttatt 540cttggagtaa ttggtggcat gctggtggca gaggcctttg aacacactcc aggcatccaa 600acggccagtc tgggcacata cctgaagacc aacctctttc tcttcctgtt tgcagttggc 660ttttacctgc ttcttagggt gctcaacatt gacctgctgt ggtccgtgcc catagccaaa 720aagtggtgtg ctaaccccga ctggatccac attgacacca cgccttttgc tggactcgtg 780agaaaccttg gggtcctctt tggcttgggc tttgcaatca actcagagat gttcctcctg 840agctgccgag ggggaaataa ctacacactg agcttccggt tgctctgtgc cttgacctca 900ttgacaatac tgcagctcta ccatttcctc cagatcccga ctcacgaaga gcatttattt 960tatgtgctgt ctttttgtaa aagtgcatcc attcccctaa ctgtggttgc tttcattccc 1020tactctgttc atatgttaat gaaacaaagc ggaaagaaga gtcagtag1068<210>9<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220><223> 引物 F4<400>9acgcgtcgac gccaccatgg ggatctta28<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 R4<400>10agaatgcggc cgcttaacag acacttttgc c 3權(quán)利要求
VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒基因組中包含一個VSIG4和IGRP雙基因表達(dá)盒，所述VSIG4和IGRP雙基因表達(dá)盒由上游至下游依次包含CMV啟動子、VSIG4全長編碼基因、終止子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES、IGRP全長編碼基因和終止子。
2.權(quán)利要求1所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特征在 于包括以下步驟a、RT-PCR擴(kuò)增 VSIG4 全長 cDNA ；b、RT-PCR擴(kuò)增 IGRP 全長 cDNA ；C、將步驟a所得VSIG4全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，步驟b所得IGRP全長 cDNA插入pStar載體的IRES下游，得重組載體pStar_VSIG4-IRES_IGRP ；d、以步驟c 所得重組載體 pStar-VSIG4-IRES-IGRP 為模板，PCR 擴(kuò)增 VSIG4-1 RES-1GRP 片段并更換該片段兩端的酶切位點(diǎn)；e、將步驟d所得VSIG4-IRES-IGRP片段插入腺病毒穿梭載體pShuttle_CMV的CMV啟 動子下游，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP ；f、將步驟e所得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP與腺病毒骨架 載體pAdEasy-Ι在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，得重組腺病毒載體pAd_VSIG4/ IGRP ；g、將重組腺病毒載體pAd-VSIG4/IGRP在293細(xì)胞中包裝成重組腺病毒Ad_VSIG4/ IGRP。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟a的具體方法為提取人肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以巢式PCR擴(kuò)增 VSIG4全長cDNA 第一輪PCR以所得總cDNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 序列為上下游引物；第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 所示序列為上下游引物海輪PCR的循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性 50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng) 純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟b的具體方法為提取人胰腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA 為模板，以SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增IGRP全長cDNA， PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2 分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組 載體 pT-IGRP。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟c的具體方法為自重組載體pT-VSIG4中用Pst I和EcoR I雙酶 切出VSIG4全長cDNA，經(jīng)純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接， 得重組載體pStar-VSIG4 ；再自pT_IGRP載體中用BamH I和Sal I雙酶切出IGRP全長 cDNA，經(jīng)純化后與同樣用BamH I和SalI雙酶切的pStar_VSIG4載體連接，得重組載體 pStar-VSIG4-IRES-IGRP。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特征在于步驟d的具體方法為以重組載體pStar-VSIG4-IRES-IGRP為模板，以SEQ ID No. 9 和SEQ ID No. 10所示序列為上下游引物進(jìn)行PCR，將VSIG4-IRES-IGRP片段兩端的酶切位 點(diǎn)更換為Sal I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性5分鐘；然 后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘； PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4-IRES_IGRP。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟e的具體方法為自重組載體pT-VSIG4-IRES-IGRP中用Sal I和Not I雙酶 切出VSIG4-IRES-IGRP片段，經(jīng)純化后與同樣用Sal I和Not I雙酶切的腺病毒穿梭載體 pShuttIe-CMV 連接，得重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-VSIG4-IRES_IGRP。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟f的具體方法為將重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP用 Pme I酶切線性化，再與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι同時電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì) 胞，進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，得重組腺病毒載體pAd-VSIG4/IGRP。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟g的具體方法為將人胚胎腎293細(xì)胞以40% 60%的細(xì)胞密度接種至培 養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至30% 50%融合時，采用LipofectamindOOO試劑將重組腺病毒載 體pAd-VSIG4/IGRP轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時離心收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液 重懸后，反復(fù)凍融使細(xì)胞裂解，離心去除細(xì)胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重組腺病毒 Ad-VSIG4/IGRP。
10.權(quán)利要求1所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒在制備抗1型糖尿病的 樹突狀細(xì)胞疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種VSIG4和IGRP雙基因共表達(dá)重組腺病毒及其制備方法和應(yīng)用，該重組腺病毒基因組中包含一個VSIG4和IGRP雙基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒由上游至下游依次包含CMV啟動子、VSIG4全長編碼基因、終止子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES、IGRP全長編碼基因和終止子；該重組腺病毒的制備方法簡單；將其體外轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞再回輸體內(nèi)，能夠降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞因子分泌能力，而且能夠延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間并降低發(fā)病率，表明本發(fā)明的重組腺病毒能夠有效誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞耐受，并有效抑制胰島β細(xì)胞的破壞，可用于制備抗1型糖尿病的樹突狀細(xì)胞疫苗。
文檔編號C12N7/01GK101818133SQ20091025108
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)