一種適用于煙草種子的rna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種從煙草種子中提取RNA的方法，其特征在于：實(shí)驗(yàn)中先用物理方法除去脂類物質(zhì)，之后用醋酸鈉和異丙醇重復(fù)沉淀RNA，并用DNaseI去除RNA中的基因組DNA；最終得到濃度高、質(zhì)量好、完整性好的RNA。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)所具備的優(yōu)點(diǎn)在于：1.提供了一種適合煙草種子總RNA的提取方法。2.有效去除了脂類物質(zhì)。3.DNaseI除去提取RNA中的基因組DNA污染。4.用NaAc和異丙醇共沉淀去除多糖類物質(zhì)。5.異丙醇在室溫下沉淀RNA能最大程度的降低鹽的共沉淀，減少鹽類物質(zhì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。6.可大大節(jié)約提取時(shí)間，實(shí)驗(yàn)效果好。
【專利說明】-種適用于煙草種子的RNA提取方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種煙草種子中總RNA提取方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0003] 煙草是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是一種重要的模式作物，其在植物生物學(xué) 包括生理學(xué)、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)研究中具有重要的作用。總RNA的提取技術(shù)是煙草分 子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高質(zhì)量(純度高，完整性好）的RNA是進(jìn)行一些分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 包括逆轉(zhuǎn)錄、Northern雜交、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、基因芯片實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的關(guān)鍵。煙草 成熟種子中富含脂類、蛋白和多糖類物質(zhì)，其主要的營(yíng)養(yǎng)貯藏物質(zhì)是油和脂肪（約占干重 的42%-43%)，其次是蛋白質(zhì)（約占干重的20%)，多糖類物質(zhì)的含量也比較多（約占干重的 17%-19%)。這些物質(zhì)往往會(huì)干擾RNA的分離和純化，能否有效的去除脂類、蛋白質(zhì)、多糖是 提高RNA質(zhì)量的關(guān)鍵。但是目前報(bào)道的提取RNA方法或者商業(yè)化的試劑盒多針對(duì)幼嫩的植 株組織或植株，很少有針對(duì)種子的RNA提取方法。丁福章等（2007)研究了煙草不同組織總 RNA的提取方法，發(fā)現(xiàn)試劑盒法和Trizol法只能提取根、莖、葉、蕾和花的總RNA，并不能提 取種子中總RNA。用CTAB法雖然能從種子中提取RNA，但是也有其自身的缺點(diǎn)。一般CTAB 法提取RNA要用LiCl和異丙醇先后沉淀RNA，雖然能去除蛋白和多糖，但是一般RNA都要沉 淀過夜，且對(duì)小分子RNA的沉淀效果不好，另外用異丙醇沉淀RNA則會(huì)有基因組DNA污染， 并且最后得到的RNA濃度并不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的正是針對(duì)上述現(xiàn)存方法存在的不足而專門設(shè)計(jì)的高效提取煙草種子 中總RNA的方法，不僅可以有效的去除脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖以及基因組DNA干擾，能得到 純度高，完整性好的RNA，另外可以大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種從煙草種子中提取RNA的方法，依次包括以下步驟： 1) 取適量煙草種子在提前預(yù)冷的小研缽中用液氮充分研磨，直至研成細(xì)粉末狀； 2) 轉(zhuǎn)移至1. 5ml的離心管中，并加入700 μ?的RNA提取緩沖液（65°C溫育30min以上， 用之前加入5% V/V的β巰基乙醇）充分混勻，后置于65°C溫育lOmin，用滅菌的牙簽或槍 頭去除脂類物質(zhì)。
[0006] 3)加入提取緩沖液等體積的等體積的氯仿：異戊醇，氯仿：異戊醇為24 : 1，充分 震蕩混勻； 4) 4°C，12000 Xg 離心 10 min,取上清； 5 )所取上清重復(fù)3和4步驟，取上清，上清中加入1/10體積的3Mo 1醋酸鈉溶液（pH5. 0 ) 和與上清等體積的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA ; 6) 4°C，12000Xg離心20min，棄去上清，會(huì)發(fā)現(xiàn)RNA以片狀沉積在離心管底部； 7) 70%乙醇洗滌沉淀一次，在超凈工作臺(tái)干燥，無核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因組DNA ; 8) 重復(fù)加入RNA水溶液1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液（pH5. 0)和與RNA水溶液等體積 的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA ; 9) 4°C 12000Xg離心20分鐘，棄上清； 10) 70%的乙醇清洗沉淀兩次，在超凈工作臺(tái)干燥（時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但是不可過度干 燥)，加入無核酸酶的ddH 20溶解RNA，置于-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0007] 所述煙草種子為成熟的煙草種子。
[0008] 所述 RNA提取緩沖液成分如下：2% 的 CTAB(W/V)，100mMol/L 的 Tris-HCl(pH8. 0)， 2.5 mMol/LEDTA ,2. OMol/L NaCl, 上述所有步驟中用到的試劑和耗材都經(jīng)過DEPC處理。
[0009] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1.提供了一種適合煙草種子總RNA的提取方法。
[0010] 2.該提取方法通過滅菌槍頭去除脂類物質(zhì)。
[0011] 3. DNasel除去提取RNA中的基因組DNA污染。
[0012] 4.用NaAc和異丙醇共沉淀去除多糖類物質(zhì)。
[0013] 5.異丙醇在室溫下沉淀RNA能最大程度的降低鹽的共沉淀，減少鹽類物質(zhì)對(duì)后 續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。
[0014] 6.提取的RNA濃度高，質(zhì)量好，RNA完整性好。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1 CTAB法提取的煙草種子RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0017] 圖2為本方法提取的煙草種子RNA的瓊脂糖凝膠圖。
[0018] 圖3為CTAB方法提取的煙草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以 CTAB法提取煙草成熟種子為例說明）。
[0019] 圖4為CTAB方法提取的煙草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以 CTAB法提取煙草露白種子為例說明）。
[0020] 圖5為本發(fā)明方法提取的煙草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以實(shí) 施例1中的樣品為例說明）。
[0021] 圖6為本發(fā)明方法提取的煙草種子RNA的Agilent 2100生物分析儀分析圖（以實(shí) 施例2中的樣品為例說明）。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步的描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0023] 實(shí)施例1 :從煙草紅花大金元成熟種子中提取RNA 1)取適量成熟干燥的種子在提前預(yù)冷的小研缽中用液氮充分研磨，直至研成細(xì)粉末 狀； 2) 轉(zhuǎn)移至1. 5ml的離心管中，并加入700 μ?的RNA提取緩沖液（65°C溫育30min以上， 用之前加入5% V/V的β巰基乙醇）充分混勻，后置于65°C溫育lOmin，可用滅菌的槍頭或 牙簽剔除漂浮的脂質(zhì)； 3) 加入提取緩沖液等體積的氯仿：異戊醇（24 : 1)，充分震蕩混勻； 4) 4°C，12000 Xg 離心 10 min,取上清； 5 )所取上清重復(fù)3和4步驟，取上清，上清中加入1/10體積的3Mo 1醋酸鈉溶液（pH5. 0 ) 和與上清等體積的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA ; 6) 4°C，12000Xg離心20min，棄去上清，會(huì)發(fā)現(xiàn)RNA以片狀沉積在離心管底部； 7) 70%乙醇洗滌沉淀一次，在超凈工作臺(tái)干燥，無核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因組DNA ; 8) 重復(fù)加入RNA水溶液1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液（pH5. 0)和與RNA水溶液等體積 的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA ; 9) 4°C 12000Xg離心20分鐘，棄上清。
[0024] 10)70%的乙醇清洗沉淀兩次，在超凈工作臺(tái)干燥(時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但是不可過度 干燥)，加入無核酸酶的ddH 20溶解RNA，置于-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025] 實(shí)施例2 : 取適量萌發(fā)過程中露白的種子，采用本方法提取RNA。
[0026] 提取完成后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)和用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行分析（圖2 :1、 2代表成熟種子，3、4代表露白的種子；圖5、6 :分別抽取成熟種子和露白種子的RNA進(jìn)行 分析)，對(duì)照實(shí)施例可參照常規(guī)的CTAB法提取葉片中總的RNA (圖1 :1、2代表成熟種子，3 和4分別代表露白的種子；圖3、4 :分別抽取成熟種子和露白種子的RNA進(jìn)行分析)，通過比 較發(fā)現(xiàn)，CTAB法提取的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳并沒有發(fā)現(xiàn)5S RNA條帶（圖1)，Agilent 2100生物分析儀分析結(jié)果顯示RNA濃度較低，且28S/18S的比值明顯大于2. 0,說明所提取 的RNA完整性不好。本發(fā)明方法提取的煙草種子的總RNA的5S條帶清晰可見（圖2)，進(jìn)一 步經(jīng)Agilent 2100生物分析儀分析發(fā)現(xiàn)RNA濃度較高，28S/18S的比值在2. 0左右，說明 所提取RNA完整性好，本發(fā)明方法提取的RNA質(zhì)量?jī)?yōu)于CTAB法提取的RNA。
【權(quán)利要求】
1. 一種從煙草種子中提取RNA的方法，其特征在于：依次包括以下步驟： 1) 取適量煙草種子在提前預(yù)冷的小研缽中用液氮充分研磨，直至研成細(xì)粉末狀； 2) 轉(zhuǎn)移至1. 5ml的離心管中，并加入700 μ?的RNA提取緩沖液充分混勻，后置于65°C 溫育lOmin，剔除漂浮的脂質(zhì)； 3) 加入提取緩沖液等體積的氯仿/異戊醇溶液，氯仿：異戊醇為24 : 1，充分震蕩混 勻； 4) 4°C，12000 Xg 離心 10 min,取上清； 5) 所取上清重復(fù)3和4步驟，取上清，上清中加入1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液和與上 清等體積的異丙醇，室溫放置15 min沉淀RNA ; 6) 4°C，12000Xg離心20min，棄去上清，會(huì)發(fā)現(xiàn)RNA以片狀沉積在離心管底部； 7) 70%乙醇洗滌沉淀一次，在超凈工作臺(tái)干燥，無核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因組DNA ; 8) 重復(fù)加入RNA水溶液1/10體積的3Mol醋酸鈉溶液和與RNA水溶液等體積的異丙 醇，室溫放置15 min沉淀RNA ; 9) 4°C 12000Xg離心20分鐘，棄上清； 10) 70%的乙醇清洗沉淀兩次，在超凈工作臺(tái)干燥，加入無核酸酶的ddH20溶解。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從煙草種子中提取RNA的方法，其特征在于：所述煙草種子 為成熟的煙草種子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從煙草種子中提取RNA的方法，其特征在于：在步驟2)中是 用滅菌的牙簽或槍頭剔除脂類物質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從煙草種子中提取RNA的方法，其特征在于：所述RNA提取 緩沖液成分如下：2% 的 CTAB (W/V)，100mMol/L 的 Tris-HCl 其 ρΗ8· 0,2· 5 mMol/L EDTA， 2. OMol/L NaCl。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的從煙草種子中提取RNA的方法，其特征在于：所述RNA提 取緩沖液使用時(shí)應(yīng)65°C溫育30min以上，用之前加入5% V/V的β巰基乙醇。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104152439SQ201410434938
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月30日
【發(fā)明者】武明珠, 李鋒, 羅朝鵬, 王燃, 魏攀, 金立鋒, 翟妞, 楊軍, 林福呈 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院