專利名稱：來源于單核細胞的去分化的可程序化干細胞及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由人單核細胞生成的成熟的去分化的可程序化干細胞及其制備，以及它們在制備體細胞和組織產(chǎn)品中的用途。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，所述細胞為自體的人干細胞，即單核細胞來源的細胞來自欲接受干細胞和/或該干細胞生成的體細胞治療的病人。在現(xiàn)有技術中，術語“干細胞”是指具有(a)自我更新能力和(b)由于其不對稱分裂能力而形成至少一種和通常是多種特化細胞類型的能力的細胞(參見Donovan，P.J Gearhart，J Nature 41492-97(2001))。術語“多能性的”是指干細胞基本上能被分化為人類和動物體的所有可能的細胞類型。迄今為止，這樣的干細胞僅僅可以從胚胎組織或胚胎癌(睪丸腫瘤)中獲得(參見Donovan，P.J.Gearhart，J在上述引文中)。胚胎干細胞的應用已經(jīng)成為公眾廣泛討論的話題，尤其是在德國，這被認為是非常嚴重的問題。除了胚胎干細胞涉及的倫理和法律問題，這種細胞的醫(yī)療應用也遇到許多困難。顯然，來自于供體機體的胚胎干細胞相對于將要接受由這些胚胎干細胞生成的分化了的細胞或組織(此后稱之為靶體細胞或靶組織)的受體而言是異源的。因此可以預見這類靶細胞將在未來受體的體內引發(fā)排斥反應形式的速發(fā)型免疫反應。
干細胞可以從成人的不同組織中分離到，即從分化的個體中分離到。這些干細胞在現(xiàn)有技術中稱之為“多能性成體干細胞”。它們在體內組織再生和穩(wěn)態(tài)(homeostasis)中發(fā)揮作用。胚胎多能性干細胞與成體多能性干細胞之間的本質區(qū)別在于從各自細胞能得到的分化的組織的數(shù)目。推測起來，這是由于多能性干細胞來源于精細胞或者能夠產(chǎn)生精子的細胞，而成體多能性干細胞來源于成人個體中不能產(chǎn)生精子的身體或體細胞。
然而，有關獲得和使用成體干細胞的實際問題還在于這些細胞的稀缺性。因而，在骨髓中僅含有比例為1∶10,000的干細胞，外周血液中為1∶250,000，肝臟中的比例為1∶100,000。因此對于患者而言獲得干細胞是十分昂貴和困難的。另外，迄今為止以合理的費用獲得臨床治療所需的大量這類細胞的生產(chǎn)幾乎是不可能的。
而與此形成鮮明對比的是，以“組織工程”或細胞治療的方式對受損組織進行治療的可能性卻在不斷提高，在“組織工程”或細胞治療構架中，將對皮膚、肌肉、心肌、肝臟、胰島、神經(jīng)、神經(jīng)元、骨骼、軟骨、內皮和脂肪細胞等進行替換。
與此相關，西方世界人口年齡和疾病狀況的可預見的發(fā)展決定了下一個十年是西歐，包括美國和加拿大的人口的健康和醫(yī)療發(fā)展的重大轉折點。僅僅在德意志聯(lián)邦共和國，人口統(tǒng)計學進展顯示，截至2015年，45-64歲年齡段的人口增長21％，超過65歲的年齡段的人口增長26％。這必然將導致病人結構和需要醫(yī)療的疾病譜產(chǎn)生變化?？梢灶A見，心循環(huán)系統(tǒng)疾病(高血壓、心肌梗塞)、源于動脈硬化和代謝疾病的血管疾病、代謝疾病如糖尿病、肝代謝疾病、腎病、以及由年齡相關的退化引起的骨骼系統(tǒng)疾病、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞損失引起的大腦退化疾病將增加并需要更新的治療概念。
基于上述情況有關的專家迅速努力開展國內和國際間的研究和開發(fā)，去獲得能夠程序化生成組織(肝臟、骨骼、軟骨、肌肉、皮膚等)特有的分化細胞的干細胞。
因此，本發(fā)明所要解決的問題是制備可用的成體干細胞，該干細胞的生成不產(chǎn)生倫理和/或法律問題，該干細胞能夠以所需數(shù)量、合理的生產(chǎn)成本迅速按計劃用于治療用途，且該干細胞用于“細胞治療”時不會在病人體內產(chǎn)生細胞排斥和誘發(fā)腫瘤尤其是惡性腫瘤形式的副作用，或者不產(chǎn)生值得注意的副作用。
根據(jù)本發(fā)明，該問題是通過制備來源于人單核細胞的去分化的可程序化細胞來解決的，鑒于本發(fā)明的目的，此后它被稱之為“干細胞”。術語“去分化”是所屬領域技術人員所熟知的，參見WeissmanI.L Cell 100157-168，圖4，(2000)。它是指一種成體的，已經(jīng)特化的(分化的)體細胞退化為干細胞，后者反過來又能夠轉化(程序化)成多種細胞類型的細胞。令人驚訝的是，已經(jīng)證明本發(fā)明所述的方法能夠導致單核細胞去分化。用這種方法制備的干細胞能夠被轉化(程序化)為大量不同的靶細胞/靶組織，參見實施例。本發(fā)明所述的干細胞除了表達分化的單核細胞的特異性表面抗原CD14之外，還能表達至少一種，優(yōu)選兩種或三種典型的多能性標記CD90、CD117、CD123和CD135。在特別優(yōu)選的方式中，本發(fā)明制備的干細胞表達表面抗原CD14和四種多能性標記CD90、CD117、CD123和CD135，參見實施例2、表1。優(yōu)選本發(fā)明的干細胞表達膜聯(lián)單核細胞特異性的表面抗原CD14，以及至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。更優(yōu)選本發(fā)明的干細胞帶有抗原CD14與至少多能性標記CD123和/或CD135的組合。低于3％，優(yōu)選低于1％的本發(fā)明所述的干細胞表達抗原CD34。最優(yōu)選本發(fā)明的干細胞不表達抗原CD34。通過上述方法，首次獲得了能夠在短時間內再次程序化成優(yōu)選的自體組織的成體干細胞。
本發(fā)明的干細胞的產(chǎn)生對患者是完全無害的，且在自體應用情形中與自體血液回輸相類似。在抽血后10至14天內就可以以合理的成本得到通常的治療所需要(見上文)數(shù)量的干細胞(108至109的細胞)。另外如果作為自體應用，由于細胞和受體優(yōu)選相同的遺傳性，用于治療的細胞產(chǎn)品不會引起任何細胞排斥形式的免疫問題。
動物實驗和培養(yǎng)證明，本發(fā)明所述的干細胞在引發(fā)惡性腫瘤方面是安全的，估計產(chǎn)生這一結果的原因是本發(fā)明所述干細胞是單核細胞來源的。
本發(fā)明所述來源于人單核細胞的去分化的可程序化干細胞的制備過程包括以下基本步驟(a)從人血中分離單核細胞；(b)在裝有包含巨噬細胞集落刺激因子(此后簡稱為M-CSF)的細胞培養(yǎng)基的合適的培養(yǎng)容器中增殖單核細胞；和(c)在白細胞介素-3(IL-3)的存在下培養(yǎng)單核細胞；和(d)從培養(yǎng)基中分離得到人去分化的可程序化的干細胞。
在該過程特別優(yōu)選的實施方案中，M-CSF和IL-3是在步驟(b)中同時加入細胞培養(yǎng)基中的。
然而為了引起單核細胞增殖，最初在步驟(b)中只向細胞培養(yǎng)基中加入M-CSF，隨后再向細胞培養(yǎng)基中加入IL-3也是可能的。
最后，步驟(b)的過程也可以通過以下方式進行單核細胞最初在僅包含M-CSF的細胞培養(yǎng)基中增殖，然后將培養(yǎng)基與細胞分離，再使用包含IL-3的另一種細胞培養(yǎng)基。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是在步驟(b)中，培養(yǎng)基與貼附于培養(yǎng)容器底部的細胞分離，使人去分化的可程序化干細胞通過脫離底面并分離細胞而獲得。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是細胞在含硫化合物的存在下進一步培養(yǎng)。這種培養(yǎng)可以是在如上所述培養(yǎng)步驟(b)之后獨立步驟中的培養(yǎng)，也可以是通過在步驟(b)中向培養(yǎng)基中進一步加入含硫化合物而進行，其優(yōu)選在培養(yǎng)的開始階段加入。
意想不到的是本發(fā)明所述方法導致了單核細胞去分化，其中去分化形成的成體干細胞除了表達去分化的單核細胞特有的表面抗原CD14之外，還表達了至少一種或多種，優(yōu)選所有的多能性標記CD90、CD117、CD123和CD135(參見表1)。優(yōu)選本發(fā)明的干細胞表達膜聯(lián)單核細胞特異性表面抗原CD14和至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。更優(yōu)選本發(fā)明的干細胞帶有抗原CD14與至少多能性標記CD123和/或CD135的組合。低于3％。優(yōu)選低于1％的本發(fā)明所述的干細胞表達抗原CD34。最優(yōu)選本發(fā)明的干細胞不表達抗原CD34。各種標記(表面抗原)的表述可以通過商業(yè)上可獲得的對各種要檢測的抗原特異性的抗體，應用標準免疫測定方法去檢驗，參見實施例2。
在增殖和去分化過程中，由于細胞貼附于各個培養(yǎng)容器底部，必須將細胞在步驟(b)從培養(yǎng)基中分離出來，使其在去分化結束后從容器底部剝離。本發(fā)明所述優(yōu)選的實施方案是貼附于底部的細胞脫離之前將細胞培養(yǎng)基的上清液棄去，隨后貼附的細胞優(yōu)選用新鮮培養(yǎng)基清洗。清洗后再向貼附于底部的細胞加入新鮮培養(yǎng)基，然后進行將細胞從底部分離的步驟(參見實施例13)。
優(yōu)選的實施方案是在步驟(c)的最后、步驟(d)之前，將細胞與生物學上可良好耐受的有機溶劑接觸。生物學上可良好耐受的有機溶劑可以是含1-4個碳原子的醇，優(yōu)選使用乙醇。
進一步的實施方案是在步驟(c)的最后、步驟(d)之前，細胞與生物學上可良好耐受的有機溶劑的蒸汽相接觸。
細胞剝離也可以采用機械方法，但是優(yōu)選使用例如胰蛋白酶進行的酶解剝離的方法。
這種方法獲得去分化的可程序性干細胞在培養(yǎng)基中自由流動，能夠直接進入再次程序化的過程，或者在培養(yǎng)基中保持幾天；后一種情況中，為了避免程序化能力的過早損失，優(yōu)選向培養(yǎng)基中加入細胞因子或LIF(白血病抑制因子)(參見Donovan，P5 Gearhart，J在上述引文中，第94頁)。最后為了貯存的目的可將細胞深度冷凍，而不喪失可程序化性。
本發(fā)明所述的干細胞不同于迄今為止已知的胚胎來源的多能性干細胞和來源于不同組織的已知的成體干細胞，其差別在于除了帶有膜聯(lián)單核細胞特異性表面抗原CD14之外，它們表面上還帶有至少一種選自CD90、CD117、CD123和CD135的多能性標記。優(yōu)選本發(fā)明的干細胞帶有膜聯(lián)單核細胞特異性表面抗原CD14和至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。更優(yōu)選本發(fā)明的干細胞帶有抗原CD14與至少多能性標記CD123和/或CD135的組合。低于3％，優(yōu)選低于1％的本發(fā)明所述的干細胞表達抗原CD34。最優(yōu)選本發(fā)明的干細胞不表達抗原CD34。
應用本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的干細胞可以被重新程序化生成任何體細胞。干細胞的重新程序化的方法是現(xiàn)有技術中已知的，參見例如Weissman I.L Science 2871442-1446(2000)和Insight ReviewArticles Nature 41492-131(2001)，以及手冊“Methods of TissueEngineering”，Eds.Atala，A Lanza，R.P Academic Press，ISBN0-12-436636-8；Library of Congress Catalog CardNo.200188747。
此外本發(fā)明所述的干細胞重新程序化獲得的分化的分離的靶體細胞和/或靶組織都帶有單核細胞的膜聯(lián)CD14分化標記。另外，低于3％、優(yōu)選低于1％的本發(fā)明所述的這些靶體細胞和/或靶組織表達抗原CD34。最優(yōu)選這些細胞或組織不表達抗原CD34。如實施例11所示，來源于本發(fā)明所述干細胞的肝細胞表達單核細胞特有的表面標記CD14的同時也生成了肝細胞特有的白蛋白。來源于本發(fā)明所述干細胞的肝細胞因此而區(qū)別于天然的肝細胞。利用同樣的方法，在來源于本發(fā)明所述干細胞的胰島素產(chǎn)生性細胞上也檢測到膜聯(lián)表面標記CD14(實施例9)。
本發(fā)明的一個具體實施方案是去分化的可程序化干細胞用于體外制備靶細胞和靶組織(參見實施例)。因此，通過本發(fā)明所述的干細胞分化(重新程序化)獲得的攜帶膜聯(lián)表面抗原CD14的分化的、分離的組織細胞也是本發(fā)明的主題。
在用于各種靶細胞和/或其碎片培養(yǎng)的(參見實施例6至8)、包含培養(yǎng)基上清液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞，使本發(fā)明所述的干細胞優(yōu)選地、簡單可靠地在體外分化成期望的靶細胞，例如脂肪細胞(參見實施例6)、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞(參見實施例3)、內皮細胞(參見實施例5)、角質細胞(參見實施例8)、肝細胞(參見實施例7)和胰島細胞(胰島，參見實施例9)。此后該上清液稱之為靶細胞條件化培養(yǎng)基。
為了本發(fā)明所述的去分化干細胞的分化(重新程序化)可以按照如下步驟進行a)粉碎包含或由期望的靶細胞組成的組織；b)得到組織細胞(靶細胞)和/或其碎片；c)靶細胞和/或其碎片在適宜的的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；d)在培養(yǎng)過程中或培養(yǎng)之后收集培養(yǎng)基上清液，作為靶細胞條件化培養(yǎng)基；和e)為了去分化干細胞重新程序化分化成期望的靶細胞或靶組織，將干細胞在靶細胞條件化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
可使用標準細胞培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基(參見實施例)。培養(yǎng)基優(yōu)選包含生長因子，如表皮生長因子。
靶細胞和/或其碎片(“細胞沉淀”)的培養(yǎng)需要經(jīng)過5-15天，優(yōu)選10天。上清液即靶細胞條件化培養(yǎng)基優(yōu)選每2-4天后移出并用新鮮的培養(yǎng)基替換。得到的上清液分別在無菌條件下過濾，收集后在約-20℃下貯存，或者直接用于干細胞的程序化。如上所述，通過在各種靶細胞條件化培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細胞以使干細胞程序化為期望的靶細胞(參見實施例)。生長培養(yǎng)基優(yōu)選另外還含有一種靶細胞特異性生長因子，例如“肝細胞生長因子”或“角質細胞生長因子”(參見實施例)。
本發(fā)明的一個具體實施方案是本發(fā)明所述的去分化的程序化干細胞本身用于制備體內生成靶細胞和靶組織的藥物組合物。
這種藥物制劑可以包含懸浮于生理上良好耐受的介質中的本發(fā)明所述干細胞。適合的介質例如PBS(磷酸鹽緩沖液)或含有20％的人白蛋白溶液的生理鹽水等等。
這些藥物制劑中包含本發(fā)明所述的有活力的去分化的可程序化干細胞，它們的表面帶有CD14表面標記和至少一種以上的多能性干細胞標記CD90、CD117、CD123和/或CD135，其相對于制劑中存在的細胞總數(shù)的百分含量為1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50％、優(yōu)選為60或70％，特別優(yōu)選為80或90％和最優(yōu)選為100％的，這些藥物制劑任選進一步含有藥學上可良好耐受的佐劑和/或載體物質。
干細胞制劑包含的本發(fā)明所述的有活力的、去分化的、可程序化干細胞的表面帶有CD14表面標記和至少一種以上的多能性干細胞標記CD90、CD117、CD123和/或CD135，其相對于制劑中存在的細胞總數(shù)的百分含量為1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59％、優(yōu)選至少60％；例如PBS或RPMI等細胞良好耐受的細胞培養(yǎng)或轉移培養(yǎng)基的細胞懸浮液，或者含有50％人白蛋白溶液和10％DMSO的RPMI的合適的貯存培養(yǎng)基中深度冷凍的細胞制劑都是優(yōu)選的。
有活力細胞的數(shù)目和上述組合物中它們的比例可以通過使用“臺盼藍染料排除技術”光學檢測，因為使用這種染料能夠用光學檢測區(qū)分無活力細胞和有活力細胞。
通常，如果在存在足夠數(shù)量的功能性干細胞的前提下，在藥物制劑中存在一些不能達到本發(fā)明所述的去分化可程序化細胞的標準的細胞，不會影響臨床治療。然而也可能根據(jù)該制劑中含有的本發(fā)明所述的去分化細胞特有的表面標記，利用現(xiàn)有技術中已知方法中的手段去除非去分化的細胞，以獲得基本上純的包含期望細胞的制劑。適合的方法例如“免疫磁珠分選”，參見Romani等人，J.Immunol.Methods 196137-151(1996)。
通過直接接觸特定細胞類型的細胞群，干細胞能夠進一步自動地在體內分化形成該類型的細胞。利用能夠再分化的細胞制備組織的方法(“組織工程”)是現(xiàn)有技術中已知的。例如，Wang，X.等人(“Liver vepopulation and correction of metabolic liverdisease by transplanted abult mouse pancreatic cells”Am.J.Pathol.158(2)571-579(2001))已經(jīng)證明在FAH-(富馬酰乙酰乙酸水解酶)缺陷小鼠中，某些小鼠體內成體胰臟細胞能夠被轉化為肝細胞中，由此能夠完全彌補這些動物的代謝功能的損失。進一步的例子為Lagasse等人，“Purified hematopoieticstem cells candifferentiate into hepatocytes in vivo”，Nature Medicine，6(11)1229-1234(2000)的實驗。作者指出骨髓中的造血干細胞在轉移入FAH-缺陷的小鼠體內后能夠轉化成肝細胞從而彌補代謝功能的損失；也可以參見Grompe M.的綜述“Therapeutic LiverRepoplilation for the Treatment of Metobolic Liver Diseases”Hum.Cell，12171-180(1999)。
特別優(yōu)選的本發(fā)明所述去分化的干細胞在體內分化的應用形式是注射、輸液或將干細胞植入體內特定的細胞群中，通過使干細胞直接與細胞群接觸而使干細胞在其中分化成特定細胞類型。注射或輸液時細胞可以在PBS(磷酸鹽緩沖液)中施用。
相關的適應癥優(yōu)選的例子有肝硬變、胰機能不全、急性或慢性腎衰、激素功能低下、心肌梗塞、肺拴塞、中風和皮膚損傷。
因此本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是去分化、可程序化干細胞在制備治療肝硬變、胰機能不全、急性或慢性腎衰、激素功能低下、心肌梗塞、肺拴塞、中風和皮膚損傷的藥物組合物的應用。
由本發(fā)明所述的干細胞獲得的靶細胞的治療用途涉及的許多概念都是已知的(參見Science 2871442-1446(2000)和Nature41492-131(2001))。
更優(yōu)選的使用涉及注射本發(fā)明所述的去分化的干細胞入腹膜，由于其周圍細胞的影響，它們可以就地分化為腹膜細胞。當腎機能不全的病人需要腹膜透析時，這些細胞能夠通過半透膜取代腎功能，將依賴腎排出的廢物釋放到腹膜中經(jīng)透析液將其排出。
因此通過干細胞再程序化獲得的特征在于膜聯(lián)CD14抗原的分化的、分離的靶體細胞和/或靶組織也是本發(fā)明的目的。這些靶體細胞和/或靶組織優(yōu)選含有脂肪細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞、內皮細胞、角質細胞、肝細胞和胰島細胞。
然而，細胞也可以直接引入將要重建的器官中。這種引入通過被相應的分化的細胞或能夠分化的細胞包裹的基質構建體來完成?；|構建體通常是生物可降解的，當新引入的細胞和已有細胞長在一起時，其可以排出體外。從這個觀點出發(fā)，例如細胞，優(yōu)選是胰島細胞、肝細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、肌細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、骨細胞、內分泌細胞等形式的自體移植物開始被考慮用于例如器官部分手術切除后的重建，用于如創(chuàng)傷后的修復，或用于如在器官功能缺失或不全時的支持用途。
本發(fā)明所述的干細胞和由其獲得的靶細胞通常被用于包裹可移植物以提高生物相容性。因此被去分化的可程序化干細胞或靶體細胞和/或靶組織所包裹的可移植物也是本發(fā)明的目的。本發(fā)明所述的實施方案是這些可移植材料是假器官。在特別優(yōu)選的實施方案中，假器官是心臟瓣膜、人工血管、人工骨骼和關節(jié)。
可移植物也可以是包含在分化的可程序化干細胞或靶細胞的人工和/或生物載體材料。此時載體材料可以是引入人體的囊或室。
在一種本發(fā)明的實施方案中，包含如胰島細胞的本發(fā)明所述分化的體細胞的袋用于制備作為提供胰島素的人工胰島細胞孔口室(port chamber)的藥物構建體。
在一種本發(fā)明的進一步實施方案中，包含本發(fā)明所述分化的體細胞如脂肪細胞的囊或室用于制備一種填充了脂肪細胞的人造聚合物，它可作為手術后乳房構建以及在整形和/或美容矯正時的進一步適應癥的藥物構建體。
此外，包含多種不同來源的內分泌細胞的半透性孔口室系統(tǒng)能夠用于體內治療內分泌、代謝或凝血功能紊亂。所述內分泌細胞例如產(chǎn)生甲狀腺素、類固醇、ADH、醛固酮、褪黑素、5-羥色胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、TSH、LH、FSH、瘦素、縮膽囊素、胃泌素、胰島素、胰高血糖素或凝血因子的細胞。
因此包含分化的分離的靶體細胞的半透性孔口室系統(tǒng)的可移植物也是本發(fā)明的目的。在本發(fā)明不同的實施方案中，這些半透性室系統(tǒng)用于制備體內治療內分泌、代謝或凝血紊亂的藥物構建體。
由本發(fā)明所述的干細胞得到的靶細胞能夠另外用作體外生物反應器的細胞培養(yǎng)物，進行例如解毒的反應。這種形式的應用特別適合急性狀況，如急性肝功能衰竭時作為肝細胞生物反應器。
上述構建體的制備及其在相關治療過程中的實施已經(jīng)在現(xiàn)有技術中多次記載。例如Lalan，S等人的綜述“Tissue enginearing andits potential impacton surgery”World J.Surg.251458-1466(2001)；Nasseri，B.A等人“Tissue engineeringan evolving21st-century science to provide replacement for restructionand transplantation”Surgery 130781-784(2001)以及Fuchs，J.R.等人，“Tissue engineeringa 21st century solution tosurgical reconstructran”Ann.Thorac.Surg.72577-591(2001)。
最后本發(fā)明所述的多能性干細胞開創(chuàng)了轉基因修復和治療的廣闊前景。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，去分化可程序化干細胞本身或者最終由它們分化得到的靶體細胞和/或靶組織被一種或多種基因轉染。這樣用于維持某些器官例如肝、腎的代謝所需的一種或多種基因被恢復和/或支持或再次導入。例如干細胞或源自所述干細胞的肝細胞被FAH(富馬酰乙酰乙酸水解酶)基因轉染。在FAH缺陷的小鼠模型中脾內注射1000個FAH陽性供體肝細胞，6-8周之后就足以完全遍及其肝臟，完全彌補了肝硬變導致的代謝功能損失(參見Grompe，M等人，Nat.Genet.12266 ff.(1996))。
通過“多藥抗性基因”轉染干細胞或通過程序化干細胞獲得的相應的靶細胞(例如造血細胞、肝細胞、卵巢細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質細胞、軟骨細胞和骨細胞等)，在惡性疾病情況下通過重建相應的造血功能使得長期的基本化療成為可能，或者產(chǎn)生輻射抗性。
本發(fā)明詳細說明如下本發(fā)明所述方法的起始原料是來自于人血的單核細胞。它們優(yōu)選是自體單核細胞，即來源于欲利用本發(fā)明所述的干細胞或由其產(chǎn)生的靶細胞進行治療病人的血液中的單核細胞。
為了得到單核細胞，首先將經(jīng)過根據(jù)已知方法用抗凝劑處理的血液分離，優(yōu)選離心，得到血漿、白細胞和紅細胞。離心后血漿在上清液中，之下是含有全部白細胞的一層，這一層也被稱之為“棕黃層”。再下面含有紅細胞相(血細胞比容)。
然后利用已知方法如離心分離“棕黃層”得到單核細胞。根據(jù)優(yōu)選的方法，不同的“棕黃層”包被在淋巴細胞分離介質(例如FicollHypaque)上再離心。通過進一步離心和漂洗，從血液中得到單核細胞組分(參見實施例1)。
從全血中獲得單核細胞的其他方法例如“熒光激活細胞分類術”(FACS)，“免疫磁珠分選”(參見Romani等人，J.Immunol.Methods196137-151(1996))和“磁激活細胞分類術”(MACS)或者所謂的“Rosetting法”(參見Gelig-Meyling，F(xiàn)等人，“Simplifiexprozedure for the separation of human Tand non-T cells”VoxSang.335-8(1977))。
根據(jù)本發(fā)明，任何分離的人血都能得到單核細胞且血液也可來源于如脾臟、淋巴結或骨髓等器官。尤其當從人血中分離單核細胞是不可能的(如在貧血或白血病情況下)或數(shù)量不足，以及在同種異體應用情況下(如在多個器官去除的構架中)，則考慮從器官中獲得單核細胞，脾臟可用作分離單核細胞的來源。
為了制備足夠量的本發(fā)明所述的干細胞，首先必須增殖單核細胞。為此使用本發(fā)明所述包含M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)的適合單核細胞生長的培養(yǎng)基。M-CSF(也被稱之為CSF-1)由單核細胞、成纖維細胞和內皮細胞生成。培養(yǎng)基中M-CSF的濃度為2-20μg/l培養(yǎng)基，優(yōu)選4-6μg/l，特別優(yōu)選為5μg/l。
M-CSF結合到單核細胞上特異性的c-Fms受體(也稱之為CSF-1R)，該受體只存在單核細胞表面，僅與M-CSF結合(Sherr C.J等人，Cell 41(3)665-676(1985))。M-CSF和受體的特異性相互作用誘發(fā)了單核細胞的分裂，單核細胞在含有M-CSF或其類似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該M-CSF或其類似物能與受體結合而活化受體。由于沒有與c-Fms受體的親和力，不能誘導單核細胞分裂，所以其他生長因子例如GM-CSF(粒細胞-單核細胞集落刺激因子)和G-CSF(粒細胞集落刺激因子)都不適合。
該方法特別優(yōu)選的實施方案是在方法的步驟b)中向細胞培養(yǎng)基中同時加入M-CSF和IL-3。培養(yǎng)基中IL-3的濃度可以為0.2-1μg/l，優(yōu)選0.3-0.5μg/l，特別優(yōu)選是0.4μg/l的IL-3。
但是也可以最初在步驟b)中只向培養(yǎng)基中加入M-CSF，隨后再加入IL-3。
進一步實施方案是培養(yǎng)容器中最初裝有只包含M-CSF的細胞培養(yǎng)基，其在細胞分離之后就被另外包含IL-3的細胞培養(yǎng)基替換。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述方法中步驟b)中的細胞在含硫化合物如巰基化合物的存在下再培養(yǎng)，在該含硫化合物中至少一個烴基與硫原子相連，所述烴基被一個或多個功能基取代。巰基化合物是指含有至少一個與烴基結合的巰基(SH)的化合物。通過另外使用所述的含硫化合物能夠使來自單核細胞的細胞去分化而得到的表達一種或多種干細胞標記CD90、CD117、CD123和CD135的干細胞的數(shù)目增加。
所述功能基優(yōu)選羥基和/或胺基。特別優(yōu)選的實施方案中含硫化合物是2-巰基乙醇。進一步優(yōu)選的實施方案中含硫化合物是二甲基亞砜(DMSO)。
含硫化合物的用量以硫為基準大約為4-大約200μmol/l。優(yōu)選大約為100μmol/l。
當使用2-巰基乙醇時，培養(yǎng)基中含有大約3-大約13μl，優(yōu)選約為7μl/l的2-巰基乙醇。
IL-3和任選的含硫化合物的處理可以同時或者在有M-CSF參予培養(yǎng)的單核細胞增殖后進行，優(yōu)選增殖以及IL-3和任選的含硫化合物的處理同時進行。同時進行的增殖和去分化持續(xù)不超過10天，IL-3和任選的含硫化合物的處理時間至少為3天，最多為10天，優(yōu)選為6天。
因此，根據(jù)本發(fā)明，當在同時含有M-CSF、IL-3和任選的巰基化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細胞時，到細胞從培養(yǎng)容器底部剝離為止的時間間隔為至少3天，最多10天，優(yōu)選5-8天，特別優(yōu)選6天。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述方法按以下方式進行。在步驟b)中，單核細胞最初在只含有M-CSF的培養(yǎng)基中增殖，在該培養(yǎng)基中增殖持續(xù)至少2天，優(yōu)選3天，特別優(yōu)選4天，最長為7天。隨后在IL-3和任選的巰基化合物存在下再培養(yǎng)3天。然而，優(yōu)選在只含有M-CSF的培養(yǎng)基中最多持續(xù)4天，接下來在IL-3和任選的巰基化合物存在下培養(yǎng)3、4、5或6天。
如實施例2和13所述，為了使增殖和去分化同時進行，單核細胞被分離出來后轉移至含有M-CSF、IL-3和任選的含硫化合物特別是2-巰基乙醇或DMSO的培養(yǎng)基中。
由于其具有吸附特性，在制備過程中單核細胞和來自于它們的干細胞貼附于與各自培養(yǎng)容器的底部。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，在步驟c)之后培養(yǎng)基與貼附于培養(yǎng)容器的底部的細胞分離后被棄去。優(yōu)選隨后用培養(yǎng)基漂洗貼附于底部的細胞，然后用新鮮培養(yǎng)基覆蓋細胞(參見實施例13)。
在該步驟中上述增殖和去分化培養(yǎng)基可以被用作培養(yǎng)基，例如標準細胞培養(yǎng)基RPMI也可用作培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案，為了提高生產(chǎn)過程最后在培養(yǎng)基中自由漂浮的干細胞的數(shù)目，可在步驟c)的最后和步驟d)之前將細胞與生物學上良好耐受的有機溶劑接觸。溶劑的用量為10μl-1ml。該溶劑優(yōu)選為含1-4個碳原子的醇，特別優(yōu)選加入乙醇。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，將細胞與前面定義的生物學上可良好耐受的有機溶劑蒸汽相接觸，優(yōu)選乙醇蒸汽(參見實施例2)。與有機溶劑優(yōu)選乙醇蒸汽接觸的時間為4-12小時，優(yōu)選8-10小時。
本發(fā)明所述的方法優(yōu)選在其表面預先涂覆有胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)容器中進行(參見實施例2)。也可以選擇使用男性供體的AB血清。用FCS的覆蓋實施如下使用前用FCS覆蓋培養(yǎng)容器的表面，且在幾個小時、特別為2-12小時，特別優(yōu)選7個小時的接觸時間后，用適當?shù)姆椒ㄈコ龥]有粘附在表面的FCS。
如果在步驟c)之后，任選在換培養(yǎng)基之后，進行有機溶劑處理，在這個步驟中細胞已經(jīng)一定程度上從底部剝離。(進一步)剝離可以用機械方法完成，例如使用精良的細胞刮棒，刮片或吸管尖(參見實施例13)。
根據(jù)本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方案，在適當?shù)拿咐缫鹊鞍酌傅淖饔孟峦瓿赏耆膭冸x(參見實施例2)。將細胞與胰蛋白酶溶液(0.1-0.025g/l，優(yōu)選0.05g/l)在35-39℃，優(yōu)選37℃下在二氧化碳存在下接觸2-10分鐘。
然后通過標準的方法抑制胰蛋白酶的活性，此時利用標準方法，例如離心和在一個實施方案中在步驟d)的最后在適宜的培養(yǎng)基中將其懸浮，可以獲得自由漂浮的去分化程序化干細胞。它們懸浮于適宜的培養(yǎng)基例如RPMI1640或DMEM中，能夠立即分化成希望的靶細胞。但是它們也能夠在培養(yǎng)基中保存幾天。在優(yōu)選的實施方案中，如果欲將細胞作為去分化的可程序化干細胞貯存在培養(yǎng)基中超過約48小時，則培養(yǎng)基中應含有細胞因子或LIF因子(白血病抑制因子)，參見Nature 41494(2001，Donovan，P.JGearhardt，J在上述引文中)。在包含這些因子的培養(yǎng)基中干細胞能夠作為去分化程序化干細胞保持至少10天。
在優(yōu)選的實施方案中，為了長期貯存，細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中，然后深度冷凍?；罴毎疃壤鋬龅募夹g是現(xiàn)有技術中已知的，參見Griffith M等人“Epithelial Cell Culture，Cornea，inMethods of Tissue Engineering”，Atala ALanza R.P Academic Press2002，第4章第131-140頁。優(yōu)選的用于本發(fā)明干細胞深度冷凍的懸浮培養(yǎng)基是含F(xiàn)CS的DMEM，參見實施例2。
參考如下實施例進一步解釋和說明本發(fā)明。
如果在實施例中沒有進一步限定，所用的培養(yǎng)基和物質的組成如下1.青霉素/鏈霉素溶液每毫升生理氯化鈉溶劑(0.9％的NaCl)中10,000單位作為青霉素G鈉鹽的青霉素和1000μg作為硫酸鏈霉素的鏈霉素。
2.胰蛋白酶-EDTA每升含0.5g胰蛋白酶和0.2gEDTA(4Na)3.胰島素約28單位/mg的產(chǎn)生自大腸桿菌(E.coli)的人重組胰島素4.含L-谷氨酰胺的RPMI 1640(1x，液體(11875))RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養(yǎng)基1640是廣泛用于哺乳動物細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
參見Moore G.E.等人，J.A.M.A.199519(1967)
5.PBS(Dulbecco磷酸鹽緩沖液)參見J.Exp.Med.98167(1954)
6.2-巰基乙醇合成質量；含量＞98％，密度1.115-1.116，參見如Momo J.等人，J.Am.Chem.Soc.734961(1951)。
7.Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離培養(yǎng)基(蔗糖/表氯醇共聚合產(chǎn)物，Mg 400,000；密度1.077，泛影酸鈉調節(jié))8.視黃酸1.5ml的PBS溶液中含有300μl維生素A酸(C20H28O2)，其相應的濃度為1mM。當用作神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的程序化培養(yǎng)基時，10ml培養(yǎng)基中含有150μl維生素A酸(相應濃度為10-6M)。
9.DMEMDulbecco改性的Eagle培養(yǎng)基(高葡萄糖)參見Dulbecco，R.等人，Virology 8396(1959)；Smith，J.D.等人，Virology12158(1960)；Tissue Culture StandardsCommittee，In Vitre，62(1993)10.L-谷氨酰胺液體29.2mg/ml11.II型膠原酶參見Rodbell，M.等人，J.Biol.Chem.239375(1964).
12.白細胞介素-3(IL-3)來源于大腸桿菌的重組人白介素(Yang Y.C.等人，Cell4710(1986))，其中所含的包括成熟IL-3的133個氨基酸殘基和包括甲硫氨酰形式的134個氨基酸殘基的比例約為1∶2；計算分子量約為17.5kD，特異性活性1×103U/μg(R&D目錄No.203-IL)13.巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)來源于大腸桿菌的重組人M-CSF，其中含有包括N-末端甲硫氨酸的135個氨基酸殘基的單體(18.5KD)，它是以分子量為37kD同型二聚體存在(SIGMA目錄No.M6518)。
14.抗體實施例中應用的抗CD14、CD31、CD90、CD117、CD123、CD135抗原的抗體都是商業(yè)上可以得到的。它們從下列來源得到CD14DAKO，單克隆小鼠抗人CD14、單核細胞、克隆TK4，代碼為M0825，Lot 036 Edition 02.02.01；CD31PharMingen International，單克隆小鼠抗大鼠CD31(PECAM-1)，克隆TLD-3A12，目錄編號22711D，0.5mg；CD90Biozol Diagnostica，Serotec，小鼠抗人CDw90克隆No.F15-42-1，MCAP90，批號0699；CD117DAKO，單克隆小鼠抗人CD117，c-kit，克隆號104D2，代碼No.M 7140，Lot 016，Edition 04.05.00；CD123Research Diagnostics Inc.小鼠抗人CD123抗體，克隆9F5，目錄號RDI-CD123-9F5；CD135Serotec，小鼠抗人CD135，MCA1843，克隆號BV10A4H2實施例1從全血液中分離單核細胞為了避免血液凝固和為了飼養(yǎng)細胞，在一個3室?guī)钛b置中將450ml全血和63ml穩(wěn)定溶液混合。該穩(wěn)定溶液組成為每升水中含有3.27g檸檬酸，26.3g檸檬酸三鈉鹽，25.5g右旋糖和22.22g二羥基磷酸鈉鹽。溶液的pH值為5.6-5.8。
上述混合物在20℃以4000rpm條件下“高速離心”7分鐘以分離血液中的成分。結果形成了3層顆粒和非顆粒成分。通過將帶狀裝置接入為此目的提供的一個加壓機器上，把紅血球壓入下層的袋中，把血漿壓入上層袋中，“為此目的提供的棕黃層”保留在中間袋中，其體積約為50ml。
將50ml新鮮制備的“棕黃層”分成每份25ml的2份，將每份以25ml的事先加入到2個50ml的Falcon試管中Ficoll-Hypaque分離介質覆蓋。
將該混合液在2500rpm下不間斷離心30分鐘。之后，紅細胞和死細胞仍然留在Ficoll相下面的“棕黃層”中，而白細胞包括單核細胞被分離出來，形成在Ficoll上的白色界面。
將單核細胞的白色界面小心的吸出并用10ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混合。
然后將混合物在1800rpm下有間斷地離心3次，每次10分鐘；每次離心后將上清液吸出，離心管中裝滿新鮮的PBS。
離心管(Falcon試管)底部收集的沉淀含有單核細胞組分，即單核細胞。
實施例2單核細胞的增殖和去分化單核細胞的培養(yǎng)和增殖和細胞去分化都是在具有下列組成的營養(yǎng)培養(yǎng)基中一步完成的
營養(yǎng)培養(yǎng)基還含有2.5ug/500ml的M-CSF和0.2ug/500ml的白細胞介素-3(IL-3)。
將實施例1中分離的單核細胞轉移到一個6孔板上的5個孔中(每孔直徑為30毫米)，每次每個孔中的加入量約105個細胞。在每個孔中用2毫升上述營養(yǎng)培養(yǎng)基填滿。該6孔板事先用純的滅活的FCS裝滿，約7小時后將胎牛血清輕輕倒出，由此得到FCS包被的6孔板。每孔中的精確劑量的細胞數(shù)目可根據(jù)一個已知的方法來確定，參見Hay R.J“Cell Quantification and Characterisation”in Methods of Tissue Enginearing，Academic Press 2002，第4章，第55-84頁。
蓋上6孔板的蓋子在37℃培養(yǎng)箱中放置6天。細胞在24小時后沉到孔的底部。每隔一天吸去上清液，將6孔板的每一個孔再次裝滿2ml新鮮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
在第六天，將2毫升70％乙醇加入到6孔板中未使用的第6個孔中，蓋上6孔板的蓋子在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10個小時。
接著，在6孔板中含有細胞的每一個孔中用吸管加入1毫升用PBS以1∶10稀釋的胰蛋白酶溶液。蓋上6孔板在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃下放置5分鐘。
之后在6孔板的每個孔中加入2毫升RPMI 1640培養(yǎng)基阻斷胰蛋白酶的活性。將每個孔的所有上清液(1毫升胰蛋白酶+2毫升培養(yǎng)基)吸出，收集到一個15ml的Falcon管中，在1800rpm下離心10分鐘。棄去上清液，沉淀用新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)基混合(2毫升/105細胞)。
該細胞懸液可直接用來分化成不同的靶細胞。
或者，在離心棄去含胰蛋白酶的上清液后，細胞和作為冷凍培養(yǎng)基的DMSO/FCS混合，在106個/ml的濃度下深度冷凍。
冷凍培養(yǎng)基中含95％的FCS和5％的DMSO。每次約106個細胞置于1ml培養(yǎng)基中按照下述的步驟冷卻冰浴30分鐘；在-20℃下于預冷的發(fā)泡聚苯乙烯(Styropor)盒中放置2小時；在-80℃下于發(fā)泡聚苯乙烯(Styropor)盒中放置24小時；在-180℃下于液氮(N2)中的試管中貯藏。
為了現(xiàn)察根據(jù)上述方法得到的來源于單核細胞的去分化的可程序化干細胞的群體的免疫組織化學表型，每次取105個細胞并在載玻片上固定為細胞離心涂片器(cytospin)制劑以用于進一步組織化學染色(Watson，P.“A slide centrifuge；an apparatus forconcentrating cells in suspension on a microscope slide”J.Lab.Clin.Med 68494-501(1966))。之后可利用Cordell，J.L等人(文獻見下)描述的應用APAAP紅色復合物的技術對細胞進行染色。如果沒有另外指出，加入的一抗是用PBS以1∶100稀釋的，每次實驗中使用200μl該濃度的抗體。作為一抗使用的單克隆抗體抗如表1所列的細胞抗原表位。圖6顯示染色的細胞離心涂片器制劑和相應的干細胞標記物CD90，CD117，CD123和CD135的證據(jù)。
和染色技術有關的文獻Cordell J.L.，et al.″Immunoenzymatic labeling of monoclonalantibodies using immune complexes of alkaline phosphatase andmonoclonal anti-alkaline phosphatase(APAAP complexes).″J.Histochem.Cytochem.32219-229(1984).
和標記物有關的文獻CD14Ferrero E.，Goyert S.M.″Nucleotide sequence of the gene enco-ding the monocyte differentiation antigen，CD14″Nucleic AcidsRes.164173-4173(1988).
CD31Newman P.J.，Berndt M.C.，Gorski J.，White J.C.II，Lyman S.，Paddock C.，Muller W.A.″PECAM-1(CD31)cloning and relation toadhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily″Science 2471219-1222(1990).
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CD117Yarden Y.，Kuang W.-J.，Yang-Feng T.，Coussels L.，MunemitsuS.，Dull T.J.，Chen E.，Schlessinger J.，F(xiàn)rancke U.，UllrichA.″Human proto-oncogene c-kita new cell surface receptortyrosine kinase for an unidentified ligand.″EMBO J.63341-3351(1987).
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″STK-1，the human homolog of Flk-2/Flt-3，is selectivelyexpressed in CD34+human bone marrow cells and is involved inthe proli feration of early progenitor/stem cells.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91459-463(1994).
表1本發(fā)明所述干細胞抗原的表述
所示分級對應于檢測到的抗原陽性程度。單核細胞在相應的特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-9天后，反應變明顯。然后，將各自的細胞離心涂片器在顯微鏡下與陰性對照(沒有一抗時的染色)對比。
+細胞和一抗有清晰的顏色反應；++細胞和一抗有強烈的顏色反應。
僅對有70％以上的具有典型的干細胞形態(tài)(參見圖6)的活細胞的細胞離心涂片器制劑進行估計。其中只有不足1％的細胞表達了CD34抗原。
實施例3由成體干細胞制備神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的制備是在一個直徑為100mm的培養(yǎng)皿中進行的。為準備培養(yǎng)皿，在每個培養(yǎng)皿中加入5mm純的滅活的胎牛血清(FCS)以包被培養(yǎng)皿底部。7小時后將沒有粘附于培養(yǎng)皿底部的FCS部分吸出。將約106個根據(jù)實施例2制備的細胞加入到一個上述方法準備的培養(yǎng)皿中，并加入10ml如下列組成的營養(yǎng)培養(yǎng)基
營養(yǎng)培養(yǎng)基中還含有1×10-6M/500ml的視黃酸。
用來制備神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的干細胞在10天內發(fā)生再程序化/分化，這期間約每3天換培養(yǎng)基。此后，細胞大多數(shù)貼附于培養(yǎng)皿的底部，可以通過和以前對干細胞的描述中的類似的方式用簡單的胰蛋白酶消化作用，將其從平皿的底部剝離下來。
實施例4神經(jīng)元前體細胞，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的證明為了以后對由去分化的可程序化干細胞生成的靶細胞進行免疫組織化學特征分析，將從單核細胞生成的干細胞加至蓋玻片(20mm×20mm)上(105個細胞/蓋玻片)，將玻璃蓋放置于6孔板的底部(每孔直徑為30mm)，加入營養(yǎng)培養(yǎng)基(每孔2ml)培養(yǎng)。在干細胞分化成各自的靶細胞后，用下列方法將其固定移去營養(yǎng)培養(yǎng)基(上清液)后，加入2ml甲醇固定培養(yǎng)的靶細胞，甲醇的的作用時間超過10分鐘。隨后吸出乙醇，用PBS(每次2毫升)沖洗孔板2次。之后根據(jù)Cordell，J.L.等人“Immunoenzymatic labelingmonoclonal antibodies using immune complexes of alkalinephosphatase and monodonal artiralkaline phosphatase(APAAPcomplexes)”J.Histochem.Cytochem.32219-229(1994)中所描述的技術，用APAAP紅色復合體將細胞染色。除非另有說明，所加的一抗是用PBS以1∶100的比例稀釋的，每次6個孔的每1個中吸入200μl該濃度的抗體。
神經(jīng)元前體細胞可以通過用抗S100-抗原的抗體進行染色來檢測，參見
圖1中的中間圖(×200)。
神經(jīng)元是通過突觸泡蛋白MAP2(微管相關蛋白2)或具有相應的特異性抗體(一抗用PBS以1∶300的比例稀釋)的神經(jīng)絲68的特定表達來檢測的，圖1右圖，×200。
神經(jīng)膠質細胞例如星形膠質細胞是通過檢測GFAP(膠質原纖維相關蛋白)(一抗用PBS以1∶200的比例稀釋)來確定的，圖1左圖，×200。
根據(jù)如Carmiols“Cell lsolation and Selection”Methods ofTissue Engineering，Academic Press 2002，第2章，第19-35頁中記載的方法，利用特異性抗MAP2(神經(jīng)元)或GFAP(神經(jīng)膠質細胞)的抗體，通過MACS(磁激活細胞分選)的方式來分離神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞。
通過染色可見的細胞的類型如圖1所示。
實施例5由來源于單核細胞的去分化的可程序化的成體干細胞制備內皮細胞Matrigel(Beckton and Dickinson，Heidelberg，DE)被用作培養(yǎng)內皮細胞基質。這種基質由纖維結合素，層粘連蛋白和膠原I和IV組成。
冷凍的基質在4℃冰箱中經(jīng)過12小時的時間緩慢融化。在此期間它的狀態(tài)發(fā)生變化，即原先固態(tài)的基質變?yōu)楹＞d狀/液體狀。將這種狀態(tài)下的基質加入到一個48孔板(每孔直徑為10mm)使得每個孔的底部都被覆蓋。
此后，此孔板在室溫下放置30分鐘，直到凝膠在底部凝固成粘附層。
緊接著，每孔加入約1×102個細胞，并加入營養(yǎng)培養(yǎng)基在Matrigel上進行培養(yǎng)(如實施例2所述)。
4-5天以后第一個管狀的細胞鏈出現(xiàn)了，其在6-8天后發(fā)展成3維的細胞網(wǎng)絡。通過各自的特異一抗(每次200μl，用PBS以1∶100的比例稀釋)可以鑒定在細胞上的內皮標記物CD31和因子VIII。
另一種方法是將液態(tài)的基質加入到一個血管假器官中，然后用實施例2所述的去分化的可程序化的成體干細胞將其包被。約6天后可以鑒定到一大片內皮細胞以環(huán)狀的方式包被在假器官上。
如圖2所示，通過用相應的內皮特異性抗體(見上)進行染色可以顯示出內皮細胞。中間的圖顯示的是在Matrigel上培養(yǎng)5天后的細胞。第一個管狀的鏈將單個細胞聚集組合。深棕色標記的細胞表達CD31抗原(用黃色濾光片，經(jīng)200倍放大)。8天后三維的網(wǎng)絡結構開始慢慢形成(抗-CD31-抗原染色，黃色濾光片經(jīng)200倍放大)。12天后在Matrigel上培養(yǎng)的新分化的CD31+細胞形成一個容器狀的具有著多層壁結構的三維管，形態(tài)學上使人聯(lián)想到一個容器。經(jīng)檢測，現(xiàn)在幾乎所有細胞都表達CD31抗原(CD31染色，藍色濾光片，經(jīng)400倍放大)，如右圖所示。
實施例6脂肪細胞的制備A為了將實施例2中所述成體干細胞程序化/分化成脂肪細胞，首先要制備一種條件化培養(yǎng)基。為此，將20克自體的脂肪組織，即來自于同一人供體的脂肪組織且在該供體的血液中也可生成單核細胞，用如下方法處理首先脂肪組織在一個培養(yǎng)皿中壓碎，然后將破碎的組織碎片過篩(孔徑100μm)。
然后將上述方法得到的懸浮液轉移至一直徑為100mm的培養(yǎng)皿中，加入10ml含有30mg的II型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基。將此混合物在室溫下(22℃±2℃)放置大約60分鐘以使膠原酶作用于脂肪細胞。
緊接著將混合物轉移至一個50毫升的Falcon管中，將此管在1800rpm下離心10分鐘。
離心后棄去上清液，將由脂肪細胞和前體細胞組成的細胞沉淀轉入裝有8ml下述組成的培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)皿(直徑為100mm)中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。
胰島素溶液含有溶解于2ml醋酸水溶液(由40ml水和0.4ml冰醋酸組成)中的18mg的胰島素(Sigma 1-0259)。此溶液經(jīng)醋酸水溶液以1∶10比例稀釋。
在10天的培養(yǎng)期間，脂肪細胞條件化培養(yǎng)基(FCCM)形成上清液。每種情形中2-4天后用新鮮的培養(yǎng)基替換該上清液。將每次更換培養(yǎng)基所獲得的FCCM經(jīng)過無菌過濾后在-20℃保存。接著將10ml上述的FCCM和約106個實施例2所述的干細胞一起加入到一個培養(yǎng)皿(直徑為100mm)中。4天后就可見包含脂肪小體的初始前體細胞(圖3A)。6天后出現(xiàn)可被蘇丹紅染色的單個脂肪細胞(圖3B和C)。10天后這些細胞出現(xiàn)典型的聚集并形成叢，在該步驟，肉眼已可將其看作脂肪細胞(圖3D)。
如圖3A-3D所示，染色使得脂肪細胞可以看見，這樣就與對照3E和3F有著十分明顯的區(qū)別圖3E顯示來源于單核細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基(如實施例2所述)中培養(yǎng)6天的細胞，營養(yǎng)培養(yǎng)基未加IL-3和2-巰基乙醇。其中隨后加入了FCCM。這些細胞不能分化成脂肪細胞。圖F顯示的是在完全培養(yǎng)基(見實施例2)中培養(yǎng)6天，然后繼續(xù)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中而不是FCCM(見實施例2)中培養(yǎng)6天的細胞。FCCM含有給脂肪細胞分化提供信號所需的組分。
如圖3A，B，C，D細胞的蘇丹紅染色是根據(jù)Patrick Jr C.W等人“Epithelial cell Culturereast”，in Methods of TissueEngineering，Academic Press 2002，第4章，第141-149頁中所描述的方法進行的。
B除了通過用蘇丹紅染色來鑒別脂肪細胞的表型以外，也可以在mRNA水平上對脂肪細胞進行分子生物學特征的鑒別，來檢查脂肪細胞的遺傳編碼是否在使用脂肪細胞條件化培養(yǎng)基培養(yǎng)而進行相應的程序化之后經(jīng)歷了相應改變，以及來檢查從可程序化的單核細胞中程序化得到的脂肪細胞中是否可以鑒定所述脂肪細胞特有的供使核糖核酸(mRNA)轉錄物。通過聚合酶鏈式反應(PCR)的方法由分離出的RNA樣品擴增出脂肪細胞代謝的兩個特有的mRNA序列，此RNA樣品是從來源于單核細胞的去分化的可程序化的干細胞中分離得到的，該mRNA在平行實驗混合物中由已程序化的脂肪細胞中擴增到，分別稱為“過氧化物酶體增殖活化受體γ”(PPARG)-mRNA(Tontonoz，P等人“Stimulation of adipogenesis in fibroblaots by PPARgamma 2，a lipid-activated transcription factor”Cell 791147-1156(1994)，基因庫查詢號NM-005037)和“瘦素(肥胖同系物，小鼠)”-mRNA(Zhang Y等人“Positional cloming of themouse obese gene and its human homologue”Nature 372425-432(1994)，基因庫查詢號NM-000320)。
為此需要進行的RNA分離、逆轉錄法和目標mRNA序列的PCR擴增條件的選擇根據(jù)現(xiàn)有技術的詳細記載進行，參見Ungefroren H等人，“Human pancreat ic adenocarcinomas express Fas and Fasligand yet are resistant to Fas-mediated apoptosi”，CancerRes.581741-1749(1998)。
為此選擇的引發(fā)PCR擴增的各種引物要能使正向-和反向引物結合到mRNA序列上，該mRNA序列的染色體基因的同源區(qū)位于兩個不同的外顯子上，其相互被一個大的內含子分開。這樣可以確保從細胞中包含的mRNA獲得碎片而不是由染色體DNA中存在的序列進行擴增。特別優(yōu)選下述的用于PPAR-γ和瘦素的引物序列PPAR-γ正向引物；265-288(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物487-465(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為487-265bp＝223bp的擴增碎片，見圖3G。圖3G進一步表明在可程序化干細胞和腫瘤細胞系HL-60(人早幼白血病細胞系)中已鑒定了痕量轉錄的PPAR-γ特異性mRNA，盡管其比脂肪細胞本身的信號帶明顯窄得多。不同的是，通過逆轉錄酶PCR在mRNA的水平上只能在由可程序干細胞生成的脂肪細胞中檢測到脂肪細胞特異性蛋白瘦素。
可程序化干細胞(progr.Stem cell)作為對照，人腫瘤細胞系HL-60、Panc-1和WI-38不轉錄瘦素。作為陰性對照的沒有加入逆轉錄酶(脂肪細胞/-RT)的所有樣品和水的樣品同時進行測定。通過測定陽性對照中的GAPDH“看家”基因，可以確保PCR擴增步驟在每個混合物中是正常進行的。
實施例7肝臟細胞(肝細胞)的制備A為使實施例2所述的來源于單核細胞的去分化的可程序化干細胞程序化生成肝細胞，首先要制備條件化培養(yǎng)基。因此將40g人肝臟組織進行如下處理。
首先將肝臟組織在PBS中漂洗幾次，基本上去除紅細胞。然后在培養(yǎng)皿中將組織壓碎，再在室溫下與分離溶液一起培養(yǎng)約45分鐘。分離溶液由40mlPBS(磷酸鹽緩沖液)，10ml用PBS按1∶10稀釋的胰蛋白酶溶液和30mlII型膠原酶(Rodbel M等人J.Biol.Chem.239375(1964))組成。培養(yǎng)45分鐘之后將組織碎片過篩(參見實施例6)。
然后將混合物轉入50ml的Falcon管中，加入PBS至50ml，1800rpm下離心10分鐘。
離心后棄去上清液，含有肝細胞的細胞沉淀再用50ml的PBS漂洗、離心。再次棄去形成的上清液，將細胞沉淀引入25ml如下組成的培養(yǎng)基中，在細胞培養(yǎng)瓶(體積為250ml)中在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天。
肝細胞生長培養(yǎng)基
營養(yǎng)培養(yǎng)基另外含有5μg(10ng/ml)的表皮生長因子(Pascall，I.C.等人，J.Mol.Endocrinol.12313(1994))。胰島素溶液的組成如實施例6所述。
在持續(xù)10天的培養(yǎng)期間，肝臟細胞條件化培養(yǎng)基(LCCM)形成了上清液。2-4天后分別用新鮮的營養(yǎng)培養(yǎng)基取代上清液。每次換培養(yǎng)基時得到每批LCCM都要經(jīng)過無菌過濾(0.2μm孔徑的膜過濾)后-20℃下貯存。
然后將1×106個去分化的干細胞在裝有10ml如下組成的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑100mm)或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
肝細胞分化培養(yǎng)基
肝細胞生長因子(Kobayashi，Y.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2207(1996))的使用濃度為40ng/ml。幾天以后可以觀察到趨向扁平的、多角形的單倍體或二倍體細胞的形態(tài)學改變(圖4A)。10-12天以后，可以通過免疫組織化學檢測肝特異性抗原α-胎蛋白來鑒定來源于去分化的干細胞的肝細胞(Jacobsen，G.K.等人，Am.J.Surg.Pathol.5257-66(1981))，如圖4B和4C所示。
B為了檢查在使用肝細胞條件化培養(yǎng)基進行相應的程序化之后干細胞的基因編碼是否產(chǎn)生相應的變化，以及作為由本發(fā)明的干細胞生成的肝細胞的肝細胞特有的信使核糖核酸轉錄物是否可被鑒定，除了通過α-胎蛋白的免疫組織化學鑒定肝細胞的表型之外，還要進行mRNA水平的肝細胞的分子生物學特征的鑒定。因此在來源于單核細胞的去分化的可程序化干細胞中，以及在平行試驗的樣品中，在來源于干細胞程序化得到的肝細胞中，通過分離的RNA樣品的聚合酶鏈反應(PCR)方法來檢測5種不同的肝細胞特有mRNA序列的存在。具體而言，這是智人(Homo Sapiens)白蛋白mRNA(Lawn，R.M等人“The sequence of human seum a16umin cDNA and HSexpression in E.coli”Nucleic Acids Res.96103-6114，(1981)，基因庫查詢代號MM-000477)、α-胎蛋白mRNA(Morinaga T等人“Primary Stractures of human alpha-fefoprotein and the mRNA”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804604-4608(1983)，基因庫查詢代號V01514)、人氨甲酰磷酸合成酶I的mRNA(Haraguchi，Y等人“Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamylphosphate syathetasermolecular analysis ofhyperamoronemin”Gene 107335-340(1991)，基因庫查詢代號D90282)、智人凝血因子II(凝血酶，F(xiàn)2)mRNA(Degen，S.J.等人“Characterization of the complementary deoxyribonucleicacid and gene coding for human prothrom 6in”Biochemistry 222087-2097(1983)，基因庫查詢代號NM-000506)、智人凝血因子VII(血清凝血酶原轉變加速因子，F(xiàn)7)mRNA(NCBI AnnotationProject.Direct Submission，2002年2月6日，國家生物科技信息中心，NIH，Bethesda，MD 20894，美國，基因庫查詢代號XM-027508)。
根據(jù)現(xiàn)有技術中詳細記載，進行逆轉錄酶方法所必需的RNA分離和選擇目標mRNA序列的PCR擴增的條件，參見Ungefroren H等人，“Human pancreatic adenocarcinomas express Fas and Fas ligandyet are resistant to Fas-mediated apoptosis”Cancer Res.581741-1749(1998)。
選用的PCR擴增的各種引物要能使正向和反向引物結合到mRNA序列上，該mRNA序列在染色體基因上的同源區(qū)位于兩個不同的外顯子中，其相互被一個大的內含子彼此分開。由此確保從細胞中包含的mRNA獲得碎片而不是由染色體DNA中存在的序列進行擴增。
引物序列的選擇如下所示；各種PCR分析的結果在圖40中再現(xiàn)。本發(fā)明的去分化的可程序化干細胞稱為“pror.stem cell”，由其程序化得到的肝細胞成為“pror.hepatocyte”。
α胎蛋白正向引物1458-1478(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1758-1735(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1758-1458bp＝391bp的擴增碎片，見圖4D。
如圖4所示，本身不具有可識別的α胎蛋白的特異性mRNA轉錄物的程序化干細胞(pror.stem cell)能夠被程序化為含有這種mRNA轉錄物(分子量為301bp的陽性帶)的肝細胞(pror.hepatocyte)。這也解釋了圖4B和4C所示的α胎蛋白免疫組織化學的檢測結果。陽性對照稱為人肝臟組織，肝腫瘤細胞系HepG2也轉錄α胎蛋白mRNA，由301bp的帶確認。
白蛋白正向引物1450-1473(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1868-1844(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1868-1450bp＝419bp的擴增碎片，見圖4D。
圖4D顯示了在可程序化干細胞中已有的痕量轉錄的白蛋白特異性mRNA，同時都作為陽性對照的由干細胞程序化獲得的肝細胞、正常肝組織以及肝腫瘤細胞系HepG2的肝細胞都大量表達mRNA，可以看見清晰的譜帶。
氨甲酰磷酸合成酶I正向引物3135-3157(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物46 35-4613(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為4635-3135bp＝1500bp的擴增碎片，見圖4D。
氨甲酰磷酸合成酶I是肝細胞的特異性酶，其在“尿素循環(huán)”中尿素的代謝中發(fā)揮重要作用。這種解毒作用由活性的肝細胞保證。如圖4D所示，對于從可程序化干細胞得到的肝細胞和陽性對照(人肝臟組織和HepG2腫瘤細胞系)都可以看到氨甲酰磷酸合成酶I的特異性mRNA帶(1500bp)。程序化的肝細胞(pror.hepatocyte)mRNA條帶的一定程度上較弱的表這是由于培養(yǎng)皿中缺乏可用的底物。
凝血因子II正向引物1458-1481(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1901-1877(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1901-1458bp＝565bp的擴增碎片，見圖4D。
同樣的如圖4D所示，這種肝細胞特異性蛋白僅能在程序化的肝細胞(pror.hepatocyte)和來自人肝臟組織的陽性對照中在mRNA水平上以444bp條帶的表述檢測到，而可程序化干細胞(pror.stemcell)并不顯示出這個帶，即基因不在那里轉錄。
凝血因子VII正向引物725-747(在外顯子1中的相應基因序列)，反向引物1289-1268(在外顯子2中的相應基因序列)，其結果為1289-725bp＝444bp的擴增碎片，見圖4D。
與凝血因子II的情形相同，這種蛋白僅在程序化的肝細胞(pror.hepatocyte)和陽性對照(人肝臟組織)中轉錄(見656bp的帶)，盡管弱于凝血因子II?？沙绦蚧杉毎完幮詫φ?水)都不顯示該特異性mRNA帶。
甘油醛脫氫酶這種基因也稱之為“看家基因”，能夠在每個真核細胞中檢測到，被作為PCR擴增是否在所有樣品中正常進行的對照。它同時進行測定，并且由加入的確定量的來自各種細胞樣品的RNA得來。
作為陰性對照樣品的水同時在所有的檢測中共同測定。如果DNA不污染水，在PCR中就沒有擴增，也不會檢測到條帶(以此作為反對照)。
實施例8皮膚細胞(角質細胞)的制備為了使實施例2所述單核細胞源的去分化的可程序化干細胞在皮膚細胞中程序化，首先應制備一種條件化培養(yǎng)基。為此1-2cm2完整的人皮膚作如下處理。
首先將皮膚原料在無菌條件下去除皮下組織。然后將該組織在劇烈振蕩的無菌容器中用總計10×的PBS洗滌。洗滌二次之后，再次去除組織中連接著的有區(qū)別的組織殘渣。
再將皮膚原料置于直徑60mm的培養(yǎng)皿，混入3ml的按1∶10的比例用PBS稀釋的胰蛋白酶溶液，再將其切成小塊(約0.5-1mm3)。隨后，再向混合物中加入3ml用PBS接1∶100的比例稀釋的胰蛋白酶溶液，混合物在37℃下間歇振蕩培養(yǎng)。
然后使較大的顆粒沉淀，倒出包含角質細胞的上清液，在800rpm下離心5分鐘。這時吸出得到的上清液，將細胞沉淀置于3ml如下組成的培養(yǎng)基中，在37℃的培養(yǎng)箱中在培養(yǎng)皿(直徑100mm)中培養(yǎng)15天。
角質細胞生長培養(yǎng)基
營養(yǎng)培養(yǎng)基中包含5μg的表皮生長因子(參見實施例7的精確說明)和5mg的氫化可的松(參考Merck索引12，4828)。
在15天的培養(yǎng)期間，角質細胞條件化培養(yǎng)基KCCM形成上清液。每種情形中2-4天后用新鮮的營養(yǎng)培養(yǎng)基取代上清液。將每次換培養(yǎng)基得到的KCCM過濾除菌在-20℃下貯存。
然后，在培養(yǎng)皿(直徑100mm)或培養(yǎng)瓶中用10ml如下組成的培養(yǎng)基培養(yǎng)1×106去分化干細胞。
角質細胞分化培養(yǎng)基
如Finch等人，Gastroenterology 110441(1996)中所述，角質細胞生長因子的使用濃度為25ng/ml。
幾天后可以觀察到細胞出現(xiàn)形態(tài)學上的變化。6天之后能夠檢測到角質細胞特異性抗原，即與使用的一抗都能夠結合的細胞角蛋白5和6(見圖5A)(Exp.Cell.Res.162114(1986))。10天之后培養(yǎng)基中較大的細胞個體開始粘著，這樣就能夠看到聚集在一起的細胞形成的可見細胞組織(圖5B)。
實施例9由分化的程序化干細胞制備胰島素產(chǎn)生性細胞胰島素產(chǎn)生性細胞的制備是在體積約250ml和平壁的培養(yǎng)瓶(T75細胞培養(yǎng)瓶)中進行的。根據(jù)實施例13制備的約5×106的細胞懸浮在約5ml的如下所述的培養(yǎng)基(胰島素產(chǎn)生性細胞分化培養(yǎng)基)中，當其被引入培養(yǎng)瓶后，進一步與15ml的培養(yǎng)基混合。為了使細胞去分化，須將培養(yǎng)瓶在37℃和5％CO2，水平放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
培養(yǎng)基(根據(jù)Rameya V.K.等人，Nature Medicine，6(3)，278-282(2000)改良的)
營養(yǎng)培養(yǎng)基還包含量為10ng/ml的表皮生長因子和量為20ng/ml的肝細胞生長因子。
在第一個小時中，細胞貼附于培養(yǎng)容器的底部。干細胞的分化根據(jù)胰島素的產(chǎn)生進行監(jiān)控。為此在間隔約2-3天后要改變培養(yǎng)基，每次收集細胞上清液，并于-20℃下冷凍。貼附于培養(yǎng)瓶底部的細胞可通過實施例2中所述的胰蛋白酶作用而被剝離。
不同分化時間收集到的上清液中胰島素含量可通過用于測定人胰島素的ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測定法)測定(Bruhn D.H FlschU.R.(Eds)，Lehrbuch der LabormedizinGrundlagen，Diagnostik，Klinik Pathobiochemie[Textbook of Laboratory Medicine，Principles，Diagnosis，Clinical Pathobiochemistry](1999)，189頁)，并與培養(yǎng)基的空白讀數(shù)進行比較。圖8中重復的結果表明培養(yǎng)至14天，細胞胰島素產(chǎn)量達到最大值。處在分化處理過程中的細胞產(chǎn)生的胰島素的含量14天之后增加到3μU/ml，而在對照組中沒有檢測到人胰島素。圖8中的柱狀圖形分別代表三個各自獨立的試驗每次確定的三個獨立的數(shù)值。
在確定分化成本發(fā)明所述胰島素產(chǎn)生性細胞的去程序化干細胞的胰島素的含量之后，進而要確定去分化進行3周之后仍然能夠表達單核細胞特異性表面抗原CD14的產(chǎn)生胰島素的細胞的比例。結果發(fā)現(xiàn)，3周以后有很大比例(約30-40％)的這些細胞上都檢測到了單核細胞特異性抗原CD14。
實施例10由去分化可程序化干細胞制備肝細胞的可選擇的方法如實施例7中所述，作為使用肝細胞條件化培養(yǎng)基(LCCM)的替代，干細胞在下述營養(yǎng)培養(yǎng)基(Ha)中被誘導分化成肝細胞。來源于干細胞的肝細胞的制備在體積約250ml和平壁的培養(yǎng)瓶(T75細胞培養(yǎng)瓶)中進行。根據(jù)實施例13制備的約5×106的細胞被引入約5ml的如下面所述的改良培養(yǎng)基(Ha，肝細胞分化培養(yǎng)基)中，當其被引入培養(yǎng)瓶中之后，進一步與15ml的培養(yǎng)基混合。為了細胞去分化，須將培養(yǎng)瓶在37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱中水平放置培養(yǎng)。
肝細胞分化培養(yǎng)基(Ha)(根據(jù)Schwarz等人，“Multipotentadult progenitor cells from 6one marrow differentiae intofunctional nepatodyte-like cells”，J.Clin.Invest.10(109)，1291-1302(2002))
營養(yǎng)培養(yǎng)基中還含有量為3ng/ml的成纖維細胞生長因子(FGF-4)。
在第一個小時之內細胞貼附于培養(yǎng)容器底部。根據(jù)白蛋白產(chǎn)生來監(jiān)控干細胞的分化。為此約間隔2-3天換培養(yǎng)基，每次收集的細胞上清液在-20℃下冷凍。貼附于培養(yǎng)瓶底部的細胞可用實施例2中所述的胰蛋白酶作用進行剝離。
不同時間收集到的上清液中白蛋白含量可通過用于測定人白蛋白的ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測定法)測定(根據(jù)BethylLaboratories Inc.的規(guī)程和Schwarz等人，在上述引文中)，并與培養(yǎng)基的空白讀數(shù)進行比較。圖9的結果顯示培養(yǎng)14-28天期間細胞的白蛋白生產(chǎn)保持大致恒定。分別在相對于加入Ha培養(yǎng)基的時間的第0(培養(yǎng)基的空白讀數(shù))、14、21、28和30天進行檢測。每次檢測結果分別為5ng/ml、450ng/ml、425ng/ml、440ng/ml和165ng/ml。圖9中的柱狀圖形分別代表三個各自獨立的試驗每次確定的三個獨立的數(shù)值。
實施例11來源于去分化干細胞的肝細胞中共表述的白蛋白和單核細胞特異性抗原CD14的測定在來源于去分化干細胞的肝細胞中共表達的白蛋白和單核細胞特異性抗原CD14的測定一方面是通過雙重染色(A)，另一方面是通過FACS分析(B)進行的。
A)將根據(jù)實施例10所述的本發(fā)明所述分化成肝細胞的干細胞在6孔板中的蓋玻片上培養(yǎng)，并按照實施例4所述用甲醇固定。為了檢測同時表達的抗原CD14(單核細胞表型標記)和白蛋白(肝特異性標記)要使用雙重染色。
為此如實施例4所述首先將細胞與抗人白蛋白(豚鼠抗人白蛋白)的一抗一起在按1∶50稀釋的PBS中培養(yǎng)。洗滌步驟后，然后將細胞也在按1∶50稀釋的PBS中與二抗小鼠抗大鼠培養(yǎng)45分鐘，該二抗結合豚鼠抗體。然后再根據(jù)實施例4采用Cordell J.L等人(在上述引文中)的方法用APAAP紅色復合物進行染色。
在第二步染色步驟中，細胞與一抗即小鼠抗人CD14抗體一起培養(yǎng)，根據(jù)實施例4洗滌后再使用Hsu，S.M等人在“The use ofantiavidin antibody and avidin-biotin-peroxidase complex inimmunoperoxidanse，technics”Am.J.Clin.Pathol.75(6)816-821(1981)中dem DAB復合物(褐色)(Vector Laboratories)的方法用Vectastain(Vector)的ABC鏈霉抗生物素蛋白試劑盒進行染色。
然后按照實施例4所述用haemalaun進行核對染，接著將其嵌入Kaiser’s甘油明膠。
結果如圖10所示。圖中表明抗原CD14表述為褐色，其顏色隨著細胞轉變成肝細胞的形態(tài)學變化慢慢褪去，而白蛋白表達為紅色，其顏色隨著肝細胞的不斷成熟而加深。圖10中第4號圖顯示的是用肝細胞條件化培養(yǎng)基刺激三周后的細胞。
B)雙重標記進行的同時，利用FACS(熒光激活細胞分類術)分析對本發(fā)明所述干細胞分化成肝細胞進行分析。
根據(jù)實施例10的由干細胞分化成的肝細胞首先用細胞刮棒將細胞從培養(yǎng)瓶中機械分離。小心的用PBS將細胞從瓶上洗下，共洗滌兩次，每次使用10mlPBS溶液。為此，將PBS溶液中細胞懸液置于15ml離心管中，在1600rpm下離心沉淀。得到的細胞沉淀用PBS稀釋至每100μl PBS含有1×105個細胞。
然后在該細胞懸液中加入各10μl的FITC-標記的抗CD14抗體(BD Pharmigen)或FITC-標記的抗白蛋白抗體(Beckmann)以及FITC-標記的非特異性IgG1小鼠抗人抗體。培養(yǎng)20分鐘之后，細胞在500μl的PBS中重懸兩次，每次在1600rpm下沉淀5分鐘，最后再轉入200μl的PBS中。將細胞再次混懸后，利用BD Bioscience公司出產(chǎn)的BD FACScalibur流式細胞儀檢測熒光(參見FranklinLakes，NJ)(參見Bruhn H.D Flsch U.R.(eds.)，Lehrbuch derLabormedizinGrundlagen，Diagnostik，Klinik Pathobiochemie[Textbook of Laboratory Medicine，Principles，Diagnosis，Clinical Pathobiochemistry]，395-403(1999)，以及Holzer U等人，“Differential antigen sensitivity and costimulatoryrequirements in human Th1 and Th2 antigen-specific CD4(+)cells with similar TCr anidity”J.Immunol.170(3)1218-1223(2003))。使用Marquez M.G.等人“Flow cytometric analysisof intestinal intra-epithelial lymphocytes in a model ofimmunodeficiency in Wistar rats”Cytometry 41(2)115-122(2000)中介紹的微軟WinMDI程序對結果進行評價。
FACS分析的結果在圖11中再現(xiàn)。圖中顯示了在本發(fā)明所述去分化單核細胞(左欄)和分化成肝細胞的干細胞(右欄)中測量的CD14(上面一排)和白蛋白抗原(下面一排)的表達。在去分化單核細胞中能檢測到CD14的大量表達，檢測不到白蛋白的表達。而在由去分化單核細胞生成的肝細胞中檢測到較少的CD14的表達，白蛋白的表達則很強。
實施例12單核細胞來源的去分化程序化干細胞的體內應用為了闡明可程序化干細胞在體內利用肝臟中存在的信號提供者而進行特異分化的程度，首先將雌性LEW大鼠的肝臟用倒千里光堿處理來抑制肝臟中已有肝細胞的增殖活性(參見Lacone，E等人“Long-term，11 ear-total liver replacement bytransplantation of isolated hepatocytes in rats treated withretrorsine”Am.J.Path.153319-329(1998))，然后將所述可程序化干細胞經(jīng)門靜脈注射入遺傳上相同的受體動物的肝臟。
為此LEW大鼠在14天內腹膜內兩次注射30mg雙吡咯烷類生物堿倒千里光堿。隨后切除經(jīng)上述方法處理的肝臟的80％，然后將含有5×105的可程序化干細胞的1mlPBS溶液注入剩余肝臟的門靜脈。如實施例2所述干細胞來自于雄性LEW大鼠的單核細胞。注入干細胞5天以后，利用肝臟活組織穿孔對肝臟進行組織學評價，利用具有Y染色體特異性探針的熒光原位雜交(FISH)方法檢測由干細胞分化的細胞的類型(詳細記載見Hoebee，B.等人“Lsolation of ratchromosome-Specific paint probes by bivariate flow sortingfollowed by degenerate oligonucleo tide primed-PCR”Cytogenet.Cell Genet.66277-282(1994)。
圖7A顯示的是給倒千里光堿預處理過并切除80％的雌性受體動物的肝臟進行門脈內注射第五天時，由雄性LEW干細胞生成的Y染色體陽性(細胞核中有紅點)的肝細胞。干細胞注射后第25天選擇性去除同樣的肝臟表明干細胞分化成肝細胞、內皮細胞和膽管上皮(圖7B)。與此同時，肝臟已經(jīng)達到正常大小，＞90％的細胞具有Y染色體。由此可以推斷注射的同源的可程序化的單核細胞源的干細胞能夠在體內有效的完全恢復肝臟正常代謝動能。與此相關，圖7C表示在施用倒千里光堿和80％肝臟切除后，干細胞處理的對未處理的受體大鼠的Kaplan-Meier存活曲線(每組n＝4)。
功能性參數(shù)膽紅素和氨證實了干細胞處理的長期存活的動物具有完整的代謝功能(圖7D和7E)實施例13細胞培養(yǎng)瓶中單核細胞的增殖和去分化在含有相同的營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，一方面進行單核細胞的大規(guī)模培養(yǎng)和增殖，另一方面進行細胞大量去分化，這也可以用于孔板中的培養(yǎng)(參見實施例2)。營養(yǎng)培養(yǎng)基中包含2.5μg/500ml的M-CSF和0.2μg/500ml白細胞介素3(IL-3)。
將實施例1中分離的單核細胞轉入體積為250ml和平壁的培養(yǎng)瓶底部(T-75細胞培養(yǎng)瓶)。約10倍×106的細胞被轉入每個裝有20ml上述營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。根據(jù)已知的方法(參見Hay R.J.，“”，Academic Press(2002)，第4章，55-84頁)確定每瓶中確切的細胞數(shù)量。
細胞培養(yǎng)瓶在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。24小時之后，細胞貼附于瓶底。每隔一天移走上清液，并加入20ml新鮮的培養(yǎng)基。
第六天，將營養(yǎng)培養(yǎng)基從瓶中吸出，然后將每個培養(yǎng)瓶用10ml PBS漂洗兩次。至此，所有沒有貼附于瓶底的細胞都被移走。隨后將貼附于瓶底的生長的細胞用無菌細胞刮棒剝離下來。用PBS沖洗從瓶上剝離的分離的細胞，收集在50ml的Falcon管中，1800rpm下離心10分鐘。然后棄去上清液，沉淀再用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基再次懸浮(2ml/105細胞)。
細胞懸浮液可直接用于分化成不同的靶細胞。
也可以離心后將細胞與作為冷凍培養(yǎng)基的DMSO/FCS混合，以106/ml的濃度深度冷凍。
冷凍培養(yǎng)基含有95％的FCS和5％DMSO。約106的細胞加入1ml介質中。按照如下的步驟冷卻
冰浴30分鐘；在-20℃預冷的可發(fā)泡性聚苯乙烯盒中2個小時；在-80℃的可發(fā)泡性聚苯乙烯盒中24個小時；在-180℃液氮(N2)中的試管中貯存。
權利要求
1.制備來源于人單核細胞的去分化的可程序化干細胞的方法，其特征在于a)從人血液中分離單核細胞；b)在含有細胞生長因子M-CSF的適宜的培養(yǎng)基中增殖單核細胞；c)同時或在步驟b)之后在含有IL-3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細胞；d)從培養(yǎng)基中分離得到人成體的去分化的可程序化干細胞。
2.權利要求1所述方法，其特征在于在步驟c)中向培養(yǎng)基中再加入巰基化合物。
3.權利要求2所述方法，其特征在于使用的巰基化合物中至少有一個碳基團與硫鍵合，和烴基可以被一個或多個其它的功能基團取代。
4.權利要求2或3所述方法，其特征在于巰基化合物是2-巰基乙醇或二甲基亞砜。
5.權利要求1-4所述方法，其特征在于在步驟c之后和步驟d之前，細胞與一種生物學上可接受的有機溶劑接觸。
6.權利要求5所述的方法，其特征在于生物學上可接受的有機溶劑是具有1-4個碳原子的醇。
7.權利要求6所述的方法，其特征在于所述醇為乙醇。
8.權利要求5至7所述的方法，其特征在于使細胞與生物學上可接受的有機溶劑的蒸汽相接觸。
9.權利要求1至8所述的方法，其特征在于在步驟d之后，將細胞懸浮于適宜的細胞培養(yǎng)基中。
10.權利要求9所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為RPMI或DMEM。
11.權利要求9或10所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基中包含一種細胞因子或LIF。
12.權利要求9至11所述的方法，其特征在于將細胞懸浮于液體培養(yǎng)基中并隨后深度冷凍。
13.權利要求12所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為細胞培養(yǎng)基。
14.來源于人單核細胞的去分化的可程序化干細胞。
15.權利要求14所述的干細胞，其可以通過權利要求1至13的方法獲得。
16.藥物組合物，其包含權利要求14或15所述去分化的可程序化干細胞。
17.權利要求14或15所述去分化的可程序化干細胞在制備靶細胞和靶組織中的用途。
18.權利要求17所述的用途，其特征在于a)壓碎包含期望的靶細胞的組織；b)從壓碎的組織中獲得靶細胞和/或其碎片；c)在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)靶細胞和/或其碎片；d)在培養(yǎng)過程中和之后收集培養(yǎng)基上清液，作為靶細胞條件化培養(yǎng)基；和e)使干細胞在靶細胞條件化培養(yǎng)基中生長以使干細胞再程序化/分化為期望的靶細胞。
19.權利要求17或18所述的用途，用于制備脂肪細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞、內皮細胞、角質細胞、肝細胞或胰島細胞。
20.權利要求1至13所述的方法，其特征在于去分化的可程序化干細胞被一個或多個基因轉染。
21.權利要求14所述來源于人單核細胞的去分化的可程序化干細胞，其特征在于膜聯(lián)單核細胞特異性表面抗原CD14和至少一種選自CD117、CD123和CD135的多能性標記。
22.權利要求14、15或21所述的干細胞，其特征在于去分化的可程序化干細胞被一個或多個基因轉染。
23.干細胞制劑，其中含有在適宜的培養(yǎng)基中的權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞的。
24.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療肝硬變的藥物組合物中的用途。
25.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療胰機能不全的藥物組合物中的用途。
26.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療急性或慢性腎功能衰竭的藥物組合物中的用途。
27.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療激素功能低下的藥物組合物中的用途。
28.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療心肌梗塞的藥物組合物中的用途。
29.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療肺栓塞的藥物組合物中的用途。
30.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療中風的藥物組合物中的用途。
31.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞在制備治療皮膚損傷的藥物組合物中的用途。
32.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞用于制備用于體內生成靶細胞和靶組織的藥物組合物中的用途。
33.由權利要求14、15、21或22所述干細胞再次程序化獲得的分化的、分離的靶體細胞和/或靶組織，其特征在于膜聯(lián)表面抗原CD14。
34.權利要求33所述靶體細胞和/或靶組織，其選自脂肪細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞、內皮細胞、角質細胞、肝細胞或胰島細胞。
35.權利要求33或34所述靶體細胞和/或靶組織，其特征在于它們被一個或多個基因轉染。
36.權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞或權利要求33-35所述靶體細胞和/或靶組織包被的可移植物。
37.權利要求36所述的可移植物，其特征在于所述可移植物是假器官。
38.權利要求37所述的可移植物，其特征在于所述假器官選自心臟瓣膜、血管假器官、骨和關節(jié)假器官。
39.權利要求36所述的可移植物，其特征在于所述可移植物是包含權利要求14、15、21或22所述去分化的可程序化干細胞或權利要求33-35所述靶細胞的人工的和/或生物的載體材料。
40.權利要求39所述的可移植物，其特征在于所述載體材料是介入人體的囊或室。
41.包含權利要求33所述的胰島細胞的權利要求40所述囊或室在制備藥物構建體中的用途，該藥物構建體作為提供胰島素的人工胰島細胞孔口室。
42.包含權利要求33所述的脂肪細胞的權利要求40所述囊或室在制備用于手術后乳房重塑和整形和/或美容矯正的藥物構建體中的用途，該藥物構建體中包含填充有脂肪細胞的人工聚合物。
43.權利要求36或40所述可移植物，其特征在于所述可移植物是含有權利要求33所述分化的分離的靶體細胞的半透性孔口室系統(tǒng)。
44.權利要求43所述的半透性孔口室系統(tǒng)在制備用于體內治療內分泌、代謝或凝血疾病的藥物構建體中的用途。
45.M-CSF和IL-3在制備來源于人單核細胞的去分化的可程序化干細胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及從人單核細胞制備成體去分化可程序化干細胞，所述制備通過將單核細胞在含有M－CSF和IL－3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而進行。本發(fā)明進一步涉及含有去分化可程序化干細胞的藥物組合物以及這些干細胞在靶細胞和靶組織制備中的用途。
文檔編號A61K35/12GK1643137SQ03807128
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權日2002年3月28日
發(fā)明者B·K·F·克雷默, F·費恩德里希, M·魯恩克 申請人:布拉斯蒂康生物科技研究有限責任公司