專利名稱：用于治療對PPAR－γ受體的活化有響應(yīng)的病變的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及螺萊素(spirolaxine)在治療這些對PPARγ受體(過氧化物酶體增殖蛋白激活性受體)的活化有響應(yīng)的病變?nèi)?型抗胰島素性糖尿病中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含作為用于治療對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變?nèi)缂毙詯盒匝翰〉幕钚猿煞值穆萑R素和全反式視黃酸。
PPARγ是核受體總科的成員。其與類視黃醇1受體(RXR)異二聚體化并可作為與葡萄糖和脂質(zhì)代謝相連的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑(Diabetes47(4)507 1998年4月14日)。
糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的綜合征；其特征為胰島素分泌和其它代謝紊亂以及血管異常，即血液中葡萄糖濃度升高、非特異性的動脈粥樣硬化加速、神經(jīng)病和由腎和視網(wǎng)膜變性而導(dǎo)致的毛細(xì)管基底層加厚。
根據(jù)現(xiàn)代分類，糖尿病主要被分成兩類1-胰島素依賴性糖尿病(也被稱為1型糖尿病)；患有這種類型糖尿病的患者完全依賴于胰島素來防止酮酸中毒和死亡。就內(nèi)源性胰島素分泌而言，患有1型糖尿病的患者表現(xiàn)為胰島素分泌減少。
2-非胰島素依賴性糖尿病(也被稱為2型糖尿病)；患有這種類型糖尿病的患者不需要胰島素來生活他們可以決定是否用其來控制糖尿病的癥狀。就內(nèi)源性胰島素分泌而言，患有2型糖尿病的患者可被進(jìn)一步分為兩類。在第一類中，胰島素水平正常或低于正常；在第二類中，胰島素值高于正常并且患者表現(xiàn)出抗胰島素性。
如上所述，PPARγ還可作為與脂質(zhì)和葡萄糖代謝有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑。
可用于糖尿病的治療的胰島素敏化藥，PPARγ的配體已經(jīng)是已知的。
例如，將噻唑烷二酮衍生物描述為可用于治療患有2型抗胰島素糖尿病患者的物質(zhì)。這些化合物是PPARγ的高親和力配體；其由于在體內(nèi)對所說受體具有高連接親和力而具有抗糖尿病活性(NipponRinsho 2000年二月；58(2)401-4)。
類似地，PPARγ在一些白血病細(xì)胞系中具有高水平的表達(dá)，其不能進(jìn)行區(qū)分使得隨后在最不成熟水平上發(fā)生累積(Jan，Exp.4，281-99，1995)。
急性惡性血液病是血癌，其在發(fā)達(dá)國家中進(jìn)行性的不斷增長。
在空氣中存在越來越多的污染化物，其使得人類基因庫發(fā)生突變。這些突變常常是造成實(shí)體癌和惡性血液病的原因。
如上所述，急性惡性血液病的特征為淋巴系或骨髓系細(xì)胞不能分化，其使得隨后在最不成熟的水平上發(fā)生了累積。
通?？梢杂每梢韵麥邕@些腫瘤細(xì)胞或可誘導(dǎo)其末期分化的藥物來治療這些病變(分化療法)。
在European Journal of Cell Biology 67，379-85-1995年8月和European Journal of Cell Biology 77，214-19-1998年11月中描述了具有抗增生活性的PPARγ配體，當(dāng)與類維生素A聯(lián)用時，其對不同的骨髓白血病細(xì)胞系表現(xiàn)出強(qiáng)的前期分化協(xié)同作用。
事實(shí)上，通過與RXT類維生素A受體的異二聚體化，PPARγ決定了活化受體絡(luò)合物的活性增加和兩種受體的同時活化(Cell第93卷，241-52，1998年4月)。
視黃酸和PPARγ配體的聯(lián)合治療為這些特征是細(xì)胞分化不足的病變?nèi)缂毙詯盒匝翰〉闹委熖峁┝酥委熒系膬?yōu)點(diǎn)。
Spirolaxine是一種已知的化合物；在Phytochemistry，(1990)第29卷，第2期，第613-616頁中對作為真菌Sporotichum laxum代謝產(chǎn)物的該物質(zhì)進(jìn)行了描述。在日本專利申請JP 08177033中對螺萊素的抗腫瘤活性進(jìn)行了描述。在該申請中描述的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕婕耙种颇[瘤系增殖的體外試驗(yàn)。該試驗(yàn)表明通過對所試驗(yàn)?zāi)[瘤系的直接citotoxicity而顯著抑制了增殖。
在WO 9605204中，將螺萊素描述為一種用于治療由幽門螺旋桿菌而引起的胃十二指腸疾病的化合物。在日本專利申請JP 94-82785中，將螺萊素描述為一種具有抗膽固醇血癥活性的降低脂質(zhì)的化合物。
在Phytochemistry，(1990)第29卷，第2期，第613-616頁中描述了制備螺萊素的方法。
視黃酸也是一種已知的化合物。J.J.Kamm in J.Am.Acad.Dermatol.6，652(1982)公開了這種化合物的毒理學(xué)和致畸性。C.D.Robertson等人在J.Am.Chem.Soc.77，4111(1955)中對這種化合物的合成進(jìn)行了描述。
從來沒有過有關(guān)單獨(dú)或與全反式視黃酸合用的螺萊素可用作治療這些對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變的物質(zhì)的描述。
由于其可刺激腫瘤細(xì)胞克隆物早幼粒細(xì)胞的分化(分化治療)，所以視黃酸是一種用來治療急性前髓細(xì)胞白血病(APL)的物質(zhì)，特別是用來治療惡性血液病的物質(zhì)。
與其它類型的白血病相比，APL表現(xiàn)出較不顯著的白細(xì)胞增多、貧血和血小板減少，當(dāng)用常規(guī)化療進(jìn)行治療時還表現(xiàn)出較低的緩解百分比和較高的死亡率。
APL的特征為異常易位，其涉及牽涉視黃酸受體α基因(Cin.Lab.Sci.2000 Spring；13(2)106-16)的染色體15和17的長臂[translocationt(15；17)]。
ATRA的口服給藥使大多數(shù)患有APL的患者獲得了完全緩解。但是，在一些情況中用ATRA進(jìn)行的治療可能會造成所謂的“視黃酸綜合征”。這種綜合征的特征為所治療患者的白細(xì)胞計數(shù)迅速并進(jìn)行性的增加，其可以用其它化療來進(jìn)行治療。
此外，因?yàn)樵谟肁TRA進(jìn)行治療期間，腫瘤細(xì)胞變得對這種化合物有抗藥性，所以需要進(jìn)行后期緩解治療。
盡管近年來進(jìn)行了一些努力，但是仍然需要一些可用于治療這些對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變的單獨(dú)或聯(lián)用的新化合物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)式(I)的螺萊素是一種可用于制備治療這些對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變的藥物的物質(zhì)。
本發(fā)明的一個目的是式(I)的螺萊素用來制備治療這些對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變的藥物的應(yīng)用，其中所說的對該類受體的活化有響應(yīng)的病變是2型抗胰島素性糖尿病。
本發(fā)明的另一個目的是包含作為活性成分的式(I)的螺萊素和式(II)的全反式視黃酸的用于治療這些對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是式(I)的螺萊素與式(II)的全反式視黃酸的聯(lián)合。
本發(fā)明的另一個目的是一種包含作為活性成分的式(I)的螺萊素和式(II)的全反式視黃酸以及至少一種賦形劑和/或基質(zhì)的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是式(I)的螺萊素與式(II)的全反式視黃酸聯(lián)合用于制備治療這些對PPARγ受體的活化有響應(yīng)的病變的藥物的應(yīng)用，其中所述的對PPARγ的活化有響應(yīng)的病變是急性惡性血液病，包括淋巴細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病和巨核細(xì)胞白血病。
本發(fā)明的另一個目的是式(I)的螺萊素與式(II)的全反式視黃酸聯(lián)合用于制備治療急性前髓細(xì)胞白血病的應(yīng)用。
此外，其中將多種抗腫瘤藥同時或相繼進(jìn)行給藥的治療方案的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中是公知的。
在治療方案中將多種抗腫瘤藥進(jìn)行給藥的必要性可以根據(jù)事實(shí)證明，通過在不同代謝水平的作用，在一些情況中其有助于癌癥的完全緩解，而在其它情況中其有助于使進(jìn)行治療的患者活的更久和/或改善其生活質(zhì)量。本發(fā)明的聯(lián)合可與一種或多種治療急性惡性血液病的已知抗腫瘤藥一起使用。
因此，本發(fā)明的另一個目的還是一種包含式(I)的螺萊素和式(II)的全反式視黃酸的聯(lián)合以及一種或多種治療急性惡性血液病理學(xué)的已知抗腫瘤藥的藥物組合物。上述已知的抗腫瘤藥包括烷化劑；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑；抗微管蛋白藥；插入劑(intercalants)；抗代謝劑；天然產(chǎn)物如長春花屬生物堿(Vinca alcaloids)、表鬼臼毒素、抗生素、酶和紫杉烷類(taxanes)。
報告下面的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以更好的對本發(fā)明進(jìn)行說明。
實(shí)施例1螺萊素(ST1397)對PPARγ的活化作用通過一些用受PPAR-γRE控制的表達(dá)PPAR-γ的質(zhì)粒和編碼熒光素酶的信息載體進(jìn)行的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明了螺萊素與PPARγ受體相連的能力和決定這些具有PPAR-γ(PPAR-γRE)響應(yīng)序列的基因的活化作用的能力(Cell 68；879-887；1992；J.Biol.Chem.272；25252-25259；1997)。
通過用PPAR-γ質(zhì)粒和TK-PPAR-Reluc信息載體對NIH-3T3鼠科動物成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染而證明了熒光素酶表達(dá)的活化作用；在用螺萊素以40nM的濃度進(jìn)行處理24小時后對熒光素酶活性進(jìn)行了測定。
將螺萊素的活性與一種用于治療2型抗胰島素性糖尿病的已知化合物——曲格列酮(TZD)的活性進(jìn)行了比較，是在5μM的濃度下進(jìn)行試驗(yàn)的。
在

圖1中所闡明的結(jié)果表明螺萊素比上述抗糖尿病化合物更有效。實(shí)際上，由參考化合物所誘導(dǎo)并由TK-PPAR-Reluc信息載體所介導(dǎo)的熒光素酶活性(可作為受體活化作用的指數(shù))比對照高5倍，而由本發(fā)明螺萊素所誘導(dǎo)的熒光素酶活性比對照高7倍。
實(shí)施例2本發(fā)明的聯(lián)合對人前髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系(NB4)分化的作用在這種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑β萑R素(ST1397)和ATRA單獨(dú)使用和聯(lián)用時的前期分化活性都進(jìn)行了評估。
眾所周知，全反式視黃酸在0.1至1μM的濃度之間變得有效；當(dāng)生長顯著停止時，一般在治療的第三/第四天內(nèi)觀察到分化作用的峰值。
NB4細(xì)胞在25cm2燒瓶中在5ml帶有10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)物以約100.000細(xì)胞/ml的密度進(jìn)行生長。在一天之后，用ATRA以10-7M的濃度或用ST1397以0、1、0、5和1μM的劑量對其進(jìn)行處理，或用等體積的兩種化合物的組合對其進(jìn)行處理。然后，在不替換培養(yǎng)介質(zhì)的情況下將該細(xì)胞放在培養(yǎng)器中培養(yǎng)2-3天。
在處理的第二天或第三天結(jié)束時，通過NBT染料還原和樣品的分光光度發(fā)分析來測定細(xì)胞到粒細(xì)胞的分化。
用1mM的DMSO溶液將視黃酸溶解于該培養(yǎng)介質(zhì)中。因?yàn)檫@種化合物(DMSO)在某些試驗(yàn)條件下也可能發(fā)生分化，所以用等體積的DMSO對對照培養(yǎng)物進(jìn)行處理。
為了對分化作用進(jìn)行測量，從各樣品中收集500.000個細(xì)胞，離心并將其用1ml帶有10％血清、1mg/ml氮藍(lán)四唑(NBT)和100ngPMA的RPMI1640培養(yǎng)物重新混懸。將重新混懸的細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)20-60分鐘。在培養(yǎng)結(jié)束時，將細(xì)胞進(jìn)行離心并將由此而獲得的團(tuán)狀物重新混懸于1ml包含10％Triton X 100的PBS中。
對樣品進(jìn)行超聲以使其完全溶解，然后用分光光度計在540nm的波長下進(jìn)行讀數(shù)。
圖2所列結(jié)果表明當(dāng)單獨(dú)給藥時，ST1397在NB4細(xì)胞中不能誘導(dǎo)分化。ATRA的分化作用已經(jīng)是眾所周知的，但是發(fā)現(xiàn)其這種作用被如上所述的單獨(dú)給藥時無效的ST1397的同時給藥所加強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.式(I)的螺萊素和式(II)的全反式視黃酸所組成的組合物
2.一種藥物組合物，其中式(I)的螺萊素作為活性成分，并結(jié)合式(II)的全反式視黃酸以及至少一種賦形劑和/或載體，
3.如權(quán)利要求1所述的組合物用于制備治療急性惡性血液病的藥物的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所說的急性惡性血液病是選自淋巴細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病或巨核細(xì)胞白血病。
全文摘要
本發(fā)明的特征為式(I)的螺萊素用于治療這些對PPAR－γ受體的活化有響應(yīng)的病變?nèi)?型抗胰島素性糖尿病的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種用于治療這些對PPAR－γ受體的活化有響應(yīng)的病變?nèi)缂毙詯盒匝翰〉乃幬锝M合物，其包含作為活性成分的式(I)的螺萊素和式(II)的全反式視黃酸。
文檔編號A61K31/203GK1839823SQ20061000578
公開日2006年10月4日 申請日期2002年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月16日
發(fā)明者C·皮薩諾, T·里喬尼 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司