一種與psma膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽、放射性核素標(biāo)記多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與PSMA膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽、放射性核素標(biāo)記多肽及其應(yīng)用。該多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，該多肽通過偶聯(lián)劑來介導(dǎo)放射性核素進(jìn)行標(biāo)記，可用于制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物。
【專利說明】-種與PSMA膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽、放射性核素標(biāo)記多 肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與PSM膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽、放射性核素標(biāo) 記多肽及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺癌（PCa)已成為目前危害全球男性健康的主要惡性腫瘤，早期主要通過 外科手術(shù)和放射治療，但早期發(fā)現(xiàn)困難，就診時多數(shù)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。未經(jīng)治療的PCa細(xì) 胞多為雄激素依賴性，即通過阻斷雄激素促使雄激素依賴性癌細(xì)胞凋亡，但雄激素依賴 性PCa經(jīng)過一段時間（平均14-30月）內(nèi)分泌治療后，大多數(shù)轉(zhuǎn)為非激素依賴性前列腺 癌（androgenindependentprostatecancer,AIPC)，最終轉(zhuǎn)化為激素難治性前列腺癌 (Hormonerefractoryprostatecancer,HRPC),目前對于HRPC及其轉(zhuǎn)移灶尚無有效的治 療方法，臨床統(tǒng)稱為難治性前列腺癌，是導(dǎo)致PCa預(yù)后差、死亡率高的主要原因。
[0003]125Kltl3Pd粒子近距離放射治療及外放療是HRPC的治療手段，但主要限于局部病 灶。針對多發(fā)病灶的靶向內(nèi)放射性治療近年來備受關(guān)注，mLu是理想靶向內(nèi)放射治療性核 素，常用于抗體、多肽及其類似物等的標(biāo)記，且mLu通過反應(yīng)堆輻射產(chǎn)生，具有低成本和易 得性，具有適宜的物理半衰期（6. 7d)，發(fā)射的β-粒子傳能線密度及生物學(xué)效應(yīng)高于1251， 組織平均射程小于200μπι，適合殺死癌細(xì)胞，發(fā)射的γ射線可用于SPECT顯像，以監(jiān)測和指 導(dǎo)治療過程，因此，如何增加理想治療性核素mLu在HRPC及轉(zhuǎn)移灶的靶向性聚集和滯留是 改善其預(yù)后亟待解決的難題，其中受體和配體的選擇尤為重要。
[0004]前列腺特異性膜抗原（prostatespecificmembraneantigen，PSMA)是一種II型 跨膜糖蛋白，其大小約為100_120kD。它由3部分構(gòu)成：短的胞內(nèi)段（氨基酸1-18)，跨膜段 (氨基酸19-43)和較長的胞外段（氨基酸44-750)，在高度惡性原發(fā)性PCa、HRPC及其轉(zhuǎn) 移灶的腫瘤細(xì)胞表面呈高豐度表達(dá)，且隨PCa惡性進(jìn)展而升高，而在前列腺、腎臟、肺臟、肝 臟等正常組織、炎性增生性組織及其它良性病變細(xì)胞表面表達(dá)水平極低、甚至不表達(dá)，成為 HRPC及其轉(zhuǎn)移灶靶向治療的主要靶蛋白。
[0005] 作為配體，多肽較抗體分子量小，穩(wěn)定性好，無免疫源性，不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特 異性攝取，可通過化學(xué)修飾連接ΝΟΤΑ、CB-TE2A、PCTA、DOTA等偶聯(lián)物，進(jìn)行放射性核素標(biāo) 記，體外類合成（如固相法）過程簡單、經(jīng)濟(jì)，為廣泛臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。更重要的是，多 肽作為放射性核素載體，通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化可獲得體內(nèi)藥代動力學(xué)良好如血清除快、靶向特異 性好、結(jié)合穩(wěn)定的多肽。
[0006] 若能夠研制出一種能與PSM胞外區(qū)特異性結(jié)合特性和具有靶向功能的多肽，對 于PCa的診斷和治療具有較好的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題提供一種與PSM膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供由上述多肽制備的放射性核素標(biāo)記多肽。
[0009] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述多肽制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種與PSM膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽，該多肽的氨基酸序列如SEQIDNo: 1所 /Jn〇
[0012] 一種放射性核素標(biāo)記多肽，該放射性核素標(biāo)記多肽是上述氨基酸序列如SEQ IDNo: 1所示的多肽通過偶聯(lián)劑來介導(dǎo)放射性核素進(jìn)行標(biāo)記。
[0013] 所述的放射性核素標(biāo)記多肽，其中偶聯(lián)劑為D0TA、ΝΟΤΑ、CB-TE2A、PCTA或Hynic。
[0014] 所述的放射性核素標(biāo)記多肽，其中放射性核素為顯像性放射性核素或治療性放射 性核素。
[0015] 所述的放射性核素標(biāo)記多肽，其中顯像性放射性核素如64CiU686&、11111!、 99"^，治療 性放射性核素9°Y、mLu、89Sr。
[0016] 氨基酸序列如SEQIDNo: 1所示多肽在制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中 的應(yīng)用。
[0017] 上述的放射性核素標(biāo)記多肽在制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中的應(yīng)用。
[0018] 本課題組首次通過體外固相法合成PSM膜外區(qū)靶向性結(jié)合的小分子直線多肽， 其結(jié)構(gòu)為多膚序列為Gly-Asp-His-Ser-Pr〇-Phe-Thr_Gly-Ser(SEQIDNo:l)，即甘氛 酸-天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-絲氨酸（以下 簡稱PSMATP)，可與PSMA胞外段（氨基酸44-750)靶向結(jié)合，并與偶聯(lián)劑（如D0TA、ΝΟΤΑ、 CB-TE2A、PCTA、Hynic等）通過聚乙二醇（PEGn，η= 0, 1，2, 3)連接，偶聯(lián)劑介導(dǎo)多肽的放 射性核素（如68Ga、64CU、89Sr、mIn、9°Y、mLU和99mTc)的標(biāo)記。其中放射性核素可以是顯像 性放射性核素如64Cu、68Ga、niIn、99mTc，也可以是治療性放射性核素如9°Y、mLu、89Sr等。體外 實(shí)驗(yàn)考查其體外穩(wěn)定性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)考察其體內(nèi)藥代動力學(xué)和生物學(xué)分布，并通過MicroPET/ CT(或microSPECT/CT)顯像評價(jià)其在前列腺癌腫瘤部位的放射性攝取。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明制備的小分子多肽PSMATP，能與PSM膜外區(qū)靶向性結(jié)合，利用該多肽制備 的放射性核素標(biāo)記多肽，可作為診斷或治療前列腺癌的靶向性藥物，具有較好的效果。
[0021] 同抗體不同，該多肽無免疫源性，分子量小，血液清除快，肝脾等富網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) 攝取少且清除快，在前列腺等組織中分布少，而在前列腺癌（及其轉(zhuǎn)移）病灶部位濃聚多， 且滯留時間長，可有效作為診斷和治療用放射性核素的載體。另外，由于PSM膜外區(qū)長，高 特異性結(jié)合的多肽序列的篩選和獲得困難，本小分子多肽核苷酸序列通過噬菌體展示技術(shù) 獲得（噬菌體展示技術(shù)是公知技術(shù)，篩選過程不再贅述），可通過體外固相合成法制備，利 于量化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖 1 是D0TA-PSMATP的結(jié)構(gòu)圖。
[0023]圖 2 是D0TA-PSMATP的HPLC檢查。
[0024]圖 3 是D0TA-PSMATP質(zhì)譜圖。
[0025] 圖4是68Ga-DOTA-PSMATP的HPLC分析的放射性峰。
[0026]圖 5 是68Ga-DOTA-PSMATP的HPLC分析的紫外峰。
[0027] 圖6是前列腺癌（C4-2)荷瘤鼠尾靜脈注射68Ga-D0TA-PSMATP60min后行 microPET/CT顯像（左側(cè)為3D圖像，右側(cè)為橫斷層融合圖像）。
[0028] 圖7.荷瘤鼠（前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾靜脈注射mLu-DOTA-PSMATP前 后不同時間的腫瘤體積變化。
[0029] 圖8.荷瘤鼠（前列腺癌C4-2和胰腺癌PC-3)尾靜脈注射mLu-DOTA-PSMTP前 后不同時間的體重變化。
[0030] 圖9.前列腺癌（C4-2)荷瘤鼠尾靜脈注射mLu-DOTA-PSMATP后ld，5d，15d腫瘤 組織病理檢查結(jié)果（HE:X10)。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 一、多肽D0TA-PSMATP的合成及其質(zhì)控
[0034] 1、固相法直線多肽PSMTP的合成及與1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四 乙酸（DOTA)的偶聯(lián)
[0035] ①多肽從C端到N端方向合成，先在樹脂上掛第一個氨基酸，稱取2.Og樹脂于潔 凈干燥的反應(yīng)管中，加入適量二甲基甲酰胺（DMF)，活化30min左右，然后稱取第一個氨基 酸Fmoc-Ser-OHO· 5mmol，4_ 二甲氛基批陡（DMAP) 75mg，N,Ν'-二異丙基碳二亞胺（DIC)Iml 加入到反應(yīng)管中，DMF做溶劑反應(yīng)3h。反應(yīng)完畢用DMF洗4?6次，加入適量吡啶和甲醇， 體積比為1:1，反應(yīng)30min。反應(yīng)完畢用DMF洗4?6次。然后用哌啶溶液脫掉氨基酸的 Fmoc，脫兩次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量樹脂用茚三酮 檢測試劑檢測，檢測為藍(lán)色，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)；
[0036] ②稱取第二個氛基酸Fmoc-Gly-OHLSmmol,HBTUI. 5mmo1于反應(yīng)管中，加入 DIEAO. 5ml，反應(yīng)40min，用DMF洗4?6次，取少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，顯無色，然 后加入哌啶溶液脫Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗兩次，取出少量樹脂用茚三 酮檢測試劑檢測，檢測為藍(lán)色，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)；
[0037] ③以下氨基酸反應(yīng)方法同②，氨基酸種類按SEQ IDNo:1所示反向逐步增加，最終 得到SEQ IDNo:1所不多膚，即Gly-Asp-His-Ser-Pro-Phe-Thr-Gly-Ser ;
[0038]④稱取0. 75mmolD0TA，苯并三氮唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU)L5mmol于反應(yīng)管中，加入Ν，N-二異丙基乙胺（DIEA)O. 25ml，經(jīng)過用茚三酮檢測試 劑檢測，檢測為無色；
[0039] ⑤最后用三氟乙酸切割液切割2h，反應(yīng)液抽濾，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉 淀，離心，然后再用乙醚洗3?5次，得白色固體，經(jīng)HPLC純化，凍干，取少量進(jìn)行質(zhì)量分析。
[0040] 2、質(zhì)量分析：
[0041] 使用高效液相色譜儀（HPLC)和質(zhì)譜儀（MS)對目標(biāo)化合物進(jìn)行肽序、分子量和化 學(xué)純度進(jìn)行質(zhì)量分析
[0042] HPLC分析：參數(shù)：C18柱，（4. 6*250mm)，流動相：溶劑A為含0. 1%三氟醋酸的乙 腈，溶劑B為含0.I%三氟醋酸的超純水，流動相梯度如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種與PSMA膜外區(qū)靶向性結(jié)合的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示。
2. -種放射性核素標(biāo)記多肽，其特征在于該放射性核素標(biāo)記多肽是權(quán)利要求1所述多 肽通過偶聯(lián)劑來介導(dǎo)放射性核素進(jìn)行標(biāo)記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的放射性核素標(biāo)記多肽，其特征在于偶聯(lián)劑為D0TA、ΝΟΤΑ、 CB-TE2A、PCTA 或 Hynic。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的放射性核素標(biāo)記多肽，其特征在于放射性核素為顯像性放射 性核素或治療性放射性核素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的放射性核素標(biāo)記多肽，其特征在于顯像性放射性核素如64Cu、 68Ga、mIn、99D1Tc，治療性放射性核素 90Y、177Lu、89Sr。
6. 權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求2所述的多肽在制備治療或診斷前列腺癌的靶向性藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K51/00GK104262458SQ201410438305
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】邵國強(qiáng), 王自正, 王峰, 杜同信 申請人:邵國強(qiáng), 王自正, 王峰, 杜同信