專(zhuān)利名稱(chēng)：特異性mhc－肽復(fù)合物的抗體的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷自身免疫性疾病的方法、用于該方法的單克隆抗體、包含該抗體的診斷組合物以及治療自身免疫性疾病的方法。
自身免疫性疾病是維護(hù)人類(lèi)健康的一個(gè)主要問(wèn)題。某些自身免疫性疾病可能是針對(duì)一種抗原或抗原性復(fù)合物的免疫學(xué)過(guò)程的結(jié)果，而在其它自身免疫反應(yīng)中可能包括可能存在于多個(gè)器官的多種抗原。
免疫系統(tǒng)的基本功能作用在于保護(hù)個(gè)體以防帶有外來(lái)(即非自身)抗原的病原體的侵襲。為安全有效地履行這種功能，需要辯別外來(lái)抗原以及來(lái)自個(gè)體自身的自身抗原的機(jī)制。大多數(shù)個(gè)體一般耐受自身存在的物質(zhì)。
相反，某些個(gè)體不能將其抗原識(shí)別為自身，而針對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)、組織或成分產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種免疫反應(yīng)導(dǎo)致對(duì)包含該內(nèi)源性物質(zhì)的器官的極度損害。相關(guān)自身免疫性疾病的發(fā)展一般非常緩慢(以年計(jì))，這很大程度上妨礙了及時(shí)的臨床診斷和治療。一般只有在已經(jīng)引起身體明顯的損害以后才能做出診斷。
診斷自身免疫性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)，在疾病早期、或者涉及的關(guān)節(jié)相對(duì)較少時(shí)，最為困難，不幸的是，診斷往往在癥狀初起之后延誤幾個(gè)月。例如，此時(shí)難以辨別類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它原因的慢性炎性關(guān)節(jié)炎或瞬時(shí)性滑膜炎綜合癥。常見(jiàn)持續(xù)性未分化的多關(guān)節(jié)炎綜合癥患者，最初可能難以與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相區(qū)分。許多患者表現(xiàn)出炎性關(guān)節(jié)炎的體征和癥狀，而不患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
個(gè)體發(fā)生自身免疫性疾病的機(jī)會(huì)與其遺傳背景密切相關(guān)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類(lèi)分子呈遞(自身)抗原給識(shí)別MHC-肽復(fù)合物的應(yīng)答性T細(xì)胞，其編碼基因與疾病易感性呈現(xiàn)強(qiáng)的遺傳連鎖。據(jù)認(rèn)為疾病早期的發(fā)病機(jī)理由T細(xì)胞介導(dǎo)。T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別結(jié)合抗原性肽的特異性主要組織相容性復(fù)合物分子。MHC/肽/TCR復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)導(dǎo)致T細(xì)胞活化。該三分子復(fù)合物是一般免疫應(yīng)答和自身免疫的要素。目前相信，許多自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)理涉及MHC-結(jié)合加工的自身抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞的TCR。
人軟骨糖蛋白-39(HC gp-39)是在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中鑒定的一種候選自身抗原(Verheijden等人，1997，Arthritis and Rheum.，401115-1125)。用該蛋白質(zhì)免疫BALB/c小鼠，導(dǎo)致發(fā)展慢性、復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)炎。免疫之前于鼻內(nèi)給藥該蛋白質(zhì)，引起i)DTH應(yīng)答完全消失，以及ii)防止或延遲發(fā)病。此外，利用半治療方案，HC gp-39可以減少DBA/1小鼠II型膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率和嚴(yán)重性(Joosten等人，2000，Arthritis Rheum.43645-655)。
HC gp-39的幾種肽鑒定為可能具有自身反應(yīng)性。RA患者的T細(xì)胞至少識(shí)別其中的四種肽(103-116，259-271，263-275和326-338)。有趣的是，RA患者比健康對(duì)照識(shí)別HC gp-39263-275更為顯著，提示該T細(xì)胞表位在引發(fā)或維持類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用。因此該肽因在RA中的治療和診斷目的而受關(guān)注。為治療目的，該肽或其修飾可用于鼻內(nèi)耐受(tolerization)。此外，與DRB1*0401復(fù)合的肽可用于靜脈內(nèi)耐受。
與MHC分子復(fù)合的肽可以用于診斷目的。檢測(cè)特異性MHC-肽復(fù)合物的常規(guī)方法有賴(lài)于帶有相應(yīng)TCR的T細(xì)胞的活化。然而，這種功能性試驗(yàn)不能用于鑒定組織切片中帶有TCR-配基的APC。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)產(chǎn)生了具有自身免疫性疾病、優(yōu)選類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的MHC-肽復(fù)合物特異性的抗體。最優(yōu)選來(lái)源于HC gp-39復(fù)合物的肽。
MHC-肽復(fù)合物為綜合癥特異的，也就是說(shuō)，該疾病特征在于存在這種特異性MHC復(fù)合物以及自身抗原。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在能夠臨床確診之前，患者組織中經(jīng)常檢測(cè)到這些特異性復(fù)合物。該因此該免疫復(fù)合物預(yù)測(cè)正在發(fā)展哪種疾病。
在患者組織或血液中及時(shí)檢測(cè)這些免疫復(fù)合物比較重要，因?yàn)槟芤虼溯^早地開(kāi)始治療患者，從而延遲以至防止在疾病后期常見(jiàn)的嚴(yán)重?fù)p害。
因此，本發(fā)明一方面提供了診斷自身免疫性疾病的方法。該方法包含檢測(cè)罹患自身免疫性疾病患者中自身免疫特異性MHC-肽復(fù)合物的存在。利用特異性結(jié)合MHC-肽復(fù)合物的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
此處所用術(shù)語(yǔ)抗體定義為具有與相關(guān)抗原結(jié)合特性的單抗體種類(lèi)或多抗體種類(lèi)?？贵w只識(shí)別MHC-肽復(fù)合物，而不識(shí)別單獨(dú)的肽或MHC。因此，抗體必須能夠識(shí)別位于MHC分子結(jié)合凹槽(bindinggroove)內(nèi)的特異性自身免疫相關(guān)的肽。該抗體可以從包含該抗體的血清中純化，但該抗體優(yōu)選為單克隆抗體，更優(yōu)選為小鼠或人單克隆抗體。因而該抗體與罹患自身免疫性疾病患者的自身免疫特異性MHC-肽復(fù)合物相結(jié)合。此特異性復(fù)合物更進(jìn)一步是指MHC-肽復(fù)合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，仍然能夠結(jié)合特異性MHC-肽復(fù)合物的抗體片段也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。因此術(shù)語(yǔ)片段是指包含可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域(例如Fab、F(ab′)2或Fv)的抗體部分。抗體也可能是遺傳工程抗體，包括能夠結(jié)合MHC-肽復(fù)合物的單鏈抗體或嵌合(例如雙特異性)抗體。此外，抗體可能由來(lái)源于不同種類(lèi)的區(qū)域組成，例如嵌合或人源化抗體。
本發(fā)明欲檢測(cè)的MHC-肽復(fù)合物與自身免疫性疾病、優(yōu)選類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。該MHC復(fù)合物優(yōu)選為HLA DRB 1*0401、DRB1*0404、DRB1*0407和DRB1*0101型，最優(yōu)選為HLA DRB1*0401，而復(fù)合物中的肽優(yōu)選為RA相關(guān)抗原。優(yōu)選利用具有來(lái)源于HC gp-39的肽的復(fù)合物制備抗體。該肽優(yōu)選包含HC gp-39的氨基酸263-273或263-275(HC gp-39263-273或HC gp-39263-275)，但是氨基酸序列有可能有小的變異。這種抗體可檢測(cè)HC gp-39相關(guān)的MHC-肽復(fù)合物，最可能該抗體可檢測(cè)其中的肽是來(lái)自HC gp-39的MHC-肽復(fù)合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，肽可能在其任一側(cè)或兩側(cè)延長(zhǎng)，并仍然發(fā)揮相同的免疫學(xué)功能，即它在MHC相關(guān)的復(fù)合物中能夠由抗體識(shí)別。延長(zhǎng)的部分可能是類(lèi)似于該蛋白質(zhì)天然序列的氨基酸序列。然而，肽也可能延長(zhǎng)為非天然序列。肽自身序列也可能稍有不同，但仍然能夠由抗體識(shí)別。
通過(guò)全序列中的氨基酸差異，或者通過(guò)在所述序列中缺失、置換、插入、顛換或添加氨基酸，可以表明序列、特別是小肽序列中存在的變異。已經(jīng)描述了預(yù)期基本上不改變生物學(xué)和免疫學(xué)活性的氨基酸置換。相關(guān)氨基酸之間的氨基酸置換或者進(jìn)化中時(shí)常發(fā)生的置換特別是Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn，Ile/Val等(參見(jiàn)Dayhof，M.D.，Atlas of protein sequence and structure，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，vol.5，suppl.3)。根據(jù)該資料，Lipman和Pearson開(kāi)發(fā)了一種快速敏感的蛋白質(zhì)比較(Science，2271435-1441，1985)并確定同源多肽之間功能相似性的方法。
可以利用公知的有機(jī)化學(xué)肽合成方法(例如J.Amer.Chem.Soc.852149(1963)和Int.J.Peptide Protein Res.35161-214(1990)所描述的固相肽合成)制備(較小)肽。
可以通過(guò)C和/或N端修飾降低外肽酶催化的水解作用而使肽穩(wěn)定。修飾可包括C端?；?例如乙酰化＝Ac-肽)、N端引入酰胺(例如肽-NH2)、聯(lián)合酰基化和引入酰胺(例如Ac-肽-NH2)以及引入D-氨基酸代替L-氨基酸。(Powell等人，J.Pharm.Sci.，81731-735，1992)。
其它修飾集中在防止內(nèi)肽酶水解作用。這些修飾的例子有引入D-氨基酸代替L-氨基酸、修飾的氨基酸、肽內(nèi)環(huán)化、引入修飾的肽鍵，例如還原的肽鍵ψ[CH2NH]以及例如類(lèi)肽(peptoid)(N-烷基化甘氨酸衍生物)(Adang等人，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas，11363-78，1994以及Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，899367-9371，1992)。
可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備單克隆抗體。在有或沒(méi)有合適佐劑的存在下，用包含MHC-肽復(fù)合物的制劑免疫動(dòng)物。然后，利用適當(dāng)?shù)娜诤霞夹g(shù)，優(yōu)選PEG融合(Kohler和Milstein，Nature 256；495-497，1975)或電融合(Van Duijn等人，Exp.Cell Research，183，463-472，1989)，將免疫動(dòng)物的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤。單克隆抗體的制備手冊(cè)(例如Harlow和Lane，Antibodiesa laboratory manual，Cold SpringHarbor Laboratory 1988或者Coligan等人，Current Protocols inImmunology，John Wiley and Sons Inc.1992)詳細(xì)描述了免疫、融合、雜交瘤選擇、雜交瘤的克隆和擴(kuò)增、以及單克隆抗體純化的標(biāo)準(zhǔn)方法。
抗原特異性B細(xì)胞可以在B細(xì)胞培養(yǎng)體系、優(yōu)選EL-4B細(xì)胞培養(yǎng)體系中，于有限稀釋條件下選擇并生長(zhǎng)。各個(gè)B細(xì)胞克隆然后進(jìn)行融合，以獲得產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤，如此處引入以供參考的EP448470和US6,020,170所述。
還可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)產(chǎn)生人單克隆抗體或抗體片段。對(duì)適當(dāng)?shù)男∈髥慰寺】贵w進(jìn)行嵌合或人源化，可以產(chǎn)生人抗體或抗體片段。另一眾所周知的產(chǎn)生人抗體或抗體片段的技術(shù)是噬菌體展示技術(shù)。還可以通過(guò)EBV轉(zhuǎn)化體內(nèi)致敏的B細(xì)胞、通過(guò)體外免疫的B細(xì)胞永生化、或者通過(guò)表達(dá)人免疫球蛋白所有組成成分的免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠B細(xì)胞永生化產(chǎn)生人單克隆抗體。
用適當(dāng)?shù)膹?fù)合物免疫可以利用如實(shí)施例1所述分離的MHC-肽復(fù)合物進(jìn)行。作為復(fù)合物的來(lái)源，也可利用抗原遞呈細(xì)胞(APC)，例如具有適當(dāng)?shù)腗HC復(fù)合物并帶有特定自身抗原(例如通過(guò)將HC gp-39提供給APC)的單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞。將完全目的蛋白質(zhì)提供給APC的替代方法是可提供其子序列。子序列的長(zhǎng)度并不重要，只要其包含為相關(guān)MHC分子所識(shí)別的表位。這些肽優(yōu)選具有9-55個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。該肽更優(yōu)選具有9-35、特別是9-25個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。更加優(yōu)選的肽具有9-15個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。最優(yōu)選的肽是HC-gp39263-273或HC-gp39263-275。
因此，本發(fā)明的目的也在于提供自身免疫性疾病、優(yōu)選類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的MHC-肽復(fù)合物的特異性抗體。該MHC復(fù)合物類(lèi)型優(yōu)選為HLA DRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0407和DRB1*0101，最優(yōu)選HLA DRB1*0401，而復(fù)合物中的肽優(yōu)選為RA相關(guān)抗原。最優(yōu)選的肽來(lái)源于HC gp-39。該肽優(yōu)選包含HC gp-39的263-273或263-275位氨基酸(HC-gp39263-273或HC-gp39263-275)，但是氨基酸序列有可能有小的變異。最優(yōu)選抗體是ORG3 8948 08A、ORG3 8948 12A或ORG3 894804B。
本發(fā)明目的還在于提供與特異性MHC-肽復(fù)合物(其中肽由較小的RA相關(guān)肽的多聚體、例如二聚體或三聚體組成)反應(yīng)的抗體。多聚體可以是由許多相同的肽組成的同聚體，或者是由不同的肽組成的異聚體。
本發(fā)明的另一目的在于提供與自身免疫特異性復(fù)合物(其中的肽與MHC分子相連，因此結(jié)合凹槽由肽占據(jù))反應(yīng)的抗體。柔性的接頭分子(優(yōu)選也由氨基酸序列組成)可連接肽。MHC亞基也可能直接或通過(guò)柔性間隔區(qū)(spacer)以共價(jià)鍵相連。它們可能以單體或二聚體的Ig分子為″支架″(scaffold)進(jìn)行構(gòu)造。MHC分子不必具有其恒定結(jié)構(gòu)域，可能只由其可變結(jié)構(gòu)域組成，彼此直接共價(jià)連接或者通過(guò)柔性接頭相連。可以利用常規(guī)重組DNA技術(shù)制備這種抗體或其片段。以IgG為支架的二聚體MHC/肽復(fù)合物如Lebowitz等人(1999)CellularImmunology 192175-184所述。
MHC I的四聚體MHC/肽復(fù)合物如Davis等人(1996)Science27494-99所述，MHC II的四聚體MHC/肽復(fù)合物如Gutgemann等人(1998)Immunity 8667-673和Kotzin等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97291-296所述。
本發(fā)明的抗體可用于鑒定自身免疫特異性復(fù)合物(例如組織切片中APC上的HC gp-39263-275)以及定量MHC-肽復(fù)合物(例如各個(gè)APC上的DRB1*0401/HC gp-39263-275復(fù)合物)。利用特異性抗體定量MHC-肽復(fù)合物為監(jiān)控疾病活性提供了機(jī)會(huì)?？贵w能夠另外用于定位病理組織內(nèi)的APC。
依靠抗體，即MHC-肽復(fù)合物的特異性，能夠診斷幾種自身免疫性疾病，例如胰島素依賴(lài)性糖尿病、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、牛皮癬或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。此外，利用RA相關(guān)的MHC-肽復(fù)合物的特異性抗體，能夠區(qū)分類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它原因的慢性炎性疾病，例如多關(guān)節(jié)炎(polyarthitis)、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathy)或骨關(guān)節(jié)炎。
若干技術(shù)利用抗體或抗體片段檢測(cè)特異性MHC-肽復(fù)合物。這些技術(shù)包括但不限于免疫組織化學(xué)、FACS、免疫沉定反應(yīng)以及Western印跡。抗體或抗體片段可未標(biāo)記使用或綴合酶、放射性同位素、熒光色素、順磁顆?；蛏锼胤肿邮褂?。
本發(fā)明的另一目的在于提供用于通過(guò)例如親和層析純化MHC-肽自身免疫復(fù)合物的抗體。為此目的，利用本領(lǐng)域公知技術(shù)將抗體偶聯(lián)至固體基質(zhì)，例如Sepharose小珠、硅石(silica)小珠或順磁小珠。為此目的使用的抗體為本發(fā)明診斷方法所述的抗體。
此外，這種抗體可用來(lái)抑制T細(xì)胞體外和體內(nèi)對(duì)自身抗原肽的應(yīng)答。
本發(fā)明的另一目的在于提供治療所用抗體。本發(fā)明因此還提供通過(guò)給予針對(duì)自身免疫復(fù)合物(更具體而言是MHC-肽復(fù)合物，優(yōu)選MHC-HC gp-39子序列復(fù)合物，更優(yōu)選DRB1*0401，DRB1*0404，DRB1*0101或DRB1*0407/HC gp-39263-273或HC gp-39263-275復(fù)合物)的抗體治療自身免疫性疾病(例如胰島素依賴(lài)性糖尿病、多發(fā)性硬化、牛皮癬、重癥肌無(wú)力和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，最優(yōu)選疾病為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的方法。最優(yōu)選抗體為抗體ORG38948 08A、ORG38948 12A或ORG38948 04B。如前所述抗體的變體也可用于治療目的。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可用于制造自身免疫性疾病、更優(yōu)選類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療藥物。通過(guò)給予本發(fā)明的抗體阻斷T細(xì)胞活化，可以減少炎癥。
為避免對(duì)抗體的抗原性反應(yīng)，優(yōu)選使用人抗體。如果抗體是非人來(lái)源，則優(yōu)選人源化抗體。已知人源化抗體的方法，例如CDR移植(Jones等人，Nature 321，522-525，1986)。
抗體ORG38948 08A、ORG38948 12A或ORG38948 04B已經(jīng)保藏在ECACC，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，UK，登錄號(hào)分別為99061728；99061729和99061730。按照布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)的條款進(jìn)行這些保藏。
下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，決不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范疇。


圖1 Org38948的單克隆抗體不與DRBI*0401分子反應(yīng)。
在包被純化的Org38948(a)或DRB1*0401(b)的微孔elisa(microelisa)板上測(cè)定單克隆抗體滴度。平板然后與山羊抗小鼠HRP溫育，利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法進(jìn)行顯色反應(yīng)。
圖2免疫沉定反應(yīng)確定抗Org38948 MAb識(shí)別MHC II類(lèi)分子。
上部印跡1；非還原條件下進(jìn)行SDS/PAGE，利用L243進(jìn)行印跡。下部印跡2；還原條件下進(jìn)行SDS/PAGE，利用L227進(jìn)行印跡。
泳道1分子量標(biāo)志，泳道2ORG38948 01A(IgGl，κ)，泳道3ORG38948 04B(IgA，κ)，泳道4ORG38948 08A(IgGl，κ)，泳道5ORG38948 09A(IgA，κ)，泳道6ORG38948 11B(IgGI，κ)，泳道7ORG38948 12A(IgG1，κ)，泳道8ZP(19-38)1A(IgG1對(duì)照)，泳道9L243(抗HLA-DR)，泳道10ZP 1A(IgA對(duì)照)。注意ORG38948 09A是與Org38948和DRB1*0401兩者都反應(yīng)的抗體。
圖3a抗Org38948 MAb識(shí)別帶有HC gp-39263-275的DRB1*0401陽(yáng)性BSM上的HC gp-39263-275復(fù)合物。
FACS分析帶有HC gp-39263-275的BSM細(xì)胞(————)，用抗Org38948抗體染色，與空載細(xì)胞(non-loaded)(-----------)的染色相比較?？笻LA/DR，L243，用作存在DR分子的陽(yáng)性對(duì)照。同型對(duì)照抗體用作陰性對(duì)照(...............)。
圖3b抗Org38948 MAb識(shí)別帶有HC gp-39263-275的DRBI*0401陽(yáng)性Priess上的HC gp-39263-275復(fù)合物。
FACS分析帶有HC gp-39263-275的Priess細(xì)胞(————)，用抗Org38948抗體染色，與空載細(xì)胞(-----------)染色相比較。抗HLA/DR，L243，用作存在DR分子的陽(yáng)性對(duì)照。同型對(duì)照抗體用作陰性對(duì)照(...............)。
圖4Org38948的抗體通過(guò)Org38948抑制T細(xì)胞雜交瘤的活化。
包被Org38948復(fù)合物，并與逐漸升高濃度的MAb以及目的T細(xì)胞雜交瘤溫育。37℃溫育兩天后，確定IL-2的生成。每個(gè)數(shù)值代表三份培養(yǎng)物的平均計(jì)數(shù)。a)雜交瘤5G11，b)雜交瘤4G11，以及c)雜交瘤8B12。
圖5Org38948的抗體通過(guò)HC gp-39263-275脈沖的BSM細(xì)胞抑制T細(xì)胞雜交瘤的活化。
HC gp-39263-275脈沖的BSM細(xì)胞與10μg/ml MAb以及或T細(xì)胞雜交瘤5G1l(左圖)或14G11(右圖)溫育。37℃溫育兩天后，確定IL-2的生成。每個(gè)數(shù)值代表三份培養(yǎng)物的平均計(jì)數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)施例實(shí)施例1Org38948的制備Org38948是DRB1*0401(DRA，DRB1*0401)二聚體與包含HCgp-39的263-275位氨基酸的肽的復(fù)合物，溶于0.05％十二烷基麥芽糖苷(dodecylmaltoside)的去污劑溶液中。
如Nag等人所述(J.Immunol.(1993)1501558-1564)稍作改變純化DRB1*0401分子。簡(jiǎn)言之，EBV轉(zhuǎn)化的成淋巴樣(lymphoblastoid)細(xì)胞系BSM(NIGMS；GM06821)于包含10％FCS、2g/l葡萄糖、4mML-谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。收獲細(xì)胞以后，用0.5％Triton X100的PBS提取DRB1*0401分子。然后溶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾澄清，再用10kD超濾膜濃縮。濃縮的Triton X100溶解產(chǎn)物上樣偶聯(lián)L243的Sepharose-4B柱，用0.05％十二烷基麥芽糖苷、pH 11.3的PBS洗脫結(jié)合的DRB1*0401。組分立即用20％磷酸二氫鈉緩沖液中和，通過(guò)0.05％十二烷基麥芽糖苷、pH7.3的PBS的DEAE離子交換柱收集DRB1*0401分子。
在GMP條件下，于Diosynth利用fmoc化學(xué)合成對(duì)應(yīng)于HC gp-39的263-275位氨基酸殘基的肽。
通過(guò)摩爾過(guò)量50倍的HC gp-39263-275與純化的DRB1*0401分子于0.05％十二烷基麥芽糖苷、pH7.0的PBS中37℃溫育72-80h制備MHC-肽復(fù)合物。最后通過(guò)S-300/S-200串聯(lián)的分子大小排阻柱層析去除游離肽，純化的復(fù)合物保存在0.05％十二烷基麥芽糖苷、pH7.2的PBS中。
實(shí)施例2產(chǎn)生Org38948的單克隆抗體按照表1所示時(shí)間表免疫六周齡的雌性BALB/c小鼠。在免疫程序的第48天，通過(guò)眼眶(orbita punction)取血樣。此時(shí)發(fā)現(xiàn)高滴度的Org38948和DRBI*0401抗體(介于22,000-46,000)。在使用的免疫程序之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差別。末次注射5天后，處死小鼠，如前所述制備去除紅細(xì)胞的脾細(xì)胞群體(Steenbakkers，1992 J.Immunol.Methods15269；Steenbakkers，1994，Molecular Biology Reports 19125)。這些脾細(xì)胞群體冷凍于-140℃，或直接地用來(lái)產(chǎn)生MAb。
為產(chǎn)生MAb，混合小鼠1、小鼠2和小鼠3的2×107去除紅細(xì)胞的脾細(xì)胞，在塑料培養(yǎng)瓶中于DMEM/HAM′s F12(Gibco BRL，Paisly，UK，cat.no.041-91825)、10％小牛血清(Hyclone，Logan，UT，USA)37℃溫育1h，以去除大部分單核細(xì)胞。非貼壁細(xì)胞隨后在DRB1*0401包被的培養(yǎng)皿中進(jìn)行三輪連續(xù)淘選(panning)，如Steenbakkers等人所述(1994，Molecular Biology Reports 19125)。這些步驟從細(xì)胞懸液中去除了針對(duì)HLA-DRB1*0401的B細(xì)胞。然后將得到的細(xì)胞懸液在Org38948包被的培養(yǎng)皿上37℃溫育90min，以選擇針對(duì)DRB1*0401/HC gp39263-275復(fù)合物的B細(xì)胞。仔細(xì)洗滌去除未結(jié)合細(xì)胞，最后經(jīng)胰蛋白酶處理收集結(jié)合細(xì)胞。
如前所述，通過(guò)克隆擴(kuò)增和微型電融合(mini-eleetrofusion)，從這些選擇的B細(xì)胞中得到產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤(Steenbakkers等人，1994 Molecular Biology Reports 19125)。簡(jiǎn)言之，選擇的B細(xì)胞與T細(xì)胞上清液以及50,000照射的(2500rad)EL-4 B5細(xì)胞在96孔平底組織培養(yǎng)板、終體積為200μl的DMEM/HAM′s F12、10％小牛血清中混合。第8天，上清液利用DRB1*0401或Org38948包被的平板進(jìn)行ELISA測(cè)試。將產(chǎn)生可與Org38948反應(yīng)而不與DRB1*0401反應(yīng)的MAb的B細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行微型電融合程序。這些培養(yǎng)物中的特異性B細(xì)胞與106NS-1骨髓瘤細(xì)胞混合，經(jīng)DMEM/HAM′s F12洗滌去除血清。然后細(xì)胞用鏈霉蛋白酶溶液處理3min，接著用融合培養(yǎng)基洗滌。在50μl融合杯中，通過(guò)交流電場(chǎng)30s、2MHz、400/Vcm，繼之以10μs、3kV/cm的矩形強(qiáng)電場(chǎng)脈沖，并再次以30s、2MHz、400V/cm的交流電場(chǎng)進(jìn)行電融合。最后，融合杯中內(nèi)容物轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基(DMEM/HAM′s F12、10％FCS、10-4M次黃嘌呤(Sigma_)、1.6×10-5M胸苷(Sigma_)、0.4μM氨基蝶呤(Life Technologies_)、1％人膀胱癌T24條件培養(yǎng)基(ATCC HTB4))，有限稀釋條件下接種96孔微量滴定板。融合后第13天，檢查培養(yǎng)物的雜交瘤生長(zhǎng)，并利用DRB1*0401或Org38948包被的平板再次進(jìn)行ELISA篩選。
在B細(xì)胞培養(yǎng)及微型電融合以后，發(fā)現(xiàn)5種抗體(ORG38948 01A、ORG38948 04B、ORG38948 08A、ORG38948 11B和ORG38948 12A)ELISA顯示與Org38948的反應(yīng)性，而不與DRB1*0401反應(yīng)(圖1a和1b)。這些MAb也不與聚苯乙烯板上包被的HC gp-39263-275反應(yīng)，Org38948的反應(yīng)性不受游離的HC gp-39263-275抑制，因此這些MAb針對(duì)DRB1*0401和HC gp-39263-275的聯(lián)合表位。BlAcore實(shí)驗(yàn)證實(shí)不與肽HC gp-39263-275結(jié)合。
為進(jìn)一步證明MAb的特異性，我們利用Org38948進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，10ug Org38948與6×106預(yù)先加入1ml雜交瘤上清液的綿羊抗小鼠Ig偶聯(lián)的順磁小珠(Dynal_110.02，Oslo，Norway)，在300ul0.1％BSA的PBS中4℃溫育2h。然后用PBS洗滌免疫沉淀物三次，在樣品緩沖液中煮沸，非還原和還原條件下進(jìn)行10％凝膠的SDS-PAGE。利用標(biāo)準(zhǔn)方法將蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用PBS、0.5％Tween20_、5％脫脂奶粉封閉印跡上游離的結(jié)合部位以后，在0.5％Tween20_、1％BSA、1％正常山羊血清的PBS中，將印跡與抗DR MAb(20ml 2ug/mlL243或12.5ml 1.1ug/ml L227)室溫下溫育1h。然后在相同緩沖液中，將印跡與結(jié)合堿性磷酸酶的山羊抗小鼠Ig溫育1h。最后，利用BCIP_和NBT為生色底物進(jìn)行印跡顯色。這些實(shí)驗(yàn)表明，該MAb能夠免疫沉淀60kD的分子，其在還原條件下進(jìn)行SDS/PAGE時(shí)，分離為33kD和28kD的兩個(gè)分子(圖2)。該分子量證實(shí)，該MAb與MHC II類(lèi)分子的反應(yīng)性，其由兩個(gè)非共價(jià)鍵相連的多肽鏈組成(α鏈32kD，β鏈28kD)。
實(shí)施例3Org38948的MAb識(shí)別帶有HC gp39263-275的DRB1*0401陽(yáng)性BLCL上的DRB1*0401/HC gp39263-275復(fù)合物。
利用FACS分析，確定MAb結(jié)合不同的、經(jīng)多種肽脈沖的、表達(dá)MHC的EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系(BLCL)。利用自動(dòng)化Milligen 9050合成儀，通過(guò)固相肽合成方法合成肽，并經(jīng)反相HPLC純化。
簡(jiǎn)言之，106BLCL與40ug肽在DMEM/HAM′s F12或空白培養(yǎng)基中37℃溫育4h。溫育后，用2％FCS、0.02％疊氮鈉的PBS洗滌細(xì)胞。大約2×105細(xì)胞與130ul包含MAb的雜交瘤上清液(外加20ul 20％FCS、0.02％疊氮鈉的PBS)4℃溫育1h。細(xì)胞用2％FCS、0.02％疊氮鈉的PBS洗滌兩次后，其與50ul、20％FCS、0.02％疊氮鈉(外加10ul山羊抗小鼠Ig/FITC(Beckton & Dickinson))的PBS 4℃溫育lh。細(xì)胞隨后用2％FCS、0.02％疊氮鈉的PBS洗滌三次，最后重懸于400ul 2％p-甲醛的PBS。細(xì)胞與生物素化的HC gp-39263-275溫育，并用鏈親和素/PE(Beckton & Dickinson)染色，作為肽結(jié)合的對(duì)照。用抗HLA/DR L243(從雜交瘤ATCC HB 55中純化的Ig)進(jìn)行染色，作為HLA-DR表達(dá)的對(duì)照。用FACScanTM(Beckton & Dickinson)分析染色的細(xì)胞。在各種情況下，利用前向和側(cè)向散射分析排除死細(xì)胞和碎片，以進(jìn)一步分析。
兩種DRB1*0401純合的BLCL(BSM和Priess)帶有HC gp-39263-275，抗體對(duì)這些細(xì)胞的反應(yīng)性與不帶有該肽的細(xì)胞相比較。圖3a和b表明，除ORG38948 11B之外的所有Org38948特異性抗體能區(qū)分帶有和不帶肽的BLCL。用ORG38948 01A、ORG38948 08A和ORG38948 12A獲得DRB1*0401/HCg p-39263-275復(fù)合物的最好染色。但是，其中兩種抗體(01A和08A)對(duì)一種BLCL(BSM)出現(xiàn)染色背景，可能使其用處不大。
實(shí)施例4Org38948的MAb的表位定位通過(guò)在DRB1*0401的情況下研究結(jié)合多種HC gp-39263-275的修飾和截短的肽，我們定位了抗體識(shí)別表位。將抗體的反應(yīng)性與通過(guò)小鼠T細(xì)胞雜交瘤8B12(在HLA-DRB1*0401的情況下，識(shí)別HC gp-39263-275的小鼠T細(xì)胞雜交瘤。如Cope等人，1999 Arthritis and Rheumatism421597-1507所述，該雜交瘤由HC gp-39263-275免疫的HLA-DRB1*0401+/+、人CD4+/+、I-Aβ-/-轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生)TCR的識(shí)別相比。
允許在肽主鏈和側(cè)鏈有多種修飾，而不影響ORG38948 12A或8B12的識(shí)別(表II)。就識(shí)別的表位而論，抗體ORG38948 01A和ORG38948 08A的識(shí)別似乎更重要，因?yàn)閷?duì)修飾識(shí)別得不好(ORG38948 08A)或根本不識(shí)別(ORG38948 01A)。ORG38948 12A不與N端伸長(zhǎng)兩個(gè)氨基酸的肽(DRB1*0401/HC gp-39261-275)反應(yīng)。
另一實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試多種截短的HC gp-39263-275以確定ORG3894812A所識(shí)別的DRB1*0401的最小表位。去除C端兩個(gè)氨基酸不失去結(jié)合，但N端不允許截短(表III)。所以，ORG38948 12A識(shí)別的最小表位是DRB1*0401/HC gp-39263-273。ORG38948 12A識(shí)別的表位不同于雜交瘤8B12識(shí)別的表位。除C端截短兩個(gè)氨基酸之外，雜交瘤8B12允許去除N端的兩個(gè)氨基酸。
實(shí)施例5Org38948的MAb的精細(xì)特異性利用如實(shí)施例3所述的相同方法，研究是否1)抗Org38948 MAb與帶有一套不同肽的DRB1*0401交叉反應(yīng)，以及2)在DRB1*0401的情況下，ORG38948 12A的結(jié)合僅限于HC gp-39263-275，或者也識(shí)別其它的HLA-DR/HC gp-39263-275復(fù)合物。
附1)用與DRB1*0401結(jié)合良好的肽脈沖Priess細(xì)胞。表IV總結(jié)的數(shù)據(jù)表明，未觀察到與帶有組成DRB1*0401結(jié)合基序的其它HC gp-39衍生肽的DRB1*0401交叉反應(yīng)。也未發(fā)現(xiàn)與帶有來(lái)自流感血細(xì)胞凝集素(Influenca Heamagglutinin)和麻瘋桿菌(Mycobacterium Leprae)的無(wú)關(guān)肽的DRB1*0401交叉反應(yīng)。
ORG38948 12A也識(shí)別生物素化的HC gp-39263-275，而抗體ORG38948 01A、ORG38948 04B和ORG38948 08A不識(shí)別。由于生物素偶聯(lián)到肽的N端，這提示后者M(jìn)Ab識(shí)別的表位接近復(fù)合物中肽的N端。
附2)為研究DRB1*0401/HC gp-39263-275外ORG38948 12A與其它HLA-DR/HC gp-39263-275復(fù)合物的交叉反應(yīng)性，使用下列表征清楚的、純合的、EBV轉(zhuǎn)化的或B淋巴樣細(xì)胞系(BLCL)PriessDRA，DRB1*0401BSMDRA*0101，DRB1*0401，DRB4*0101，DQA1*0301，DQB1*0302，DPA1*01，DPB1*01012.
YARDRA*0101，DRB1*0402，DRB4*0101，DQA1*0301，DQB1*0302，DPA1*01，DPB1*0401SA9001DRA，DRB1*0101，DQ1，DP4.
BM92DRA*0101，DRB1*0404，DRB4*0101，DQA1*0301，DQB1*0302，DPA1*01，DPB1*0402.
MGARDRA*0102，DRB1*1501，DRB5*0101，DQA1*0102，DQB1*0602，DPA1*01，DPB1*0401.
JHAFDRB1*0407，DRB4*0101，DQA1*0301，DQB1*0301，DPA1*01，DPB1*0301.
AMALADRA*0102，DRB1*1402，DRB3*0101，DQA1*0501，DQB1*0301，DPA1*01，DPB1*0402.
EKDRA*0102，DRB1*1401，DRB3*0202，DQA1*0101，DQB1*0503，DPA1*01，DPB1*0402.
這些純合的BLCL帶有HC gp-39263-275，隨后用ORG38948 12A染色。在一系列實(shí)驗(yàn)中，ORG38948 12A在DRB1*0401和DRB1*0407的情況下，都染色HC gp-39263-275(表V)。通常濃度的抗體下，在DRB1*0101、DRB1*0404、DRB1*1402(RA易感型單倍型)、DRB1*0402、DRB1*1301、DRB1*1401(緊密相關(guān)，非RA易感型單倍型)以及DRB1*1501(更遠(yuǎn)相關(guān)，非RA易感型單倍型)的情況下未觀察到肽的染色。在非常高的抗體濃度時(shí)，在DRB1*0101，DRB1*0404，DRB1*1301和DRB1*1401的情況下也發(fā)現(xiàn)與HC gp-39263-275較弱的反應(yīng)性。在這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照中，表明i)ORG38948 12A不結(jié)合空載的BLCL，ii)HC gp-39263-275結(jié)合BLCL，以及iii)所有BLCL均顯示高水平表達(dá)DR(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6Org38948的MAb通過(guò)Org38948和HC gp39263-275脈沖的DRBl*0401陽(yáng)性BLCL抑制T細(xì)胞雜交瘤的活化。
利用兩種不同的分析測(cè)定抗Org38948 MAb對(duì)抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞雜交瘤活化的抑制。在一個(gè)分析中，用MHC/肽-復(fù)合物刺激T細(xì)胞雜交瘤。在另一個(gè)分析中，利用帶有HC gp-39263-275的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞刺激T細(xì)胞雜交瘤5G11、8B12和14G11(在HLA-DRB1*0401的情況下，識(shí)別HC gp-39263-275的小鼠T細(xì)胞雜交瘤，如Cope等人，1999 Arthritisand Rheumatism 421597-1507所述，這些雜交瘤由HC gp-39263-275免疫的HLA-DRB1*0401+/+、人CD4+/+、I-Aβ-/-轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生)。
為了利用MHC/肽復(fù)合物刺激，用100ul PBS中濃度為200ng/mlOrg38948 4℃過(guò)夜包被平底微孔。用PBS洗滌兩次，去除過(guò)量的復(fù)合物。然后，各孔與100ul DMEM/HAM′s F12、10％FCS中的各種濃度MAb，于37℃溫育1h。與MAb預(yù)溫育以后，加入100ul DMEM/HAM′sF12、10％FCS中的T細(xì)胞雜交瘤懸浮液(5G11和14G11為2×104c/孔；8B12為104c/孔)。培養(yǎng)物于37℃溫育兩天，最后收集上清液，測(cè)定小鼠IL-2。圖4a表明，所有MAb均以劑量相關(guān)方式抑制雜交瘤5G11的活化。與對(duì)照IgG MAb相比，利用ORG38948 01A獲得部分抑制。相反，與ORG38948 08A和ORG38948 12A溫育，濃度為25ug/ml時(shí)完全抑制。與抗HLA/DR MAb L243相比，復(fù)合物特異性抗體是T細(xì)胞雜交瘤活化的低效抑制劑，這可能由于抗體的親合力有差別。利用雜交瘤14G11獲得類(lèi)似結(jié)果(圖4b)。雜交瘤8B12受抑制較少(圖4c)，與我們先前的觀察結(jié)果—該雜交瘤需較少?gòu)?fù)合物成為完全刺激—相一致。
在另一個(gè)分析中，1.2×106細(xì)胞與10ug肽在1ml DMEM/HAM′sF12中37℃溫育5h，使BSM細(xì)胞帶有HC gp-39263-275。然后洗掉過(guò)量的肽，用15,000rad劑量照射細(xì)胞。隨后在圓底微孔中，2×104帶有肽的BSM細(xì)胞與10ug/ml MAb 37℃預(yù)溫育1h，終體積為100ulDMEM/HAM′s F12。然后在100ul DMEM/RAM′s F12、20％FCS中加入2×104T細(xì)胞雜交瘤。37℃溫育兩天以后，收集上清液，測(cè)定小鼠IL-2。從圖5可以推斷，發(fā)現(xiàn)所有抗體在10ug/ml濃度下均抑制肽誘導(dǎo)的雜交瘤5G11和14G11的活化?？笻LA/DR MAb L243再次獲得較強(qiáng)抑制。
注意利用抗小鼠IL-2(Pharmingen 18161D)捕獲、抗小鼠IL-2/生物素(Pharmingen 18172D)為第二抗體，在雙夾心ELISA測(cè)定小鼠IL-2。綴合銪(Europium)的鏈親和素(WallacTM1244-360)用于在時(shí)間解析熒光計(jì)(time-resolved fluorometer)中檢測(cè)IL-2結(jié)合。
實(shí)施例7RA患者滑液的APC上存在DRB1*0401/HC gp-39263-275復(fù)合物如Baeten等人所述(2000，Arthritis和Rheumatism 431233-1243)進(jìn)行滑液切片的免疫組織化學(xué)分析。簡(jiǎn)言之，滑液活檢于液氮速凍，制成5μm低溫切片。丙酮固定10min后，用1％過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，切片與3種不同的抗HC gp-39 MAb(06A、08B和10B)的混合物或者ORG38948 12A溫育30min。用無(wú)關(guān)的同型匹配MAb溫育平行切片作為陰性對(duì)照。切片隨后與生物素化的抗小鼠第二抗體溫育，繼之以鏈親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(Dako，Glostrup，Denmark)溫育。利用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)生色底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。最后切片用蘇木精(haematoxylin)復(fù)染。染色的滑液切片是雙育的(blinded)，由兩個(gè)觀察者獨(dú)立計(jì)數(shù)。
19名RA患者、10名SpA患者、3名PsA患者、2名OA患者、1名假性痛風(fēng)患者以及迄今仍未確診的3名患者的滑液組織切片，分別利用一套三種抗HC gp-39MAb以及ORG38948 12A，通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)試其HC gp-39表達(dá)，并用ORG38948 12A染色。15名共有表位陽(yáng)性的RA患者中，有10名檢測(cè)到DR4/HC gp-39263-275或DRB1*0101/HC gp-39263-275復(fù)合物(表VIa)。與DRB1*0404/HCgp-39263-275和DRB1*0101/HC gp-39263-275的反應(yīng)性和ORG38948 12A在DRB1*0404和DRB1*0101的情況下也識(shí)別HC gp39263-275的觀察結(jié)果相一致(表V)。ORG38948 12A染色僅限于處在或鄰近淋巴浸潤(rùn)的樹(shù)突狀樣細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。該定位顯然不同于表達(dá)HC gp-39細(xì)胞的定位，這提示表達(dá)MHC/HC gp-39263-275的細(xì)胞不是產(chǎn)生HC gp-39細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)罹患各種疾病的19名對(duì)照患者中未有ORG38948 12A MAb染色(表VIb)。其中5名患者因表達(dá)共有表位(DR4或DR1)為相關(guān)對(duì)照，6名為共有表位陰性，其它患者的HLA-DR類(lèi)型仍然未知。同型對(duì)照抗體的染色一直是陰性。
表I用Org38948免疫

cFA＝弗氏完全佐劑；iFA＝弗氏不完全佐劑i.p.＝腹膜內(nèi)；s.c.＝皮下表IIOrg38948的單克隆抗體的表位定位HC gp-39肽 識(shí)別經(jīng)由MAb 01AMAb 08AMAb 12A 8B12RSFTLASSETGVG + + + +Ac-RSFTLASSETGVG - - + +HOCH2-(CHOH)4-CH2-RSFTLASSETGVG +/-+/-+ +Ac-RSFTLASSETGV-ψ-[CH2NH]-G-NH2 - +/-+ +Ac-R-NhSer-FTLASSETGVG-NH2- +/-+ +Ac-R-NhSer-FTLASSETGV-ψ-[CH2NH]-G-NH2- +/-+ +FGRSFTLASSETGVG - +/-- ？Ac-RSFTLASSETGVG-NH2 - +/-+ +
表III單克隆抗體ORG3894812A的表位定位DRB1*0401中的HC gp-39肽 結(jié)合識(shí)別經(jīng)由MAb 12A 8B12RSFTLASSETGVG263-275+++++RSFTLASSETGV 263-274+++++RSFTLASSETG 263-273+++++/-RSFTLASSET 263-272++ --FTLASSETGVG 265-275+++-+/-TLASSETGVG 266-275- --SFTLASSETGV 264-274+++-+FTLASSETG265-273+ --
表IVOrg38948 MAb對(duì)帶有不同肽的Priess細(xì)胞上DRA/DRB1*0401的特異性。肽IC5001A04B08A11B12A無(wú)- - - +/-+/--HC gp-39263-2750.08+ +/-+ +/-+HC gp-39263-275-bion.d.- - +/-+/-+HC gp-39103-1160.08- - +/-+/--HC gp-39259-2710.04- - +/-+/--IHA307-319F0.56- - +/-+/--IHA307-319F-bion.d.- - +/-+/--MLep 18K38-510.3 - - +/-+/--IC50對(duì)DRB1*0401的相對(duì)結(jié)合親和力；IHA流感血細(xì)胞凝集素；MLep；麻瘋桿菌-不結(jié)合抗體(熒光強(qiáng)度0-4)+/-中等結(jié)合抗體(熒光強(qiáng)度4-40)+強(qiáng)結(jié)合抗體(熒光強(qiáng)度40-400)
表V通過(guò)單克隆抗體ORG38948 12A識(shí)別帶有HC gp-39263-275的HLA-DR分子BLCL HLA DR單倍型 RA易感性 由ORG38948 12A識(shí)別3μg/ml 200-500μg/mlBSM DRB1*0401DR4 Dw4 易感的 ++ ++Priess DRB1*0401DR4 Dw4 易感的 ++ ++SA9001 DRB1*0101DR1 Dw1 易感的 - +/-BM92DRB1*0404DR4 Dw14易感的 - +AMALA DRB1*1402DR6 Dw16易感的 - -YAR DRB1*0402DR4 Dw10緊密相關(guān)；不易感- -CB6BDRB1*1301DR6a緊密相關(guān)；不易感- +/-EK/OH DRB1*1401DR6b緊密相關(guān)；不易感- +/-MGARDRB1*1501DR2 Dw2 不易感 - -JHAFDRB1*0407DR4 Dw13未知++ ++各種BLCL帶有HC gp-39263-275，隨后用ORG38948 12A染色。確認(rèn)在對(duì)照中，i)ORG38948 12A不結(jié)合空載的BLCL，ii)HC gp-39263-273結(jié)合BLCL，以及iii)所有BLCL顯示高水平表達(dá)DR。
表VIaRA患者的滑液中表達(dá)MHC/HC gp-39263-275復(fù)合物。
患者 年齡診斷病程 HLA-DR MHC-肽157 RA 1年 B1*0404 +274 RA 2年 B1*0401 -353 RA 6年 B1*0401 +460 RA 7年 B1*0401 +567 RA 19年 B1*0101 -678 RA 20年 B1*0401 -770 RA 22年 B1*0401 +864 RA 25年 B1*0101 -950 RA 2月 B1*04+10 39 RA 3月 ？-11 50 RA 4月 B1*04-12 52 RA 9月 B1*04+13 24 RA 1年 B1*0101 +14 33 RA 3年 B1*04+15 82 RA 4年 ？-16 48 RA 6年 B1*0401，B1*0404 +17 36 RA 8年 -/- -18 64 RA 15年 ？-19 58 RA 20年 B1*04+RA類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎表VIb非RA對(duì)照的滑液中表達(dá)MHC/HC gp-39263-275復(fù)合物。
患者 年齡診斷 病程 HLA-DR MHC-肽130 SpA2月 ？ -236 SpA3月 -/- -337 SpA6月 ？ -456 SpA6月 B1*0401-528 SpA6月 -/- -652 SpA8月 -/- -719 SpA9月 -/- -822 SpA2年 B1*0401-935 SpA3年 ？ -10 41 SpA12年 B1*0401-148 PsA1月 ？ -260 PsA1月 -/- -352 PsA2年 ？ -173 CC 2年 -/- -276 OA -366 OA -467 ？ 9月 B1*04 -580 ？ 1月 ？ -638 ？ 30年 B1*0101-CC假性痛風(fēng)；SpA脊柱關(guān)節(jié)??；PsA牛皮癬關(guān)節(jié)炎；OA骨關(guān)節(jié)炎序列表序列表<110> Akzo Nobel N.V.<120> 特異性MHC-肽復(fù)合物抗體的用途<130><140><141><160> 20<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 11<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<220><223> HC gp-39 AA 263-273<400> 1Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly1 5 10<210> 2<211> 13<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 263-275<400> 2Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 3<211> 12<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 263-274<400> 3Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val1 5 10<210> 4<211> 10<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 263-272<400> 4Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr1 5 10<210> 5<211> 11<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 265-275<400> 5Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 6<211> 10<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 266-275<400> 6Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 7<211> 11<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 264-274<400> 7Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val1 5 10<210> 8<211> 9<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 265-273<400> 8Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly1 5<210> 9<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述N端連接乙?；?amp;lt;400> 9Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 10<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述N端連接HOCH2-(CHOH)4-CH2<400> 10Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 11<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述N端連接乙酰基；C端連接NH2；12位Xaa是NH-CH(CH(CH3)2)-CH2<400> 11Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Xaa Gly1 5 10<210> 12<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述N端連接乙?；籆端連接NH2；2位Xaa是N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)<400> 12Arg Xaa Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 13<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述N端連接乙酰基；C端連接NH2；2位Xaa是N[CH2)2-OH]-CH2-C(O)；12位Xaa是NH-CH(CH(CH)3)2)-CH2<400> 13Arg Xaa Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Xaa Gly1 5 10<210> 14<211> 14<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 261-275<400> 14Phe Gly Arg Ser Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 15<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述；N端連接乙?；?；C端連接NH2<400> 15Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210> 16<211> 13<212> PRT<213> 流感病毒<220><223> 血細(xì)胞凝集素AA 307-319<400> 16Pro Lys Phe Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10<210> 17<211> 14<212> PRT<213> 麻瘋分枝桿菌<220><223> 18K蛋白質(zhì)AA 38-51<400> 17Glu Glu Phe Val Val Glu Phe Asp Leu Pro Gly Ile Lys Ala1 5 10<210> 18<211> 14<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 103-116<400> 18Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn Thr Gln Ser Arg1 5 10<210> 19<211> 13<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 259-271<400> 19Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu1 5 10<210> 20<211> 13<212> PRT<213> 人<220><223> HC gp-39 AA 326-338<400> 20Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser Lys Val1 5 10
權(quán)利要求
1.診斷自身免疫性疾病的方法，包含利用特異性結(jié)合MHC-HC-gp39衍生肽復(fù)合物的抗體或其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域檢測(cè)罹患自身免疫性疾病患者中自身免疫特異性MHC-肽復(fù)合物的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合物的MHC部分為HLADRB1*0401、DRB1*0404、DRB1*0407和DRB1*0101型。
3.權(quán)利要求2的方法，其中 所述MHC類(lèi)型為HLA DRB1*0401。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述HC gp-39衍生肽包含HC-gp39263-273或HC-gp39263-275。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述HC gp-39衍生肽是HC-gp39263-273或HC-gp39263-275。
6.權(quán)利要求5的方法，其中該抗體是ORG38948 08A、ORG3894812A或ORG38948 04B。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法中使用的抗體。
8.包含權(quán)利要求7的一種或多種抗體以及檢測(cè)試劑的診斷組合物。
9.用于治療的權(quán)利要求7的抗體。
10.權(quán)利要求7的抗體在制造治療自身免疫性疾病的藥物制劑中的用途。
11.權(quán)利要求7的抗體在純化自身免疫特異性的MHC-肽復(fù)合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了通過(guò)檢測(cè)罹患自身免疫性疾病患者的自身免疫特異性MHC－肽復(fù)合物的存在診斷自身免疫性疾病活性的方法。MHC－肽復(fù)合物與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。也描述了用于該方法的單克隆抗體。該抗體還可以用于治療目的。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1447919SQ01814193
公開(kāi)日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2001年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月14日
發(fā)明者P·G·A·斯廷貝克斯 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司