聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒及制備方法、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療血管增生藥物的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物及制備方法、應(yīng)用。本發(fā)明的治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒，所述納米顆粒包含聚陽(yáng)離子核酸材料和基因物質(zhì)，所述聚陽(yáng)離子核酸材料與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為1～100：1。治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒包含聚陽(yáng)離子核酸材料和基因物質(zhì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的納米顆?？捎行б种蒲茉錾?，可實(shí)現(xiàn)基因物質(zhì)的輸送，并且，不存在體內(nèi)毒性和體內(nèi)免疫原性的問(wèn)題，由于納米顆粒不帶電荷，還可避免體內(nèi)非靶組織的粘附，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)病變細(xì)胞靶向，從而有效提高靶向效果，且不影響體內(nèi)病變細(xì)胞的內(nèi)吞。
【專利說(shuō)明】聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒及制備方法、應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及治療血管增生藥物的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種治療血管增生的聚陽(yáng)離 子核酸復(fù)合物及制備方法、應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 新生血管可伴發(fā)于創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)、眼內(nèi)缺血性病變等多種情況。新生血管 的生成是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，目前的大量研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelialgrowth factor, VEGF)及其家族成員能特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖及遷 移，在新生血管形成過(guò)程中起重要作用。
[0003] VEGF是一類糖蛋白，廣泛分布于人和動(dòng)物體內(nèi)的腦、腎、肝、脾、肺、骨骼等組織。 人類成熟的 VEGF 以五種亞型存在-VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206,均 系通過(guò)不同的剪接方式來(lái)自同一基因。除VEGF外，VEGF家族主要還包括胎盤生長(zhǎng)因子 (placenta growth factor，PlGF)、VEGF- B、VEGF- C、VEGF- D、VEGF- E，該些家族成員與 VEGF具有相似的結(jié)構(gòu)、功能及分布。
[0004] 由于在新生血管生成中的重要作用，VEGF家族與新生血管生成相關(guān)性疾病及某些 生理過(guò)程關(guān)系密切。VEGF家族在腫瘤新生血管的生成中起重要作用。
[0005] 關(guān)于VEGF家族和眼內(nèi)新生血管的研究表明，VEGF家族中VEGF在與缺氧有關(guān)的眼 內(nèi)新生血管化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在眼內(nèi)新生血管活動(dòng)眼中（糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜 中央靜脈阻塞等），玻璃體內(nèi)VEGF含量明顯增加。而在玻璃體內(nèi)注射VEGF亦可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜 新生血管化。另外，臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗VEGF療法可觀顯抑制眼內(nèi)新生血管反應(yīng)。
[0006] VEGF家族和胚胎血管生成VEGF在胚胎血管生成中起主導(dǎo)作用?，F(xiàn)已證明，在人3 個(gè)月孕早期和足月的胎盤中VEGF mRNA即已存在。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只要缺乏VEGF兩個(gè) 等位基因中的任何1個(gè)，胚胎均最終死亡，原因是心血管系統(tǒng)形成失敗。
[0007] 由于VEGF家族能明顯促進(jìn)新生血管生成，故可從不同層次抑制其功能，來(lái)預(yù)防和 治療新生血管相關(guān)性疾病。目前，抑制劑主要針對(duì)VEGF。
[0008] 現(xiàn)有的抗VEGF抑制策略包括：
[0009] 1)蛋白抗體可直接中和VEGF蛋白，從而抑制VEGF的生物效應(yīng)。
[0010] 2)可溶性VEGF受體能特異地結(jié)合VEGF，間接阻斷VEGF與其受體作用。
[0011] 3) VEGF受體阻斷劑與VEGF受體結(jié)合，進(jìn)而阻止其與VEGF作用，也起到了抑制 VEGF的作用。
[0012] 4)反義VEGF -組特異的核苷酸序列，能與VEGF mRNA結(jié)合，干擾VEGFmRNA的翻譯 和VEGF蛋白的生成。
[0013] 5) VEGF信號(hào)傳導(dǎo)阻斷劑與VEGF受體結(jié)合后將產(chǎn)生受體自磷酸化等一系列信號(hào)傳 導(dǎo)，通過(guò)阻斷傳導(dǎo)途徑，達(dá)到抑制VEGF作用的目的。
[0014] 可特異性結(jié)合VEGF165的制劑哌加他尼鈉（Pegaptanib，商品名Macugen)是最早 獲批用于眼科的抗VEGF類藥物；此后，能廣泛結(jié)合VEGF165及其他所有VEGF-A異構(gòu)體的 雷珠單抗（Ranibizumab，商品名Lucentis)相繼上市。這些抗VEGF制劑為治療新生血管 及血管性疾病導(dǎo)致的黃斑水腫帶來(lái)革命性的改變。如果Ranibizumab的顯著療效是由于其 廣泛結(jié)合所有VEGF-A異構(gòu)體而非僅僅結(jié)合VEGF165,那么廣譜結(jié)合VEGF家族所有成員的 藥物則有望獲得更好療效。能廣譜作用于VEGF家族成員的新一代抗VEGF藥物阿柏西普 (Aflibercept，眼用制劑VEGF Trap-Eye,商品名Eylea)已于2011年11月上市。
[0015] 雖然單抗藥物已經(jīng)取得一系列臨床治療作用，但仍存在不少問(wèn)題，比如單抗的靶 點(diǎn)單一，目前僅針對(duì)VEGF165,對(duì)于其他VEGF亞型缺乏針對(duì)性。且單抗的研發(fā)成本高，周期 長(zhǎng)，制備成本高。
[0016] siRNA是一段21 - 25個(gè)堿基對(duì)的RNA分子，發(fā)現(xiàn)于單細(xì)胞生物抵御病毒侵襲的機(jī) 制。單細(xì)胞生物針對(duì)入侵病毒的mRNA序列合成出一段與之互補(bǔ)的siRNA，主動(dòng)結(jié)合mRNA， 從而阻斷病毒的復(fù)制。siRNA因其獨(dú)特的靶點(diǎn)特異性、結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)性和代謝安全性，成為科 研界普遍看好的新的治療藥物。然而，在過(guò)去的20年里，研究人員設(shè)計(jì)了一系列的載體用 于siRNA的體內(nèi)輸送，但僅有極少數(shù)進(jìn)入臨床階段，迄今，仍未有一個(gè)載體得到FDA認(rèn)證，一 個(gè)有效載體的缺位，導(dǎo)致核酸物質(zhì)體內(nèi)輸送仍然處于臨床瓶頸期。
[0017] 將核酸物質(zhì)輸送到靶細(xì)胞的胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，需要克服一系列的體內(nèi)輸送屏障， 因此，核酸載體是否高效，是其能否用于臨床治療的關(guān)鍵所在。核酸物質(zhì)輸送的載體一般為 以下兩類：（1)病毒載體：病毒載體（如慢病毒載體、腺病毒載體）作為基因的輸送載體， 雖然有較高的體外轉(zhuǎn)染活性，然而，其免疫原性與易導(dǎo)致突變的缺點(diǎn)為臨床試驗(yàn)帶來(lái)了巨 大的安全問(wèn)題，使得其應(yīng)用受限。（2)非病毒載體：非病毒載體的優(yōu)勢(shì)主要在于，在保證預(yù) 期的轉(zhuǎn)染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帶來(lái)的免疫原性與諸多炎癥反應(yīng)，其一 般為以下兩種載體設(shè)計(jì)：(a)陽(yáng)離子脂質(zhì)體；(b)聚陽(yáng)離子基因載體。而目前研究更多的主 要集中于聚陽(yáng)離子基因載體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的修飾，使之適用于基因物質(zhì)的靶向輸送。陽(yáng) 離子脂質(zhì)體具有較高的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染活性，然而，由于表面的正電荷影響其體內(nèi)的正常分布， 同時(shí)，由于選用陽(yáng)離子脂質(zhì)，免疫原性與炎癥反應(yīng)在動(dòng)物試驗(yàn)中也成為不可避免的缺點(diǎn)之 一 (Gao, K. &Huang, L. Nonviral methods for siRNA delivery. Molecular pharmaceutics 6, 651-658(2008).)。
[0018]由于siRNA序列與沉默對(duì)象蛋白的高度特異性，以及當(dāng)前siRNA合成的 低成本，使siRNA序列可實(shí)現(xiàn)低成本的開發(fā)，并可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)蛋白的沉默， 從而可生成低成本、高效、高安全性的產(chǎn)品。目前，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建靶序 列 5, -GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3'（Takei Y，et al. A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics.Cancer research2004;64(10):3365-70.)#&5，-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3'（FilleurS，et al. SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-land slows tumor vascularization and growth. Cancer research 2003 ;63 (14): 3919-22.)可有效抑制人 體VEGF的表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明目的在于提供一種治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒，以解決 現(xiàn)有的抑制血管增生的抗VEGF藥物存在的上述技術(shù)問(wèn)題。
[0020] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述的治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆 粒的制備方法，以解決現(xiàn)有的抑制血管增生的抗VEGF藥物存在的上述技術(shù)問(wèn)題。
[0021] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒在制備治療血 管增生的藥物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0023] -種治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒，所述納米顆粒包含聚陽(yáng)離子 核酸材料和基因物質(zhì)，所述聚陽(yáng)離子核酸材料與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為1?1〇〇 :1。
[0024] 優(yōu)選地，所述聚陽(yáng)離子核酸材料由低分子量的聚乙烯亞胺（PEI)與含二甲醛的鏈 接劑以亞胺鍵構(gòu)成，所述聚陽(yáng)離子核酸材料的結(jié)構(gòu)式為：
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒包 含聚陽(yáng)離子核酸材料和基因物質(zhì)，所述聚陽(yáng)離子核酸材料與基因物質(zhì)的質(zhì)量比為1?100 : Io
2. 如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚陽(yáng)離子核酸材料由低分子量的 聚己帰亞胺（PEI)與含二甲酵的鏈接劑W亞胺鍵構(gòu)成，所述聚陽(yáng)離子核酸材料的結(jié)構(gòu)式 為：
其中，X為含二甲酵的鏈接劑衍生的基團(tuán)。
3. 如權(quán)利要求2所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚己帰亞胺的分子量低于2000。
4. 如權(quán)利要求2所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚己帰亞胺選自直鏈聚己帰亞胺 或支鏈聚己帰亞胺。
5. 如權(quán)利要求2所述的納米顆粒，其特征在于，所述鏈接劑選自戊二酵、對(duì)苯二甲酵、 間苯二甲酵、鄰苯二甲酵、2, 5-咪哇二甲酵、2, 4-化巧二甲酵、2, 5-化巧二甲酵、2, 6-化巧 二甲酵、2, 5-化嗦二甲酵或2, 6-化嗦二甲酵的其中一種。
6. 如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述基因物質(zhì)選自RNA或DNA，所述RNA 包括 5, -GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3' 或 5, -AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3,；所述 DNA 為構(gòu)建的 質(zhì)粒DNA，所述質(zhì)粒DNA包括功能基因序列、啟動(dòng)子序列和抗性基因，所述質(zhì)粒DNA的功能基 因序列包括 5' -GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3'或 5' -AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3'。
7. 如權(quán)利要求6所述的納米顆粒，其特征在于，所述RNA的分子量為19-2化P。
8. 如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚陽(yáng)離子核酸材料與基因物質(zhì)的 質(zhì)量比為優(yōu)選為5?50 ;1，更優(yōu)選為10?30:1。
9. 權(quán)利要求1所述的治療血管增生的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒的制備方法，其特 征在于，包括W下步驟： 聚陽(yáng)離子核酸材料的水溶液和基因物質(zhì)的水溶液混合，在室溫靜置20-60分鐘即可制 成所述納米顆粒。
10. 權(quán)利要求1所述的聚陽(yáng)離子核酸復(fù)合物納米顆粒在制備治療血管增生的藥物中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08J3/24GK104257630SQ201410504891
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】袁偉恩, 陳順, 車俊怡, 原明璐 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)