一種番茄黃曲葉病毒lamp檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種番茄黃曲葉病毒LAMP檢 測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 番茄是常見的可食用植物，其營養(yǎng)豐富、風味特別，具有減肥瘦身、消除疲勞、增進 食欲、促進蛋白質消化等功效，原產南美洲，在我國廣泛栽培。然而，1964年Cohen等首次報 道了在以色列發(fā)生的番茄黃曲葉病毒病。在之后的幾十年間，該病迅速地擴散到中東、地中 海沿岸、東亞、南亞、非洲、歐洲、美國、中美洲、澳大利亞等眾多國家和地區(qū)。2002年傳入我 國南部省份，首先在廣西大面積暴發(fā)，同年傳入江浙一帶，隨后在各個省份相繼發(fā)現(xiàn)、連續(xù) 暴發(fā)，給我國的番茄生產造成重大損失。
[0003] 番前黃曲葉病毒病的病原體是番前黃曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)，是對番茄產量影響最嚴重的病害之一，主要由煙粉虱傳播。番茄植株感染該 病毒后，最典型的癥狀是病株生長遲緩或停滯，節(jié)間變短，嚴重矮化，枝條直立叢簇，葉片明 顯變小、增厚、皺縮，葉質脆硬，向上卷曲呈杯、盤狀，植株頂部形似菜花;病葉邊緣至葉脈區(qū) 域黃化，植株上部葉片癥狀尤其明顯;大部分花穗凋萎，結果稀少，果實變小，膨大速度慢， 成熟期的果實不能正常轉色。番茄在開花以前遭受TYLCV侵染，危害極其嚴重，果實產量和 商品價值均大幅度下降，嚴重時造成的損失可達100%。
[0004] 番前黃曲葉病毒病的癥狀并不是一成不變的，而是隨著病毒株系、番前品種、植株 年齡以及侵染時間的不同而改變，難以鑒別。此外，番茄病毒病的種類很多，經常是多種病 毒同時發(fā)生，如黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄花葉病毒(ToMV)等，構成混合侵染，因此田間癥狀 往往十分復雜，不易辨認。目前檢測番茄黃曲葉病毒多使用血清學測定或PCR法，然而這兩 種方法均存在不足:前者須制作抗血清，非特異反應多，易產生假陽性或假陰性結果，而PCR 靈敏度和特異性不高，導致檢測結果的準確性較低。因此，有必要開發(fā)一種快速、準確的 TYLCV檢測方法，以滿足產業(yè)需求。
[0005] 環(huán)介導恒溫核酸擴增技術（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 近些年發(fā)展起來的一種新型的核酸擴增方法（見文獻Notomi T，0kayama H，Masubuchi Η, Yonekawa T,ffatanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)。該技術不僅能夠在恒溫條件下對 目的序列進行快速擴增，且與常規(guī)PCR相比，無需高端的儀器設備，可以通過在擴增產物中 加入熒光染料進行直接判斷或者通過觀察擴增曲線變化判斷擴增結果，因此具有特異性 強、靈敏度高、易于判讀、可定性定量等優(yōu)勢。目前LAMP技術已經應用于多種動植物病毒的 快速檢測，并隨著該技術的成熟，使用范圍也越來越廣。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種番茄黃曲葉病毒LAMP檢測試劑盒及檢測方法。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個方面中，本發(fā)明提供一種番前黃曲葉病毒LAMP檢 測試劑盒，其包括特異性引物、反應緩沖液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核 苷酸序列如下所示：
[0008] 外引物F3:TGAAGAATGAITTGCGGGATA(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:GCATGCGTACATGCCATA(SEQ ID NO:2)
[0010] 內引物FIP: CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA
[0011] TGAGGAAATTTCATG(SEQ ID NO:3)
[0012] 內引物BIP: ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAA
[0013] CAAGGCGTTTTCAGT(SEQ ID N0:4)〇
[0014] 優(yōu)選地，所述外引物F3和所述外引物B3的濃度均為5pmolAU，所述內引物FIP和所 述內引物BIP的濃度均為40pmolAU。
[0015] 優(yōu)選地，所述反應緩沖液由l〇mM dNTP、10 X ThermoPol反應緩沖液、5mM甜菜堿和 50mM MgS〇4組成。
[0016] 優(yōu)選地，所述核酸染料為SYBR Green I。
[0017]優(yōu)選地，所述番茄黃曲葉病毒LAMP檢測試劑盒進一步包括DNA提取試劑以及陽性 對照和陰性對照。
[0018]在另一個方面中，本發(fā)明還提供一種番茄黃曲葉病毒LAMP檢測方法，其包括以下 步驟：
[0019] (1)提取待測樣品DNA:向待測樣品中加入CTAB抽提緩沖液，按照常規(guī)CTAB法提取 DNA；
[0020] (2)設計并合成引物，其中所述引物的核苷酸序列如下所示：
[0021] 外引物F3:TGAAGAATGATTTGCGGGATA(SEQ ID N0:1)
[0022] 外引物B3:GCATGCGTACATGCCATA(SEQ ID NO:2)
[0023] 內引物FIP: CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA
[0024] TGAGGAAATTTCATG(SEQ ID NO:3)
[0025] 內引物BIP: ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAA
[0026] CAAGGCGTTTTCAGT(SEQ ID NO:4)；
[0027] (3)建立LAMP反應體系：在PCR管中制備25μ1的LAMP反應體系，其包括5pmolAU的 外引物 F3 1μ1、5ρηιο1/μ1 的外引物 Β3 1μ1、40ρηιο1/μ1 的內引物 FIP 1μ1、40ρηιο1/μ1 的內引 物BIP ΙμL、反應緩沖液2.5yl、8U Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水補充至25μ1，并以 番茄黃曲葉病毒基因組DNA作為陽性對照，以lOOmM Tris-HCl ρΗ8.0和50mM EDTA作為陰性 對照；
[0028] (4)LAMP反應:將步驟(3)中PCR管于63°C恒溫反應60min;
[0029] (5)結果判讀:在反應產物中加入核酸染料，如反應液為橙色，表示結果為陰性，綠 色表示結果為陽性。
[0030] 優(yōu)選地，所述反應緩沖液由10mM dNTP、10 X ThermoPol反應緩沖液、5mM甜菜堿和 50mM MgS〇4組成。
[0031] 優(yōu)選地，所述核酸染料為SYBR Green I。
[0032] 本發(fā)明的番茄黃曲葉病毒LAMP檢測試劑盒及檢測方法針對病毒保守區(qū)域設計，獲 得特異性和靈敏度高的四條引物，假陽性率低;擴增在30-60min內即可完成，快速、高效且 產率高;通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，無需高端的儀器設備以及繁鎖的電泳和紫 外觀察等步驟，鑒定簡便，較傳統(tǒng)的PCR檢測方法優(yōu)勢顯著。
【具體實施方式】
[0033]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0034]實施例1本發(fā)明的番茄黃曲葉病毒LAMP檢測試劑盒的制備
[0035] 1.1試劑
[0036]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol