專利名稱：Cdk17基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因的應(yīng)用，特別是涉及ー種⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白激酶是由人類基因組中最大的ー類基因所編碼，其作用是通過將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物蛋白上，來調(diào)控各種蛋白的活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞生物學(xué)過程，人類基因群編碼超過57個激酶家族之中的518種蛋白激酶。大約有55%已知的原癌基因編碼蛋白激酶，其余多數(shù)的原癌基因則編碼可激活蛋白質(zhì)激酶或被激酶磷酸化的特異蛋白。所有蛋白激酶 參與細(xì)胞信號通路，參與心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、關(guān)節(jié)炎和其它免疫紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)如老年性癡呆癥，阿默海茨癥AD等發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)已發(fā)與超過400種人類疾病與蛋白激酶相關(guān)。美國FDA的制藥和生物技術(shù)公司中有四分之一的藥物研究開發(fā)方案集中在研發(fā)新的蛋白激酶抑制劑，這些藥物應(yīng)用于治療包括腫瘤、炎癥、心カ衰竭、糖尿病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，超過60種的蛋白激酶抑制劑正在臨床試驗之中，其中許多已開發(fā)上市,如諾華(Novartis)的 Gleevec",阿利斯康(AstraZeneca)的 Iressa",施貴寶的 Tarceva" (Genentech andOSIPharmaceuticals),拜爾的 Nexavar" (Bayer),輝瑞的 Sutent" (Pfzer) , Sprycel"(Bristol-Myers Squibb),和葛蘭素史克的 Tykerb" (GlaxoSmithKline),制藥公司清楚地認(rèn)識到蛋白激酶抑制劑的重要性，已成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。肝癌嚴(yán)重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。肝癌的治療在過去20年來已取得很大的進(jìn)展，外科手術(shù)切除及肝臟移植屬于“根治性”治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物學(xué)概念的改變，腫瘤局部非手術(shù)治療在肝癌治療中的地位日益提高。經(jīng)導(dǎo)管動脈內(nèi)化療栓塞(TACE)已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。該方法可使90%以上的肝癌患者受益，但總體療效有待提高。此外，經(jīng)皮肝穿刺瘤內(nèi)無水こ醇治療(PEI)也是較常用的局部化療方法，對癌直徑< 3cm的肝癌及門靜脈癌栓的治療有一定價值。但目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對性差，療效不佳，因此，迫切需要尋找新的作用靶點(diǎn)，研究和開發(fā)肝癌特異的新藥物，提高化療的特異性和有效性。近幾年來隨著對肝癌基礎(chǔ)研究的深入，生物治療在肝癌的綜合治療中取得了較大進(jìn)展，成了繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第四大療法，如免疫治療、基因治療，包括抗血管生成、自殺基因治療、腫瘤疫苗治療、siRNA技術(shù)等。但許多生物治療的臨床療效仍不十分滿意，且絕大多數(shù)還處在實驗研究階段，相關(guān)的關(guān)鍵理論和實驗技術(shù)仍需進(jìn)ー步研究和發(fā)展。⑶K17基因編碼的蛋白屬于ser/thr蛋白激酶家族中cdc2/cdkx亞家族成員。其大鼠同源蛋白被認(rèn)為在神經(jīng)元細(xì)胞的終末分化中起作用，因此，有進(jìn)ー步研究的價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之ー是提供ー種⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之ニ是提供ー種CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供ー對特異擴(kuò)增CDK17基因的引物，該引物可用于制備用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供⑶K17基因的s i RNAs，該s i RNAs可用于制備治療肝癌的藥物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供了ー種⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、激酶活性檢測、原位雜交、或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括ー對特異擴(kuò)增⑶K17基因的引物。所述用實時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增⑶K17基因的引物。所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與⑶K17蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。所述用激酶活性檢測的產(chǎn)品包括特異性檢測CDK17激酶活性的底物及反應(yīng)體
系O所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與CDK17基因的核酸序列雜交的探針。所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括:與CDK17基因的核酸序列雜交的探針。在本發(fā)明的一方面，提供了用于制備用RT-PCR診斷肝癌產(chǎn)品的ー對特異擴(kuò)增CDK17基因的引物,所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO :1所不的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補(bǔ)序列。另外，本發(fā)明還提供了ー種CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。所述治療肝癌的藥物及方式包括通過RNA干擾抑制⑶K17基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體，或能夠抑制CDK17蛋白激酶活性的化合物、多妝、單克隆抗體。其中，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾特異性抑制⑶K17基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態(tài)、不同遞送方式。所述治療肝癌的藥物包括攜帯特異性針對⑶K17基因干擾其表達(dá)的DNA載體、病
毒載體。在本發(fā)明的另一方面，提供用于制備治療肝癌藥物的⑶K17基因的三對siRNAs，分別為 CDK17-sil、CDK17-si2 和 CDK17-si3。其中，CDK17_sil 的正義鏈具有如 SEQ ID NO:
5所示序列，⑶K17-sil的反義鏈具有如SEQ ID NO :6所示序列。⑶K17_si2的正義鏈具有如SEQ IDNO 7所示序列，CDK17-si2的反義鏈具有如SEQ ID NO 8所示序列。CDK17_si3的正義鏈具有如SEQ ID NO :9所示序列，CDK17-si3的反義鏈具有如SEQ ID N0:10所示序列。本發(fā)明治療肝癌的藥物施用方式可以是ロ服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。
本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。針齊U、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。本發(fā)明中，為了實現(xiàn)本發(fā)明中CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用，即⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為制備肝癌治療藥物的靶點(diǎn)，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)(I)化學(xué)合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對CDK17基因序列，利用脂質(zhì)體包裹遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)，干擾⑶K17基因的表達(dá)，CCK-8法測量肝癌細(xì)胞Huh-7、H印3B、MHCC-97H、MHCC-97L生長活性，本發(fā)明中實驗結(jié)果證明特異性針對⑶K17基因的小核糖核酸分子能夠抑制肝癌細(xì)胞體外的生長，說明CDK17基因可用作制備肝癌治療藥物的靶基因；(2)利用各種載體,包括DAN載體、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體來干擾CDK17基因的表 達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干擾CDK17基因的效果，從而現(xiàn)實抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)増殖的目的；(3)獲得能夠特異性抑制CDK17基因激酶活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制CDK17激酶活性的目的，從而從而現(xiàn)實抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)増殖的目的；(4)獲得能夠特異性抑制CDK17基因激酶活性的化合物，達(dá)到抑制CDK17激酶活性的目的，從而現(xiàn)實抑制肝癌細(xì)胞増殖的目的。本發(fā)明中用于特異性干擾CDK17基因的小核糖核酸序列設(shè)計原則如下(I)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA” ニ連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)(untranslatedregions, UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(人，或者小鼠，大鼠等等)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常ー個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列體外評估干擾⑶K17基因表達(dá)。本發(fā)明首次公開了 CDK17激酶基因的應(yīng)用，用于制備肝癌診斷的產(chǎn)品和肝癌治療的藥物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CDK17基因序列特異性siRNA干擾可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長，因此CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為診斷肝癌的標(biāo)志物和用于肝癌治療的藥物靶點(diǎn)，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，并提供了新的肝癌治療的基因靶點(diǎn)?？傊景l(fā)明CDK17基因為防治肝癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。


下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)的說明圖I是RNAi篩選技術(shù)體系示意圖；圖2是激酶siRNAs庫對四株肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC_97L生長活性影響分布圖；圖3是四株肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L中5 %可信區(qū)間(Confidenceinterval,Cl)和 10%分析區(qū)間(Analysis interval,Al)的確定，分別得到抑制、促進(jìn)細(xì)胞生長的siRNAs及對應(yīng)的激酶基因圖；圖4是四株肝癌細(xì)胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L全激酶組范圍內(nèi)RNAi對細(xì)胞活性影響的統(tǒng)計圖，圖中的1、2、3、4代表相應(yīng)的細(xì)胞株數(shù)目；圖5是RNAi篩選體系鑒定干擾⑶K17基因能夠抑制肝癌細(xì)胞H印3B、MHCC-97H、MHCC-97L的生長的柱狀圖。
具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊· (NewYork ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I RT-PCR實驗檢測⑶K17基因在肝癌組織中的表達(dá)情況逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實驗檢查⑶K17基因再肝癌組織中的表達(dá)情況。RT-PCR 是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription ；RT)反應(yīng)和 PCR(Polymerase ChainReaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了ー種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及SI核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技木，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo (dT)或基因特異性的引物起始。RT-PCR可以一歩法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每ー步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。I.組織分離實驗用組織來源于原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟ー經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(_80°C )保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。2.總核糖核酸(RNA)的抽提試劑盒抽提總核糖核酸(RNA)采用TRIZOL(Invitrogen),該試劑是基于酸性酹ー步抽提法生產(chǎn)的。TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。用于抽提總核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均進(jìn)行核糖核酸酶滅活處理，以保證實驗中無核糖核酸酶的環(huán)境。3.核糖核酸(RNA)抽提步驟 RNA提取的一般步驟是破碎組織一分離RNA —沉淀RNA —洗滌RNA —融解RNA —保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分離RNA—半用酚、氯仿等有機(jī)溶剤，加入少量異戊醇，經(jīng)過此步，離心，RNA—般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA—般用こ醇、3M NaAc (pH-5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%こ醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干こ醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存ー個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA :加入NaAc 至 O. 3M, 12，OOOXg 離心 5 分鐘。4、cDNA 的合成(I)冰浴離心管里面加入模板RNA 4yL(lyg/yL)，隨機(jī)引物2yL(20pmol/μ L),去離子水5 μ L,混勻，離心3-5秒；
(2)70°C水浴5分鐘，冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對);(3)加入5 X M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈緩沖液4 μ L (200U/ μ I), RNase抑制劑
Iμ L (Ribonuclease Inhibitor, 40U/ μ I，TaKaRa)，dNTP 2 μ L (2. 5mM, TaKaRa)(這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管)，混勻；(4) 37°C水浴5分鐘，加入I μ L M-MLV RT反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I)，混勻；(5)37°C水浴I小時(此步是反轉(zhuǎn)錄過程)；(6) 700C，10分鐘結(jié)束反應(yīng)(此處是滅活酶活性，避免對后續(xù)實驗產(chǎn)生干擾)，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一歩PCR實驗，余下的-70°C保存。5、RT-PCR的弓丨物設(shè)計及擴(kuò)增理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的単一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。設(shè)計理想的引物都有以下共同的特點(diǎn)典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。設(shè)計5’端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。避免引物對3’末端存在互補(bǔ)序列，這會形成引物ニ聚體，抑制擴(kuò)增。避免3’末端富含GC。設(shè)計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。避免3’末端的錯誤配對。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部ニ級結(jié)構(gòu)的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。因此，本實施例中設(shè)計的引物具體如下CDK17-F:5’ -CTGAGACCCGGACTTGCAT-3，(SEQ ID NO 1)CDK17-R:5’ -CCTATCAATTGAATGTGGCTTG-3’ (SEQ ID NO 2)β -actin(F) :5，-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，(SEQ ID NO :3)β -actin(R) :5，-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO :4)以β-actin作為內(nèi)對照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β -actin(R) >CDK17 (F)、CDK17 (R)、10XPCR buffer、Mgcl2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq ) cDNA 模板分別為O. 2，O. 2，O. 4，O. 4，I. O，I. O，O. 2，O. I和5 μ LcDNA模板，最后補(bǔ)充ddH20使反應(yīng)體系為10 μ L0PCR的反應(yīng)條件如下94 °C，5分鐘預(yù)變性；94 °C，30秒變性；55 °C，30秒退火；720C，30秒延伸；35個循環(huán)，電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
實施例2原位雜交用CDK17基因探針，與腫瘤切片進(jìn)行原位雜交，陽性雜交信號越強(qiáng)，患肝癌的可能性越高。實驗步驟為將肝臟腫瘤組織取材后OCT包埋、液氮速凍，恒冷冰凍切片，該冰凍切片進(jìn)ー步用于原位雜交。實施步驟如下(I)冰凍切片與雜交前預(yù)處理I).將樣品從_80°C取出，用OCT包埋，在-23°C (切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10 μ m厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180°C干烤6小吋)，保存于-70°C冰柜備用。2).冰凍切片經(jīng)室溫干燥IOmin后，在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin。3).活躍的 DEPC-PBS (未高壓的 O. I % DEPC-I X PBS 溶液)洗 2 次，每次 5min。4).在O. 2M的鹽酸作用中作用IOmin后，重復(fù)步驟4)。5).在切片上滴加蛋白酶K(0. 11^/1111)，37で孵育15min，重復(fù)步驟4)。6).經(jīng)O. IM TEA (三こ醇胺)作用5min后，再在新配制的O. 25% ΑΑ/0. IM TEA (こ酸酐/三こ醇胺，pH8. O)中こ酰化IOmin (在大多數(shù)實驗中，步驟4，5，6省略)。7). 5XSSC 中平衡 15min。(2)雜交I).在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μ L/玻片)，置于放有濕盒液(50%甲酰胺 ν/ν;0. 3Μ NaCl ；lmM EDTA ;IOmM Tris_Cl，pH8. O)的濕盒中，55 58°C下的烘箱中預(yù)雜交2h。2).甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度l-2ng/l·! L)經(jīng)70°C變性10分鐘，置冰上lmin，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60 μ L/玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48 58°C下雜交18-30h。(3)雜交后處理I).取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52°C預(yù)熱的5XSSC洗30mino2).在無 DNA 的 RNA 酶 A (20 μ g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min。3).分別依次用 52°C預(yù)熱的 2 X SSC, IXSSC O. I X SSC 洗 2 次，每次 30min。(4)雜交信號檢測I).在緩沖液 A(0. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15Μ NaCl)中平衡 5min。2).在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(I 500 I : 2000稀釋于含O. 5%阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。3).用緩沖液A洗2次，毎次15min。4).在緩沖液 B (O. IM Tris-HCl ；0. IM NaCl ；0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5)中平衡 5min。5).硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴_4_氯_3_吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4. 5 μ L NBT和3. 5 μ L BCIP0在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過夜。6).充分顯色后，用 EDTA(lmM EDTA, pH8. O)洗 15min 終止反應(yīng)。7).在95%こ醇中洗Ih以除去非特異的背景。8).用蒸餾水洗15min除去可能存在的結(jié)晶體。9).脫水、透明，用中性樹膠封片。10).充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。
實施例3全激酶組范圍內(nèi)RNAi篩選肝癌細(xì)胞生長必需激酶基因RNAi作為ー種簡單快速、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、效果可預(yù)測的技術(shù)，具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，它比反義核酸技術(shù)優(yōu)越，比基因敲除簡單，具有很好的應(yīng)用前景。具體可用于以下幾個方面基因功能分析；研究信號傳導(dǎo)通路的新途徑；新藥物的研究和開發(fā)；基因治療。RNAi只抑制致病基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能減少非特異作用引起的副作用。腫瘤發(fā)生是多基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的単一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這ー特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射ー種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因同時沉默的效應(yīng)，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時沉默。針對人類基因組上所有激酶及激酶相關(guān)基因的siRNAs庫通過商業(yè)化途徑獲得(Stealth RNAi Human Kinase Collection, Invitrogen, Catalog no. 12938-200)。姆套Stealth RNAi Collection 由若干 96 孔板組成,2nmoles 的 Stealth RNAi 溶解在 100μ1的 IX RNA 退火 / 稀釋溶液中(IOmM Tris-HCl，pH 8. O ；20mM NaCl ；lmM EDTA, pH 8. 0)，終濃度為20 μ MoCCK-8測定細(xì)胞活性CCK-8試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞増殖和毒性分析。其基本原理為該試劑中含WST-8 [其化學(xué)名稱為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-ニ磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸ニ甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲染料(Formazan dye)。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顔色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。分光光度計讀數(shù)，產(chǎn)生原始細(xì)胞活性數(shù)據(jù)，實驗流程如圖I所示。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化，數(shù)據(jù)校正、Z值評估等步驟，得到SiRNA庫對肝癌細(xì)胞生長影響的數(shù)據(jù)(圖2-4)，用于進(jìn)一歩分析。實施例4 RNAi干擾效應(yīng)將構(gòu)建好的質(zhì)粒pSUPER質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后48小時后抽提細(xì)胞株RNA，定量PCR鑒定RNA干擾的效果，確認(rèn)質(zhì)粒能夠發(fā)揮RNAi效應(yīng)后，與pcDNA3. I (質(zhì)粒質(zhì)量比5 : I)共轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞重新接種于IOcm大盤中培養(yǎng)，同時培養(yǎng)液中加入新霉素G418進(jìn)行篩選培養(yǎng)4 6周，去除培養(yǎng)液，IXPBS漂洗兩遍后結(jié)晶紫染色后拍照計數(shù)。實施例5免疫檢測I、抗原蛋白獲得(I)利用基因工程表達(dá)可從Genebank數(shù)據(jù)庫中獲得人⑶K17基因的cDNA序列，通過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)⑶K17蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白。2、抗體制備可采用以下幾種方法制備抗體(I)細(xì)胞融合法用上述制備的⑶K17蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髄瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。(2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。(3)利用純化的蛋白免疫動物，制備多抗血清。3、檢測 (I)用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行肝癌的病理檢測，陽性信號為肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應(yīng)為肝癌可疑病人。(3)將⑶K17抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。實施例6⑶K17基因的小干擾核糖核酸(SiRNA)體外化學(xué)合成小干擾核糖核酸(SiRNA)具有快速、簡單和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在抗腫瘤治療等方面有廣泛的應(yīng)用前景。針對CDK17基因mRNA設(shè)計合成三對siRNAs對應(yīng)靶序列，該3對siRNA序列分別如下CDK17-sil 正義鏈CCUCCAAC⑶CUCACAGUAUGCAUU(SEQ ID NO 5)；CDK17-sil 反義鏈AAUGCAUACUGUGAGACGUUGGAGG (SEQ ID NO 6)；CDK17-si2 正義鏈CCAAGAAUACAUGCUUUACCAGAAA(SEQ ID NO :7)；CDK17-si2 反義鏈UUUCUGGUAAAGCAUGUAUUCUUGG(SEQ ID NO :8)；CDK17-si3 正義鏈GGAAGUCAGACUAUUGAUGAAUCAU(SEQ ID NO :9)；CDK17-si3 反義鏈AUGAUUCAUCAAUAGUCUGACUUCC(SEQ ID NO :10)；另外設(shè)置無關(guān)序列作為陰性對照siRNA，正義鏈，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO :11)，反義鏈，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO :12)在96孔板中每孔接種3 X IO3個Huh_7，H印3B，MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞(無血清培養(yǎng)液)(均源自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，待細(xì)胞密度達(dá)到40 %左右吋，利用脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染試劑分別將上述3種siRNA按終濃度50nmol/L轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh_7，H印3B，MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞中，4h后換成含10%胎牛血清的DMEM。以24h為I個檢測單位培養(yǎng)7d，每天檢測I次該細(xì)胞密度。每孔待測細(xì)胞液中加10 μ L CCK-8，37°C孵育Ih0利用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測其吸光度以代表細(xì)胞存活能力，繪制生長曲線。實驗結(jié)果，如圖5所示，表明特異性干擾CDK17表達(dá)的小干擾核糖核酸(siRNA)能夠抑制肝癌細(xì)胞系MHCC-97H的生長，肝癌細(xì)胞的存活率明顯低于對照組的細(xì)胞，說明人⑶K17基因的表達(dá)下調(diào)能在一定程度上抑制肝癌細(xì)胞生長。
權(quán)利要求
1.ー種⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于所述⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、激酶活性檢測、原位雜交、或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增CDK17基因的引物。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用實時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括ー對特異擴(kuò)增⑶K17基因的引物。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與⑶K17蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用激酶活性檢測的產(chǎn)品包括特異性檢測CDK17激酶活性的底物及反應(yīng)體系。
7.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與CDK17基因的核酸序列雜交的探針。
8.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與⑶K17基因的核酸序列雜交的探針。
9.ー種⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于所述⑶K17基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在干所述治療肝癌的藥物及方式包括通過RNA干擾抑制CDK17基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸、DNA載體、腺病毒或腺相關(guān)病毒載體，能夠抑制CDK17蛋白激酶活性的化合物、多肽、單克隆抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾特異性抑制CDK17基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸及其不同修飾狀態(tài)、不同遞送方式。
12.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療肝癌的藥物包括攜帶特異性針對⑶K17基因干擾其表達(dá)的DNA載體、病毒載體。
13.用于制備用RT-PCR診斷肝癌產(chǎn)品的一對特異擴(kuò)增⑶K17基因的引物，其特征在于所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO :1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述引物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互補(bǔ)序列。
14.用于制備治療肝癌藥物的ー對⑶K17基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 5所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 6所示序列。
15.用于制備治療肝癌藥物的ー對⑶K17基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 7所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 8所示序列。
16.用于制備治療肝癌藥物的ー對⑶K17基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正義鏈具有如SEQ ID NO 9所示序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO 10所示序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，用于制備肝癌診斷及治療的產(chǎn)品。本發(fā)明的CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物，可作為診斷肝癌的特異性標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速；本發(fā)明的CDK17基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為制備治療肝癌藥物的靶基因，提供新的肝癌治療途徑。
文檔編號C12N15/113GK102690879SQ20111007117
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者王群, 鄧慶, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心