專利名稱：檢測堿性紅g的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種添加劑檢測技術(shù)，具體來說，特別是涉及一種檢測堿性紅G的試劑盒。
背景技術(shù)：
堿性紅G，又名羅丹明6G或玫瑰紅6G，屬酞菁類著色劑，易溶于水和醇，色彩鮮艷，具有優(yōu)良的勻染性和滲染性，用作工業(yè)染色劑。堿性紅G為高毒類化學(xué)物質(zhì)，我國、美國、力口拿大、日本、澳大利亞等多國都明確禁止食品和化妝品中使用堿性紅G。因此，快速檢測堿性紅G在食品和化妝品中的含量是非常必要的。
發(fā)明內(nèi)容基于此，本實用新型在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低廉、操作簡便、靈敏性高的檢測堿性紅G試劑盒。其技術(shù)方案如下檢測堿性紅G的試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及每個微孔內(nèi)包被濃度為1-3 μ g/mL堿性紅G特異性抗原的酶標(biāo)板；所述試劑瓶包括裝有濃度為1-3 μ g/mL堿性紅G特異性抗體溶液的試劑瓶。下面對進一步技術(shù)方案進行說明在一些實施例中，所述試劑瓶還包括裝有辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗的試劑瓶、裝有堿性紅G標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑瓶、兩瓶裝有顯色劑的試劑瓶、裝有終止液的試劑瓶、裝有洗滌液的試劑瓶、裝有濃縮樣品稀釋液的試劑瓶、裝有封閉液的試劑瓶。在其中一個實施例中，該試劑盒還包括有用于檢測時密封酶標(biāo)板的封口膜。本實用新型的檢測堿性紅G的試劑盒檢測原理為將堿性紅G特異性抗原吸附于固相載體上，加入樣品或堿性紅G的標(biāo)準(zhǔn)溶液及堿性紅G特異性抗體工作液，待測樣品中堿性紅G和固相載體上包被的堿性紅G特異性抗原競爭結(jié)合堿性紅G特異性抗體，孵育后，加入酶標(biāo)二抗進行酶活性的放大作用，孵育，顯色后終止，測定樣品的吸光度，該值與樣品中堿性紅G的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出堿性紅G濃度范圍。下面對前述技術(shù)方案的優(yōu)點進行說明本實用新型的檢測堿性紅G的酶聯(lián)免疫試劑盒，利用競爭酶聯(lián)免疫測定法檢測堿性紅G，具有特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確且前處理簡單，對儀器設(shè)備要求低、檢測成本低的特點。同時，本試劑盒中的試劑以工作液形式提供，操作簡單、快捷，為使用者節(jié)省了時間并減少因步驟復(fù)雜造成的誤差。適合用于快速而準(zhǔn)確的檢測大批量樣品中的堿性紅G。

圖I是本實用新型實施例所述試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；[0013]圖2是下凹瓶位設(shè)置示意圖；圖3是本實用新型實施例中酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖。附圖標(biāo)記說明1.盒體；2.下凹瓶位；3.塑料框架；4.酶標(biāo)板；5.微孔。
具體實施方式
下面對本實用新型的實施例進行詳細(xì)說明，但不對本實用新型的內(nèi)容造成任何限制。實施例I本實施例所述的檢測堿性紅G試劑盒的主要組成成份如下如圖I-圖3所示，所述檢測堿性紅G試劑盒的盒體I內(nèi)具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14個下凹瓶位)，下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶；位于塑料框架3中的酶標(biāo)板4，酶標(biāo)板4中的微孔5內(nèi)包被有堿性紅G特異性抗原。具體組成如下I)堿性紅G特異性抗原工作液；通過以下方法制得將O. 88g,即2. Ommol堿性紅G分散于50mL的O. 01mol/L鹽酸中，55°C攪拌2h，堿性紅G的酯基被水解形成羧基；將O. 82g，即2. Ommol的上述堿性紅G羧酸衍生物、I. 2g,即5mmol N_(3_胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2. Ig,即4mmol六氟磷酸苯并三唑-I-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL DMF中，65°C攪拌lh，反應(yīng)產(chǎn)物進行柱層析純化得到中間產(chǎn)物；隨后將中間產(chǎn)物加入30倍的三氟乙酸(TFA)中，回流攪拌lh，脫去叔丁氧?；谋Ｗo，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的堿性紅G的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺(NHS)和碳二亞胺(EDC)混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌lh，偶聯(lián)制備得到堿性紅G特異性抗原，并用濃縮樣品稀釋液稀釋至濃度為2 μ g/mL。2)堿性紅G特異性抗體工作液；通過以下方法制得將合成得到的堿性紅G特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫。首次免疫使用完全弗氏佐劑與堿性紅G特異性抗原的O. 01M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液乳化，抗原濃度為O. 35mg/mL，劑量為IlOy g/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與堿性紅G特異性抗原的O. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液乳化，劑量同初次免疫。初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫5-10次，當(dāng)抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐劑直接用堿性紅G特異性抗原的O. 01M, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液腹腔注射，劑量同初次免疫。尾部取血檢測血清效價。取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細(xì)胞按6:1比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合。采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。單克隆抗體的制備與純化Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為O. 5mL/只。將細(xì)胞濃度為I. 4萬/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為O. 5mL/只。接種雜交瘤細(xì)胞疒10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次。存于4°C冰箱保存。經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化。具體方法每I份腹水中加入3份乙酸鈉緩沖液(濃度O. 05mol/L, ρΗ4· 0)，用濃度O. lmmol/L NaOH調(diào)整pH值至4. 5，在4°C下攪拌30min,期間緩慢加入辛酸,按稀釋前腹水體積計算40 μ L/mL ;在4°C靜止3h,離心(10140r/min, 30min)，取上清液，保持在4°C環(huán)境中，30min內(nèi)加入(NH4)2S04使其終濃度為O. 277g/mL,靜止lh,4°C離心(10140r/min, 30min),棄上清液,得到單克隆抗體沉淀，并用濃縮樣品稀釋液稀釋至濃度為2 μ g/mL。3)辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗；由商業(yè)公司提供的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗；4)堿性紅G標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶；濃度分別為IX IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、0. 5 μ g/L ；5)酶標(biāo)板；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，由商業(yè)公司提供；6)底物顯色劑；由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為濃度為30%的過氧化氫水溶液，顯色劑B為濃度為10mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺DMSO溶液；7)洗滌液；為含有重量比為O. 05%-0. 5%吐溫-20的O. OlM, pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液；8)終止液；為2mol/L的硫酸溶液；9)封閉液；為含5%脫脂奶粉的O. OlM, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；10)濃縮樣品稀釋液；為O. OlM, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(即磷酸根濃度為O. 01M/L, pH7. 4的磷酸鹽緩沖液)；11)自封袋；由商業(yè)公司提供。實施例2間接競爭ELISA方法的建立。采用間接競爭ELISA法檢測堿性紅G單克隆抗體的競爭抑制率，方法如下I)用2 μ g/mL的堿性紅G特異性抗原包被96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，放置于4°C冰箱包被過夜，用300 μ L/孔封閉液(即5%脫脂奶粉)封閉后用洗滌液洗滌，并拍干；2)加入堿性紅G標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度分別為:1 X IO5 μ g/L、I X IO4 μ g/L、I X IO3 μ g/L、I X IO2 μ g/L、IXlO1U g/L、0. 5 μ g/L)或樣品溶液50 μ L，再加入濃度為2 μ g/mL的堿性紅G特異性抗體工作液50 μ L，混合均勻，37°C溫育Ih ；3)洗滌拍干后，加入用稀釋液按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗工作液，100 μ L/孔，37°C溫育Ih ；4)洗漆拍干，每孔加入50 μ L顯色液B液、10 μ L顯色液A液顯色15min,加入濃度為2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，終止反應(yīng)，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(優(yōu)選用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定OD值。以抑制率1%為縱坐標(biāo)，以堿性紅G濃度的對數(shù)Ig [堿性紅G (ng/mL)]為橫坐標(biāo)，繪制堿性紅G競爭抑制曲線。將樣品的抑制率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中堿性紅G的實際含量。抑制率計算公式如下
權(quán)利要求1.一種檢測堿性紅G的試劑盒，其特征在于，包括盒體，盒體內(nèi)主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及每個微孔內(nèi)包被濃度為1-3 μ g/mL堿性紅G特異性抗原的酶標(biāo)板；所述試劑瓶包括裝有濃度為1-3 μ g/mL堿性紅G特異性抗體溶液的試劑瓶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測堿性紅G的試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶還包括裝有辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗的試劑瓶、裝有堿性紅G標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑瓶、兩瓶裝有顯色劑的試劑瓶、裝有終止液的試劑瓶、裝有洗滌液的試劑瓶、裝有濃縮樣品稀釋液的試劑瓶、裝有封閉液的試劑瓶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測堿性紅G的試劑盒，其特征在于，還包括有用于檢測時密封酶標(biāo)板的封口膜。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測堿性紅G的試劑盒，屬于添加劑檢測技術(shù)領(lǐng)域。包括盒體，盒體內(nèi)主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及每個微孔內(nèi)包被濃度為1-3μg/mL堿性紅G特異性抗原的酶標(biāo)板；所述試劑瓶包括裝有濃度為1-3μg/mL堿性紅G特異性抗體溶液的試劑瓶。用該試劑盒對堿性紅G進行檢測，具有成本低廉、操作簡便、靈敏性高的優(yōu)點，適合用于快速而準(zhǔn)確的檢測大批量樣品中的堿性紅G中。
文檔編號G01N33/543GK202757935SQ20122039257
公開日2013年2月27日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者郭新東, 羅海英, 冼燕萍, 蔡瑋紅, 吳玉鑾, 柯振華, 陳意光, 羅東輝 申請人:廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院