本發(fā)明涉及用基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫佐劑，尤其涉及一種免疫馬用的免疫佐劑。

背景技術(shù)：

抗破傷風(fēng)免疫球蛋白是治療破傷風(fēng)感染時(shí)能用的唯一有特效的解毒藥物?？蛊苽L(fēng)免疫球蛋白通常是用大型家畜免疫破傷風(fēng)類(lèi)毒素，待抗破傷風(fēng)免疫抗體達(dá)到一定滴度時(shí)采取血漿提取抗體成份制備而成。當(dāng)這些抗體注射入破傷風(fēng)感染病人體內(nèi)時(shí)，抗毒素可以很快中和相應(yīng)的破傷風(fēng)毒素。在破傷風(fēng)感染治療中，抗破傷風(fēng)免疫球蛋白發(fā)揮了無(wú)可替代的作用?？蛊苽L(fēng)免疫球蛋白是治療破傷風(fēng)毒素中毒的最快速、最有效的藥物。

抗蛇毒血清是治療毒蛇咬傷時(shí)能用的唯一有特效的解毒藥物。抗蛇毒血清通常是用大型家畜免疫相關(guān)的蛇毒，待蛇毒抗體達(dá)到一定滴度時(shí)采取血漿提取抗體成份制備而成。當(dāng)這些抗蛇毒血清注射入被毒蛇咬傷病人體內(nèi)時(shí)，抗血清可以很快中和相應(yīng)的蛇毒。在蛇傷治療中，馬抗蛇毒血清發(fā)揮了無(wú)可替代的作用。馬抗蛇毒血清是治療蛇傷的最快速、最有效的藥物。在我國(guó)每年有10萬(wàn)余人被毒蛇咬傷，臨床上使用的抗蛇毒血清高達(dá)8萬(wàn)人份。

制備這些免疫球蛋白和抗血清每年需要上千萬(wàn)毫升高抗體滴度的馬血漿，因此每年馬匹的保有量達(dá)到數(shù)百匹。實(shí)際生產(chǎn)中，經(jīng)常碰到免疫動(dòng)物對(duì)抗原反應(yīng)不一，有的馬匹能產(chǎn)生高滴度的抗體；有些馬匹對(duì)抗原刺激反應(yīng)很弱，產(chǎn)生的中和抗體滴度很低甚至沒(méi)有抗體，這部分馬匹占整個(gè)免疫馬群的30%左右。即使馬匹能產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，隨著采血漿的次數(shù)增加，馬匹體內(nèi)的抗體滴度也會(huì)下降以致從這類(lèi)馬中采取的血漿無(wú)法用于抗毒素、抗血清的生產(chǎn)。這部分馬匹無(wú)法用于生產(chǎn)，對(duì)產(chǎn)能影響很大。

免疫佐劑也稱(chēng)佐劑或抗原佐劑，是一類(lèi)單獨(dú)使用時(shí)一般無(wú)免疫原性，但是與抗原物質(zhì)協(xié)同使用時(shí)能增強(qiáng)抗原物質(zhì)免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，或改變機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)類(lèi)型的物質(zhì)。

細(xì)胞因子(cytokine)是一類(lèi)機(jī)體在免疫反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。機(jī)體的免疫系統(tǒng)在受到抗原和各種免疫佐劑的刺激后，產(chǎn)生的應(yīng)答性物質(zhì)，這類(lèi)物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞因子。天然的細(xì)胞因子為哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，多數(shù)為分子量較小的單體（1x10⁴-2.5x10⁴），也有天然狀態(tài)為二體或三體的。免疫反應(yīng)通常是由多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)的。細(xì)胞因子對(duì)抗原遞呈細(xì)胞(apc)的作用有增加apc的數(shù)量和活化apc的功能兩個(gè)方面。

interferon-alpha-1（干擾素α1）是一種增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（nk細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和t淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。interferon-alpha-1可以明顯提高機(jī)體的體液免疫機(jī)能。我們?cè)谑褂民Rinterferon-alpha-1預(yù)防馬病毒性傳染病時(shí)發(fā)現(xiàn)一群對(duì)抗原免疫反應(yīng)差的、反復(fù)多次抗原免疫后血清抗體滴度低的馬匹，在注射interferon-alpha-1后抗體效價(jià)明顯提高，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示interferon-alpha-1可以作為一種免疫佐劑以提高馬匹抗血清的產(chǎn)量和質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種免疫馬用的免疫佐劑。該免疫佐劑設(shè)計(jì)巧妙，應(yīng)用方便，使用后可以較大幅度提高被免疫動(dòng)物的抗體水平，具有很大的實(shí)用價(jià)值。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種免疫馬用的免疫佐劑，含有馬interferon-alpha-1。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的馬interferon-alpha-1采用基因工程重組表達(dá)方法制得，即重組馬interferon-alpha-1。所述的重組馬interferon-alpha-1是根據(jù)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01710147935.6的說(shuō)明書(shū)中記載的方法制備，所述重組馬interferon-alpha-1的制備方法，包括如下步驟：

（1）將經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的編碼馬interferon-alpha-1的核苷酸序列構(gòu)建入酵母細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)載體中；

（2）轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后誘導(dǎo)表達(dá)；

（3）進(jìn)行純化，從而獲得所述重組馬interferon-alpha-1。

較佳地，步驟（1）中，所述核苷酸序列是如seqidno:2所示的序列；步驟（2）中，所述酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞（即pichiapastoris細(xì)胞），更佳地，所述畢赤酵母細(xì)胞（即pichiapastoris細(xì)胞）是gs115細(xì)胞。

所述酵母細(xì)胞表達(dá)載體是畢赤酵母表達(dá)載體，載體轉(zhuǎn)染入畢赤酵母細(xì)胞（pichiapastoris細(xì)胞）后與酵母染色體重組整合入酵母染色體中。

所述的酵母表達(dá)載體是適合于畢赤酵母細(xì)胞（pichiapastoris細(xì)胞）的表達(dá)載體。

較佳地，所述的酵母表達(dá)載體為pichiapastoris分泌型載體。更佳地，所述的酵母表達(dá)載體為pichiapastoris分泌型載體，其所用的啟動(dòng)子為aox1啟動(dòng)子，能表達(dá)interferon-alpha-1。

較佳地，所述誘導(dǎo)表達(dá)在培養(yǎng)液的od600達(dá)到20-400時(shí)啟動(dòng)。更佳地，所述od600為50-300。更進(jìn)一步地，所述od600為150-250。

較佳地，所述的表達(dá)載體是分泌型表達(dá)載體，更進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)表達(dá)通過(guò)甲醇進(jìn)行。

較佳地，所述純化采用離子交換層析將所述重組馬interferon-alpha-1以單體形式分離。

重組interferon-alpha-1純化后可以進(jìn)一步超濾濃縮然后添加保護(hù)劑和/或冷凍干燥保存。

制備的馬interferon-alpha-1用于配制免疫佐劑，免疫馬匹，從而提高馬匹對(duì)相應(yīng)抗原產(chǎn)生的抗體的效價(jià)。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述的重組馬interferon-alpha-1蛋白溶液的濃度在0.01毫克/毫升和50毫克/毫升之間；較佳地，在0.01毫克/毫升和10毫克/毫升之間；更佳地，在0.02毫克/毫升和3毫克/毫升之間。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述免疫佐劑的每毫升免疫劑量中含有馬interferon-alpha-1的量為1-100微克；較佳地，為10-80微克；更佳地，為20-30微克。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述馬interferon-alpha-1為水溶液注射液。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述免疫佐劑用量及使用方法具體如下：所述免疫佐劑每次注射的免疫劑量為1毫升，注射部位為馬的頸部或臀部，注射于皮下或肌肉內(nèi)；抗原每2周免疫注射一次，動(dòng)物注射抗原后的第一天開(kāi)始每天注射一次所述免疫佐劑，連續(xù)注射七天，然后間隔1周，開(kāi)始第二次抗原注射免疫，抗原注射的第一天開(kāi)始，每天注射一次馬interferon-alpha-1，連續(xù)注射七天，然后間隔1周，開(kāi)始第三次抗原注射免疫和馬interferon-alpha-1注射，這種序列的免疫程序依次循環(huán)。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，每毫升所述免疫佐劑含有1-100微克馬interferon-alpha-1、1毫克甘氨酸、0.8毫克氯化鈉、1.6毫克醋酸鈉。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述免疫佐劑的ph值為4.0-4.5。

本發(fā)明的有益效果在于：將具有高度生物學(xué)活性的重組馬interferon-alpha-1配制成一種免疫佐劑，這種佐劑用于免疫馬匹時(shí)可以大幅度提高動(dòng)物的抗體滴度，從而使抗血清產(chǎn)品質(zhì)量明顯提高，表現(xiàn)在抗血清的比活性高，雜蛋白減少，相應(yīng)的副作用也可以降低。應(yīng)用方便，使用后可以較大幅度提高被免疫動(dòng)物的抗體水平，具有很大的實(shí)用價(jià)值，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1中畢赤酵母重組表達(dá)和純化后的馬interferon-alpha-1在還原條件下的sds-page電泳結(jié)果示意圖，從左到右：泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下分別為97、66、45、31、20、14kd；泳道2為sp-sepharose離子交換層析獲得的馬interferon-alpha-1；泳道3為sp-sepharose離子交換層析獲得的馬interferon-alpha-1經(jīng)分排阻層析純化的馬interferon-alpha-1。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例11中免疫蝮蛇毒抗原并采血漿3年以上馬匹在免疫蝮蛇抗原的同時(shí)用不同量馬interferon-alpha-1注射動(dòng)物獲得的抗體滴度比較示意圖，未用interferon-alpha-1的免疫動(dòng)物，抗體的滴度較低；使用含5微克interferon-alpha-1，動(dòng)物的免疫反應(yīng)較前者高；使用含20-30微克interferon-alpha-1的動(dòng)物，免疫后抗體的滴度最佳。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特以重組馬interferon-alpha-1制劑用于馬蝮蛇毒素免疫為例，列舉以下具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。然而，具體實(shí)施例僅僅是用于舉例說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：重組馬interferon-alpha-1制備

根據(jù)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)“一種重組馬interferon-alpha-1的制備方法”(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01710147935.6)說(shuō)明書(shū)中記載的方法，用基因工程的方法，在畢赤酵母中分泌表達(dá)，獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)固液分離、離子交換層析、分子排阻層析、超過(guò)濾濃縮等方法制備而成，用此方法得到的重組馬interferon-alpha-1的純度大于95%，蛋白濃度在0.1-10毫克/毫升范圍，比活性等于或大于4x10⁶unit/mg。

具體制備步驟如下：

1、表達(dá)序列獲取和優(yōu)化

為了達(dá)到使馬interferon-alpha-1在酵母細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)這個(gè)目的，通過(guò)查文獻(xiàn)得到該完整基因的氨基酸序列（即seqidno:4所示的氨基酸序列）。根據(jù)這個(gè)氨基酸序列，確定編碼馬interferon-alpha-1的核苷酸序列（即seqidno:1所示的序列），經(jīng)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)了核苷酸序列（即seqidno:2所示的序列），將該核苷酸序列插入表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。然后使用相應(yīng)的誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)?？梢允褂卯叧嘟湍刚T導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

2、表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建和表達(dá)克隆篩選

在優(yōu)選實(shí)施方案中，含密碼子優(yōu)化的馬interferon-alpha-1的核苷酸序列（即seqidno:1所示的序列）在5’端加上x(chóng)hoi位點(diǎn)和aaaaga核苷酸序列，在3’端加入ecori位點(diǎn)。選用ppic9質(zhì)粒（invitrogen），用xhoi和ecori雙酶切使之線性化。將具有xhoi和ecori酶切獲得的馬interferon-alpha-1dna與xhoi和ecori線性化的ppic9質(zhì)粒（invitrogen）連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株dh5ɑ（invitrogen）獲得，名稱(chēng)定為ppic9-interferon-alpha-1?？衫斫猓景l(fā)明不限于馬interferon-alpha-1因子，也涉及其它動(dòng)物來(lái)源的（狗、羊、兔等）的interferon-alpha-1。

ppic9-interferon-alpha-1用sali酶切使之成線性，用苯酚：氯仿：異戊醇（phenol:chloroform:isoamylalcohol）(25:24:1)抽提后，上清加乙醇沉淀dna。沉淀的dna干燥去乙醇后加10微升te緩沖液。

表達(dá)宿主細(xì)胞采用pichiapastoris細(xì)胞株gs115。在長(zhǎng)有g(shù)s115的ypd（yeastextractpeptonedextrosemedium(1l)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基）平板上挑取單克隆細(xì)胞接種到含5毫升ypd培養(yǎng)基的50毫升conical（圓錐形）管中，在28-30℃，250-300rpm條件下培養(yǎng)過(guò)夜。取0.5毫升過(guò)夜的培養(yǎng)細(xì)胞接種到含500毫升ypd培養(yǎng)基的2升三角燒杯中，在28-30℃，250-300rpm條件下培養(yǎng)至od600=1.3-1.5。培養(yǎng)液1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于500毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于250毫升冰2-8℃水中，1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于溫度為2-8℃、20毫升1m山梨醇中，1500g、4℃離心5分鐘，棄上清。細(xì)胞重懸于溫度為2-8℃、1毫升1m山梨醇中，此時(shí)重懸液的體積為1.5毫升左右。10微克線性化ppic9-interferon-alpha-1加入到80微升重懸的gs115細(xì)胞中混勻后轉(zhuǎn)移到0.2cm的電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)杯在冰浴中放置5分鐘，在電轉(zhuǎn)儀上脈沖電擊細(xì)胞一次。電擊后立即加入1毫升冰凍1m山梨醇，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管中。取200微升涂布到rdb板（rdb培養(yǎng)板成分：13.4g/l酵母基本氮源；0.4mg/l生物素；20g/l葡萄糖；50mg/ll-谷氨酸；50mg/ll-甲硫氨酸；50mg/ll-賴(lài)氨酸；50mg/ll-亮氨酸；50mg/ll-異亮氨酸；20g/l瓊脂）上，rdb板置28-30℃培養(yǎng)5-7天。挑取克隆，同時(shí)接種在md培養(yǎng)板（md培養(yǎng)板成分：13.4g/l酵母基本氮源；0.4mg/l生物素；20g/l葡萄糖，20g/l瓊脂）和mm培養(yǎng)板（mm培養(yǎng)板成分：13.4g/l酵母基本氮源；0.4mg/l生物素；5ml/l甲醇；20g/l瓊脂）上，置28-30℃培養(yǎng)2天。兩天后比較同一克隆在md培養(yǎng)板和mm培養(yǎng)板上生長(zhǎng)狀況，在md和mm培養(yǎng)板上生長(zhǎng)正常的克隆為mut⁺,在md培養(yǎng)板上生長(zhǎng)正常，在mm培養(yǎng)板上生長(zhǎng)很慢或不生長(zhǎng)的克隆為mut^s。

挑取mut⁺克隆接種在含5毫升ypd培養(yǎng)基（ypd培養(yǎng)基成分：10g/l酵母提取物粉；20g/l蛋白胨；20g/l葡萄糖）的50毫升conical管中，置28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)2天。離心棄上清，添加含1%甲醇的yp培養(yǎng)基（yp培養(yǎng)基成分：10g/l酵母提取物粉；20g/l蛋白胨）5毫升，置28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)72小時(shí)，在培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)每管分別加甲醇25微升。72小時(shí)后取培養(yǎng)上清，用sds-page（sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳）進(jìn)行分析。sds-page參照sambrooketal.,molecularbiology:alaboratorymethod,1989上的方法進(jìn)行。成層膠4%，分離膠12.5%。培養(yǎng)上清50微升和等量sds-page上樣緩沖液混勻后取20微升上樣。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)r-250染色，分析結(jié)果。gs115細(xì)胞誘導(dǎo)后無(wú)19kd處蛋白條帶，而在無(wú)精氨酸培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的13克隆大部分在19kd處有蛋白條帶，有的克隆表達(dá)量高，有的克隆僅微量表達(dá)。表達(dá)陽(yáng)性的克隆，在19kd處可見(jiàn)一蛋白條帶。

3、干擾素純化

取50毫升sp-sepharoseff裝入2.6x10cm層析柱，凝膠先后用2體積1mnacl,2體積0.5nnaoh清洗后用ph4.0、50mm醋酸緩沖液平衡。

四個(gè)2000毫升三角燒瓶，每個(gè)含500毫升ypd培養(yǎng)基，均接種篩選到的最佳interferon-alpha-1表達(dá)克隆，28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)48小時(shí)，離心棄上清，在無(wú)菌條件下各加含0.5%（v/v）甲醇的yp培養(yǎng)基500毫升，28-30℃搖床200-250rpm生長(zhǎng)72小時(shí)，每24小時(shí)各添加2.5毫升甲醇。72小時(shí)后離心取上清，上清用20%醋酸調(diào)ph至4.0，上已經(jīng)平衡的sp-sepharoseff離子交換層析柱。上樣完畢，層析柱用ph4.0、50mm醋酸緩沖液洗滌至od280小于0.05，接著用ph4.0、50mm醋酸、0.5m氯化鈉緩沖液洗脫，收集洗脫獲得的蛋白峰，這個(gè)蛋白峰即為高純度重組馬interferon-alpha-1。馬interferon-alpha-1的氨基酸序列（帶有信號(hào)肽）如seqidno:3所示，重組表達(dá)馬interferon-alpha-1的氨基酸序列（無(wú)信號(hào)肽）如seqidno:4所示。

畢赤酵母重組表達(dá)和純化后的馬interferon-alpha-1在還原條件下的sds-page電泳結(jié)果如圖1所示，從左到右：泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下分別為97、66、45、31、20、14kd；泳道2為sp-sepharose離子交換層析獲得的馬interferon-alpha-1；泳道3為sp-sepharose離子交換層析獲得的馬interferon-alpha-1經(jīng)分排阻層析純化的馬interferon-alpha-1。

實(shí)施例2：5微克/ml濃度的馬interferon-alpha-1佐劑配制

于50毫升falcon試管內(nèi)先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化鈉、80毫克醋酸鈉，注射用水加至40毫升，加入250微克馬interferon-alpha-1，接著用2m醋酸調(diào)ph至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌過(guò)濾膜除菌過(guò)濾后置2-8°c保存，在1周內(nèi)使用完畢。

實(shí)施例3：10微克/ml濃度的馬interferon-alpha-1佐劑配制

于50毫升falcon試管內(nèi)先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化鈉、80毫克醋酸鈉，注射用水加至40毫升，加入500微克馬interferon-alpha-1，接著用2m醋酸調(diào)ph至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌過(guò)濾膜除菌過(guò)濾后置2-8°c保存，在1周內(nèi)使用完畢。

實(shí)施例4：20微克/ml濃度的馬interferon-alpha-1佐劑配制

于50毫升falcon試管內(nèi)先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化鈉、80毫克醋酸鈉，注射用水加至40毫升，加入1000微克馬interferon-alpha-1，接著用2m醋酸調(diào)ph至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌過(guò)濾膜除菌過(guò)濾后置2-8°c保存，在1周內(nèi)使用完畢。

實(shí)施例5：30微克/ml濃度的馬interferon-alpha-1佐劑配制

于50毫升falcon試管內(nèi)先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化鈉、80毫克醋酸鈉，注射用水加至40毫升，加入1500微克馬interferon-alpha-1，接著用2m醋酸調(diào)ph至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌過(guò)濾膜除菌過(guò)濾后置2-8°c保存，在1周內(nèi)使用完畢。

實(shí)施例6：40微克/ml濃度的馬interferon-alpha-1佐劑配制

于50毫升falcon試管內(nèi)先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化鈉、80毫克醋酸鈉，注射用水加至40毫升，加入2000微克馬interferon-alpha-1，接著用2m醋酸調(diào)ph至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌過(guò)濾膜除菌過(guò)濾后置2-8°c保存，在1周內(nèi)使用完畢。

實(shí)施例7：50微克/ml濃度的馬interferon-alpha-1佐劑配制

于50毫升falcon試管內(nèi)先后加入50毫克甘氨酸，40毫克氯化鈉、80毫克醋酸鈉，注射用水加至40毫升，加入2500微克馬interferon-alpha-1，接著用2m醋酸調(diào)ph至4.0-4.5后，注射用水加至50毫升，用0.22微米除菌過(guò)濾膜除菌過(guò)濾后置2-8°c保存，在1周內(nèi)使用完畢。

實(shí)施例8：干擾素活性測(cè)定

用rhifn-ɑ2b作對(duì)照（人干擾素生物學(xué)活性測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品），采用濾泡性口膜炎病毒（vsv）-人羊膜傳代細(xì)胞（wish）體系測(cè)定干擾素的抗病毒活性。系依據(jù)干擾素可以保護(hù)人羊膜細(xì)胞wish免受vsv破壞的作用，用結(jié)晶紫對(duì)存活的wish細(xì)胞染色，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定其吸光度，可得到干擾素對(duì)wish細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)曲線，以此測(cè)定干擾素生物學(xué)活性。

試劑:

1.細(xì)胞培養(yǎng)液：每升mem培養(yǎng)基加青霉素10⁵iu和鏈霉素10⁵iu，再加碳酸氫鈉2.1g，除菌過(guò)濾，4℃保存。

2.完全培養(yǎng)液：量取新生牛血清10ml加mem培養(yǎng)液90ml。4℃保存。

3.測(cè)定培養(yǎng)液：量取新生牛血清7ml加mem或rpmi1640培養(yǎng)液93ml,4℃保存。

4.攻毒培養(yǎng)液：量取新生牛血清3ml加mem培養(yǎng)液97ml,4℃保存。

5.消化液：取乙二胺四乙酸二鈉0.2g、氯化鈉8.0g、氯化鉀.2g、磷酸氫二鈉1.152g、磷酸二氫鉀0.2g加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。使用時(shí)加胰蛋白酶至0.25%（w/v）濃度。

6.染色液：取結(jié)晶紫50mg加無(wú)水乙醇20ml溶解后加水稀釋至100ml即得。

7.脫色液：取無(wú)水乙醇50ml、乙酸0.1ml加水稀釋至100ml。

8.pbs緩沖液：取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121℃15分鐘滅菌。

9.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：取人干擾素生物學(xué)活性測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，按說(shuō)明書(shū)復(fù)溶后用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至每1ml含1000iu。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2孔，在無(wú)菌條件下操作。

10.供試品溶液制備：將供試品按標(biāo)示量溶解后用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋成每1ml約含1000iu。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2個(gè)孔，在無(wú)菌條件下操作。

具體實(shí)驗(yàn)如下：

使wish細(xì)胞在含10%小牛血清的mem培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)。按1:3傳代，每周2次于完全培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。棄去培養(yǎng)液用pbs洗貼壁細(xì)胞2次后，消化和收集細(xì)胞，用含10%小牛血清的mem培養(yǎng)基配制成每1ml含2.5×10⁵-3.5×10⁵個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)6小時(shí)。棄去孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，將配制完成的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液移入接種wish細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24小時(shí)。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液。分別向每孔加100μl將配制好的水泡性口炎病毒（vsv）（-70℃保存）攻毒培養(yǎng)液。于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)24小時(shí)，鏡檢觀察細(xì)胞狀況后棄細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，每孔加入染色液50μl，室溫放置30分鐘后用流水小心沖去染色液，并吸干殘留水分，每孔加入脫色液100μl，室溫放置3-5分鐘?；靹蚝笥妹笜?biāo)儀以630nm為參比波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品中的半效稀釋倍數(shù)，然后按公式：待測(cè)樣品效價(jià)=標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)x待測(cè)樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)樣品預(yù)稀釋倍數(shù)x待測(cè)樣品半效稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)樣品半效稀釋倍數(shù)。經(jīng)測(cè)定，1毫克馬interferon-alpha-1活性為3.5x10⁸，其活性與人α2b干擾素相似。

實(shí)施例9：蝮蛇毒素滅活

蝮蛇毒凍干粉加入pbs，使之溶解配成20毫克/毫升濃度，濾紙過(guò)濾除去不溶性顆粒后用0.22微米孔徑的除菌過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。除菌后的蝮蛇毒溶液邊攪拌邊滴加甲醛溶液，甲醛溶液加至最終甲醛濃度為0.2%，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笫覝胤胖?天，使蛇毒完全滅活。

實(shí)施例10：滅活蛇毒的ld50比較

ld50初步確定實(shí)驗(yàn)：

選擇體重18－20克小鼠進(jìn)行蛇毒毒力初步確定試驗(yàn)。用生理鹽水稀釋蛇毒至不同的濃度，每個(gè)濃度取0.5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小時(shí)觀測(cè)小鼠的成活狀況。根據(jù)預(yù)初試驗(yàn)的結(jié)果，初步推斷出蛇毒致死的劑量。

ld50試驗(yàn)：

選擇體重18－20克小鼠進(jìn)行蛇毒毒力試驗(yàn)，每6只分成一組，所需組數(shù)則根據(jù)試驗(yàn)需要而定。采用blliss簡(jiǎn)化幾率單位法測(cè)定蛇毒毒力，以半數(shù)致死量ld50表示。未經(jīng)滅活蛇毒、甲醛滅活蛇毒根據(jù)預(yù)初試驗(yàn)的結(jié)果把劑量調(diào)節(jié)至使用最高劑量時(shí)小鼠的死亡率接近100%，最小劑量時(shí)小鼠的死亡率接近0%，在最高劑量和最低劑量之間添加3－5個(gè)劑量組，各劑量組之間的比值衡定。注射蛇毒后觀察48小時(shí)，記錄小鼠的成活狀況。未經(jīng)處理的蝮蛇蛇毒的ld50為0.6mg蛇毒/kg小鼠體重；甲醛滅活蝮蛇蛇毒的ld50為196mg蛇毒/kg小鼠體重。

免疫用的滅活蛇毒濃度為5毫克/毫升，與等體積的羊毛脂石蠟油佐劑（2份石蠟油，1份羊毛脂混勻后121度高溫高壓滅菌后制成）充分混勻乳化后背部皮下2點(diǎn)注射。

實(shí)施例11：重組馬interferon-alpha-1促進(jìn)馬抗體效價(jià)試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選擇免疫蝮蛇毒、采血3年以上、血漿中和抗體效價(jià)低于100u/ml的馬匹24匹，分8組，每組各3匹馬。各組馬匹均每?jī)芍鼙巢科は伦⑸?毫克蝮蛇抗原；同時(shí)注射蝮蛇抗原后第一天開(kāi)始每天肌肉注射馬interferon-alpha-1一次，共七次；第一組作為對(duì)照，用生理鹽水代替馬interferon-alpha-1；第二、三、四、五、六、七、八組均注射馬interferon-alpha-1，使用的劑量分別為1、5、10、20、30、40、50微克/次。每次抗原免疫前4天，采血進(jìn)行抗血清中和活性試驗(yàn)。

如圖2所示，該實(shí)施例11的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第一組不用重組馬interferon-alpha-1的免疫馬匹，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒83ld50（±14）。第二組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射1微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒75ld50（±0）。第三組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射5微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒108ld50（±14）。第四組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射10微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒158ld50（±14）。第五組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射20微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒250ld50（±39）。第六組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射30微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒250ld50（±43）。第七組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射40微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒225ld50（±25）。第八組在每次抗原免疫后的前七天每天肌肉注射50微克重組馬interferon-alpha-1，經(jīng)5次免疫后獲得的抗血清混合后測(cè)得的每毫升血清可以中和蝮蛇毒225ld50（±43）。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明重組馬interferon-alpha-1可以提高動(dòng)物對(duì)抗原的免疫反應(yīng)，使得抗體的滴度增高。如圖2所示，在interferon-alpha-1和抗血清滴度的量效關(guān)系上，顯示：未用interferon-alpha-1的免疫動(dòng)物，抗體的滴度較低；使用含5微克interferon-alpha-1，動(dòng)物的免疫反應(yīng)較前者高；在5-50微克interferon-alpha-1時(shí)都能使動(dòng)物的抗體滴度提高，但是使用含20-30微克interferon-alpha-1的動(dòng)物，免疫后抗體的滴度最佳。

實(shí)施例12：重組馬interferon-alpha-1促進(jìn)馬抗體效價(jià)持續(xù)性試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選擇免疫蝮蛇毒、采血3年以上、血漿中和抗體效價(jià)低于100u/ml的馬匹5匹，每?jī)芍鼙巢科は伦⑸?毫克蝮蛇抗原，注射抗原后的前七天，每天肌肉注射30微克重組馬interferon-alpha-1，每隔一次抗原免疫前4天采血進(jìn)行抗血清中和活性試驗(yàn)，如血清中和活性大于125個(gè)ed50，則采血漿3000毫升，接著進(jìn)行下一輪免疫。免疫持續(xù)進(jìn)行52周。

該實(shí)施例12中，3匹馬免疫后血清效價(jià)與采血漿量見(jiàn)下表1：

表1

實(shí)施例12的結(jié)果表明應(yīng)用長(zhǎng)期馬interferon-alpha-1作為佐劑，能持續(xù)獲得高效價(jià)的抗血清，對(duì)抗血清的生產(chǎn)有明顯的增產(chǎn)效果。

實(shí)施例13：抗血清中和活性試驗(yàn)（ed50）

一、抗血清e(cuò)d50范圍初步測(cè)定試驗(yàn)：

抗血清的效價(jià)測(cè)定按國(guó)際通用的中和試驗(yàn)法進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，其方法是把抗原和特異性抗體作用一定時(shí)間后，再給動(dòng)物注射，借助動(dòng)物體的反應(yīng)情況來(lái)判定抗血清的效價(jià)。本發(fā)明所用的動(dòng)物試驗(yàn)方法是以動(dòng)物死亡為反應(yīng)指征，以小白鼠注射抗蛇毒血清與蛇毒混合液后，動(dòng)物的生存死亡情況，確定血清的效價(jià)。

為了確定抗血清的中和劑量范圍，5ld50的蝮蛇毒與不同濃度的抗血清混合成1毫升體積后在37℃水浴箱中放置1小時(shí)，取0.4毫升這種混合液體注射到小鼠的腹腔內(nèi)，每個(gè)濃度注射一只小鼠，觀測(cè)小鼠在48小時(shí)內(nèi)存活狀態(tài)。通過(guò)這種預(yù)初試驗(yàn)獲得小鼠100%存活和100%死亡所用的抗血清的濃度范圍。如樣品批號(hào)為610號(hào)馬血清，其5.2倍稀釋后按上述方法處理小鼠，所有小鼠都存活，當(dāng)稀釋倍數(shù)為14.8倍時(shí)所有小鼠都死亡。

二、中度有效劑量（themediumeffectivedose,ed50）試驗(yàn)：

根據(jù)抗血清e(cuò)d50范圍初步測(cè)定試驗(yàn)獲得的小鼠100%存活和100%死亡所用的抗血清的濃度，將ed50所用的抗血清濃度在這個(gè)范圍進(jìn)行分組，每組試驗(yàn)的小鼠為5只，體重在18－20克之間。免疫血清效價(jià)的測(cè)定采用固定蛇毒劑量、改變血清劑量的方法，即取1毫升濃度蝮蛇毒溶液(蛇毒以ld50為單位)加入1毫升含不同血清，混合后置37℃1小時(shí)，取0.4毫升注射小白鼠腹腔內(nèi)作中和反應(yīng)測(cè)定之，以含抗血清最低濃度量動(dòng)物不死亡為中和終點(diǎn)，計(jì)算1毫升血清中和蛇毒數(shù)量。一個(gè)ed50的抗體可以中和1個(gè)ld50的蝮蛇毒。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表2：

表2

樣品ed50的計(jì)算：

待檢品效價(jià)=待檢品ed50×5u（1個(gè)u相當(dāng)于1個(gè)蝮蛇毒ld50）。

序列表

<110>上海賽倫生物技術(shù)股份有限公司

<120>一種免疫馬用的免疫佐劑

<130>hj17-13343

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>552

<212>dna

<213>馬interferon-alpha-1

<400>1

atggctttgccagtttctttgttgatggctttggttgttttgtcttgtcactctatctgt60

tctttgggttgtgacttgccacacactcactctttgggtaacactagagttttgatgttg120

ttgggtcaaatgagaagaatctctccattctcttgtttgaaggacagaaacgacttcggt180

ttcccacaagaagttttcgacggtaaccaattcagaaagccacaagctatctctgctgtt240

cacgaaactatccaacaaatcttccacttgttctctactgacggttcttctgctgcttgg300

gacgaatctttgttggacaagttgtacactggtttgtaccaacaattgactgaattggaa360

gcttgtttgtctcaagaagttggtgttgaagaaactccattgatgaacgaagactctttg420

ttggctgttagaagatactttcagagaatcgcgttgtacttgcaagagaagaagtactct480

ccatgtgcttgggaaatcgttagagctgaaatcatgagatcgttctcttcttctactaac540

ttgccacaatct552

<210>2

<211>552

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atggctttgccagtttctttgttgatggctttggttgttttgtcttgtcactctatctgt60

tctttaggttgtgacttaccacacactcactctttgggtaacactagagttttgatgttg120

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ccatgtgcttgggaaatcgttagagctgagatcatgagatcgttctcttcttctactaac540

ttaccacaatct552

<210>3

<211>553

<212>prt

<213>人工序列

<400>3

metalaleuprovalserleuleumetalaleuvalvalleusercyshisserilecys60

serleuglycysaspleuprohisthrhisserlleuglyasntheargvalleumetle120

uleuglyglnmetargargileserprophesercysleulysaspargasnaspphegl180

ypheproglngluvalpheaspglyasnglnphearglysproglnalaileseralava240

lhisgluthrileglnglnilephehisleupheserthraspglyserseralaalatr300

paspgluserleuleuasplysleutyrthrglyleutyrglnglnleuthrgluleugl360

ualacysleuserglngluvalglyvalglugluthrproleumetasngluaspserle420

uleualavalargargtyrpheglnargieualaleutyrleuglnglulyslystyrse480

rprocysalatrpgluilevalargalagluilemetargserpheserserserthras540

nleuproglnser553

<210>4

<211>484

<212>prt

<213>人工序列

<400>4

cysaspleuprohisthrhisserlleuglyasntheargvalleumetleuleuglygl60

nmetargargileserprophesercysleulysaspargasnasppheglypheprogl120

ngluvalpheaspglyasnglnphearglysproglnalaileseralavalhisgluth180

rileglnglnilephehisleupheserthraspglyserseralaalatrpaspgluse240

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largargtyrpheglnargieualaleutyrleuglnglulyslystyrserprocysal420

atrpgluilevalargalagluilemetargserpheserserserthrasnleuprogl480

nser484