一種玉米小斑病菌分子檢測(cè)引物及快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種玉米小斑病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法，專(zhuān)用于玉米小斑病菌的快速分子檢測(cè)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)田間玉米小斑病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米是我國(guó)重要的糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物，還具有能源、飼料、果蔬等多種用途，是種植面積居首位、產(chǎn)量居次席的農(nóng)作物，需求量極大。玉米產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展對(duì)改善我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，保障糧食安全具有十分積極的重要作用。
[0003]玉米小斑病是由平臍婦孢屬玉蜀黍平臍婦孢菌(Bipolaris maydis)侵染引起的葉部真菌病害，玉米小斑病發(fā)病的適宜溫度為26-29°C。在充足水分或者高濕條件下，玉米小斑病病情迅速擴(kuò)展，在玉米孕穗期以及抽穗期遇降水多、濕度高，光照時(shí)數(shù)少的天氣情況下小斑病容易大流行，同時(shí)，玉米小斑病主要發(fā)生于夏玉米產(chǎn)區(qū)，近年來(lái)發(fā)病越來(lái)越嚴(yán)重，己成為玉米生產(chǎn)的主要病害。
[0004]玉米小斑病菌主要以菌絲體在田間病殘?bào)w內(nèi)越冬，越冬病原菌的存活量與越冬的環(huán)境有很大關(guān)系。病原菌菌絲或分生孢子在地面上能夠存活1-2年，存放在室內(nèi)或者室外的病殘?bào)w也能產(chǎn)生大量的分生孢子。所以，堆放在田間的玉米秸桿，遺留的玉米病葉、玉米苞葉都是來(lái)年發(fā)病的初侵染源。越冬的病原菌在來(lái)年遇到適宜溫濕度等氣候條件，便產(chǎn)生大量的分生孢子，并且借助氣流或者雨水傳播到田間生長(zhǎng)的玉米葉片上，形成病斑，之后病斑上產(chǎn)生大量分生孢子，又借助氣流傳播，對(duì)田間生長(zhǎng)的玉米進(jìn)行反復(fù)侵染，造成病害爆發(fā)流行，玉米上小斑病的潛育期為4 d -6 d，顯癥期大約為7 d。由于目前還有沒(méi)有完全免疫的玉米品種，玉米發(fā)病初期的化學(xué)防治是治理玉米小斑病的主要防治措施，而小斑病菌侵染初期難以從癥狀上與彎孢霉葉斑病、圓斑病及大斑病區(qū)分，且以癥狀為基礎(chǔ)的病害常規(guī)診斷技術(shù)，需要采用柯赫氏法則經(jīng)過(guò)病原菌分離培養(yǎng)、病原菌鑒定、接菌、癥狀分析等步驟，耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、準(zhǔn)確性差，難以做到病害發(fā)生時(shí)及時(shí)檢測(cè)和有效控制病原菌的傳播和病害流行。而玉米小斑病菌在形態(tài)特征上與玉米大斑病菌極其相似，難以鑒定，因此迫切需要建立一種快速、靈敏的檢測(cè)方法用于玉米小斑病的早期診斷，為病害的最佳防治時(shí)期提供技術(shù)支撐。
[0005]隨著分子生物學(xué)技術(shù)在植物病理學(xué)科不斷發(fā)展和應(yīng)用，一些分子標(biāo)記技術(shù)為植物病原菌的診斷檢測(cè)提供了新的途徑，其中PCR(polymerase chain react1n)技術(shù)以特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷等特點(diǎn)被用于植物病原菌的診斷。真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)序列種內(nèi)的保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR，對(duì)病原菌進(jìn)行快速檢測(cè)和鑒定的技術(shù)已受到廣泛的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外研究人員已成功開(kāi)發(fā)出多種病原菌的特異性引物和檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了快速、靈敏和準(zhǔn)確的鑒定。但目前有關(guān)玉米小斑病菌分子檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)玉米小斑病菌的檢測(cè)和鑒定主要基于病原形態(tài)學(xué)特征，程序繁瑣、耗死長(zhǎng)、對(duì)鑒定經(jīng)驗(yàn)要求高、準(zhǔn)確度低，難以滿足玉米小斑病診斷的實(shí)際需要問(wèn)題，提供了一種玉米小斑病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
本發(fā)明首先提供了一種玉米小斑病菌分子檢測(cè)引物，其核苷酸序列為:
上游引物BSF: 5 ’ -TGCAAAATATGTGCTGCGCT-3 ’ ；
下游引物BSR: 5 ’ -CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3 ’。
[0008]所述引物BSF和BSR對(duì)玉米小斑病菌特異性擴(kuò)增出392bp的產(chǎn)物。
[0009]本發(fā)明還提供了一種玉米小斑病菌的快速檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(I)從玉米葉片或葉鞘中提取DNA;
用于檢測(cè)病原菌純培養(yǎng)物時(shí)，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA;用于檢測(cè)玉米葉片或葉鞘組織是否存在玉米小斑病菌時(shí)，采用NaOH快速裂解法提取玉米植株組織基因組 DNA。
[0010](2)以提取玉米葉片或葉鞘DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系25yL，包含2.5μL 10XPCR buffer，2.0yU^度為2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15yU^度為5U/yL的Taq酶，lOymol/L的引物BSF和BSR各0.5yL，DNA模板lyL，加ddH20至總體積達(dá)25yL;PCR反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 45sec，54°C 退火 45sec，72°C 延伸 45sec，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin；
(3)上步所得的PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上用0.5 X TBE緩沖液電泳分析，電壓為4-5V/cm;根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定檢測(cè)結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出392bp的產(chǎn)物，則判定所述的玉米葉片或葉鞘中存在玉米小斑病菌，否則所述的玉米葉片或葉鞘中不存在玉米小斑病菌。
[0011]本發(fā)明的有益效果在于:
(1)準(zhǔn)確性高:本發(fā)明是根據(jù)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-1TS)序列在真菌種內(nèi)的高度保守性和科屬種間可變性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)玉米小斑病菌具有特異擴(kuò)增作用的PCR引物。已經(jīng)對(duì)不同地理來(lái)源的玉米小斑病菌、攜帶玉米小斑病菌的葉片、攜帶玉米小斑病菌的葉鞘和健康玉米葉片進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，只有玉米小斑病菌和攜帶該病菌的組織中能特異性地?cái)U(kuò)增出一條392 bp的電泳條帶，說(shuō)明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物用于檢測(cè)玉米小斑病菌準(zhǔn)確可靠；
(2)特異性強(qiáng):本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)玉米小斑病菌具有很強(qiáng)的特異性，能夠用于區(qū)別玉米大斑病菌、玉米彎孢霉葉斑病菌、玉米圓斑病菌等玉米上常見(jiàn)病害的病原菌，從而能有效區(qū)分發(fā)生在玉米上癥狀特征相似的病害；
(3)靈敏度高:本發(fā)明將設(shè)計(jì)的特異引物與ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)聯(lián)合起來(lái)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增后，對(duì)玉米小斑病菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1fg;
(4)適用性廣、實(shí)用性好:本發(fā)明的玉米小斑病菌的檢測(cè)方法，不僅能對(duì)病菌菌絲體進(jìn)行檢測(cè)，也能對(duì)感病的玉米葉片或葉鞘進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)玉米小斑病菌的早期檢測(cè)，即在病害顯癥前進(jìn)行檢測(cè)，防治病害的爆發(fā)流行。
[0012](5)操作簡(jiǎn)便快速:本發(fā)明只需進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，一般整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，操作簡(jiǎn)便快捷。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明引物對(duì)玉米小斑病菌特異性擴(kuò)增電泳圖:其中泳道M為2000bpDNAMarker，泳道2、泳道3為不同地理來(lái)源的玉米小斑病菌，泳道4_11分別為:玉米灰斑病菌、玉米圓斑病菌、玉米大斑病菌、玉米南方銹病病菌、玉米紋枯病菌、玉米彎孢霉葉斑病菌、花生褐斑病菌、陰性對(duì)照。
[0014]圖2為本發(fā)明引物玉米小斑病菌的靈敏性檢測(cè)擴(kuò)增電泳圖:圖2-A:普通PCR靈敏度檢測(cè)，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-12分別為:10ng、1ng、Ing、10pg、1pg、lpg、lOOfg、10fg、lfg、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照；圖2-8為巢式PCR靈敏度檢測(cè)，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-13分別為:10ng、1ng、Ing、10pg、1pg、lpg、lOOfg、1fg、I fg、I OOag、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
[0015]圖3為本發(fā)明玉米葉片和葉鞘擴(kuò)增電泳圖，其中泳道M為2000bp DNA Marker，泳道2-11分別為自然發(fā)病的玉米葉片、自然發(fā)病的玉米葉鞘、人工接種發(fā)病的玉米葉片、人工接種發(fā)病玉米葉鞘、滅菌后的玉米葉片、健康玉米葉片、健康的玉米葉鞘、健康的玉米苞葉、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0017]下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0019]實(shí)施例1分子檢測(cè)引物設(shè)計(jì)及玉米小斑病菌特異分子檢測(cè)方法的建立 1.玉米小斑病菌基因組DNA的提取:
采用CTAB法提取本實(shí)驗(yàn)室保存的不同來(lái)源的22株玉米小斑病菌的基因組DNA，具體步驟如下:
(1)取0.1g菌絲粉于1.5 mL離心管中，加入900 yL2%CTAB提取液，使用振蕩器振蕩混勾，60°C水浴60min，室溫條件下，12000r/min離心15 min；
(2)取上清液700yL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液(各體積比為25:24:1)，溫和搖動(dòng)，室溫條件下，8000 r/min離心1min ；
(3)取上清液500yL，加入等體積氯仿再抽提一次，室溫條件下，8000 r/min離心1min;
(4)取上清液350yL，加入1/10體積3 mo I/L NaAc和2倍體積無(wú)水乙醇，_20°C沉淀60min，4°C條件下，8000 r/min離心5 min ；
(5)棄去上清液，加入700yL體積濃度為70%冰乙醇，輕搖1sec，4°C條件下，8000r/min離心lOsec，晾干，加入50 yL TE緩沖液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0020]2.玉米小斑病菌ITS序列測(cè)定:
以真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-1TS)通用引物TSl:5’_TCCGTAGGGAACCTGCGG_3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’為引物對(duì)提取玉米小斑病菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?yàn)?PCR反應(yīng)體系25yL，包含2.5yL 1XPCR buffer，2.度為2.5mmol/lJ^dNTP Mixture，0.15yU^度為5U/yL的Taq酶(Takara 大連寶生物工程有限公司)，lOymol/L的引物TISl和ITS4各0.5yL，DNA模板IyL，加CldH2O至總體積達(dá)25yL;PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性I min，55°C退火45sec，72°C延伸I min，共35個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin;所得PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程有限公司測(cè)序。
[0021 ] 3.玉米小斑病菌特異分子檢測(cè)引物的設(shè)計(jì):
根據(jù)玉米小斑病菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-1TS)序列在真菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，用Clustal X軟件將測(cè)序得到的22株玉米小斑病菌的ITS序列與GenBank中Bipolaris屬不同種的ITS序列、玉米灰斑病菌ITS序列、玉米圓斑病菌ITS序列、玉米