專利名稱：雄性不育植物及其保持系的培育方法以及所使用的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)雄性不育性植物的方法以及該方法中所使用的表達(dá)載體。
利用基因工程創(chuàng)造雄性不育性植物的工作起始于80年代末。Mariani等于1990年在這一領(lǐng)域進(jìn)行了開創(chuàng)性的工作。他們利用從煙草花藥分離出的花藥絨氈層特異表達(dá)的基因TA29的啟動(dòng)區(qū)與RNaseT1和Barnase基因連接，通過(guò)農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)入煙草和油菜中，均獲得了雄性不育的轉(zhuǎn)化株。隨后將雄性不育基因緊密連鎖到抗除草劑基因Bar上，通過(guò)噴灑除草劑來(lái)殺死敏感的可育株，達(dá)到保持和繁殖具有抗性的雄性不育株，從而得到保持系(Mariani et al.，Nature，1990，247737-741)。1992年，他們又根據(jù)Barnase的抑制因子Bastar能夠與其形成一對(duì)一的復(fù)合體，使其失去核糖核酸酶活性的原理，采用Bastar基因代替Barnase構(gòu)建成嵌合基因，并獲得恢復(fù)系(Mariani et al，Nature，1992，357384-387)。他們建立的基因工程“三系”系統(tǒng)目前已經(jīng)用于油菜、煙草、番茄、棉花、花椰菜、菊苣和芝麻等(Mariani et al.，Nature，1992，375(4)384-387；Leemans，InReproductive biology and plant breeding(Y Dattee et al eds)，Springer-Verlag，1992，pp82-86；Denis et al，Plant Physiol.，1993，101(4)1295-1304；Greef et al，1994；李勝國(guó)等，植物學(xué)報(bào)，1995，37(8)659—660；Phul PS et al.，Crop Improvement，1996，23(special issue)15-28；Chenet al.，Acta Agriculturae Boreali-Sinica，1996，11(4)33-38；Zhan et al.，Sex.Plant Reprod.，1996，9(1)35-43 1992；Hoyle，Nature-Biotechnology，1998，162，118)。利用Barnase/Bar系統(tǒng)，De Block等在小麥上獲得雄性不育性(De Block et al.，TGA，1997，95(1-2)125-131)。這一系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是在轉(zhuǎn)基因植物中引入了微生物來(lái)源的核糖核酸酶基因Barnase和核糖核酸酶抑制基因Bastar，使人們?cè)诮邮苻D(zhuǎn)基因植物，特別轉(zhuǎn)基因是食物植物有所顧慮。
Van de Meer等利用反義基因技術(shù)，通過(guò)封閉查爾酮(Chs)基因的表達(dá)，在矮牽牛上意外獲得雄性不育性(Van de Meer et al，Plant Cell，1992，4253-262；Ylstra and van Tune，Prophyta，1993，46(1)56-58)。自這一開創(chuàng)性的工作后，出現(xiàn)了通過(guò)反義基因技術(shù)特異性地封閉或抑制某一或某些功能基因的表達(dá)來(lái)創(chuàng)造植物雄件不育的報(bào)道(綜述見(jiàn)Xiao，InProc.China-Eu workshop on manipulating plant metabolism and agro-biotechnology，Oct.27-31，1997，Yang Tse River，China，pp49-50；李艷紅等，InProc.the 1stinternational workshop on hybrid wheat.Nov.，1998，Beijing，China，pp197-203)。但是封閉或抑制某一或某些功能基因產(chǎn)生的雄性不育不徹底仍然是難以克服的問(wèn)題。
通過(guò)細(xì)菌影響小孢子發(fā)育也可導(dǎo)致雄性不育。Schmulling等將Agrobacterium rhizogenes A4 T-DNA rol C基因與CaMV 35S啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化到煙草、番茄、擬南芥中，結(jié)果得到了表現(xiàn)雄性不育的煙草轉(zhuǎn)化株(Schmulling et al.，EMBO J.，1988，72621-2629)；當(dāng)與rol C基因的反義基因與CaMV 35S構(gòu)成的嵌合基因得到的轉(zhuǎn)化株雜交時(shí)，育性得到恢復(fù)(Schmullinget al.，Mol.Gen.Genet，1993，237385-394)；用A.rhizogenes的rol B基因與金魚草TapI啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)花藥生長(zhǎng)素含量增加，導(dǎo)致花粉異常，造成雄性不育(Spena et al.，TAG，1992，84520-527)。將編碼核酶的DNA克隆與絨氈層特異啟動(dòng)子相連，導(dǎo)入植物，可得到雄性不育株；通過(guò)提前降低胼胝質(zhì)含量或利用轉(zhuǎn)座子突變等其它方式也可創(chuàng)造雄性不育(Worrall et al.，Plant Cell，1992，4759-771)。然而，這些雄性不育性或不徹底，或改變了轉(zhuǎn)基因植物的其它性狀，包括重要的農(nóng)藝性狀，或引入了微生物基因作為目標(biāo)基因而未能用于雜種生產(chǎn)實(shí)踐。
植物細(xì)胞，包括花藥和花粉細(xì)胞，除了含有細(xì)胞核和各種細(xì)胞器外，在細(xì)胞質(zhì)中還有一個(gè)三維的細(xì)胞骨架(cytoskeleton)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。細(xì)胞骨架由微絲(microfilament)、微管(microtubule)和中間纖維(intermediatefilament)組成。微絲由肌動(dòng)蛋白(actin)和肌球蛋白(myosin)組成，微管主要由微管蛋白(tubulin)組成，中間纖維則由堿性和酸性角蛋白等蛋白組成。細(xì)胞骨架系統(tǒng)作為一個(gè)系統(tǒng)整體，對(duì)維持細(xì)胞形狀、使細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器和細(xì)胞本身行使各種功能起著重要的作用。組成細(xì)胞骨架的微絲、微管和中間纖維，除了作為主要成員貢獻(xiàn)于整體系統(tǒng)的功能之外，還有它們各自的功能。微絲參與細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、有絲分裂、胞質(zhì)分裂、頂端生長(zhǎng)、物質(zhì)運(yùn)輸、花粉粒萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)等(閻隆飛等，科學(xué)通報(bào)，1999，44(23)247l—2475)。微管參與細(xì)胞內(nèi)囊泡和蛋白質(zhì)顆粒的運(yùn)動(dòng)、有絲分裂過(guò)程中染色體的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞極性的確定以及信號(hào)傳遞等。中間纖維與細(xì)胞內(nèi)微管的分布、結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)，與染色體的分布和動(dòng)態(tài)有關(guān)，還與細(xì)胞核內(nèi)的核膜骨架蛋白有關(guān)(徐是雄等編，植物細(xì)胞骨架。北京，科學(xué)出版社，1996，135頁(yè))。因此，特異性封閉或抑制骨架蛋白基因的表達(dá)不但能破壞三維細(xì)胞骨架系統(tǒng)的完整性，使花藥和/或花粉細(xì)胞失形或畸形，導(dǎo)致其它細(xì)胞器喪失正常工作的“空間”，而且使細(xì)胞骨架的組份喪失其專有的功能，從而不能產(chǎn)生花粉或僅僅產(chǎn)生畸形的沒(méi)有活力的花粉，最終導(dǎo)致徹底的雄性不育。植物的花藥花粉發(fā)育過(guò)程涉及大量的基因表達(dá)。在煙草早期的花藥中大約有25000個(gè)基因在表達(dá)，其中約有10000個(gè)基因是花藥特異性(Kamalayand Goldberg，PNAS，1984，812801-2805；Mascarenhas，Ann.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，1990，41317-338)。封閉或抑制其中任何一個(gè)基因的表達(dá)都將導(dǎo)致花藥和/或花粉生長(zhǎng)發(fā)育的不完全或失敗，導(dǎo)致雄性不育(Xiao，InProc.China-EU workshop on manipulating plant metabolismand agro-biotechnology.Oct，1997，Yang-Tse River，China，pp49-50)。本發(fā)明就是利用這一原理，通過(guò)封閉或抑制植物花藥花粉發(fā)育過(guò)程中的基因表達(dá)，來(lái)生產(chǎn)雄性不育植物的。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)雄性不育植物及其保持系的方法以及該方法中所使用的表達(dá)載體，克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，以便更好、更廣泛地利用植物的雜種優(yōu)勢(shì)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種培育雄性不育植物的方法，包括下列步驟(a).選擇植物雄性器官細(xì)胞骨架蛋白基因(完整基因或其片段)為目標(biāo)基因；(b).構(gòu)建封閉或抑制所述目標(biāo)基因表達(dá)的雄性不育基因表達(dá)盒；(c).將所述雄性不育基因表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官中；(d).將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官培養(yǎng)成雄性不育植株。
上述方法中，所述雄性器官包括花藥和/或花粉；所述骨架蛋白基因包括肌動(dòng)蛋白基因、肌球蛋白基因和微管蛋白基因，其中肌動(dòng)蛋白基因包括G—肌動(dòng)蛋白基因亞族和F—肌動(dòng)蛋白基因亞族；所述的細(xì)胞骨架蛋白基因的片段一般情況下最少具有10核苷酸殘基，優(yōu)選20-50個(gè)核苷酸殘基，最優(yōu)選約40個(gè)殘基。所述封閉或抑制指利用目標(biāo)基因(部分或完整基因)的反義基因進(jìn)行封閉或抑制；所述表達(dá)盒由只在植物花藥和/或花粉中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、目標(biāo)基因編碼區(qū)(ORF)全區(qū)或部分及終止子組成；所述導(dǎo)入可以通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的“直接法”(如，基因槍法、花粉管通道法、電激穿孔法、PEG法、激光穿孔法和超聲波法等)和“介導(dǎo)法”(如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染法等)導(dǎo)入表達(dá)載體來(lái)進(jìn)行，其中終止子包括Nos終止子、Ocs終止子或Ca MV35s終止子，啟動(dòng)子為花藥或花粉特異性啟動(dòng)子，包括TA29、A3、A8、A9、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1，Bp4B.Bp4C，Bp19，BetvI，BetvIII，ca55，CDPK，ChiA，ChiB，ChsA，Def A，E1，E2，F(xiàn)2s，13#，17#，G10，KBG41，LAT52，LAT59，Lol PI，Lol Pib，Lec6，MS2，Osg6B，P2，SF1，SF2，SF3，SF5，SF6，SF9，SF16，SF18，SF19，TA13，TA20，TA32，TA56，T72，tap2，TUA1和Zm13等啟動(dòng)子；所說(shuō)的目標(biāo)基因編碼區(qū)包括花藥和/或花粉生長(zhǎng)和/或發(fā)育所需要基因的編碼區(qū)；所說(shuō)的表達(dá)載體是含有雄性不育基因表達(dá)盒、抗除草劑基因表達(dá)盒、選擇基因和/或報(bào)告基因表達(dá)盒的質(zhì)粒，所說(shuō)的質(zhì)粒是經(jīng)過(guò)人工改造已經(jīng)除去可能對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)和發(fā)育不利的DNA片段的質(zhì)粒，包括供“直接法”和“介導(dǎo)法”用的(植物表達(dá))質(zhì)粒；所說(shuō)的雄性不育系是通過(guò)導(dǎo)入雄性不育基因表達(dá)盒或表達(dá)載體所獲得的雄性不育的轉(zhuǎn)基因植株及其所形成的株系、品系和品種，包括轉(zhuǎn)基因單子葉植物和雙子葉植物。
本發(fā)明還提供了培育所述雄性不育植物保持系的方法，是在上述培育雄性不育植物的過(guò)程中，在雄性不育基因表達(dá)盒上連鎖抗除草劑基因表達(dá)盒，并將所獲得的轉(zhuǎn)基因雄性不育植物為母本與其相應(yīng)的普通植株進(jìn)行雜交，在雜種播種前后或苗期用相應(yīng)的除草劑進(jìn)行處理，存活植株為雄性不育保持系。
本發(fā)明的有益效果在于1、雄性不育性完全徹底，在生產(chǎn)雜交種時(shí)不用進(jìn)行物理或化學(xué)去雄，省時(shí)省力無(wú)污染，能更好地發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)。2、不會(huì)改變植物的優(yōu)良性狀和引入不良的農(nóng)藝性狀。3、所獲得雄性不育性不會(huì)受到光溫等影響，應(yīng)用不受區(qū)域限止。4、不會(huì)給植物引入微生物基因。5、獲得的雄性不育植物僅僅是雄性不育，雌蕊和營(yíng)養(yǎng)體正常，可以避免白花授粉，并可以接受其它具有親和力的花粉而結(jié)實(shí)，保證植物的生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。6、雄性不育系的保持方法使得利用本發(fā)明所獲得的植物雄性不育系可以用于雜種生產(chǎn)實(shí)踐，克服了天然或自然發(fā)現(xiàn)的核雄性不育難以保持而無(wú)法用于雜種生產(chǎn)實(shí)踐的障礙；同時(shí)也可以應(yīng)用到其它基因工程方法創(chuàng)造的植物雄性不育的保持。
利用賽百盛公司的PCR試劑盒，按照說(shuō)明，利用20μl反應(yīng)體系擴(kuò)增TA29片段(310bp。在0.5ml PCR反應(yīng)薄壁管中加入5’端引物1(30pM)和3’端引物2(30pM)(見(jiàn)圖2)各1μl，經(jīng)HindIII過(guò)夜酶切的煙草總DNA20～50μg，加重蒸餾水至總體積20μl。在PCR儀(HybaidTOUTHDOWN)上擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為94℃變性5min，1個(gè)循；94℃變性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用等體積酚、氯仿、酚各抽提一次，加0.1倍體積的3mol/L NaAc(pH6.0)、0.2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，去上清，用70％乙醇洗沉淀兩次，空氣干燥。用重蒸餾水溶解至濃度大約為150ng/μl，用KpnI＋BamHI雙酶切2hr左右，連接到用KpnI＋BamHI雙酶切的pUC18上，形成轉(zhuǎn)化子。用得到的轉(zhuǎn)化子連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(株系JM101)，經(jīng)a-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑。提取質(zhì)粒，用KpnI-BamHI雙酶切，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大約310bp和2.7kb兩條帶者為正確的轉(zhuǎn)化子，記為p18TA29。(c).雄性不育基因(pGTAa)從p18TA29上用BamHI＋KpnI酶切回收TA29啟動(dòng)子。先用BamHI酶切p18TA29，再用Klenow大片段補(bǔ)平，然后用KpnI酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收0.3kb的TA29啟動(dòng)子。從pSKActin(胡松年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，1996，69頁(yè))上用EcoRV＋BamHI酶切回收1.6kb的肌動(dòng)蛋白基因(actin)片段。將回收的兩片段先體外反向連接，再連接到用KpnI＋BamHI雙酶切的pGEM-7Zf質(zhì)粒，形成轉(zhuǎn)化子。用所得到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑。提取質(zhì)粒，酶切鑒定。正確的轉(zhuǎn)化子用KpnI＋BamHI酶切出2.9kb的載體和1.9kb的TA29＋Anti-actin帶，用EcoRI酶切出2.9kb的載體、1.6kb的Actin和0.3kb的TA29啟動(dòng)子帶，用BamHI酶切出4.8kb的質(zhì)粒帶。正確的轉(zhuǎn)化子記為pGTAa，含構(gòu)建的雄性不育基因(TA29＋Anti-actin)。(d).雄性不育基因表達(dá)盒(pSTAa)的構(gòu)建將Nos終止子連接到所構(gòu)建的雄性不育基因(TA29＋Anti-actin)下游，以構(gòu)成完整的雄性不育基因表達(dá)盒(TA29＋Anti-actin＋Nos)。用XbaI＋BamHI酶切pGTAa，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收1.9kb的雄性不育基因片段(TA29-Anti-actin)；從pBARGUS上用BamHI＋HindIII酶切回收0.3kb的Nos終止子。將回收的兩片段先體外連接，再連接到用XbaI＋HindIII雙酶切的pSK質(zhì)粒，形成轉(zhuǎn)化子。用得到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑。提取質(zhì)粒，酶切鑒定。正確的轉(zhuǎn)化子用XbaI＋HindIII酶切出2.9kb的載體片段和2.2kb的“TA29＋Anti-actin＋Nos”片段，即雄性不育基因表達(dá)盒；用KpnI＋BamHI酶切出2.9kb的載體、1.9kb的雄性不育基因(TA29＋Anti-actin)片段和0.3kb的Nos片段。含有這一表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化子記為pSTAa。3.雄性不育基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例的雄性不育植物表達(dá)載體除含有完整的雄性不育基因表達(dá)盒之外，還含有方便選擇轉(zhuǎn)基因植株和方便保持雄性不育性的抗除草劑基因表達(dá)盒。具體采用抗除草劑草丁膦(PPT)的基因Bar表達(dá)盒。Bar基因編碼草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，該酶使PPT上的自由NH2基乙?；?，從而使PPT失活(Thompson等，EMBOJ.，1987.62519-2523)。
目前世界上用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體可分成雙元載體(又稱二元載體，binary vector)和共合載體(integrative vector)兩大類。雙元載體質(zhì)粒在進(jìn)入植物細(xì)胞后，能將其T-DNA部分轉(zhuǎn)移和整合到寄主植物的染色體。本實(shí)施例用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)載體是雙元載體類，但也可以利用共合載體。
從上節(jié)構(gòu)建的pSTAa上用KpnI＋HindIII雙酶切回收2.2kb的雄性不育基因表達(dá)盒(TA29＋Anti-actin＋Nos)，連接到用KpnI＋HindIII雙酶切的雙元載體質(zhì)粒pBin19(10.9kb)的T-DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，a-互補(bǔ)藍(lán)白選擇，挑取白斑，提取質(zhì)粒，用KpnI＋HindIII雙酶切，得到10.9kb的載體帶和2.2kb的目標(biāo)帶，用HindIII酶單切，得到一條13.1kb的帶。這一轉(zhuǎn)化子記為pBTAa。從pBARGUS上，用HindIII酶切回收2.1kb的Bar表達(dá)盒，與HindIII酶切的pBTAa連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取菌落，提取質(zhì)粒，用HindIII酶切，切出2.1kb的Bar盒帶和13.1kb的pBTAa帶；用KpnI酶切，切出11.4kb和3.8kb兩條帶，用EcoRI＋HindIII酶切，得到12.8kb、2.2kb和1.6kb三條帶。這一轉(zhuǎn)化子記為pBTAaB，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物的雄性不育基因表達(dá)載體，在其T-DNA區(qū)含有本發(fā)明所構(gòu)建雄性不育基因表達(dá)盒、Bar基因表達(dá)盒和pBin19所帶的NptII基因表達(dá)盒(NptII基因編碼并表達(dá)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，賦予卡那霉素抗性)。4.農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化本實(shí)施例所選用的農(nóng)桿菌株系為L(zhǎng)BA4404、A281、EHA105和AGL1，也可以選用其它類型。各株系的培養(yǎng)方法基本相同，只是所用的抗生素有異。A281、EHA105和AGL1具有對(duì)利福平(Rif)的抗性(20μg/ml)、LBA4404對(duì)鏈霉素(Str)的抗性(50μg/ml)。本實(shí)施例選用的基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固體培養(yǎng)時(shí)加瓊脂15g/L)。菌株接種于附加有相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，倒置在37℃溫育培養(yǎng)過(guò)夜，然后在4℃保存。(a).農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(以株系LBA4404為例)挑取單菌落LBA4404，接種于5ml含100μg/ml Str的YEB液體培養(yǎng)基(每L10g蛋白胨，1g酵母粉，5g蔗糖，0.5g MgSO4·7H2O，pH7.0)中，于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取2ml過(guò)夜活化的菌液接種于50ml含100μg/ml Str的YEB中，同樣條件培養(yǎng)至O.D.值大約為0.5，冰浴30min。于4℃，5000rpm離心5min，棄上清，用10ml0.15M NaCl懸浮菌體。于4℃，5000rpm離心5min，棄上清，用2ml 20mM CaCl2懸浮菌體，加入15％的甘油。每管100μl分裝，液氮速凍，于-70℃保存。(b).農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化參照An(Methods in Enzymology，1987，153293-305)方法，用凍融法將本發(fā)明所構(gòu)建的用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物的雄性不育植物表達(dá)載體(pBTAaB)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。
取1～2μg質(zhì)粒，加到100μl于冰上溶化的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min。置于液氮中迅速冷凍5min，移入37℃水浴中溶化5min，迅速冰浴2min后加入1000μl YEB液體培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)3～5hr。于4℃，5000rpm離心5min，沉淀菌體，棄掉上清后，重新懸浮菌體，均勻涂布于含Str 50μg/ml和Kan 50μg/ml的固體YEB培養(yǎng)基(在液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂)上。于28℃倒置培養(yǎng)2～3天。5.植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官的遺傳轉(zhuǎn)化(a).用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物參照Horsch等的葉盤法(Science，1985，2271229-1231)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙子葉植物，本實(shí)施例選用的雙子葉植物為煙草和番茄。
挑取含有重組質(zhì)粒(例如，pBTAaB)的農(nóng)桿菌株系(例如，LBA4404)單菌落，接種于5ml含有相應(yīng)抗生素的細(xì)菌液體培養(yǎng)基(例如，YEB)中，28℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)活化農(nóng)桿菌。取過(guò)夜培養(yǎng)活化的農(nóng)桿菌，按1∶50的比例轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。將培養(yǎng)物于5000rpm離心5min，收集菌體。用1/2液體植物培養(yǎng)基稀釋10～20倍，備用。
切取7～8天苗齡的外植體(子葉或幼葉)，置于再生培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)2～4天。將外植體投入預(yù)先準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，室溫下不時(shí)搖動(dòng)，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，侵染10～30min。取出外植體，置濾紙上吸去多余的菌液，轉(zhuǎn)入表面鋪有一層濾紙的再生培養(yǎng)基上。暗處共培養(yǎng)2天。經(jīng)共培養(yǎng)的外植體，轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)滅菌抗生素和選擇抗生素的再生培養(yǎng)基上，每隔2～3周更換一次培養(yǎng)基，并逐漸降低滅菌抗生素的濃度。把再生的抗性芽接到含有低濃度滅菌抗生素和高濃度選擇抗生素以及其它選擇劑的生根培養(yǎng)基上。待幼苗生長(zhǎng)較大生根，開瓶一周煉苗，再移苗入土，保濕一周后，于22～26℃的溫室內(nèi)生長(zhǎng)。6.轉(zhuǎn)基因植物的鑒定本實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因植株(植物)鑒定法包括生物法、化學(xué)法、組織化學(xué)染色法和分子生物學(xué)法。(a).化學(xué)法根據(jù)所構(gòu)建和導(dǎo)入植體的載體質(zhì)粒所攜帶的選擇性基因(例如，抗抗生素基因、抗除草劑基因等)和/或誘導(dǎo)性基因，在植株再生階段和生根階段于培養(yǎng)基中加入足以殺死未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏南鄳?yīng)的選擇劑(例如，相應(yīng)的抗生素、除草劑)和/或誘導(dǎo)劑。在幼苗階段和成苗階段，用濃度適當(dāng)提高的相應(yīng)的選擇劑(例如，除草劑)和/或誘導(dǎo)劑處理，以排除在試管階段篩選偷逃者。本實(shí)施例用于鑒定轉(zhuǎn)基因番茄(品種麗春)和煙草(品種NC89)的Kan(卡那霉素)濃度都為50mg/L，在含有Kan50mg/L的培養(yǎng)基上，90％的轉(zhuǎn)基因番茄和98％的轉(zhuǎn)基因煙草的葉圓盤再生芽苗，而未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照葉圓盤全部黃化死亡，沒(méi)有一片再生芽苗。將這些Kan-抗性芽苗移到含有Kan 50mg/L和PPT 5mg/L的延長(zhǎng)生長(zhǎng)和生根培養(yǎng)基上后，98％以上的芽苗都能正常生長(zhǎng)和生根，而未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照芽苗則全部黃化死亡。(b).生物法對(duì)于雙子葉轉(zhuǎn)基因植物，取試管苗或溫室苗的葉片或其它容易再生的組織或器官，在加有較高濃度選擇壓[對(duì)應(yīng)于(a)的選擇劑]的再生培養(yǎng)基上作植株再生，同時(shí)取未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照苗的相同組織或器官在加有較高濃度選擇壓[對(duì)應(yīng)于(a)的選擇劑]的再生培養(yǎng)基上作植株再生，以作為負(fù)對(duì)照。只有在這樣的培養(yǎng)基上能再生植株者，其外植體的供體植株為真轉(zhuǎn)基因植株。本實(shí)施例選用從上述化學(xué)法(a)篩選出的Kan-和PPT-抗性番茄和煙草試管苗上取幼葉作圓盤(直徑0.8cm)，在含有Kan50mg/L和PPT5mg/L的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因的番茄和煙草的同齡葉圓盤作對(duì)照。培養(yǎng)4—6周后，抗性株的葉圓盤95％以上都再生出芽苗，而對(duì)照則沒(méi)有一株芽苗再生。(c).組織化學(xué)染色法如果所構(gòu)建和導(dǎo)入植體的載體質(zhì)粒所攜帶的報(bào)告基因GUS或類似基因，常用Jefferson等(Jefferson等，EMBO J.，1987，63901-3907)報(bào)道的GUS染色法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因愈傷組織和植株檢測(cè)。只有轉(zhuǎn)基因愈傷組織或植株的組織或器官被染成藍(lán)色。本實(shí)施例所構(gòu)建和導(dǎo)入植體的載體質(zhì)粒所攜帶的報(bào)告基因GUS。通過(guò)上述化學(xué)法和生物法檢測(cè)的抗性苗，取其葉片或無(wú)性系整株苗用GUS染色法染色后，93％的番茄和95％以上的煙草都能完全染成藍(lán)色，3—5％能部分染色，有0—2％不能染色。對(duì)照株的則全部比能染色。(d).分子生物學(xué)鑒定---PCR法利用PCR方法對(duì)通過(guò)上述(a)、(b)和(c)檢測(cè)或鑒定的轉(zhuǎn)基因愈傷組織和/或植株進(jìn)行鑒定是最快的分子生物學(xué)鑒定方法，一般利用目標(biāo)基因和/或標(biāo)志基因的核心片段為模板設(shè)計(jì)雙端PCR引物，以待檢測(cè)植株的DNA為模板擴(kuò)增，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩甑腄NA模板擴(kuò)增作為負(fù)對(duì)照。擴(kuò)增出預(yù)期帶者為轉(zhuǎn)基因植株。本實(shí)施例利用反義目標(biāo)基因anti-actin的核心序列設(shè)計(jì)的PCR兩端引物5’端引物5′-GGATCCATGGAAGCATTTCCTGTG-3′3’端引物5′-TGATCAGCAGAAYCCGAAG-3′(序列4)在供試的通過(guò)上述(a)、(b)和(c)檢測(cè)的10株轉(zhuǎn)基因番茄和10株轉(zhuǎn)基因煙草植株中都擴(kuò)增出一條1.2kb的目標(biāo)帶，而在對(duì)照植株中沒(méi)有擴(kuò)增出這條帶。---Southern Blot法Southern Blot法是更準(zhǔn)確可靠的分子生物學(xué)鑒定方法。根據(jù)本說(shuō)明提供的方法提取待檢測(cè)植株的DNA[參見(jiàn)C(a)]。按照Southern(J.Mol.Biol.，98503-517)報(bào)道的方法，DNA用酶切后(用任意內(nèi)切酶或所導(dǎo)入目標(biāo)基因的酶切位點(diǎn)酶)，瓊脂糖凝膠電泳分離，變性后轉(zhuǎn)移到尼龍膜或纖維素膜。以載體上的目標(biāo)基因片段合成探針(缺口平依法、隨機(jī)引物法或PCR法)，用放射性同位素或地高辛(DIG)標(biāo)記探針。再用標(biāo)記的探針與所得到的尼龍膜或纖維素膜雜交。用放射性同位素標(biāo)記者將雜交后的膜壓X-片，用地高辛(DIG)標(biāo)記者按照DIG說(shuō)明書將雜交后的膜染色。具有陽(yáng)性信號(hào)者為轉(zhuǎn)基因植株。未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株呈陰性反應(yīng)。本實(shí)施例以導(dǎo)入番茄和煙草的anti-actin基因片段為目標(biāo)基因，通過(guò)PCR法制備探針，用地高辛(DIG)標(biāo)記探針，轉(zhuǎn)基因番茄和煙草的DNA中檢測(cè)出一條1.6kb的帶，而在未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照番茄和煙草中都沒(méi)有檢測(cè)到任何帶。6.轉(zhuǎn)基因植株的育性檢測(cè)或檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植株的育性檢測(cè)或鑒定包括雄性育性鑒定和雌性育性鑒定。本實(shí)施例提供的雄性育性鑒定方法有雄性器官的顯微形態(tài)觀察、花粉的KI-I染色、花粉的FDA染色、花粉體外發(fā)芽、花粉授粉(自花授粉、給野生型植株授粉)；提供的雌性育性鑒定方法有雌性器官的顯微形態(tài)觀察、套袋白花授粉、用野生型植株的花粉授粉。(a).雌雄器官的顯微形態(tài)觀察取轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株欲開發(fā)的花，去花瓣后在顯微鏡下觀察花藥的有無(wú)、多少、大小、形狀、豐滿程度和顏色；觀察花絲的長(zhǎng)短、粗細(xì)和曲直等；觀察雌蕊的大小、花柱的高低等。雄性不育者花藥少、小、不豐滿、色較淡或近白色；花絲短粗、不超過(guò)柱頭。本實(shí)施例觀察到部分(60％)轉(zhuǎn)基因煙草的花絲短粗、不超過(guò)柱頭；部分轉(zhuǎn)基因小麥的花藥幾乎完全退化，非常小而為白色，不含花粉；部分轉(zhuǎn)基因小麥的花藥雖然呈黃色，但較小，花絲短粗、遠(yuǎn)在柱頭之下。(b).花粉的I-KI染色許多植物的正?；ǚ酆械矸哿＃貏e是禾本科植物。淀粉與I反應(yīng)形成黑色或黑紫色。不育花粉多不含或含有極少量淀粉粒，因此用I-KI染色時(shí)不顯色或僅顯非常淺的淡紫色。本實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因小麥的花粉99.5％以上不能被I-KI染色，而對(duì)照植株的花粉99.7％以上都能被染成黑色或黑紫色。(c).花粉的FDA染色將FDA用丙酮配成2mg/ml的母液，避光保存。用時(shí)先在載玻片上滴一滴B5液體培養(yǎng)基，隨后用鑷子夾取花藥，輕輕擠出花粉粒，然后再滴上少量FDA母液，混勻，稍等片刻，蓋上蓋玻片，于Nikon熒光顯微鏡下觀察花粉粒的顏色。具有生活力的花粉發(fā)出綠色或綠黃色熒光，沒(méi)有生活力的花粉不發(fā)熒光或有暗紅色熒光。本實(shí)施例轉(zhuǎn)基因番茄花粉用FDA染色后，95％以上的花粉不發(fā)熒光或有暗紅色熒光，而對(duì)照則只有不到1％的花粉不發(fā)熒光或有暗紅色熒光，99％以上發(fā)出綠色或綠黃色熒光；轉(zhuǎn)基因小麥的花粉99％以上不發(fā)熒光或有暗紅色熒光，而對(duì)照則99％以上發(fā)出綠黃色熒光。(d).基因產(chǎn)物的標(biāo)定基因產(chǎn)物的標(biāo)定是指檢測(cè)被特異性封閉或抑制的基因表達(dá)產(chǎn)物的標(biāo)定。
將觀察到的不育花粉和對(duì)照株的花粉進(jìn)行肌動(dòng)蛋白的標(biāo)定，以分析雄性不育的轉(zhuǎn)化株的花粉和對(duì)照植株花粉中肌動(dòng)蛋白的含量及分布情況。本實(shí)施例采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。標(biāo)定方法參見(jiàn)李巖(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，1998)。轉(zhuǎn)基因雄性不育小麥的花粉畸形，沒(méi)有規(guī)則的細(xì)胞骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)照株的花粉則具有呈球形、規(guī)則的細(xì)胞骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(e).自交和雜交將對(duì)通過(guò)染色法檢測(cè)出雄性不育的轉(zhuǎn)化株在的部分花開花前2-3天直接套袋，觀察其自交結(jié)實(shí)狀況；另取大部分小花在去雄后進(jìn)行人工授粉(父本為同樣的基因型，未進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn))后再套袋以便用于觀察轉(zhuǎn)化株的雌蕊的育性情況；同時(shí)取轉(zhuǎn)化株的花粉對(duì)未轉(zhuǎn)基因的野生型進(jìn)行授粉，以確認(rèn)花粉的育性。本實(shí)施例所得轉(zhuǎn)基因雄性不育小麥的套袋自交結(jié)實(shí)率為零，但作母本在人工授粉后的結(jié)實(shí)率為80％(對(duì)照為85％)，以轉(zhuǎn)基因雄性不育株的“花粉”給未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晔诜酆蟮慕Y(jié)效率也為零。7.轉(zhuǎn)基因雄性不育性的保持本實(shí)施例在提供雄性不育基因植物表達(dá)載體時(shí)已經(jīng)將抗除草劑基因表達(dá)盒與雄性不育基因表達(dá)盒緊密連鎖。所以，本實(shí)施例的雄性不育株(系、品系或品種)在具有雄性不育的同時(shí)，還具有對(duì)除草劑的抗性。用轉(zhuǎn)基因雄性不育基因型的野生型作父本與其雜交，獲得的種子有1/2含有雄性不育基因和抗除草劑基因。因此，在種子播種前后或苗期用相應(yīng)的除草劑處理，將會(huì)殺死1/2的不含雄性不育基因和抗除草劑基因者，保持含有雄性不育基因和抗除草劑基因者。這樣，就可以得到雄性不育保持系。本實(shí)施例以0.1％Basta(除草劑，含PPT 150mg/L)處理小麥轉(zhuǎn)基因雄性不育基因型的野生型作父本與轉(zhuǎn)基因雄性不育植株雜交獲得的種子，大約49.5％的種子能正常發(fā)芽，而未轉(zhuǎn)基因植株的種子則100％不能正常發(fā)芽；上述雜交所得種子的苗期(3—5葉期)用0.03-0.05％Basta噴灑，大約48％的苗具有抗性而正常生長(zhǎng)發(fā)育，而對(duì)照苗則全部黃化枯萎。實(shí)施例2利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化雄性不育單子葉植物本實(shí)施例除了轉(zhuǎn)化植物的步驟和生物法鑒定如下所述外，其它步驟同實(shí)施例1。1.轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)化植物是用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化單子葉植物小麥的，采用菌——愈傷組織共培養(yǎng)法。所說(shuō)的愈傷組織可以來(lái)自花藥、幼穗、幼花序、幼胚和成熟胚，或其它器管。
取上述一種或幾中外植體置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在暗處誘導(dǎo)愈傷組織。出愈后10-15天的淡黃色、顆粒狀鮮嫩的愈傷組織用于農(nóng)桿菌侵染。挑取淡黃色、幼嫩愈傷組織置于活化好的農(nóng)桿菌液中。侵染1-2小時(shí)后取出愈傷組織用無(wú)菌、干燥的濾紙吸干，然后放在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)2-4天。將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到具有相應(yīng)滅菌抗生素的愈傷組織增殖培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7-10天后，移至愈傷組織抗性篩選(加相應(yīng)的選擇抗菌素和/或其它選擇劑)培養(yǎng)基上，25±2℃，黑暗條件下培養(yǎng)，篩選帶有抗性的愈傷組織；2-3周繼代一次。40-45天后，挑取顏色較新鮮的愈傷組織置于分化篩選培養(yǎng)基上，25±2℃，16hr/8hr光照下分化植株。分化篩選20-30天后，將得到的抗性試管苗移至新的生根篩選培養(yǎng)基上，25±2℃，16hr/8hr光照下使抗性苗生根。將生根的抗性苗移到溫室中先閉瓶煉苗7天、再開瓶煉苗3天后進(jìn)行移栽入盆。2.生物法鑒定取轉(zhuǎn)化小麥試管苗或溫室苗的葉片和不容易枯萎的組織或器官以及分蘗，在加有較高濃度選擇壓的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和/或生根，同時(shí)取未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照苗的相同組織或器官在相同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和/或生根，以作為負(fù)對(duì)照。只有葉片和不容易枯萎的組織或器官在這樣的培養(yǎng)基上保持1—2周有愈傷組織形成或不枯萎者，分蘗在這樣的生根培養(yǎng)基上能正常生根者，其供體植株為真正的轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例3利用基因槍法轉(zhuǎn)化雄性不育單子葉植物本實(shí)施例除了雄性不育表達(dá)載體的構(gòu)建與植物的轉(zhuǎn)化方式如下所述外，其它步驟均與實(shí)施例2相同，在轉(zhuǎn)化的植物的鑒定過(guò)程中，最好利用實(shí)施例1所記載的PCR法。1.直接法轉(zhuǎn)化植物的雄性不育基因表達(dá)載體(pSBTAa)的構(gòu)建用HindIII酶切pBARGUS，回收2.1kb的Bar表達(dá)盒，它具有CaMV35S啟動(dòng)子、內(nèi)含子、Bar編碼區(qū)和終止子的完整高效表達(dá)盒(Thompson等，EMBO J.，1987，62519-2523)。將Bar盒與HindIII酶切的pSTAa連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取菌落，提取質(zhì)粒，用HindIII酶切出2.1kb Bar盒，再用KpnI酶切，得到2.9kb和1.5kb的帶，用EcoRI酶切，得到5.0kb，1.6kb的actin及其它帶0.4kb、0.3kb。正確的轉(zhuǎn)化子記為pSBTAa。該表達(dá)載體含有pSK的骨架和雄性不育基因表達(dá)盒及Bar表達(dá)盒，總大小為7.2kb。2.基因槍法轉(zhuǎn)化植物(1).基因槍微彈的制備本實(shí)施例提供的基因槍法轉(zhuǎn)化單子葉植物小麥采用了美國(guó)Bio-Rad公司的PDS—1000/He型基因槍和金粉微彈。轟擊對(duì)象為小麥愈傷組織。
微彈的制備基本按說(shuō)明書進(jìn)行。稱取50mg直徑為1um的金粉顆粒放入滅菌的離心管中，加入1ml無(wú)水乙醇振蕩懸浮，放置過(guò)夜。5000rpm離心3分鐘，去上清，收集金粉，無(wú)菌水沖洗3—4次至乙醇完全除去，最后加入1ml無(wú)菌水制成濃度為50mg/ml的金粉懸液。用前吸取50μl金粉懸液移至Eppendorf管中，加入5μl質(zhì)粒DNA，充分振蕩；然后分別加入2.5M CaCl250μl和0.1M亞精胺20μl，并充分混均；靜置2分鐘后，用140μl的70％乙醇洗滌；12000rpm離心2分鐘，棄上清，加140μl 100％乙醇洗滌；12000rpm離心2分鐘，棄上清，加入90μl 100％乙醇，4℃保存，備用；每槍上樣10μl。(2)愈傷組織的前處理按照實(shí)施例2誘導(dǎo)愈傷組織，將出愈后15天的淡黃色、顆粒狀鮮嫩的愈傷組織在轟前4-6hr移至含0.4M甘露醇的高滲培養(yǎng)基上，集中在直徑9cm的培養(yǎng)皿的中央(直徑2cm的范圍內(nèi))，用于轟擊。(3)轟擊打開基因槍電源，將消毒后的可裂圓片裝入固定蓋，旋緊。取微彈懸浮液10μl點(diǎn)在消過(guò)毒的微彈載體中心區(qū)域，吹干，然后與阻擋網(wǎng)一并裝入發(fā)射裝置中。將待轉(zhuǎn)化的材料放在樣品板上(轉(zhuǎn)化材料與微彈之間的距離為7cm，但可調(diào)整)，關(guān)上轟擊室。抽真空，當(dāng)真空度為27—28Pa時(shí)，將VAC鍵轉(zhuǎn)到HOLD位置，按FIRE鍵使氦氣壓力達(dá)到可裂膜的壓力(900psi和1100psi)時(shí)進(jìn)行轟擊。(4)植株再生與篩選將轟擊12—16hr后的愈傷組織移至不加滲透壓調(diào)節(jié)劑和選擇壓的普通愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，繼續(xù)暗培養(yǎng)兩周后移至分化篩選培養(yǎng)基[參見(jiàn)(b)]，于25±2℃，16hr/8hr光照培養(yǎng)；約20天后將再生出的綠苗移至生根篩選培養(yǎng)基，于25±2℃，16hr/8hr光照培養(yǎng)，并將含有健壯根系的綠苗移栽到花盆中。實(shí)施例4利用花粉通道法轉(zhuǎn)化雄性不育單子葉植物。
除了轉(zhuǎn)化方法采用花粉通道法外，其它步驟與實(shí)施3相同。
權(quán)利要求
1.一種雄性不育植物的培育方法，包括(a).選擇植物雄性器官細(xì)胞骨架蛋白基因或其片段為目標(biāo)基因；(b).構(gòu)建封閉或抑制所述目標(biāo)基因表達(dá)的雄性不育基因表達(dá)盒；(c).將所述雄性不育基因表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官中；(d).將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官培養(yǎng)成雄性不育植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述雄性器官是花藥和/或花粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞骨架蛋白基因是肌動(dòng)蛋白基因、肌球蛋白基因或微管蛋白基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述封閉或抑制是使用目標(biāo)基因的反義基因進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述表達(dá)盒由只在植物花藥和/或花粉中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、目標(biāo)基因編碼區(qū)(ORF)全區(qū)或部分及終止子組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述導(dǎo)入是通過(guò)使用含有雄性不育基因表達(dá)盒的雄性不育表達(dá)載體來(lái)進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述終止子是Nos終止子、Ocs終止子或Ca MV35s終止子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的目標(biāo)基因編碼區(qū)包括花藥和/或花粉生長(zhǎng)和/或發(fā)育所需要基因的編碼區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所說(shuō)的表達(dá)載體是含有雄性不育基因表達(dá)盒、抗除草劑基因表達(dá)盒、選擇基因和/或報(bào)告基因表達(dá)盒的質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所說(shuō)的肌動(dòng)蛋白基因包括G—肌動(dòng)蛋白基因亞族和F—肌動(dòng)蛋白基因亞族。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述啟動(dòng)子是TA29、A3、A8、A9、AG、AmbaI、BA42、BA112、BA158、Bcp1，Bp4B.Bp4C，Bp19，BetvI，BetvIII，ca55，CDPK，ChiA，ChiB，ChsA，Def A，E1，E2，F(xiàn)2s，13#，17#，G10，KBG41，LAT52，LAT59，Lol PI，Lol Pib，Lec6，MS2，Osg6B，P2，SF1，SF2，SF3，SF5，SF6，SF9，SF16，SF18，SF19，TA13，TA20，TA32，TA56，T72，tap2，TUA1或Zm13啟動(dòng)子。
12.一種雄性不育基因，它是雄性器管的細(xì)胞骨架蛋白基因的反義基因。
13.一種雄性不育基因表達(dá)盒，其特征在于含有在植物花藥和/或花粉中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、封閉和/或抑制雄性器管的細(xì)胞骨架蛋白基因表達(dá)的編碼區(qū)(ORF)全區(qū)或部分及終止子。
14.一種雄性不育基因表達(dá)載體，其特征在于包括雄性不育基因表達(dá)盒和抗除草劑基因表達(dá)盒，其中所述的雄性不育基因表達(dá)盒由在植物花藥和/或花粉中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、封閉和/或抑制雄性器管的細(xì)胞骨架蛋白基因表達(dá)的編碼區(qū)(ORF)全區(qū)或部分及終止子組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的雄性不育基因表達(dá)載體，其特征在于所述的抗除草劑基因是Bar基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的雄性不育基因表達(dá)載體，其特征在于所述Bar基因是編碼草丁膦己乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
17.一種培育雄性不育保持系的方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的方法培育雄性不育系，其中的雄性不育基因表達(dá)盒上連鎖抗除草劑基因表達(dá)盒；以這種轉(zhuǎn)基因雄性不育系的植物為母本與其普通的植株作為父本進(jìn)行雜交，將雜種播種前后或苗期用相應(yīng)的除草劑進(jìn)行處理，存活植株為雄性不育保持系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雄性不育植物的培育方法,包括:選擇植物雄性器官細(xì)胞骨架蛋白基因或其片段為目標(biāo)基因;構(gòu)建封閉或抑制所述目標(biāo)基因表達(dá)的雄性不育基因表達(dá)盒;將所述雄性不育基因表達(dá)盒導(dǎo)入植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官中;將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官培養(yǎng)成雄性不育植株。該方法產(chǎn)生的雄性不育性完全、徹底、穩(wěn)定,既不會(huì)改變植物的優(yōu)良性狀也不會(huì)引入不良的農(nóng)藝性狀,不會(huì)受到光、溫等影響,不會(huì)給植物引入微生物基因。
文檔編號(hào)A01H1/04GK1326674SQ00109108
公開日2001年12月19日 申請(qǐng)日期2000年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月7日
發(fā)明者肖興國(guó), 閻隆飛, 張愛(ài)民, 李艷紅, 趙廣榮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)