專利名稱：植物體外培養(yǎng)中的起始方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)方法。具體來說，本發(fā)明涉及外植體的起始。
組織培養(yǎng)是一種公認(rèn)和有用的用于繁殖許多種類植物的方法。在植物器官中，由于根表面及其內(nèi)部富含土壤微生物，新挖出的根尤其難于作為體外培養(yǎng)的起始材料。
由根引發(fā)體外培養(yǎng)物的現(xiàn)有方法通常從表面清洗和消毒開始，然后獲得用于培養(yǎng)的外植體。適當(dāng)?shù)谋砻嫦颈黄毡檎J(rèn)為是成功開始體外培養(yǎng)的先決條件。針對(duì)這一目的，引入了各種化學(xué)物質(zhì)作為消毒劑并且已建立了不同的消毒方案。普通的表面消毒方法包括浸在消毒劑中，比如浸在次氯酸鈉中。為了獲得外植體，通常使用得自根中柱的髓組織。含有脈管組織的外植體經(jīng)常伴有高度污染，這是因?yàn)槊}管系統(tǒng)可能含有表面消毒所不能清除的內(nèi)部感染。在較小的根中，髓只占根的一小部分，因此很難將髓組織與根的其他部分分開。另外，分離根髓而不觸碰脈管系統(tǒng)從技術(shù)上也是困難的。在髓柱切除方法中，使用軟木鉆孔器來協(xié)助該過程，但這一技術(shù)要求高，操作困難經(jīng)常導(dǎo)致污染。而且，根髓分離步驟中會(huì)浪費(fèi)掉多數(shù)根組織，在外植體有限的情況下這就是一個(gè)嚴(yán)重的問題。
即使用先進(jìn)的表面消毒和操作技術(shù)，來自根組織的體外培養(yǎng)物也易出現(xiàn)高水平的污染。為了緩解這一問題已提出了各種方法。Tadashi在1998年召開的XXV國際園藝大會(huì)上提交的一份論文中描述了一種用于試管繁殖蘭花和其他植物的簡單技術(shù)，該技術(shù)不需將培養(yǎng)基滅菌或使用層流罩超凈臺(tái)。在該方法中，直接將一種消毒劑(次氯酸鈉或二氯異氰脲酸鈉)加入無菌培養(yǎng)基中。外植體和培養(yǎng)基的所有表面也噴灑了相同的消毒劑以減少污染。
在日本專利申請(qǐng)7264944中公開的另一種方法中，用超聲清洗儀器對(duì)多漿植物的植物組織進(jìn)行表面滅菌，用殺菌劑處理并用無菌水洗滌。
試圖減少污染的許多其他嘗試包括將抗生素應(yīng)用到培養(yǎng)基中以減少根組織的內(nèi)部感染。某些相關(guān)方法中，在表面消毒之后脈沖式地給予更高劑量的抗生素。但是，抗生素對(duì)真菌作用很??；而且使用抗生素還會(huì)引起選擇抗性菌株的顧慮。另一方面來說，抗生素脈沖處理(APT)法將對(duì)根外植體施加一個(gè)強(qiáng)的處理后應(yīng)變，影響愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的生長和胚胎再生以及從應(yīng)變中恢復(fù)的時(shí)間。此外，抗生素脈沖處理的整個(gè)過程是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。
與前面提及的問題相關(guān)聯(lián)的后果是成功引發(fā)培養(yǎng)物的效率低。因此多數(shù)研究人員采用了一種對(duì)大量植物材料進(jìn)行滅菌和培養(yǎng)的策略以便提高成功培養(yǎng)物的數(shù)量。這種作法需要額外的資源，包括植物材料、實(shí)驗(yàn)空間和人力。所用消毒劑對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響進(jìn)一步增加。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提高植物根體外培養(yǎng)產(chǎn)量的方法。


圖1的示意圖顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案從根組織切取外植體的方法。
圖2的數(shù)據(jù)顯示抗生素處理對(duì)由未進(jìn)行表面消毒的根切取下來的外植體其污染率的影響。
圖3顯示由未進(jìn)行表面消毒的西洋參(W)和人參栽培種D、E、L和R的根切取下來的外植體的累積污染率。該圖表明外植體的污染率取決于植物的種類和品種。其中W西洋參；D、E、L和R人參栽培種。
因此，本發(fā)明提供了一種由植物器官制備外植體的方法，該方法中省略了表面消毒。一方面，該方法避免了存在于器官表面的污染物在打開組織的過程中感染內(nèi)部組織。另一方面，可以無菌地接近并從器官中取下外植體材料以便進(jìn)行體外培養(yǎng)。該方法易于應(yīng)用在那些難以進(jìn)行表面滅菌的植物根上。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，只將根組織洗干凈并吸干水，無需作進(jìn)一步表面處理。然后將根橫切成兩段，每段有一個(gè)暴露的橫斷面。根的斷裂方式使得橫斷面上暴露的內(nèi)部組織保持無菌。然后從根上取下內(nèi)部組織并轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，給洗過并干燥好的根噴灑70％的乙醇并迅速過火以燃盡乙醇。然后在希望斷開的位置作一個(gè)淺的橫切口。然后在切口處將根橫斷開。用無菌解剖刀在橫斷面處經(jīng)無菌劃開并割取暴露的根組織。將得到的外植體培養(yǎng)在合適的基質(zhì)中。
本發(fā)明基于這樣的原理，即在植物器官(例如根)表皮界面以內(nèi)的組織，除非由于疾病或機(jī)械損傷造成的內(nèi)部感染，它們是無菌的。因此本發(fā)明的方法不是消除根外表面的污染物，而是涉及防止這些污染物在外植體切除過程中感染根的內(nèi)部。建立了這樣一種技術(shù)，由此不需首先將根的外表面消毒就可以無菌地得到根的內(nèi)部組織。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是使根組織遭受的脅迫最小化，從而保證有最好的可能的外植體材料來引發(fā)生成體外培養(yǎng)物。
本文中使用的術(shù)語“外植體”指用于引發(fā)生成體外培養(yǎng)物的任何植物材料。植物器官是指希望從中獲得外植體的植物的任何部位，比如莖、葉或根。根是指任何地下植物器官，包括儲(chǔ)藏器官比如球根和根莖等。消毒是指使微生物減至最少的一種處理。
以下的具體說明描述了一種應(yīng)用本發(fā)明的基本原理從植物根中獲得外植體材料的方法。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，以下描述的根組織的培養(yǎng)旨在闡述本發(fā)明，不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明討論的原理的限制。本發(fā)明尤其可用于伸長形狀的器官，其中組織培養(yǎng)者可以容易地用手指進(jìn)行折斷。在下面的討論和權(quán)利要求書中，術(shù)語“包括”、“具有”和“包含”是開放式的，因此應(yīng)解釋為表示“包括但不限于……”。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法可以大致分為三個(gè)步驟(a)表面處理；(b)器官的分段；以及(c)取下外植體進(jìn)行體外培養(yǎng)。
表面處理的最簡單的方法是一個(gè)簡單的清洗步驟在流動(dòng)的自來水中仔細(xì)地洗器官(比如根)以便除去土和細(xì)小的根毛。在優(yōu)選實(shí)施方案中，隨后在含有幾滴表面活性劑的1g/L benlate溶液中于不斷攪拌下浸泡40-60分鐘。在清洗步驟后，或在附加的benlate浸泡步驟后，將根在自來水下徹底漂洗，并吸干水分。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在浸泡前，向1g/L benlate溶液中加入幾滴吐溫20。然后優(yōu)選給根噴灑70％的乙醇并迅速過火以燃盡乙醇。
根的分段包括將其以內(nèi)部組織不會(huì)被任何根表面的污染物污染的方式斷成兩段。在一個(gè)方法中，由組織培養(yǎng)者簡單地將根斷成兩段，例如通過彎成U型。由于彎曲動(dòng)作，根會(huì)裂開，從而在每段的一個(gè)端口形成一個(gè)開放和暴露的橫截面，進(jìn)而保證暴露的橫截面不被污染。參見
圖1A-C，另一種方法包括在根19上橫向地作一個(gè)小的淺切口18。例如，可以作1-2mm深，3-5mm長的切口。然后在切口相對(duì)的一邊(箭頭20所示)將根彎曲以便將根折成兩段26和28。同樣，要小心以確保表面污染物不會(huì)感染暴露的內(nèi)部組織。
然后可以通過無菌操作取出根的內(nèi)部組織(包括髓和脈管組織)得到外植體，并將外植體材料置于合適的培養(yǎng)基中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組織培養(yǎng)者用例如手或手指牢固地把持外表面，同時(shí)用無菌手術(shù)刀仔細(xì)地劃開并挖出內(nèi)部組織。從內(nèi)部組織上取下外植體材料，要避開接近表皮的區(qū)域，每段留下一個(gè)空的外組織柱體。刮出來的部分用虛線表示。盡手術(shù)刀刃所能及地從段中取出內(nèi)部組織。為了接近更多內(nèi)部組織，在與空末端有一些距離的位置斷開根段。
圖1B顯示了位于節(jié)段28所選位置上的第2個(gè)小的淺切口34，在與切口34相對(duì)的位置22彎曲根。第2個(gè)切口產(chǎn)生了兩個(gè)小片段30和32。小片段30有一個(gè)空末端和一個(gè)有與切口位置相應(yīng)的新暴露的內(nèi)部組織的第2末端。再用無菌手術(shù)刀劃開并挖掘從而將每個(gè)小片段的內(nèi)部組織無菌操作取出(虛線表示)，并將外植體轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)基?？梢灾貜?fù)以上步驟直到取下了所有片段和小片段上的外植體材料。
所述培養(yǎng)基包含生長調(diào)節(jié)劑和標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基比如MS培養(yǎng)基(在以下實(shí)施例中定義)或任何其他適合引發(fā)生成體外培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，比如G5、SH和White等。
實(shí)施例由人參的根引發(fā)生成體外培養(yǎng)物材料與方法材料本研究中使用了5年齡人參和西洋參的新挖出的根。這些根平均直徑為2cm。小心清洗除去根上的土和細(xì)小的根毛，然后在1g/L benlate溶液(含有幾滴吐溫20)中于不停攪拌下浸40-60分鐘。Benlate處理后，將根在流動(dòng)的自來水下徹底清洗并吸干水分。這樣它們就可用于在層流罩超凈臺(tái)中切取外植體。
外植體切取給上面洗過的根噴灑70％的乙醇并迅速過火以燃盡乙醇。然后用手術(shù)刀給根做標(biāo)記。在表面上形成一個(gè)1-2mm深、3-5mm寬的切口，然后用手折成兩段。一只手持一個(gè)片段，用新手術(shù)刀仔細(xì)地切取(挖出)根組織并將外植體置于培養(yǎng)基上。盡手術(shù)刀刃所能及地將表皮界線以內(nèi)的根組織切出。此后在另一個(gè)片段上進(jìn)行同樣的操作。由于根沒有做表面消毒，應(yīng)注意不要切取根斷開前以手術(shù)刀標(biāo)記的區(qū)域，這是因?yàn)槲廴疚锟赡芡ㄟ^手術(shù)刀從根表面擴(kuò)散到標(biāo)記區(qū)域。
無法繼續(xù)切除外植體時(shí)，在根片段上做一個(gè)新切口，將該片段折成另外兩段以便進(jìn)行新一輪外植體切取。重復(fù)幾次制備根片段和切取外植體的步驟，直到再無法形成片段，整個(gè)根表皮界線以內(nèi)幾乎切空了。對(duì)于對(duì)照處理，在2-3％次氯酸鈉(NaOCl)溶液中將根表面消毒40-60分鐘，然后分成兩組。一組按照Teng和Nicholson(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)16531-535，1997)的描述再接受抗生素脈沖處理(APT)。第二組在NaOCl消毒后直接進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)條件將所有的外植體接種到培養(yǎng)基中，于23-25℃置暗處。培養(yǎng)基是MS(Murashige和Skoog,1962)基礎(chǔ)鹽附加0.5mg/l硫胺素-HCl、0.5mg/l吡哆醇、0.5mg/l尼克酸、1mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、3g/l phytogel和30g/l蔗糖。高壓滅菌前將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8-6.0。對(duì)添加抗生素的情況，各以250mg/l濃度添加過濾除菌的青霉素-G和硫酸鏈霉素。將培養(yǎng)在抗生素培養(yǎng)基中的外植體保溫2個(gè)月后轉(zhuǎn)移到無抗生素培養(yǎng)基中。
使用了包括西洋參和人參的兩個(gè)種的人參，后者包括在中國東北廣泛栽培的4個(gè)栽培種。對(duì)于每個(gè)種/栽培種使用了5-10個(gè)根，每個(gè)根看作一個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。從一個(gè)根切下來的外植體材料足夠接種10-15個(gè)培養(yǎng)皿，每皿含6個(gè)外植體。將這些培養(yǎng)皿看作每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的平行樣品。在開始的兩周內(nèi)，隔天評(píng)估一次感染率和愈傷組織的誘導(dǎo)，以后每月做一次。按月將外植體常規(guī)地轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基中。
結(jié)果參見表1，本發(fā)明的外植體制備方法不需經(jīng)過表面消毒，得到了明顯優(yōu)于使用表面消毒劑的傳統(tǒng)作法(稱為傳統(tǒng)方法)的結(jié)果。對(duì)于通過本發(fā)明方法由根得到的外植體，7個(gè)月后的累積污染為7-8％。而來自經(jīng)傳統(tǒng)方法用2-3％NaOCl溶液處理40-60分鐘的根的外植體，其污染率為85％。附加抗生素脈沖處理(APT)，盡管顯著地提高了引發(fā)培養(yǎng)物的成功率，污染率仍達(dá)到了50％。
表1
a．根在2-3％的NaOCl溶液中表面消毒40-60分鐘。表面消毒后給根添加(+)或不加(-)APT。
b．來自未表面滅菌的根的外植體在加有(+)或未加(-)250mg/l青霉素-G和硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
參見圖2，結(jié)合本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，第一個(gè)月里污染率進(jìn)一步下降；差別在第二個(gè)月中縮小，8個(gè)月后就不明顯了(還可參見表1)。由于抗生素帶來的成功率的提高小于4％，并且其有益效果隨時(shí)間而減小，因此認(rèn)為沒有必要在培養(yǎng)基中加入抗生素。
再參見表1，來自本發(fā)明方法的外植體上發(fā)生污染時(shí)，是隨機(jī)地從髓、脈管組織和皮層開始的；而對(duì)于來自傳統(tǒng)方法的外植體，污染主要從脈管組織開始。在后一種情況中污染由脈管組織起始暗示了脈管系統(tǒng)甚至在根收獲前就發(fā)生了內(nèi)部感染，這可能涉及水和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取及運(yùn)輸?shù)奶厥夤δ?。這類內(nèi)部污染無法通過表面消毒來消除，但正如由與無APT處理組相比，APT使污染下降35％所看到的，可以利用APT來盡量減少之。
即便附加APT的傳統(tǒng)方法仍有高水平污染(見表1)，由此判斷污染一部分歸因于內(nèi)部感染。本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法之間內(nèi)部感染結(jié)果的顯著差異的原因尚不清楚，由于研究用的根來自相同的來源，兩種方法制備的外植體發(fā)生內(nèi)部感染的機(jī)會(huì)應(yīng)當(dāng)沒有差別。可能內(nèi)部污染物更容易在遭受強(qiáng)烈脅迫(例如，表面消毒)的外植體上生長。相反地，在未受脅迫的外植體上它們可能處于潛伏狀態(tài)。已建立的穩(wěn)定的人參培養(yǎng)物上偶爾出現(xiàn)的污染可能與這種潛在污染(比如內(nèi)部感染)能潛伏數(shù)月到數(shù)年有關(guān)。
現(xiàn)在參見圖3，植物的種和栽培種差異是影響本發(fā)明方法效率的主要因素。在所用的四種西洋參栽培種中，栽培種“E”最易感染，8個(gè)月中的污染率達(dá)到20％，其次是栽培種“L”。在栽培種“R”中觀察到最低的污染率，為3％左右。栽培種“D”的污染率與人參的類似，在4％左右。
與傳統(tǒng)方法相比，除了提高起始培養(yǎng)的成功率，本發(fā)明方法能縮短誘導(dǎo)愈傷組織所需時(shí)間。由本發(fā)明方法制備的外植體在幾天后變黃，并在一周內(nèi)顯示出第一個(gè)可見的誘導(dǎo)出愈傷組織的跡象。由傳統(tǒng)方法制備的外植體在1-3周后變黃，并根據(jù)所受脅迫的程度在3-4周后顯示出第一個(gè)可見的愈傷組織誘導(dǎo)跡象。還記錄了利用本發(fā)明方法的明顯的愈傷組織生長情況，如表2所示。該結(jié)果提供了另一個(gè)證據(jù)表明表面消毒和附加APT對(duì)外植體有化學(xué)脅迫作用。
表2
a．根在1-3％的NaOCl溶液中表面消毒30-60分鐘。表面消毒后給根添加(+)或不加(-)APT。
b．來自未表面滅菌的根的外植體在加有(+)或未加(-)250mg/l青霉素-G和硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
總之，本發(fā)明方法比傳統(tǒng)方法有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)(1)不需要化學(xué)消毒劑，使得本發(fā)明方法對(duì)環(huán)境無害，(2)不需要表面消毒，簡化了外植體制備過程，(3)最大程度地利用根組織，對(duì)珍貴材料來說尤其重要，以及(4)可獲得高成功率，這將提高整個(gè)效率。最重要的是，不預(yù)先進(jìn)行表面消毒從根切取外植體的概念打破了處理根時(shí)，必須進(jìn)行表面消毒的一般觀點(diǎn)。預(yù)計(jì)該方法可以應(yīng)用于其他地下或地上儲(chǔ)藏器官，以及其他植物器官。
參考前面提及的圖表，并以人參種的根為重點(diǎn)具體描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)明白附圖僅用于說明，不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明的限制。另外，顯然本發(fā)明所述方法可用于許多需要無菌組織的應(yīng)用。預(yù)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離所述發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多改變和修正。因此，同樣的技術(shù)可能應(yīng)用到那些可以無菌地獲取和刮出內(nèi)部組織的莖和其他多汁植物器官。這類器官看作是根的等同物，并落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種體外培養(yǎng)植物器官的方法，包括清洗所述植物器官，但無須進(jìn)行表面消毒；將所述器官折斷從而產(chǎn)生兩個(gè)橫截面，所用方式使得斷裂暴露的器官內(nèi)部組織不被污染；無菌地切取表皮界線內(nèi)的所述未污染組織；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該取出的未污染組織。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述器官是植物根。
3．權(quán)利要求1的方法，在所述折斷步驟前另外包括一個(gè)切開所述器官表皮的步驟，該切口在所述表皮的表面上希望斷裂的位置上作出。
4．權(quán)利要求1的方法，在所述折斷步驟前另外包括一個(gè)將所述器官浸在化學(xué)溶液中的步驟，該清潔溶液能使真菌數(shù)量減至最少。
5．權(quán)利要求1的方法，在所述折斷步驟前另外包括一個(gè)將所述器官浸在化學(xué)溶液中的步驟，該化學(xué)溶液包含含有benlate的殺真菌活性組合物。
6．權(quán)利要求1的方法，在所述折斷步驟前另外包括一個(gè)切開所述器官根表皮的步驟，該切口在所述表皮的表面上希望斷裂的位置上作出；通過避開緊靠該切口的區(qū)域，再進(jìn)行所述的切取步驟。
7．權(quán)利要求1的方法，在所述折斷步驟前另外包括一個(gè)部分固定表面污染物的步驟。
8．權(quán)利要求1的方法，還包括一個(gè)給所述根表面噴灑乙醇并通過快速過火燃盡所述根上的乙醇的步驟，該噴灑步驟在所述折斷步驟前進(jìn)行。
9．一種體外培養(yǎng)植物根的方法，包括a)清洗所述植物根表面；b)將表面污染物部分固定在所述根的表面；c)對(duì)根進(jìn)行橫向切割產(chǎn)生一個(gè)淺的切口；d)在不污染所暴露出來的根內(nèi)表面的情況下，將所述根折成兩個(gè)橫段；e)無菌地取出表皮界線內(nèi)的未污染根組織；以及f)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述取出的未污染根組織。
10．權(quán)利要求9的方法，其中步驟a)不涉及消毒。
11．一種體外培養(yǎng)植物根的方法，包括a)清洗所述植物根表面；b)給所述植物根噴灑乙醇；c)短暫地?zé)幌赂?；d)將根橫向切出一個(gè)大約1-2mm深，3-5mm長的切口；e)在不污染所暴露出來的根內(nèi)表面的情況下，將所述根折成兩個(gè)橫段；f)無菌地取出表皮界線內(nèi)的未污染根組織；以及g)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述取出的未污染根組織。
12．權(quán)利要求11的方法，另外包括h)將所述橫段中的一段橫向切出一個(gè)大約1-2mm深，3-5mm長的第二切口；i)在不污染所暴露出來的根內(nèi)表面的情況下，將該段折成兩個(gè)小片段；j)從該小片段所暴露出的內(nèi)表面下無菌地取出未污染的根組織；以及k)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述取出的未污染根組織。
13．權(quán)利要求12的方法，還包括在產(chǎn)生的另外的小片段上重復(fù)步驟(h)到(k)。
14．權(quán)利要求11的方法，其中步驟a)包括在水中沖洗，然后浸在含有benlate的殺真菌活性組合物中。
15．一種由植物器官引發(fā)生成的體外植物培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物由無需消毒步驟的方法得到。
16．權(quán)利要求15的體外植物培養(yǎng)物，其中所述植物器官是根。
17．一種來自由植物器官引發(fā)生成的體外植物培養(yǎng)物的植物，所述培養(yǎng)物由無需消毒步驟的方法得到。
18．權(quán)利要求17的植物，其中所述植物器官是根。
全文摘要
一種由植物器官制備外植體的方法,其中省略了表面消毒。一方面,該方法避免了存在于器官表面的污染物在暴露組織的過程中感染內(nèi)部組織。另一方面,可以無菌地接近并從器官中取出外植體材料以便進(jìn)行體外培養(yǎng)。該方法易于應(yīng)用在那些難以進(jìn)行表面滅菌的植物根上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1296738SQ0012280
公開日2001年5月30日 申請(qǐng)日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者滕惠蘭 申請(qǐng)人:香港生物科技研究院有限公司