專利名稱：一種抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病菌蛋白及其基因，特別涉及一種抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因。
培育抗病品種是防治植物病害的根本措施，但傳統(tǒng)的雜交育種普遍具有周期長、抗病性及優(yōu)良的農(nóng)藝性狀難以兼得等缺點(diǎn)，采用基因工程手段向優(yōu)良作物品種導(dǎo)入外源抗性基因，為抗病育種開辟了新的途徑，而達(dá)到這一目標(biāo)的關(guān)鍵是分離有效的目的基因。許多拮抗細(xì)菌能夠產(chǎn)生抗菌蛋白，抗菌蛋白可以在體外直接殺死或抑制病原菌，如果能分離出抗菌蛋白的編碼基因，用基因工程的方法進(jìn)行抗病育種將是很有價(jià)值和意義的。
本發(fā)明目的在于提供一種抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因，即從水稻根際中分離得到一株多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)WY110(以下簡稱WY110)，WY110對水稻的三種主要病原菌——稻瘟病菌、水稻紋枯菌和水稻白葉枯病菌均具有很高的體外拮抗活性，兼具固氮活性，并具有較廣的拮抗譜，在溫室實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的植株防病效果，具有很好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景；從WY110菌株中分離純化得到一種對稻瘟病菌具有拮抗活性的抗真菌蛋白，并克隆和表達(dá)此抗真菌蛋白的編碼基因；此編碼基因經(jīng)修飾和重組后，可作為目的基因轉(zhuǎn)入水稻中進(jìn)行表達(dá)，以獲得抗稻瘟病的水稻品種，也可將其轉(zhuǎn)入其它水稻附生菌或內(nèi)生菌中而構(gòu)建高效生防工程菌。
本發(fā)明的實(shí)施方案如下本發(fā)明提供的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因，其特征在于該抗真菌蛋白由多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)WY110中分離純化得到；其編碼基因及氨基酸序列為GCG AAT GTG TTC TGG GAA CCA TTA AGT TAT 30ANVFWEPLSY 10TAT AAT CCG AGT ACA TGG CAA AAG GCA GAT 60YNPSTWQKAD 20GGA TAT TCC AAT GGG GAC ATG TTT AAT TGC 90GYSNGDMFNC 30ACTTGGCGTGCCAATAATGTCAATTTTACT 120T W R A N N V N F T 40AACGATGGCAAAATGAAGCTTAGCTTAACG 150N D G K M K L S L T 50AGTTCTGCGTATAATAAATTTGACGGCGGA 180S S A Y N K F D G G 60GAGTATCGTTCGAAGAATACTTACAGATAC 210E Y R S K N T Y R Y 70GGCTTATACGAGGTCAACATGAAGCCTGCG 240G L Y E V N M K P A 80AAAAATACAGGAATCGTATCTTCCTTTTTC 270K N T G I V S S F F 90ACATATACGGGACCTGCTAATGGCACGCAA 300T Y T G P A N G T Q100TGGGATGAAATAGATATTGAATTTTTAGGA 330W D E I D I E F L G110AAAGACACAACAAAAGTGCAATTTAACTAT 360K D T T K V Q F N Y120TATACAAACGGGATCGGTGGTCATGAGAAG 390Y T N G I G G H E K130GTTGTCGATCTGGGTTTTGATGCATCAAGT 420V V D L G F D A S S140GGCTTCCACACCTATGCATTCGATTGGCAG 450G F H T Y A F D W Q150CCAGGATACATTAAGTGGTATGTTGACGGG 480P G Y I K W Y V D G160GTTCTAAAGCATACGGCAACTACGAACATA 510V L K H T A T T N I170CCGAAAACGCCAGGCCAAATTATGATGAAT 540P K T P G Q I M M N180TTATGGAATGGCACCGGAGTAGATAGCTGG 570L W N G T G V D S W190TTAGGTCCATATAACGGAGTCAATCCGTTG 600L G P Y N G V N P L200TACGCCGAATATGACTGGGTAAAATATACG 630Y A E Y D W V K Y T210
AGC AAT636S N 212該抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因由636個(gè)核苷酸組成，編碼由212個(gè)氨基酸組成的具有拮抗稻瘟病菌活性的蛋白質(zhì)；其進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物序列為上游引物(22mer)5′TT GCG AAT GTG TTC TGG GAA CC 3′下游引物(26mer)5′TA CTA ATT GCT CGT ATA TTT TAC CCA 3′使用該抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的編碼基因進(jìn)行抗稻瘟病水稻轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。
本發(fā)明為一種從WY110菌株中分離純化得到的對稻瘟病菌具有拮抗活性的抗真菌蛋白，并克隆和表達(dá)此抗真菌蛋白的編碼基因，此編碼基因經(jīng)修飾和重組后，可作為目的基因轉(zhuǎn)入水稻中進(jìn)行表達(dá)，以獲得抗稻瘟病的水稻品種，也可將其轉(zhuǎn)入其它水稻附生菌或內(nèi)生菌中而構(gòu)建高效生防工程菌，其應(yīng)用前景廣闊。
其制備如下將拮抗活性檢測后的多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)WY110接種于LB液體培養(yǎng)液(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，pH7.0-7.2)中，振蕩培養(yǎng)過夜作為種子液，按1％的接種量轉(zhuǎn)接于7升自動發(fā)酵罐(BIOFLOH，NBS公司)培養(yǎng)，有效容積5升，30℃，pH7.2，調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速使溶氧保持在20％左右，培養(yǎng)18小時(shí)；發(fā)酵液于4℃ 4000rmp離心15分鐘，除去菌體，收集上清液；加硫酸銨于上清液至70％的飽和度，4℃靜置過夜；8000rmp 4℃離心20分鐘沉淀蛋白，溶于適量10mM的磷酸鈉鹽緩沖液(PBS，pH8.0)中得到蛋白粗提液；蛋白粗提液上Sephadex G-25凝膠過濾柱(Φ2.6×40cm)，用10mM的PBS，pH8.0洗脫收集的蛋白組分，每次上樣30ml，連續(xù)上樣洗脫，流速為5ml/min；脫鹽后的粗蛋白液上DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱(Φ2.6×20cm)，用10mM的PBS(pH8.0)緩沖液洗脫，流速為4ml/min，收集穿柱部分，收集的樣品經(jīng)SDS-PAGE和抑菌活性檢測，合并后用蔗糖包埋，4℃濃縮后上Superdex-75凝膠過濾層析柱(Φ2.6×60cm)，10mM的PBS(pH8.0)洗脫，流速為2ml/min，分部收集；經(jīng)SDS-PAGE和抑菌活性檢測后，收集目的峰，即為本發(fā)明的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白純品，低溫保存。
上述通過硫酸銨分級沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Supersex-75分子篩層析方法從多粘類芽孢桿菌WY110發(fā)酵液中分離純化制備的對稻瘟病菌具有拮抗作用的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的拮抗活性，見圖1所示，圖1為該抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白對稻瘟病的拮抗活性的示意圖，其中A為對照，B為粗蛋白，C為純化的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白蛋白，D為E.Coli重組表達(dá)的抗稻瘟病菌蛋白。
純化的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，凝膠置于CAPS緩沖液(含有0.1M 3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid，10％甲醇，pH11.0)中浸泡2分鐘，同時(shí)將測序級PVDF膜在無水甲醇中浸泡15秒，再移至CAPS緩沖液中；將SDS-PAGE凝膠上的抗真菌蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；切下PVDF膜上的抗真菌蛋白帶，直接在ABI公司的蛋白序列儀(Applied Biosystems 491Protein Sequencer)上測定N末端部分序列，該抗真菌蛋白的部分氨基酸序列為H2N-Ala-Asn-Val-Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn采用BLASTP程序(Altschul S F et al，1997)，在網(wǎng)上通過NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心，NIH下屬機(jī)構(gòu))Web服務(wù)器(網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，根據(jù)抗真菌蛋白N-末端部分氨基酸序列進(jìn)行類似性檢索，其與來源于芽孢桿菌的β-1，3-1，4-葡聚糖酶(β-1，3-1，4-glucanase，lichenase，EC3.2.1.73)或β-1，3-1，4-葡聚糖酶前體及重組酶的序列具有相似形；經(jīng)酶活性檢測，該抗真菌蛋白具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶，見圖3，圖3為該抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的示意圖，其中的A為對照，B為抗稻瘟病菌蛋白質(zhì)的組蛋白，C為純化的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白，D為E.Coli重組表達(dá)的抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白，這是首次發(fā)現(xiàn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有抗真菌活性。
根據(jù)已知的蛋白N末端氨基酸序列及β-1，3-1，4-葡聚糖酶C端保守性序列，并參照國外發(fā)表的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列(Gosalbes M J，1991)，分別設(shè)計(jì)了上、下游引物上游引物(22mer)5′TT GCG AAT GTG TTC TGG GAA CC 3′下游引物(26mer)5′TA CTA ATT GCT CGT ATA TTT TAC CCA 3′
以多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa WY110總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到0.6kb的特異性片段，與預(yù)期大小基本相符，回收此片段；將PCR產(chǎn)物回收純化后的片段與pMD18-T載體通過TA互補(bǔ)非定向連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109；經(jīng)篩選得到插有目的基因片段的陽性克隆，以F primer(M13-47)為引物進(jìn)行核苷酸序列測定目的基因5’端72個(gè)核苷酸序列與抗真菌蛋白N端已知的24個(gè)氨基酸序列完全吻合，這證明克隆的基因就是抗真菌蛋白的編碼基因，其序列全長636nt，由此得到該抗真菌蛋白的氨基酸系列全長212aa，其編碼基因及氨基酸序列為如圖2所示。
進(jìn)一步以其重組質(zhì)粒DN1A為模板，設(shè)計(jì)引物時(shí)加入兩端酶切位點(diǎn)及腸激酶裂解位點(diǎn)，通過PCR擴(kuò)增引入目的基因中，克隆PCR產(chǎn)物，測序結(jié)果表明讀框正確；目的基因雙酶切后與GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX3X定向連接，成功構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體；經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破菌，提取蛋白，用谷胱甘肽親和層析柱純化GST融合蛋白，腸激酶裂解釋放出目的蛋白；經(jīng)Western-blotting檢測，此蛋白可與抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白制備的抗體發(fā)生特異免疫反應(yīng)，生物測定表明目的該抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白對稻瘟病菌具有明顯抑菌活性，并具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性，這證明克隆的DNA片段為正確的抗真菌蛋白基因。從生物體(包括植物、昆蟲和微生物)內(nèi)尋找具有拮抗病原菌的蛋白及其基因是獲得植物抗病基因工程育種的目的基因的一個(gè)手段。幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶可以抑制病原真菌生長并將外源的基因?qū)胫参镏幸蕴岣咧参矬w內(nèi)酶的表達(dá)水平達(dá)到抗病目的。β-1，3-1，4-葡聚糖酶作為葡聚糖苷酶的一種，尚未有抑制真菌生長的報(bào)道，本發(fā)明首次從多粘類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)WY110中分離純化出一種對稻瘟病菌具有抑制作用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶并克隆到其基因，它將為轉(zhuǎn)基因抗稻瘟病水稻育種提供新的抗病基因。
使用該抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的編碼基因進(jìn)行抗稻瘟病水稻轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。


圖1抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白對稻瘟病菌的拮抗活性示意圖其中，A為對照，B為粗蛋白，C為純化的抗稻瘟病菌蛋白，D為E.Coli重組表達(dá)的抗稻瘟病菌蛋白；圖2抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的編碼基因及氨基酸序列；
圖3抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白的β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性示意圖其中，A為對照，B為粗蛋白，C為純化的抗稻瘟病菌蛋白，D為E.Coli重組表達(dá)的抗稻瘟病菌蛋白。
權(quán)利要求
1.一種抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因，其特征在于，該抗真菌蛋白由多粘類芽胞桿菌WY110中分離純化得到，其編碼基因及氨基酸序列為GCG AAT GTG TTC TGG GAA CCA TTA AGT TAT 30ANVFWEPLSY 10TAT AAT CCG AGT ACA TGG CAA AAG GCA GAT 60YNPSTWQKAD 20GGA TAT TCC AAT GGG GAC ATG TTT AAT TGC 90GYSNGDMFNC 30ACT TGG CGT GCC AAT AAT GTC AAT TTT ACT120TWRANNVNFT 40AAC GAT GGC AAA ATG AAG CTT AGC TTA ACG150NDGKMKLSLT 50AGT TCT GCG TAT AAT AAA TTT GAC GGC GGA180SSAYNKFDGG 60GAG TAT CGT TCG AAG AAT ACT TAC AGA TAC210EYRSKNTYRY 70GGC TTA TAC GAG GTC AAC ATG AAG CCT GCG240GLYEVNMKPA 80AAA AAT ACA GGA ATC GTA TCT TCC TTT TTC270KNTGIVSSFF 90ACA TAT ACG GGA CCT GCT AAT GGC ACG CAA300TYTGPANGTQ 100TGG GAT GAA ATA GAT ATT GAA TTT TTA GGA330WDEIDIEFLG 110AAA GAC ACA ACA AAA GTG CAA TTT AAC TAT360KDTTKVQFNY 120TAT ACA AAC GGG ATC GGT GGT CAT GAG AAG390YTNGIGGHEK 130GTT GTC GAT CTG GGT TTT GAT GCA TCA AGT420VVDLGFDASS 140GGC TTC CAC ACC TAT GCA TTC GAT TGG CAG450GFHTYAFDWQ 150CCA GGA TAC ATT AAG TGG TAT GTT GAC GGG480PGYIKWYVDG 160GTT CTA AAG CAT ACG GCA ACT ACG AAC ATA510VLKHTATTNI 170CCG AAA ACG CCA GGC CAA ATT ATG ATG AAT540PKTPGQIMMN 180TTA TGG AAT GGC ACC GGA GTA GAT AGC TGG570LWNGTGVDSW 190TTA GGT CCA TAT AAC GGA GTC AAT CCG TTG600LGPYNGVNPL 200TAC GCC GAA TAT GAC TGG GTA AAA TAT ACG630YAEYDWVKYT 210AGC AAT636SN 212抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因由636個(gè)核苷酸組成，編碼由212個(gè)氨基酸組成的具有拮抗稻瘟病菌活性的蛋白質(zhì)。
2.按權(quán)利要求1中所述抗稻瘟病菌的抗真菌蛋白及其基因，其特征在于其進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物序列為上游引物22mer5′TT GCG AAT GTG TTC TGG GAA CC 3′下游引物26mer5′TA CTA ATT GCT CGT ATA TTT TAC CCA 3′
全文摘要
本發(fā)明涉及對稻瘟病菌具有拮抗活性的抗真菌蛋白及其基因,由多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)WY110菌株中分離純化得到,測定其N末端氨基酸序列,利用根據(jù)末端序列合成的引物用PCR擴(kuò)增技術(shù)在大腸桿菌中克隆并有效表達(dá)了此抗真菌蛋白的編碼基因,此抗真菌蛋白及基因可用于水稻抗稻瘟病基因工程育種和構(gòu)建廣譜高效工程生防菌。
文檔編號A01N63/00GK1353182SQ0013340
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者王云山, 姚烏蘭, 宋未, 蘇志國 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所