專利名稱：增加植物中類黃酮和酚類成分含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增加植物中類黃酮和酚類成分含量的方法，其中用具有式I的生長調(diào)節(jié)性?；h(huán)己烷二酮及這些化合物的適合鹽類處理這些植物， 其中R尤其是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C10烷基硫基烷基或苯基(取代的或未取代的)，R’是氫、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、苯甲基(取代或未取代的)、苯基乙基、苯氧基乙基、2-噻吩基甲基、烷氧基甲基或烷基硫基甲基。
尤其優(yōu)選其中采用酰基環(huán)己烷二酮例如環(huán)己酮酸鈣(II)和/或抗倒酯(III)進(jìn)行處理以引起所述增加的方法。 本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法采用式I的?；h(huán)己烷二酮，尤其是環(huán)己酮酸鈣或抗倒酯處理過的植物、或這些植物的部分、或利用它們制備的產(chǎn)物(汁液、浸液、提取物、發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵殘余物)，在制備用于人和動物的治療性組合物、健康促進(jìn)組合物或補(bǔ)品，及化妝品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法制備的組合物，其中對如下紅葡萄樹的葡萄進(jìn)行收獲和加工，該紅葡萄樹的花色素苷產(chǎn)生由于?；h(huán)己烷二酮例如環(huán)己酮酸鈣或抗倒酯的處理而受到完全或部分地抑制，并且該植物由此因類黃酮和其它酚類成分含量的定性和定量增加而著稱。
植物中發(fā)現(xiàn)有多種酚類物質(zhì)(phenylpropanoid)，例如咖啡酸、阿魏酸、綠原酸、五倍子酸、丁子香酚、木聚素、香豆素、木質(zhì)素、芪(虎杖苷、白藜蘆醇)、類黃酮(黃酮、兒荼素、黃烷酮、花色素、異黃酮)、多聚甲氧基化黃酮。因此，在大量植物來源的食品和刺激物中酚也是一種普通成分。某些酚類物質(zhì)尤其重要，因?yàn)楫?dāng)隨著食物一起消化后它們可以在人和動物的代謝中起到抗氧化作用(Baum，B.O.；Perun，A.L.，抗氧化效力與結(jié)構(gòu)(Antioxidant efficiency versus structure)，Soc.Plast.Engrs Trans 2250-257(1962)；Gardner，P.T.；McPhail，D.B.；Duthie，G.G.，電子自旋共振光譜評估水和有機(jī)介質(zhì)中浸液的抗氧化潛能(Electron spin resonance spectroscopic assessment of theantioxidant potential of infusions in aqueous and organic media)，J.Sci.Food Agric.76257-262，(1997)；Rice-Evans，C.A.；Miller，N.J.；Pananga，G.，類黃酮和酚酸的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的關(guān)系(Structure-antioxidant activity relationship of flavonoids andphenolic acids)，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.20933-956，(1996)；Salah，N.；Miller，N.J.；Paganga，G.；Tijburg，L.；Bolwell，G.P.；Rice-Evans，C.，作為水相自由基清除劑和鏈斷裂抗氧化劑的多酚類黃酮(Polyphenolic flavonoids as scavenger of aqueous phase radicalsand as chain-breaking antioxidants)，Arch Biochem Biophys 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Comm239334-339，1997)。還已知某些植物來源的食品或從它們制備的刺激物對各種疾病具有積極影響。例如，白酒尤其是紅酒中(除了其它成分外)存在的白藜蘆醇具有抗心血管疾病和癌癥的活性(Gehm，B.D.；McAndrews，J.M.；Chien，P.-Y.；Jameson，J.L.葡萄和酒中發(fā)現(xiàn)的一種多酚化合物，白藜蘆醇，是雌激素受體的激動劑(Resveratrol，apolyphenolic compound found in grapes and wine，is an agonist forestrogen receptor)，Proc Natl Acad Sci USA 9414138-14143，(1997)；Jang，M.；Cai，L.；Udeani，G.O.；Slowing，K.V.；Thomas，C.F.；Beecher，C.W.W.；Fong，H.H.S；Farnsworth，N.R.；Kinghorn，A.D.；Mehtha，R.G.；Moon，R.C.，Pezzuto，J.M.一種來源于葡萄的天然產(chǎn)物，白藜蘆醇，的癌癥化學(xué)防止活性(Cancer chemopreventiveactivity of resveratrol，a natural product derived from grapes)，Science 275218-220，(1997))。在存在于茶樹(Camellia sinenesis)葉中的兒茶素、表兒荼素-3-五倍子酸鹽、表焙兒茶素和表焙兒茶素-3-五倍子酸鹽等物質(zhì)中，也發(fā)現(xiàn)有類似效果。飲料，尤其是用未發(fā)酵的茶樹葉制備的那些飲料(綠茶)，是有益于健康的(Hu，G.；Han，C.；Chen，J.綠茶和(-)-表焙兒茶素五倍子酸鹽對小鼠中癌基因表達(dá)的抑制(Inhibition of oncogene expression by green tea and (-)-epigallocatechin gallate in mice)，Nutr Cancer 24203-209；(1995)；Scholz，E；Bertram，B.Camellia sinensis(L.)O.Kuntze，DerTeestrauch[the tea 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?；h(huán)己烷二酮例如環(huán)己酮酸鈣和抗倒酯(原名cimectacarb)被作為生物調(diào)節(jié)劑用于抑制植物的縱向生長。它們的生物調(diào)節(jié)作用是基于它們對促進(jìn)縱向生長的赤霉素生物合成的阻斷。由于它們與2-酮戊二酸的結(jié)構(gòu)相關(guān)性，它們可抑制某些需要2-酮戊二酸作為共底物的雙加氧酶(Rademacher，W，植物生長延緩劑的生物化學(xué)作用，《植物生物化學(xué)調(diào)節(jié)劑》(Biochemical effects of plant growth retardants，inPlantBiochemical Regulators)，Gausman，HW(編)，Marcel Dekker公司，NewYork，第169-200頁(1991))。已知這些化合物還參與酚的代謝，因此能夠在各種植物中引起對花色素苷產(chǎn)生的抑制(Rademacher，W等，?；h(huán)己烷二酮的作用模式-一種新型生長延緩劑，《植物生物調(diào)節(jié)進(jìn)程》(Themode of action of acylcyclohexanediones-a new type of growthretardant，inProgress in Plant Growth Regulation)，Karssen，CM，van Loon，LC，Vreugdenhil，D(編)，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht(1992))。對酚類成分平衡的這些影響被認(rèn)為是火燒病中環(huán)己酮酸鈣的副作用原因(Rademacher，W等，環(huán)己酮酸Ca-一種用于蘋果的具有有趣生化特性的新植物生長調(diào)節(jié)劑(prohexadione-Ca-a newplant growth regulator for apple with interesting biochemicalfeatures)，美國植物生長調(diào)節(jié)學(xué)會的第25屆年會上Poster的報(bào)告，7月7-10，1998，Chicago)。A.Lux-Endrich(在Weihenstephan的TechnicalUniversity Munich的PhD論文，1998)在她的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)己酮酸鈣對抗火燒病的作用機(jī)制，即在蘋果的細(xì)胞培養(yǎng)物中，環(huán)己酮酸鈣導(dǎo)致酚類物質(zhì)含量的幾倍增加，并發(fā)現(xiàn)本來本不存在的一些酚。在該研究中她還發(fā)現(xiàn)暴露于環(huán)己酮酸鈣會引起該蘋果的莖組織中出現(xiàn)相對大量的luteoliflavan和圣草酚。通常在蘋果組織中并沒有l(wèi)uteoliflavan，而且僅有小量作為類黃酮代謝中間物的圣草酚。然而，在該處理的組織中不能檢測到預(yù)期的類黃酮兒茶素和花青素，或是僅發(fā)現(xiàn)有顯著減少的量(S.Rmmelt等，第8屆國際火燒病討論會的報(bào)道(paperpresented at the 8th International Workshop on Fire Blight)，現(xiàn)有顯著減少的量(S.Rmmelt等，第8屆國際火燒病討論會的報(bào)道(paper presented at the 8th International Workshop on FireBlight)，Kusadasi，Turkey，10月12-15，1998)。
以下可以認(rèn)為是正確的，即環(huán)己酮酸鈣、抗倒酯和其它酰基環(huán)己烷二酮抑制酚類物質(zhì)代謝中重要的2-酮戊二酸依賴性羥化酶。這些羥化酶主要是查耳酮合成酶(CHS)和黃烷酮3-羥化酶(F3H)(W.Heller和G.Forkmann，生物合成，《類黃酮》，Harborne，JB(編)，Chapman和Hall，紐約，1988)。然而，不能排除，酰基環(huán)己烷二酮也可抑制未知的其它2-酮戊二酸依賴性羥化酶。而且，明顯地，植物顯示出缺少兒茶素、花青素或類黃酮合成的其它終產(chǎn)物，并且反饋機(jī)制可增加關(guān)鍵酶苯丙氨酸銨裂解酶(PAL)的活性。然而，由于CHS和F3H仍然受到抑制，故不能形成這些類黃酮終產(chǎn)物，并且導(dǎo)致luteoliflavan、圣草酚和其它酚的產(chǎn)生增加(


圖1)。
本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種經(jīng)濟(jì)簡單的用于增加植物中類黃酮和酚類化合物含量的方法，和提高它們的健康促進(jìn)性質(zhì)。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，令人驚奇的是，通過用?；h(huán)己烷二酮(I)類生長調(diào)節(jié)性化合物，尤其是用化合物環(huán)己酮酸鈣(II)和抗倒酯(III)處理植物可以實(shí)現(xiàn)此目標(biāo) 用式(I)的?；h(huán)己烷二酮，即原己二酮(II)和抗倒酯(III)處理植物可以使C3原子被氫取代的類黃酮圣草酚、原花色素，例如luteoforol、luteoliflavan、apigeniflavan和tricetiflavan、以及上述結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)的同種和異種寡聚物和多聚物，以更大的量形成。
在給植物施用式(I)的酰基環(huán)己烷二酮化合物，即原己二酮(II)-鈣和抗倒酯(III)后，可以鑒定出羥基桂皮酸(對羥基桂皮酸、阿魏酸、芥子酸)、水楊酸或傘形酮，包括它們形成的同種和異種寡聚物和多聚物在內(nèi)，的酚類物質(zhì)濃度的增加。
用式(I)的?；h(huán)己烷二酮，即環(huán)己酮酸鈣(II)和抗倒酯(III)處理植物，還可增加植物中類黃酮糖苷、酚類化合物、查耳酮、芪的濃度。
而且，環(huán)己酮酸鈣、抗倒酯和相關(guān)的化合物還參與了至今僅可以認(rèn)為2-酮戊二酸酯依賴性雙加氧酶參與的其它代謝反應(yīng)。
從高等植物中獲得具有提高的治療性、健康促進(jìn)性或滋補(bǔ)作用的制品的另一個(gè)額外的積極效應(yīng)是，由于環(huán)己酮酸鈣、抗倒酯或相關(guān)?；h(huán)己烷二酮的生長調(diào)節(jié)作用，將在生物學(xué)物質(zhì)中產(chǎn)生該有關(guān)成分的濃度效應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明通過采用式(I)的酰基環(huán)己烷二酮類化合物，尤其是環(huán)己酮酸鈣(II)或抗倒酯(III)處理植物，以增加類黃酮和酚類成分含量的方法，可以成功地應(yīng)用于以下植物，但也可以成功地用于處理未提及的植物葡萄樹、櫻桃、李子、黑刺李、越桔、草莓、柑橘類水果(例如橙、柚子)、木瓜、紅環(huán)甘藍(lán)、硬花甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、胡蘿卜、歐芹、芹菜/塊根芹、洋蔥、大蒜、茶、咖啡、可可、馬黛、忽布、大豆、油籽蕓苔、燕麥、小麥、黑麥、Aronia melanocarpa和白果。
為了增加類黃酮和酚類化合物的含量，用?；h(huán)己烷二酮類化合物，尤其是環(huán)己酮酸鈣或抗倒酯處理過的植物，或這些植物的部分或從它們制備的產(chǎn)物(汁液、浸液、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品和發(fā)酵殘余物)可以用于制備人和動物用治療性組合物、健康促進(jìn)組合物或補(bǔ)品，和化妝品。
還可以從根據(jù)本發(fā)明處理的植物中制備組合物，其中收獲并加工如下紅葡萄樹的葡萄，該紅葡萄藤的花青素產(chǎn)生由于酰基環(huán)己烷二酮例如環(huán)己酮酸鈣或抗倒酯的處理而被完全或部分地抑制，而且該植物由此因類黃酮和其它酚類成分含量的定性和定量增加而著稱。
令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用式I的?；h(huán)己烷二酮，即環(huán)己酮酸鈣或抗倒酯，進(jìn)行處理的植物、這些植物的部分或從它們制備的產(chǎn)物(浸液、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、汁液等)的作用下(1)提高體外抗氧化能力(電子自旋共振(ESR)、LDL氧化、總的抗氧化能力、NO清除)；(2)觀察到對酶，尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶(蛋白激酶C、酪氨酸蛋白質(zhì)激酶、磷脂酰肌醇3-激酶)的調(diào)節(jié)作用；(3)在內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo)對氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB、AP-1)的調(diào)節(jié)；(4)調(diào)節(jié)參與炎癥發(fā)病機(jī)理的靶基因(細(xì)胞因子IL-1和IL-8、巨噬細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白質(zhì)1(MCP-1)、粘著因子ICAM-1和VCAM-1)的基因表達(dá)調(diào)控；(5)誘導(dǎo)抗聚集作用；(6)抑制肝細(xì)胞中膽固醇的合成；(7)觀察到抗增殖/抗腫瘤性轉(zhuǎn)化效應(yīng)。
結(jié)果顯示在下表中用環(huán)己酮酸鈣處理過的葉片在12和21天后表現(xiàn)出顯著增加的圣草酚濃度。
實(shí)施例2從處理和未處理的Dornfelder葡萄中制備樣品材料在不同的時(shí)間點(diǎn)上用含有環(huán)己酮酸鈣的制劑BAS 125 10W處理葡萄栽培品種“Dornfelder”兩次。每次處理每公傾施用含有1000g環(huán)己酮酸鈣的1000l噴灑混合物。
第1次施用在漿果出現(xiàn)顏色前發(fā)育階段73時(shí)進(jìn)行，第2次施用在此之后10天進(jìn)行。
收獲時(shí)，該未處理和處理的葡萄表現(xiàn)出相似的成熟程度。未處理對照69°Oechsle，酸7.3g/l；處理對照67°Oechsle，酸7.4g/l。
在該處理過的葡萄中色素沉著較不明顯。關(guān)于味道，沒有觀察到不同。
通過常規(guī)方法將這些葡萄制成紅酒，即必需將果肉持續(xù)放置一段時(shí)間以提高色素的提取。
將無暗晦的酒凍干后，從100ml未處理的酒中獲得大約2.5g糖漿樣殘余物，從用環(huán)己酮酸鈣處理過的那些葡萄制成的酒中獲得大約2.1g糖漿樣殘余物。實(shí)施例3環(huán)己酮酸鈣處理的Dornfelder酒對原代大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)物中膽固醇生物合成的抑制貯存液的配制精確稱重10mg-20mg量的該未處理和處理過的Dornfelder酒的凍干物，并用一定量的DMSO處理，獲得含有10mM總類黃酮的貯存液。在試驗(yàn)即將開始之前采用這些貯存液在培養(yǎng)基中配制稀釋液。這些稀釋按10倍稀釋步驟從10-4至10-8M進(jìn)行。肝細(xì)胞培養(yǎng)物的制備通過膠原酶灌流(Gebhardt等，Arzneimittel-Forschung/Drug Res.41800-804(1991)1990)，從Sprague-Dawley大鼠(240-290g)肝中獲得原代肝細(xì)胞。將它們培養(yǎng)在含有補(bǔ)加了10％小牛血清的Williaas培養(yǎng)基E的膠原蛋白包被培養(yǎng)皿(6孔板，Greiner，Nurtingen)中，細(xì)胞密度為125,000個(gè)細(xì)胞/cm2。更詳細(xì)的信息，尤其是關(guān)于該培養(yǎng)基的信息，參見Gebhardt等，Cell Biol.Toxicol.6369-372(1990)；和Mewes等，Cancer Res.535135-5142(1993)。2小時(shí)后，將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至補(bǔ)加了0.1μM胰島素的無血清培養(yǎng)基中。再20個(gè)小時(shí)后，將它們用于試驗(yàn)。在2-3只大鼠的3個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物中對每一種測試物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。肝細(xì)胞培養(yǎng)物與測試物質(zhì)的孵育為了闡明測試物質(zhì)影響了膽固醇的生物合成，維持該肝細(xì)胞培養(yǎng)物總共22個(gè)小時(shí)。然后，在補(bǔ)加了14C-乙酸鹽(僅示蹤量)的無血清Williams培養(yǎng)基E中將它們與指定濃度的測試物質(zhì)一起孵育2小時(shí)。每個(gè)試驗(yàn)系列均包括一個(gè)對照。該方法詳細(xì)描述于Gebhardt(1991)和Gebhardt，脂類(Lipids)28613-619(1993)。該示蹤量的14C乙酸鹽快速地與細(xì)胞內(nèi)乙酰CoA庫發(fā)生交換，由此使得14C乙酸鹽可以摻入其中＞90％組成膽固醇的固醇組分中，以致可以在不受干擾的情況下對其進(jìn)行檢測(Gebhardt，1993)。分析對膽固醇生物合成的影響采用Gebhardt(1991)的方法測定14C-乙酸鹽在固醇組分(不能水解的脂)中的摻入。如果采用Extrelut柱(Merck，Darmstadt)進(jìn)行該提取，則將除去大于95％的14C-乙酸鹽(和由此形成的其它微量低分子量代謝物)。該試驗(yàn)?zāi)軌蛱峁┰跍y試物質(zhì)影響下膽固醇和前體固醇相對合成速率的比較信息(Gebhardt，1993)。肝細(xì)胞培養(yǎng)物的目視微生物質(zhì)量檢查在該試驗(yàn)孵育前和后，在顯微鏡下目視檢查所使用的所有培養(yǎng)物的微生物感染情況和細(xì)胞單層完整性情況。在所有的樣品中均沒有觀察到細(xì)胞形態(tài)的顯著改變(尤其是在較高濃度時(shí))。這很大程度上排除了該測試結(jié)果受到測試物質(zhì)細(xì)胞毒效應(yīng)的影響這一可能性。
在所有培養(yǎng)物中常規(guī)進(jìn)行的此無菌試驗(yàn)提示沒有任何微生物感染。結(jié)果該未處理的Dornfelder酒表現(xiàn)出對膽固醇的生物合成無任何影響。相反，來源于經(jīng)環(huán)己酮酸鈣處理的葡萄的酒樣品顯著地抑制該膽固醇合成。在10-5M濃度時(shí)，該抑制作用為大約60％，而在10-4M時(shí)幾乎為100％。
環(huán)己酮酸處理的酒提取物增加了H2O2誘導(dǎo)的對白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但在正常巨噬細(xì)胞中無效。在通過增加的氧化壓力(例如anthracycline)起作用的細(xì)胞抑制情況下，也觀察到此腫瘤細(xì)胞特異性作用。該環(huán)己酮酸鈣處理的酒提取物的機(jī)制是p53依賴性的。
典型地該靜息內(nèi)皮細(xì)胞中的基礎(chǔ)含量低，見圖4。加入LDL導(dǎo)致NF-κB的激活，這在激活的巨噬細(xì)胞中比在靜息巨噬細(xì)胞中更高。這與動脈粥樣硬化形成過程中LDL的生理學(xué)氧化是相對應(yīng)的。在所有的情況下，與環(huán)己酮酸鈣處理的酒提取物一起孵育導(dǎo)致NF-κB激活的增加。
所用的該細(xì)胞培養(yǎng)物模型十分適合于描述動脈粥樣硬化形成早期中的病理生理學(xué)/炎癥情況。該環(huán)己酮酸鈣處理的酒提取物增強(qiáng)了NF-κB的激活。這相當(dāng)于生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物的作用；即，在積極的意義上增強(qiáng)了對病理生理學(xué)信號的細(xì)胞應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.增加植物中類黃酮和酚類成分含量的方法，其中用式I的生長調(diào)節(jié)性酰基環(huán)己烷二酮和這些化合物的適合鹽類處理這些植物， 其中R尤其是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、C2-C10烷基硫基烷基或苯基(取代的或未取代的)，R’是氫、C1-C6烷基、C3-C6環(huán)烷基、苯甲基(取代或未取代的)、苯基乙基、苯氧基乙基、2-噻吩基甲基、烷氧基甲基或烷基硫基甲基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該增加是由?；h(huán)己烷二酮例如環(huán)己酮酸鈣(II)和/或抗倒酯(III)的處理引起的，
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中該植物是葡萄樹、櫻桃、李子、黑刺李、越桔、草莓、柑橘類水果(例如橙、柚子)、木瓜、紅環(huán)甘藍(lán)、硬花甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、胡蘿卜、歐芹、芹菜/塊根芹、洋蔥、大蒜、茶、咖啡、可可、馬黛、忽布、大豆、油籽蕓苔、燕麥、小麥、黑麥、Aronia melanocarpa和白果。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的植物、或這些植物的部分、或采用它們制備的產(chǎn)物(汁液、浸液、提取物、發(fā)酵產(chǎn)品和發(fā)酵殘余物)，在制備用于人和動物的治療性組合物、健康促進(jìn)組合物或滋補(bǔ)品，及化妝品中的應(yīng)用。
5.通過根據(jù)權(quán)利要求1-3至之任一項(xiàng)的方法制備的組合物，其中對以下紅葡萄樹的葡萄進(jìn)行收獲和加工，該紅葡萄藤的花色素苷產(chǎn)生由于?；h(huán)己烷二酮例如環(huán)己酮酸鈣或抗倒酯的處理而受到完全或部分地抑制，并且該植物由此因類黃酮和其它酚類成分含量的定性和定量增加而著稱。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，該組合物是葡萄或葡萄的部分，或由所述葡萄獲得的汁液、酒或擠壓殘余物，或上述葡萄、葡萄的部分或葡萄產(chǎn)物的提取物。
全文摘要
在用于增加植物中類黃酮含量的方法中,用式I的生長調(diào)節(jié)性?；h(huán)己烷二酮處理這些植物。
文檔編號A01N37/42GK1355672SQ00809039
公開日2002年6月26日 申請日期2000年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月17日
發(fā)明者W·拉德梅克爾, K·克拉默, J·施維登 申請人:巴斯福股份公司