專利名稱：一種通過產(chǎn)生異核體對細(xì)胞重新編程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過細(xì)胞核增加來對動物細(xì)胞和動物細(xì)胞核重新編程。本發(fā)明還涉及用包括胞核增加的方法來產(chǎn)生動物的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、胚胎和非人動物。
胞核增加是將一個細(xì)胞的細(xì)胞核加入另一細(xì)胞的細(xì)胞核中。胞核增加與胞核轉(zhuǎn)移的不同之處在于，將胞核加入未去核的細(xì)胞中，然后該細(xì)胞可能喪失或隨后除去受者(即宿主細(xì)胞)的胞核或胞核DNA(去核)。胞核增加與胞核轉(zhuǎn)移相比有某些優(yōu)點(diǎn)，它能增強(qiáng)胞核重新編程的效率以及發(fā)育能力，從而產(chǎn)生用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和研究用途的動物細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、胚胎和動物。
胞核轉(zhuǎn)移已被用來產(chǎn)生克隆后代，該方法是將供者胞核轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中，該卵母細(xì)胞中的母體染色體被事先除去或去核。
由于能通過例如胞核轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生克隆的后代，因此能產(chǎn)生大量相同的后代，而且有機(jī)會選出所需的動物基因型。例如，可根據(jù)患者特異的或與供體匹配的主要組織相容性基因、或動物性別、抗疾病能力、增強(qiáng)的生產(chǎn)性狀或任何其它理由，從動物、胚胎、培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系選出胞核供體細(xì)胞來源。同樣，可從基因工程改造的或修飾的細(xì)胞選出胞核供體細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、胚胎和非人動物。
盡管已經(jīng)描述了在一些動物中通過胞核轉(zhuǎn)移來對細(xì)胞重新編程，但是所用程序通常是低效率的。
本發(fā)明的目的是克服或至少減少現(xiàn)有技術(shù)中的一個或多個困難或缺陷。
本發(fā)明第一方面提供一種制備重新編程的二倍體細(xì)胞的方法，該方法包括提供一個供體細(xì)胞或供體細(xì)胞核，和一個受體細(xì)胞；將供體細(xì)胞或供體細(xì)胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞中，以產(chǎn)生非整倍的細(xì)胞；使非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境下維持足以使供體細(xì)胞核重新編程的時間；和通過所述重新編程的非整倍體細(xì)胞的受體細(xì)胞核或細(xì)胞核DNA的去除、破壞或丟失，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胞核增加的破壞性可能比胞核轉(zhuǎn)移小。在胞核增加時，將供體胞核放入完整細(xì)胞中，使其受重新編程性因素的作用。這些重新編程性因素可能與受體細(xì)胞的中期板、細(xì)胞核、染色質(zhì)、染色體或DNA有關(guān)，或與通常通過受體細(xì)胞因胞核轉(zhuǎn)移程序而被除去或缺失的胞質(zhì)組分有關(guān)。胞質(zhì)增加使得供體細(xì)胞核雖然接觸這些因素但對細(xì)胞功能破壞最少。
胞核增加包括在導(dǎo)入供體細(xì)胞核之后或同時，受體細(xì)胞的中期板、細(xì)胞核、染色質(zhì)、染色體或DNA隨后喪失、被破壞或除去。供體細(xì)胞接觸重新編程性因素的時間長短可能受去核過程的影響。當(dāng)供體細(xì)胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞中后，產(chǎn)生了非整倍的細(xì)胞。出于本文的目的，該非整倍的細(xì)胞包括多倍體細(xì)胞。如果在增加供體細(xì)胞的細(xì)胞核之后，細(xì)胞的中期板、細(xì)胞核、染色質(zhì)、染色體或細(xì)胞核DNA沒有丟失、去除或破壞，則該細(xì)胞仍維持是非整倍體細(xì)胞。重建的二倍體細(xì)胞是在細(xì)胞核增加之后或同時，受體細(xì)胞的中期板、細(xì)胞核、染色質(zhì)、染色體或細(xì)胞核DNA從細(xì)胞中喪失、從細(xì)胞去除或受破壞時的細(xì)胞。
本發(fā)明方法可用來產(chǎn)生重新編程的細(xì)胞，例如至少部分重新編程(例如去分化)成為另一種體細(xì)胞狀態(tài)，或基本上完全重新編程(例如去分化)成為胚細(xì)胞結(jié)局。例如，在重新編程的細(xì)胞中，與重新編程狀態(tài)相關(guān)的一個或多個基因可能被激活，和/或在供體細(xì)胞中表達(dá)的一個或多個基因可能被阻遏。
本發(fā)明方法可用來對經(jīng)過基因工程改造的細(xì)胞進(jìn)行重新編程。細(xì)胞核供體細(xì)胞可選自基因工程改造或修飾的細(xì)胞，以便產(chǎn)生基因工程改造的干細(xì)胞、干細(xì)胞系和干細(xì)胞衍生的細(xì)胞或細(xì)胞系，例如，多能性胚胎干細(xì)胞(ES)或ES衍生的體細(xì)胞(它們可用選擇干細(xì)胞的已知方法來分離、純化或增殖)。
因此，本發(fā)明第二方面提供了一種制備重新編程的經(jīng)基因修飾的二倍體細(xì)胞的方法，所述方法包括提供供體細(xì)胞或供體細(xì)胞核，該供體細(xì)胞或細(xì)胞核經(jīng)過基因修飾而除去或減少了不需要的活性或具有或提高了所需的活性，和受體細(xì)胞；將供體細(xì)胞或細(xì)胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞中，產(chǎn)生非整倍的細(xì)胞；使該非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境下維持足以使供體細(xì)胞核被重新編程的時間；和通過使所述重新編程的非整倍體細(xì)胞中的受體細(xì)胞核或胞核DNA的去除、破壞或丟失，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的經(jīng)基因修飾的二倍體細(xì)胞。
本發(fā)明第三方面提供了一種制備重新編程的遺傳上異常的細(xì)胞的方法，所述方法包括提供供體細(xì)胞或供體細(xì)胞核，該供體細(xì)胞或細(xì)胞核從遺傳上異常的細(xì)胞(如患有遺傳疾病的動物或人的細(xì)胞)衍生獲得，和受體細(xì)胞；將供體細(xì)胞或細(xì)胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞中，產(chǎn)生非整倍的細(xì)胞；使該非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境下維持足以使供體細(xì)胞核被重新編程的時間；和通過使所述重新編程的非整倍體細(xì)胞中的受體細(xì)胞核或胞核DNA去除、破壞或丟失，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生遺傳組成與所述異常供體細(xì)胞核等價的重新編程的遺傳異常的細(xì)胞。
重新編程的細(xì)胞可用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究、基于細(xì)胞的基因和藥物篩選、診斷、和/或基因細(xì)胞的基因和組織治療。更具體地說，重新編程的異常細(xì)胞可用于基因細(xì)胞的基因和藥物篩選，以便發(fā)現(xiàn)和/或開發(fā)出典型和非典型的單基因和多基因疾病的新的治療性和預(yù)防性處理方法。
供體細(xì)胞核可以是任何合適的類型，來自任何合適的種類。供體細(xì)胞核可包含在核體或細(xì)胞中。供體細(xì)胞核可以是胚胎、胎兒、新生兒、青少年或成年的細(xì)胞。供體細(xì)胞核可通過從合適的供體細(xì)胞中取出(例如用顯微外科手術(shù))細(xì)胞核和供體細(xì)胞核周圍的一部分細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜來制得。可使用成熟的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞類型。在較佳的實(shí)施方案中，供體細(xì)胞核可來自體細(xì)胞，更佳的是成熟的體細(xì)胞或體干細(xì)胞。可使用細(xì)胞系。在一個特別佳的實(shí)施方案中，使用胚細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞或其它多能性干細(xì)胞系、胚胎生殖細(xì)胞或原生殖細(xì)胞。
特別佳的是，供體細(xì)胞出于細(xì)胞周期的特定階段，如G0，G1或S期。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)大小分揀細(xì)胞(例如用FACS)，可以分離得到富含細(xì)胞周期每一階段的細(xì)胞群。這避免了使用對細(xì)胞有毒性的品系?？蓪Υ笮》謷母骷?xì)胞群的樣品進(jìn)行染色，以確定該細(xì)胞群處于細(xì)胞周期的哪一階段。
供體細(xì)胞核可以來自正常、異常或經(jīng)基因修飾的細(xì)胞。供體細(xì)胞可從動物細(xì)胞、動物細(xì)胞培養(yǎng)物或建立的細(xì)胞系直接分離得到。異常細(xì)胞包括具有已知或未知基因突變(包括基因和其它染色體突變、缺失、重排、取代和/或復(fù)制)的細(xì)胞。
受體細(xì)胞可以有任何合適的類型、可來自任何合適的種類。受體細(xì)胞可以是體內(nèi)或體外產(chǎn)生的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞例如可以是生發(fā)泡(GV)階段或中期I(MI)的不成熟的卵母細(xì)胞，或是停滯于減數(shù)分裂成熟的第二中期的卵母細(xì)胞(MII卵母細(xì)胞)。受體細(xì)胞的其它來源包括，受精卵、受精的卵母細(xì)胞、胚胎卵裂球(例如2細(xì)胞卵裂球)和生殖腺產(chǎn)生的細(xì)胞系、生殖細(xì)胞腫瘤或任何其它適合成功加入細(xì)胞核的細(xì)胞類型。另外，受體細(xì)胞可以是多能性細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞(ES)、胚胎生殖細(xì)胞或原生殖細(xì)胞[包括細(xì)胞系分離出的細(xì)胞，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)、胎盤(ED)、胚胎外胚層或原生殖細(xì)胞(PGC)的原代培養(yǎng)物或分離的細(xì)胞]、從腫瘤(包括胚胎腫瘤)衍生獲得的細(xì)胞(例如胚胎癌性細(xì)胞(EC)或卵黃囊腫瘤細(xì)胞)。體細(xì)胞受體(如神經(jīng)或造血(haematoietic)干細(xì)胞)可用作受體細(xì)胞的來源。較佳的是卵母細(xì)胞，如停滯于減數(shù)分裂成熟的第二中期的卵母細(xì)胞(MII卵母細(xì)胞)。
供體細(xì)胞核或細(xì)胞可用合適的方法轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞。這些方法包括，但不局限于，顯微外科注射、細(xì)胞融合(例如由電脈沖(電融合)、化學(xué)試劑(如聚乙二醇)介導(dǎo))、或使用滅活病毒(如仙臺病毒)。
較佳的是，供體胞核例如是用顯微外科方法在透明帶下導(dǎo)入。
在一個特別佳的實(shí)施方案中，供體胞核或細(xì)胞可用壓電輔助的顯微操作轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中。
在本發(fā)明這些方面的較佳形式中，可對受體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，但該步驟是任選的。更具體地說，可對受體細(xì)胞的中期板、胞核、染色質(zhì)、前核染色體或胞核DNA進(jìn)行預(yù)處理。
受體細(xì)胞的預(yù)處理可包括，在導(dǎo)入供體胞核的同時、或較佳的在一段時間后，將細(xì)胞培養(yǎng)在微絲抑制劑(如細(xì)胞松弛素B，使細(xì)胞骨架松弛，并有助于除去含有受體細(xì)胞前核、中期板、胞核、染色體或DNA的一部分膜封閉的胞質(zhì))中?；瘜W(xué)處理例如是，但不局限于，在導(dǎo)入供體胞核的同時、或較佳的在一段時間后，用紫衫醇、鬼臼亞乙苷秋水仙胺和環(huán)己酰亞胺之一或組合來使受體細(xì)胞喪失或排出中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA?；蛘撸捎梅腔瘜W(xué)的方法來幫助受體細(xì)胞喪失或排出細(xì)胞的中期板、胞核、染色質(zhì)、染色體或DNA。這些方法包括，但不局限于，用紫外光(UV)、激光或其它形式的輻射使中期板、前核、胞核、染色質(zhì)、染色體和/或DNA失活、喪失能力、受損或受到破壞。
預(yù)處理也可包括激活。
在受精期間，當(dāng)穿透性精子觸發(fā)減數(shù)分裂的復(fù)蘇時，發(fā)生激活。激活的特征是鈣振動，釋放出皮質(zhì)顆粒，第二個極體壓出，形成前核，最后分裂。受體細(xì)胞或非整倍體細(xì)胞可用例如(但不局限于)乙醇、鈣離子運(yùn)載體或電刺激來誘導(dǎo)激活。激活可在供體胞核轉(zhuǎn)移之前、同時或之后進(jìn)行。
可采用在供體胞核轉(zhuǎn)移之前的初步激活步驟，它可能會影響與受體細(xì)胞胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA相關(guān)的重新編程性因素。
預(yù)處理也包括使受體細(xì)胞的胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA喪失能力或受到破壞，從而減少或消除受體細(xì)胞胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA與供體細(xì)胞的這些物質(zhì)摻雜在一起。如此形成的胚胎可能不是克隆，進(jìn)而可能不能發(fā)育至足月。
從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞的步驟可用任何合適的方法進(jìn)行。例如，可使非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持足夠長的時間，以使非整倍體細(xì)胞通過丟失非整倍體細(xì)胞的中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA、或非整倍體細(xì)胞中期板、胞核、染色質(zhì)、染色體或DNA在非整倍體細(xì)胞子細(xì)胞中的不均衡分布來產(chǎn)生二倍體細(xì)胞?；蛘?，通過除去非整倍體細(xì)胞或非整倍體細(xì)胞的子細(xì)胞中的受體細(xì)胞中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA，或破壞非整倍體細(xì)胞或非整倍體細(xì)胞的子細(xì)胞中的受體細(xì)胞中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA，來產(chǎn)生二倍體細(xì)胞。
在本發(fā)明這些方面的一個形式中，這些方法可進(jìn)一步包括下列步驟基本上除去或基本上破壞受體細(xì)胞的胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA，較佳的在非整倍體細(xì)胞分裂之前。
受體細(xì)胞胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA的除去或破壞例如可在第一個胚胎分裂之前、胞核增加程序完成后大約1-20小時(更佳的約3-12小時，最佳的約6-8小時)內(nèi)進(jìn)行。DNA的破壞可用化學(xué)或激光或其它基于輻射的顯微外科技術(shù)等來實(shí)現(xiàn)。
受體細(xì)胞胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA的除去或破壞可通過發(fā)育自校正機(jī)制(該機(jī)制將使一些細(xì)胞(如果不是全部細(xì)胞)恢復(fù)倍數(shù))自發(fā)地發(fā)生。
受體細(xì)胞中期板、胞核、染色質(zhì)、染色體或DNA的喪失或除去可用DNA螯合劑(例如是，但不局限于，Hoechst 33342)和UV照射來進(jìn)行評價，或用Pol-Scope顯影來顯現(xiàn)受體細(xì)胞的中期板、前核、胞核、染色質(zhì)或染色體。
在本發(fā)明這些方法的另一個形式中，這些方法可進(jìn)一步包括下列步驟提供相互混雜的抑制劑，和使非整倍體細(xì)胞接觸該相互摻雜的抑制劑一段時間，該時間足以減少或消除受體細(xì)胞DNA與導(dǎo)入DNA的摻雜。
相互摻雜抑制劑可以是細(xì)胞骨架(細(xì)胞動力學(xué))或核分裂抑制劑，例如但不局限于，選自細(xì)胞松弛素B、秋水仙酰胺、紫衫醇或噻氨酯噠唑中的一種或多種。非整倍體細(xì)胞接觸相互摻雜抑制劑的時間例如是胞核增加后大約1-6小時，最晚到前核形成，較佳的在胚胎分裂前。
在本發(fā)明這些方面的另一形式中，受體細(xì)胞可以在供體細(xì)胞或胞核導(dǎo)入的幾乎同時去核。較佳的是，將供體胞核導(dǎo)入待去核的細(xì)胞中，然后立即去核。更佳的是，通過一個切開部位將供體胞核導(dǎo)入待去核的細(xì)胞中，受體胞核也通過同一切開部位從細(xì)胞中取出。
本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括使受體細(xì)胞、非整倍體細(xì)胞或二倍體細(xì)胞經(jīng)過激活步驟的步驟。
受體細(xì)胞、非整倍體細(xì)胞或二倍體細(xì)胞可用，例如但不局限于，乙醇、鈣離子運(yùn)載體或電刺激來處理，以誘導(dǎo)激活。激活可在供體胞核轉(zhuǎn)入之前、同時或之后進(jìn)行。
如上所述，可在供體胞核轉(zhuǎn)移之前進(jìn)行初步激活步驟，或使并列的供體和受體細(xì)胞經(jīng)受細(xì)胞融合/激活步驟。例如，當(dāng)用電脈沖來進(jìn)行細(xì)胞融合時，可選擇電壓以同時引發(fā)激活。
并列的供體和受體細(xì)胞也可經(jīng)受同時進(jìn)行的細(xì)胞融合/激活，或是先細(xì)胞融合然后激活。
使非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持足夠長的時間以使供體胞核或細(xì)胞被重新編程。較佳的，使非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持大約1-36小時，更佳的大約1-8小時。非整倍體細(xì)胞可以維持在體外合適培養(yǎng)基中，或轉(zhuǎn)移到代孕動物中在體內(nèi)維持。
用于本發(fā)明方法的供體胞核和受體胞核可以來自任何合適的來源，無須來自同一種類。本發(fā)明適用的種類包括鳥類、魚類、爬行動物和哺乳動物(包括有蹄類和靈長類)。較佳的，細(xì)胞是豬、牛、羊、嚙齒類動物、禽類、魚類、爬行動物、鼠或人源的。
在一個較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括下列步驟從非整倍體細(xì)胞中取出供體胞核；和將所述取出的供體胞核導(dǎo)入第二個受體細(xì)胞(去核或未去核的)中，產(chǎn)生重新編程的第二代細(xì)胞、經(jīng)基因修飾的重新編程的第二代細(xì)胞或遺傳上異常的重新編程的第二代細(xì)胞。
在本發(fā)明方法的較佳實(shí)施方案中，取出的供體胞核可以來自本身作為胞核增加或胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)物的胚胎。前者稱為連續(xù)性胞核增加(serial nuclear addition)。
連續(xù)的胞核增加或胞核增加和胞核轉(zhuǎn)移的組合可提高分化的胞核指導(dǎo)正常發(fā)育的能力。盡管申請人不希望受理論的束縛，但是推斷連續(xù)的胞核增加和/或轉(zhuǎn)移能通過使卵母細(xì)胞中特異性分子組分幫助染色質(zhì)重建(對胞核重新編程有利)來提高移植胞核的發(fā)育能力。連續(xù)的胞核增加或胞核增加與胞核轉(zhuǎn)移的組合不局限于單個行為，它可以在多種情形下被啟動來隨后改善染色質(zhì)重建、胞核重新編程和胚胎發(fā)育的狀況。
供體胞核可以通過修飾、缺失或加入一個或多個基因來進(jìn)行基因修飾。待修飾、缺失或增加的基因可以是任何合適的類型。
修飾、加入或刪除基因的方法可包括轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)或定向整合。轉(zhuǎn)基因可以是全功能的基因或是包含異源基因序列的表達(dá)構(gòu)建物，這些異源基因序列包括增強(qiáng)子、阻遏子、啟動子、外顯子、內(nèi)含子、cDNA、編碼序列、反義RNA、5′或3′非編碼區(qū)以及其它RNA加工信號或元件(包括翻譯起始和終止信號、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以及聚腺苷酸化信號)。轉(zhuǎn)基因可以是基因的無功能組分，或是依靠(隨機(jī)或定向)整合入宿主基因組的不同基因的異源組分。這些轉(zhuǎn)基因包括基因阱(traps)、啟動子阱、增強(qiáng)子阱和有點(diǎn)突變或能改變內(nèi)源基因表達(dá)的其它DNA構(gòu)建物。
修飾基因的方法可包括將一個或多個突變引入靶基因的兩個拷貝中。合適的細(xì)胞可能會攝入突變，然后可用來產(chǎn)生重新編程的細(xì)胞、細(xì)胞系、胚胎或非人動物?？蓪⒓?xì)胞中基因的一個拷貝破壞，然后使所得的雜合非人動物相互雜交，直至獲得基因兩個拷貝都突變的動物。或者，可在體外修飾基因的兩個拷貝。
為了靶向內(nèi)源性基因而不是將轉(zhuǎn)基因?qū)牖蚪M的隨機(jī)位置，可采用一種DNA構(gòu)建物(轉(zhuǎn)基因)，該構(gòu)建物包括與靶基因的至少一個或多個部分在基因上基本相同的核酸序列。
尋靶DNA可包含這樣一個序列，其中所需序列經(jīng)修飾側(cè)連接了與待修飾基因組中對應(yīng)靶序列基本相同基因的DNA?；鞠嗤?等基因)的序列宜與對應(yīng)的靶序列(除所需序列修飾外)有至少大約97-98％的相同性，更佳的有至少約99.0-99.5％的相同性，最佳的有約99.6％-99.9％的相同性。尋靶DNA和靶標(biāo)DNA宜共同具有至少約75堿基對的相同性非常高的DNA序列，更佳的至少約150堿基對的有相同性非常高的DNA序列，還要佳的有至少約500堿基對的相同性非常高的DNA序列。因此，較佳的是采用從與待尋靶細(xì)胞盡可能密切相關(guān)的細(xì)胞衍生的尋靶DNA；更佳的是，尋靶DNA從基因型與待尋靶細(xì)胞相同的細(xì)胞衍生獲得。最佳的是，尋靶DNA從待尋靶細(xì)胞的同一個體(動物)的細(xì)胞衍生獲得。尋靶DNA序列宜包含至少約100-200堿基對的基本等基因的DNA，更佳的有至少約300-1000堿基對的基本等基因的DNA，還要佳的有至少1000-15000堿基對的基本等基因的DNA。
本文所用的術(shù)語“等基因”或“基本等基因的DNA”指DNA具有與參照DNA序列相同或基本相同的序列。兩個序列基因相同的指標(biāo)是它們能在最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件(例如見參考文獻(xiàn)25)下相互雜交而且不表現(xiàn)出序列多態(tài)性(即，它們沒有不同的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn))。術(shù)語“基本等基因”指DNA與參照DNA序列有至少約97-99％的相同性，較佳的是與參照DNA序列有至少約99.5-99.9％的相同性，在某些情況下與參照DNA序列有100％的相同性。兩個序列基本等基因的指標(biāo)是它們能在最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件(25)下相互雜交而且僅僅很少表現(xiàn)出限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)或序列多態(tài)性(相對于具有至少約97-98％序列相同性的特定長度序列作統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)計(jì)的數(shù)目)。一般來說，尋靶DNA序列和宿主細(xì)胞序列在至少約75個連續(xù)核苷酸的窗口內(nèi)進(jìn)行比較。如果RFLP分析未顯示出序列具有序列多態(tài)性，那么即使不能獲得詳細(xì)的DNA序列信息，比較高度近交品系個體之間的DNA序列通常認(rèn)為是基本等基因的。
因此，可通過修飾供體胞核中的內(nèi)源基因來對供體胞核作基因修飾。內(nèi)源基因可這樣來進(jìn)行修飾將一DNA構(gòu)建物導(dǎo)入所述供體胞核中，該DNA構(gòu)建物包括一核酸序列，該序列與內(nèi)源基因的至少一個或多個部分基本等基因且具有一個或多個突變或新的基因序列，從而使該DNA構(gòu)建物與內(nèi)源基因之間發(fā)生同源性重組。
導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)以及隨后對攜帶所需目標(biāo)整合的細(xì)胞的選擇需要擴(kuò)展和克隆性選擇每個建立的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。將該方法應(yīng)用于胞核移植程序的一個限制是轉(zhuǎn)染的細(xì)胞必須經(jīng)歷的細(xì)胞分裂的次數(shù)，以便為每個轉(zhuǎn)基因集落的分子分析以及隨后提供轉(zhuǎn)移用胞核提供足夠的材料。大多數(shù)適合體外基因修飾和隨后的胞核轉(zhuǎn)移的細(xì)胞具有有限的體外增殖能力。因此，希望利用轉(zhuǎn)染和選擇系統(tǒng)，該系統(tǒng)能高效地產(chǎn)生和/或鑒別被正確尋靶的克隆，而且對于體外增殖的要求有限。
選擇被正確尋靶的克隆的一種特別有效的方法是用如澳大利亞專利678234所述的IRES基因捕獲尋靶載體(該專利全文納入本文作為參考)。IRES基因捕獲尋靶載體可以選自IRES-neo，IRES-lacZ，(TAA3)IRES-lacZ，(TAA3)IRES-lacZ lox neo-tk lox，(TAG3)IRES-lacZ/mclneo，SA lacZ-IRES neo，SA(TAA3)IRES-nuclear lacZ，SA(TAA3)IRES-nuclear lacZ lox Gprt lox，IRES-B-geo，(TAA3)IRES-B-geo，SA IRES-B-geo SA優(yōu)化的IRES-B-geo，IRES-nuclear B-geo，SA IRES-nuclear B-geo，SA(TAA3)IRES-nuclearB-geo，SA優(yōu)化的IRES-nuclear B-geo，IRES-zeo，SA IRES-zeo，IRES-hph，SA IRES-hph，IRES-hph-tk，IRES-bsd，SA IRES-bsd，IRES-puro。IRES基因捕獲尋靶載體通過消除大部分隨機(jī)整合行為而顯著提高了基因?qū)ぐ械男?。IRES基因捕獲尋靶載體依靠功能性整合到活躍轉(zhuǎn)錄的基因(如靶基因)中來表達(dá)可選擇性標(biāo)記物。不選擇隨機(jī)整合到基因組的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域。
在一個較佳的實(shí)施方案中，可能希望除去靶標(biāo)基因座中的選擇性標(biāo)記盒，以消除例如抗生素抗性基因的表達(dá)。一種方法是在作為重組位點(diǎn)的合適DNA序列的兩側(cè)連接IRES選擇性標(biāo)記盒，然后加入合適的點(diǎn)特異性重組酶。合適的重組酶位點(diǎn)的一個例子是對于Cre重組酶蛋白有特異性的lox位點(diǎn)。另一合適的重組酶例子是FLP/FRT重組酶系統(tǒng)(26)。
高效的基因?qū)ぐ泻秃Y選具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫m度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪x擇系統(tǒng)(如IRES基因捕獲尋靶載體)能消除對克隆的細(xì)胞系進(jìn)行生物化學(xué)分析的需要。在這種情況下，未經(jīng)特性鑒定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞庫的個別胞核應(yīng)以等價于被選庫的比例產(chǎn)生具有所需表型的后代。當(dāng)需要或可能僅限于體外繁殖時，克隆選擇的消除可能是特別有用的。一個這樣的例子包括培養(yǎng)胚胎胞核用于胞核增加或胞核轉(zhuǎn)移。對于通過胞核轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生胎生后代而言，胚胎胞核比后階段的體細(xì)胞更有效。然而，除了小鼠、可能還有靈長類(包括人)外，其它動物種類的全能性胚細(xì)胞不能長時間培養(yǎng)。通過胚胎胞核的連續(xù)性胞核增加來回收胞核提供了在體外維持、繁殖和遺傳操作多能性動物細(xì)胞的機(jī)會。
可將DNA構(gòu)建物工程改造入細(xì)菌中，然后導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)基因可用任何合適的方法導(dǎo)入細(xì)胞中。較佳的方法包括直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體或磷酸鈣沉淀。
盡管申請人不希望受理論的束縛，認(rèn)為突變兩側(cè)任一側(cè)的基本等基因的DNA區(qū)域優(yōu)先使轉(zhuǎn)基因與靶位點(diǎn)對齊，它在此處重組并引入突變。還認(rèn)為提高特定突變引入給定基因的效率起主要作用的因素是靶DNA與導(dǎo)入DNA之間的相似性程度。因此，較佳的是，在待尋靶的基因座處，DNA是等基因的(基因相同)，而不是同種異體基因(基因不相似)。
盡管許多轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有一個或多個另一種動物的基因或其片段，但本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”應(yīng)被認(rèn)為不限于指含有這樣的一個或多個基因的細(xì)胞。相反，該術(shù)語更廣泛地指其DNA已通過重組DNA技術(shù)作過技術(shù)干預(yù)的細(xì)胞。因此，例如，出于本發(fā)明的目的，內(nèi)源基因缺失或經(jīng)修飾(通過修飾基因產(chǎn)物或表達(dá)方式)的細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，DNA中加入外源核酸序列的許多細(xì)胞也是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明重新編程的細(xì)胞可用來產(chǎn)生細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、動物胚胎和非人動物。這些產(chǎn)物可從重新編程的胚細(xì)胞(此時受體細(xì)胞是卵母細(xì)胞或其它胚細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞或原生殖細(xì)胞))或重新編程的體細(xì)胞(此時受體細(xì)胞是特異性干細(xì)胞類型，如肝或神經(jīng)干細(xì)胞)衍生獲得，并可用來使因損傷、疾病或老化而破壞的組織恢復(fù)功能。轉(zhuǎn)移的細(xì)胞還可用來重新增殖(re-populate)耗盡的組織或在移植輸送基因治療前進(jìn)行基因改變。
從重新編程的細(xì)胞或胚胎衍生獲得的細(xì)胞和細(xì)胞系也可用于基于細(xì)胞的基因和藥物篩選、用于診斷試驗(yàn)以測定基因、基因產(chǎn)物或其它生物活性化合物的存在或不存在、功能、效率、毒性或其它生物性質(zhì)。從重新編程的細(xì)胞衍生獲得的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織和器官可用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)用途和/或基礎(chǔ)研究。從重新編程的細(xì)胞衍生獲得的組織或器官、或從重新編程的胚胎發(fā)育成的動物或胚胎衍生獲得的組織或器官也可用于治療患病或具有缺陷型細(xì)胞、組織或器官的患者。細(xì)胞、細(xì)胞系、胚胎衍生的細(xì)胞系、組織和器官可用患者自身的細(xì)胞作為供體來源來建立，因此避免了移植后可能發(fā)生的組織排斥。
因此，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括從所述重新編程的細(xì)胞、或通過聯(lián)合或不聯(lián)合胞核轉(zhuǎn)移的連續(xù)性胞核增加而重新編程的細(xì)胞來產(chǎn)生細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、動物胚胎或非人動物的步驟。
本發(fā)明方法還包括另一步驟從所述基因修飾的或異常的重新編程的細(xì)胞、或從通過聯(lián)合或不聯(lián)合胞核轉(zhuǎn)移的連續(xù)性胞核增加從基因修飾的或重新編程的異常的細(xì)胞，產(chǎn)生基因修飾的或遺傳異常的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、動物胚胎或非人動物。
可用任何合適的技術(shù)從重新編程的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞、細(xì)胞系、組織和器官。
細(xì)胞、細(xì)胞系、組織和器官也可從所述重新編程的細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生的動物胚胎產(chǎn)生。細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、動物胚胎或從該胚胎衍生獲得的細(xì)胞系也可從通過聯(lián)合或不聯(lián)合胞核轉(zhuǎn)移的連續(xù)性胞核增加而重新編程的細(xì)胞產(chǎn)生。
在本發(fā)明的一個特別佳的實(shí)施方案中，可對正常、異常、有疾病或經(jīng)基因修飾的細(xì)胞進(jìn)行重新編程，從這些重新編程的細(xì)胞建立細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官、胚胎、非人胎兒或動物。另外，細(xì)胞、細(xì)胞系、組織和器官可從重新編程細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生的動物胚胎、非人胎兒或動物產(chǎn)生。這些細(xì)胞和細(xì)胞系也可用于基于細(xì)胞的基因和組織治療、基于細(xì)胞的基因和藥物篩選、診斷、基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究以及用于產(chǎn)生非人動物。
可將從重新編程細(xì)胞衍生獲得的重新編程的細(xì)胞或細(xì)胞系轉(zhuǎn)移給動物，以恢復(fù)因受損傷(例如由于疾病、受傷或老化)或因遺傳病而功能異常的組織或器官的功能、或改善該功能。
在一個特別佳的實(shí)施方案中，可從患者自身的細(xì)胞建立細(xì)胞或細(xì)胞系。也可通過對患者自身細(xì)胞進(jìn)行重新編程而產(chǎn)生的胚胎或胚細(xì)胞建立細(xì)胞或細(xì)胞系。這種方法稱為治療性克隆，它提供了治療各種醫(yī)學(xué)病情(包括但不局限于，脊髓受損、糖尿病和阿爾茨海默疾病)的機(jī)會。用治療性克隆方法建立的細(xì)胞或細(xì)胞系在遺傳上與患者相同，因此在移植后有很少或沒有免疫排斥。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過將部分或完全分化的供體細(xì)胞或胞核培養(yǎng)在合適受體細(xì)胞環(huán)境下，供體細(xì)胞或胞核可能被重新編程。例如，它可能去分化產(chǎn)生例如多能性細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞)。更具體地說，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可通過胞核增加介導(dǎo)的成年體細(xì)胞胞核重新編程來產(chǎn)生ES細(xì)胞，而且，卵丘細(xì)胞經(jīng)NA介導(dǎo)的重新編程所衍生獲得的ES細(xì)胞(CC-ES細(xì)胞)保留了在體外和體內(nèi)分化成多種細(xì)胞類型的能力(見


圖1、2和3)。
雖然不希望受理論的束縛，但申請人假設(shè)受體細(xì)胞可能提供了使供體細(xì)胞被重新編程的因素，例如使其至少部分去分化，形成多能性細(xì)胞系。
因此，本發(fā)明另一個方面提供了一種恢復(fù)或改良組織或器官功能的方法，所述方法包括提供一種動物，和一種或多種本發(fā)明的重新編程的細(xì)胞或所述重新編程細(xì)胞的衍生物；
將細(xì)胞或重新編程的細(xì)胞的衍生物轉(zhuǎn)移給動物，較佳的是轉(zhuǎn)移到所述組織或器官部位或附近；和使轉(zhuǎn)移的細(xì)胞或重新編程細(xì)胞的衍生物重新增殖所述組織或器官。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的重新編程細(xì)胞或其衍生物在制備藥物上的用途，該藥物可通過基于細(xì)胞的治療恢復(fù)或改良組織或器官的功能。
可將經(jīng)過基因修飾的細(xì)胞或細(xì)胞系可轉(zhuǎn)移給動物，以輸送基因治療?；蛑委熌苤委熛铝屑膊?，例如但不局限于，鐮刀細(xì)胞貧血癥、血友病、代謝失調(diào)、肝病、AIDS和其它傳染性疾病，還能幫助已受破壞(例如因疾病、受傷或老化)的組織或器官修復(fù)和重建。
在本發(fā)明的還有一個方面，提供了一種基因治療方法，所述方法包括提供一個動物，和一種或多種本發(fā)明的經(jīng)基因修飾的重新編程的細(xì)胞或所述細(xì)胞的衍生物；將所述細(xì)胞或重新編程細(xì)胞的衍生物轉(zhuǎn)移給動物；和使所述細(xì)胞或重新編程細(xì)胞的衍生物在所述動物體內(nèi)重新繁殖。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的經(jīng)基因修飾或異常的重新編程細(xì)胞或其衍生物在制備基因治療藥物上的用途。
本發(fā)明的細(xì)胞還可用于研究疾病過程，以及在基因和藥物篩選試驗(yàn)中用來對已定性或未經(jīng)性質(zhì)鑒定的多基因疾病作性質(zhì)鑒定。在這種情況下，細(xì)胞或細(xì)胞系宜根據(jù)患者或疾病特異性來衍生。在對動物細(xì)胞、從患遺傳疾病的動物建立的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系重新編程后，可建立這樣的細(xì)胞或細(xì)胞系。異常細(xì)胞包括具有已知或未知基因或染色體突變、缺失、重排和/或復(fù)制的細(xì)胞。重新編程的細(xì)胞、從重新編程細(xì)胞衍生獲得的細(xì)胞、組織和器官可用于研究疾病過程、評價具體藥物、基因或治療方案的治療價值、效果或毒性，隨后進(jìn)行基因校正或修飾，進(jìn)行基因和組織治療。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種研究疾病機(jī)理、過程和潛在或現(xiàn)有的治療的方法，該方法通過建立基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)來鑒定和評價候選藥物靶標(biāo)和治療性基因、鑒定和評價藥物和候選藥物，所述方法包括提供一種或多種本發(fā)明的重新編程的細(xì)胞或所述細(xì)胞的衍生物；監(jiān)測、增加、除去或研究或改變細(xì)胞過程，這些細(xì)胞過程包括但不局限于，所研究的細(xì)胞中的基因表達(dá)和表達(dá)的基因產(chǎn)物；和/或增加、除去或研究化學(xué)物質(zhì)和潛在的藥物對于重新編程的細(xì)胞或其衍生物的細(xì)胞過程的生物學(xué)作用。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的重新編程細(xì)胞或其衍生物用于評價藥物治療多基因疾病有效性的用途。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的重新編程細(xì)胞或其衍生物用于制備醫(yī)學(xué)和/或基礎(chǔ)研究用的細(xì)胞、細(xì)胞系或其衍生物的用途。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種建立醫(yī)學(xué)和/或基礎(chǔ)研究用細(xì)胞或細(xì)胞系的方法，所述方法包括提供一種或多種本發(fā)明的重新編程的細(xì)胞或所述細(xì)胞的衍生物；監(jiān)測、增加、除去或研究或改變細(xì)胞過程，以便研究作為潛在治療性靶標(biāo)或試劑的基因產(chǎn)物和化學(xué)物質(zhì)，所述細(xì)胞過程包括，但不局限于，基因表達(dá)和該細(xì)胞或其衍生物表達(dá)的基因產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的重新編程細(xì)胞或其衍生物在醫(yī)學(xué)和/或基礎(chǔ)研究中的用途。
本發(fā)明方法還可進(jìn)一步包括從所述重新編程的動物細(xì)胞或胚胎產(chǎn)生非人動物或從所述轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞或胚胎產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物的步驟。
動物胚胎可用任何合適的方法由重新編程的細(xì)胞產(chǎn)生。胚胎發(fā)育可最初在體外，隨后在代孕者體內(nèi)。這樣，非整倍體細(xì)胞最初可在體外培養(yǎng)，以產(chǎn)生由二倍體細(xì)胞或二倍體細(xì)胞與非整倍體細(xì)胞的混合物組成的胚胎，然后將該胚胎轉(zhuǎn)移到代孕者體內(nèi)，隨后發(fā)育成非人動物。細(xì)胞的體外培養(yǎng)可在任何合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
動物胚胎可以是任何類型，包括鳥類、魚類、爬行動物和哺乳動物(包括有蹄類和靈長類)，例如是鼠、牛、綿羊或豬胚胎。非人動物也可以是任何類型，包括鳥類、魚類、爬行動物和哺乳動物(包括有蹄類和靈長類)，例如鼠、牛、綿羊或豬。較佳的，動物胚胎或動物是豬胚胎或豬、牛胚胎或牛、綿羊胚胎或綿羊或鼠胚胎或鼠。
本發(fā)明另一方面提供了用本發(fā)明方法制得的重新編程的細(xì)胞或細(xì)胞系、基因修飾的重新編程的細(xì)胞或細(xì)胞系、或遺傳上異常重新編程的細(xì)胞或細(xì)胞系。該細(xì)胞或細(xì)胞系可以是人或非人細(xì)胞或細(xì)胞系。較佳的細(xì)胞或細(xì)胞系是豬、鼠、綿羊、牛、山羊或人的細(xì)胞或細(xì)胞系。
可用本發(fā)明方法制得的細(xì)胞和細(xì)胞系例子包括多能性細(xì)胞如胚胎和軀體干細(xì)胞和前體細(xì)胞或其衍生物(包括任何終末階段分化的細(xì)胞)。
本發(fā)明另一方面提供一種用本發(fā)明方法制備的或改良的分離的組織或器官。這些組織或器官可以來自任何種類的動物。較佳的是，組織或器官是豬、鼠、綿羊、牛、山羊、靈長類或人的組織或器官。
本發(fā)明另一方面提供了用本發(fā)明方法制得的或改良的動物胚胎或轉(zhuǎn)基因動物胚胎。動物胚胎或轉(zhuǎn)基因動物胚胎可以是人的或不是人的。較佳的是，動物胚胎或轉(zhuǎn)基因動物胚胎是豬、鼠、綿羊、牛、山羊、靈長類或人的胚胎。
本發(fā)明還有一個方面提供了用本發(fā)明方法制得的或改良的非人動物或轉(zhuǎn)基因非人動物。較佳的非人動物或轉(zhuǎn)基因非人動物是豬、鼠、綿羊、?；蛏窖?。這些非人動物可提供用于移植給人或其它異體移植形式的器官。
本發(fā)明還有一個方面提供了用本發(fā)明方法制得的非人動物或非人轉(zhuǎn)基因動物的動物產(chǎn)品。該動物產(chǎn)品可以是人或其它動物的蛋白或基因產(chǎn)物，或是人和非人動物產(chǎn)品的混合物。
本發(fā)明另一方面提供了一種產(chǎn)生動物胚胎的方法，該方法包括提供供體胞核，和受體細(xì)胞；將該供體胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞中，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；任選地使該非整倍體細(xì)胞經(jīng)受激活步驟；通過除去、破壞或使非整倍體細(xì)胞喪失受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞；和從所述重新編程的二倍體細(xì)胞產(chǎn)生動物胚胎。
因此，本發(fā)明方法涉及胞核增加，即，將一個細(xì)胞的胞核加入另一細(xì)胞中。
盡管不希望受理論的束縛，但是申請人假設(shè)，受體細(xì)胞的中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA在非整倍體細(xì)胞的子細(xì)胞中不均勻地分布，或是非整倍體細(xì)胞或非整倍體細(xì)胞的一個或多個子細(xì)胞排出受體細(xì)胞的中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA，結(jié)果導(dǎo)致形成二倍體動物胚胎和胎盤或二倍體動物胚胎和非整倍體胎盤。非整倍體胎盤可能提供優(yōu)于正常二倍體胎盤的好處。例如，非整倍體胎盤可能更大，更強(qiáng)壯，進(jìn)而提高了胎盤的生命力。或者，受體細(xì)胞的胞核可能被驅(qū)逐出細(xì)胞，不再參與胚胎發(fā)育。
本發(fā)明方法還包括從動物胚胎產(chǎn)生非人動物的步驟。
在還有一個方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎的方法，所述方法包括提供供體胞核，該供體胞核已經(jīng)過基因修飾而消除或降低了不希望的活性，或提供或升高了所需的活性，和受體細(xì)胞；將供體胞核加入受體細(xì)胞中，產(chǎn)生經(jīng)基因修飾的非整倍體細(xì)胞；任選地使該非整倍體細(xì)胞經(jīng)受激活步驟；通過除去、破壞或使所述非整倍體細(xì)胞喪失受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞；和從所述重新編程的二倍體細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎。
在本發(fā)明的一個較佳方面，該方法可包括對受體細(xì)胞的中期板、胞核、前核、染色質(zhì)、染色體或DNA進(jìn)行如上所述的預(yù)處理步驟。
在本發(fā)明該方面的一種形式中，方法可進(jìn)一步包括如上所述的基本除去或基本破壞受體細(xì)胞的胞核、前核、中期板、染色質(zhì)、染色體或DNA的步驟(較佳的在非整倍體細(xì)胞分裂之前)。
在另一形式中，該方法進(jìn)一步包括下列步驟提供相互摻雜的抑制劑，和如上所述使非整倍體細(xì)胞接觸該相互摻雜的抑制劑足夠長時間，以便減少或消除受體細(xì)胞DNA與導(dǎo)入DNA的相互摻雜。
可如上所述進(jìn)行評估受體細(xì)胞的中期板、胞核、染色質(zhì)、染色體或DNA的喪失或除去。
在本發(fā)明該方面的另一形式中，如上所述，受體細(xì)胞可在將供體細(xì)胞或胞核導(dǎo)入的同時去核。
本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括如上所述的對受體細(xì)胞、非整倍體細(xì)胞或二倍體細(xì)胞進(jìn)行激活的步驟。
如上所述，非整倍體細(xì)胞宜在合適的環(huán)境中維持足夠長的時間，以使供體胞核或細(xì)胞被重新編程。
用于本發(fā)明方法的供體胞核和受體細(xì)胞可以來自上述任何合適的來源。
在較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可包括如上所述的產(chǎn)生重新編程的第二代細(xì)胞，并采用連續(xù)的胞核增加或胞核增加聯(lián)合胞核轉(zhuǎn)移。
在較佳的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括下列步驟在激活前，使非整倍體細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中維持足夠長的時間，以使細(xì)胞恢復(fù)至基本正常的形狀。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使非整倍體細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持足夠長的時間以使細(xì)胞恢復(fù)至基本正常的形狀(例如通常是圓形)，可使所產(chǎn)生的活胚胎數(shù)顯著增加。該培養(yǎng)步驟可用類似于本文所述的方式進(jìn)行。
盡管不希望受理論的束縛，但是申請人假設(shè)該培養(yǎng)時間使得非整倍體細(xì)胞恢復(fù)成較正常的或穩(wěn)定的狀態(tài)。
非整倍體細(xì)胞宜在合適的培養(yǎng)基中維持大約3-8小時，更佳的維持大約4.5-6小時。然而，希望保證培養(yǎng)時間在大量分裂發(fā)生之前結(jié)束。
本發(fā)明還有一個方面提供了一種制備非整倍體或重新編程的二倍體細(xì)胞的方法，該方法包括提供供體胞核；外源核酸分子，和受體細(xì)胞；將供體胞核和外源核酸分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；和任選地，通過除去、破壞或喪失受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞。
本發(fā)明還有一個方面是提供一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎的方法，該方法包括提供供體胞核、外源核酸分子和受體細(xì)胞；將供體胞核和外源核酸分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；和任選地，通過除去、破壞或失去受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞；和從該二倍體細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎。
將供體細(xì)胞和外源核酸分子一起導(dǎo)入去核或未去核細(xì)胞的步驟宜通過以下任一方法來進(jìn)行1)將外源核酸分子導(dǎo)入供體胞核，然后將供體胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞；2)將外源核酸分子與供體胞核結(jié)合，將結(jié)合的核酸和胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)；或3)將外源核酸和供體胞核分別導(dǎo)入受體細(xì)胞。
外源核酸分子可用任何合適的方法導(dǎo)入供體胞核或受體細(xì)胞。例如，可采用直接注射、電穿孔或使胞核或細(xì)胞在外源核酸溶液中的簡單地浸泡。
在特別佳的實(shí)施方案中，可在加入胞核前將外源核酸直接導(dǎo)入供體胞核；或者，將供體胞核和外源核酸混合，然后注入受體細(xì)胞。
外源核酸分子可以是任何合適的類型。較佳的，它是裸露的DNA分子。另外可采用外源RNA、mRNA、DNA和RNA的雜合物以及核酶。盡管申請人不希望受理論的束縛，但是認(rèn)為當(dāng)這些分子導(dǎo)入供體胞核或被供體胞核攝入時，可通過隨機(jī)整合或同源重組發(fā)生基因轉(zhuǎn)移。
或者，可采用定向基因轉(zhuǎn)移，在此情況下，外源核酸分子包括指引核酸分子到達(dá)供體胞核基因組中特定位點(diǎn)的5′和/或3′末端。
本發(fā)明方法可進(jìn)一步包括從轉(zhuǎn)基因動物胚胎產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物的步驟。
供體胞核可以是上述任何合適類型的細(xì)胞，來自任何合適種類的動物。
受體細(xì)胞可以是上述任何合適類型的細(xì)胞，來自任何合適種類的動物。
供體胞核可用上述任何合適的方法轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞。
在供體胞核融合之前、之后或大致同時，可通過將沒有透明帶的受體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞或其它胞質(zhì)體融合來增加受體細(xì)胞的體積。
動物胚胎可用上述任何合適方法從重建細(xì)胞產(chǎn)生。
動物胚胎或非人動物可以是上述任何類型。
可用于本發(fā)明方法的供體胞核和受體細(xì)胞可以來自上述任何合適的來源。
本發(fā)明方法可用來產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)基因的非人動物。
本發(fā)明另一方面提供了用本發(fā)明方法產(chǎn)生的重建的動物細(xì)胞。該細(xì)胞可以是人的或非人的。重建的動物細(xì)胞宜為豬、鼠、綿羊、牛、山羊或人的細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面提供了用本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物胚胎。該胚胎可以是人的或非人的。該轉(zhuǎn)基因動物胚胎宜為豬、鼠、綿羊、牛、山羊或人的胚胎。
本發(fā)明還有一個方面提供了用本發(fā)明方法產(chǎn)生的非人轉(zhuǎn)基因動物。該轉(zhuǎn)基因動物宜為豬、鼠、綿羊、牛或山羊。
下面將參照所附實(shí)施例和附圖來更完整地描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，下列描述僅僅是描述性的，而不應(yīng)以任何方式理解為對上述發(fā)明普遍性的限制。
在該圖中
圖1親代CC-ES細(xì)胞顯示出特征性的小鼠ES細(xì)胞集落形態(tài)(a)、SSEA-1表達(dá)(b)和堿性磷酸酶活性(c)。獨(dú)特的X-gal染色的胞核(d)和雌性(40，XX)染色體組型(e)確證了轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞胞核的分布。親代CC-ES細(xì)胞和四個克隆衍生的CC-ES細(xì)胞亞系(f)沒有Y染色體特異性PCR產(chǎn)物(較低的條帶)。對照雄性ZIN40 ES細(xì)胞，雄性胎兒成纖維細(xì)胞(mFF)和沒有DNA(水)。比例條為100微米。
圖2克隆衍生的CC-ES細(xì)胞體外分化產(chǎn)生的神經(jīng)(a-d)和肌源性(e-f)細(xì)胞。對神經(jīng)元特異性蛋白的間接免疫熒光證實(shí)形態(tài)神經(jīng)絲160和68kDa(b和c)和MAP-2(d)和肌肉特異性蛋白肌動蛋白(e)和結(jié)蛋白(f)。比例條為50微米。
圖3CC-ES細(xì)胞體內(nèi)分化。親代CC-ES畸胎癌的組織學(xué)檢查(H&E)顯示存在外胚層神經(jīng)上皮(a)和成層鱗狀上皮(b)；中胚層肌肉和骨(c)；和內(nèi)胚層纖毛上皮(d)。嵌合幼崽中親代CC-ES細(xì)胞的廣泛的體細(xì)胞分布(左和右)用皮毛顏色表示(e)，在大腦(f)、心臟(g)和腸(h)中用獨(dú)特的X-gal染色胞核證實(shí)(PAS復(fù)染)。比例條，100微米。
實(shí)施例1小鼠胞核轉(zhuǎn)移中去核和直接注射次序的比較常規(guī)次序先去核再注射在五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中·操作的卵母細(xì)胞去核后存活(84/138)·壓電輔助直接注射卵丘細(xì)胞胞核后的存活數(shù)(16/78)·果導(dǎo)致只有12％操作的卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)中(16/138)相反的次序先注射后去核在五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中·壓電輔助直接注射卵丘細(xì)胞胞核后存活的卵母細(xì)胞數(shù)(129/236)·去核后的存活數(shù)(86/118)·導(dǎo)致35％操作的卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)中(86/236)所有實(shí)驗(yàn)均用標(biāo)準(zhǔn)1(C57BL/6xCBA)小鼠的卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞來進(jìn)行。
實(shí)施例2從重新編程的成年體細(xì)胞胞核分離多能性胚胎干細(xì)胞人治療性克隆的鼠模型從早期胚胎分離獲得的人多能性干細(xì)胞是用于基于細(xì)胞的基因和組織治療的許多不同細(xì)胞類型的潛在的非限制性來源(1-3)。然而，如果要明白供體胚胎衍生的細(xì)胞系的全部潛力，就需要解決供體-受體組織匹配這一重要的問題。避免移植排斥問題的一種方法是通過治療性克隆從患者自身細(xì)胞建立干細(xì)胞系(3，4)。最近的研究表明，可以從成年體細(xì)胞中取出胞核，將該胞核轉(zhuǎn)移到?jīng)]有母本染色體的未受精卵母細(xì)胞中，由轉(zhuǎn)移的胞核來指導(dǎo)胚胎發(fā)育(5，6)。從該克隆胚胎分離出的干細(xì)胞在遺傳上與患者相同，因而不會有免疫排斥的危險。在這里，我們報(bào)道從重新編程的成年體細(xì)胞胞核分離出多能性鼠干細(xì)胞。通過用機(jī)械方法將分離出的卵丘細(xì)胞胞核直接注入成熟卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生胞核增加的胚胎。從胞核增加的胚泡分離出的胚胎干細(xì)胞(ES)顯示出特征性的形態(tài)和標(biāo)記表達(dá)，并在腫瘤、嵌合胚和幼崽中大量分化成胚胎所有三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。胞核增加的ES細(xì)胞還很容易在培養(yǎng)中分化成神經(jīng)元和肌肉。該研究表明多能性干細(xì)胞可從終末分化的成年體細(xì)胞胞核衍生獲得，并且為研究胞核供體在自體的人多能性干細(xì)胞治療發(fā)展中的潛力提供了一個模型系統(tǒng)。
結(jié)果和討論用以前描述的方法(6)的改進(jìn)方案，用卵丘細(xì)胞胞核代替成熟卵母細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，產(chǎn)生胚泡。從遍在表達(dá)胞核局限性lacZ報(bào)道基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(ZIN40)收集卵丘細(xì)胞，當(dāng)用X-gal底物處理時，它顯示出獨(dú)特的藍(lán)色(7)。由于受體卵母細(xì)胞是從非轉(zhuǎn)基因品系(B6D2F1)收集得到的，因此用lacZ轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的存在來證實(shí)轉(zhuǎn)移后卵丘細(xì)胞胞核的貢獻(xiàn)(8)。在21次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，39％(362/926)的操作的卵母細(xì)胞在注射和去核后存活。在用鍶激活后，75％(270/362)的重新構(gòu)建的卵母細(xì)胞在培養(yǎng)24小時后分裂成二細(xì)胞階段。在培養(yǎng)96小時后，形成了10個(3％)形態(tài)上正常的卵丘細(xì)胞(CC)衍生的胚泡，將其放入培養(yǎng)中用于分離ES細(xì)胞。8個胚泡孵化并在首代中形成了具有3個表現(xiàn)出推定ES細(xì)胞形態(tài)的明顯的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊突起(outgrowth)。建立一個細(xì)胞系(親代CC衍生的ES細(xì)胞系)，當(dāng)其在有或沒有成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的添加了白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)基中生長時，它繼續(xù)表現(xiàn)出特征性的小鼠ES細(xì)胞形態(tài)(
圖1a)。從48個獨(dú)立的從親代CC衍生的ES(CC-ES)細(xì)胞系機(jī)械分離出的細(xì)胞建立四個亞系。
所有檢查的CC-ES細(xì)胞系顯示出特征性的ES細(xì)胞形態(tài)(
圖1a)，并表達(dá)特征性的小鼠ES細(xì)胞標(biāo)記(包括階段特異性胚胎抗原-1)(SSEA-1)(
圖1b)和堿性磷酸酶活性(
圖1c)Oct4 mRNA在未分化的ES細(xì)胞中高度表達(dá)，在分化的ES細(xì)胞培養(yǎng)中下調(diào)(未顯示)。獨(dú)特的藍(lán)色X-gal染色胞核(
圖1d)和正常雌性(40，XX)染色體組型(
圖1e)證明NT-ES細(xì)胞是從重新編程的體細(xì)胞胞核衍生獲得的。除了細(xì)胞學(xué)檢查外，親代CC-ES細(xì)胞以及克隆衍生的亞系顯示出缺少Y染色體特異性基因組PCR產(chǎn)物(
圖1f)。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，其它雌性ES細(xì)胞沒有生長。CC胚泡分化產(chǎn)生的ES細(xì)胞的比例與從55個體內(nèi)產(chǎn)生的胚泡(性交后(dpc)3.5天)建立5個ES細(xì)胞系的初步實(shí)驗(yàn)相似。
對親代CC-ES細(xì)胞系和兩個克隆衍生的亞系的多能性進(jìn)行體外和體內(nèi)研究。發(fā)現(xiàn)所有CC-ES細(xì)胞系很容易在體外分化成神經(jīng)元和搏動的肌肉，其頻率與對照ES細(xì)胞相似。用神經(jīng)元和肌肉特異性抗體對分化的CC-ES細(xì)胞培養(yǎng)物作間接免疫熒光，以證實(shí)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。在產(chǎn)生lacZ陽性畸胎瘤的免疫功能低下的小鼠中所有CC-ES細(xì)胞注射部位(12/12)未呈現(xiàn)對分化的限制，它們均廣泛分化成胚胎所有三種層，這三種胚層包括神經(jīng)上皮和復(fù)層鱗狀上皮(外胚層)；肌肉、軟骨和骨(中胚層)和纖毛分泌性上皮(內(nèi)胚層)(圖3a-d)。
體細(xì)胞胞核恢復(fù)多能性通過體細(xì)胞在嵌合胎和幼崽中的作用得到進(jìn)一步證實(shí)。6個妊娠中期(10dpc)胎兒中有四個含有X-gal陽性細(xì)胞。一個胎兒看來單獨(dú)由NT-ES細(xì)胞衍生物組成(未顯示)。14個幼崽中有6個經(jīng)明顯的皮毛和眼顏色鑒定為是嵌合的(圖3e)。通過lacZ基因組PCR(未顯示)和對所有分析器官(包括小腦、心臟和腸)冷凍切片的X-gal染色(圖3f-h)作顯微鏡分析，證實(shí)了多譜系CC-ES細(xì)胞的貢獻(xiàn)。
該報(bào)道描述了第一次從成年體細(xì)胞胞核中分離出多能性干細(xì)胞。盡管已經(jīng)從胎兒成纖維細(xì)胞胞核衍生的牛胞核轉(zhuǎn)移胚胎中分離出ES-樣細(xì)胞(9)，但是本報(bào)道描述的小鼠體細(xì)胞衍生的ES細(xì)胞研究為體外和體內(nèi)研究胞核重新編程和發(fā)育能力提供了一個更易理解和多樣化的模型系統(tǒng)。例如，可從不同的供體細(xì)胞類型建立ES細(xì)胞系，并用建立的體外和體內(nèi)ES細(xì)胞分化程序來評價對多能性可能的限制。這些分析可能有助于解釋從神經(jīng)元和足細(xì)胞胞核衍生的胞核轉(zhuǎn)移胚泡的受限制的發(fā)育(6)。還可通過使用建立的轉(zhuǎn)基因小鼠品系來加強(qiáng)這些研究，這些小鼠品系攜帶了調(diào)控發(fā)育或遍在表達(dá)的報(bào)道基因，以便監(jiān)測分子水平的重新編程或顯示嵌合胚中的細(xì)胞貢獻(xiàn)(8)。同樣，可用具有特定基因缺失或基因修飾的突變型小鼠系作為胞核供體來源，以研究該特定基因在胞核重新編程或多能性干細(xì)胞分化中的作用。
胞核重新編程與ES細(xì)胞衍生相結(jié)合的最大潛力可能在于開發(fā)自身人多能性干細(xì)胞用于基于細(xì)胞的基因和組織治療。ES細(xì)胞衍生的體細(xì)胞移植可使患病或受損的組織恢復(fù)功能，或可在移植輸送基因治療之前作遺傳上的改變。小鼠移植研究表明ES衍生的心肌細(xì)胞(10)、神經(jīng)前體細(xì)胞(11)、造血前體細(xì)胞(12)和胰島素分泌性細(xì)胞(13)能在受體動物中存活并發(fā)揮作用。本報(bào)道中描述的研究為在模型系統(tǒng)中的人治療性克隆提供了主要證據(jù)。
補(bǔ)充材料和方法通過直接胞核注射產(chǎn)生胚泡分別從超排卵的成年C6D2F1(C57BL/6J×DBA/2)和ZIN40/129Sv雌小鼠收集卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。機(jī)械分離各卵丘細(xì)胞胞核，用壓電輔助的顯微操作(Piezo impactmicromanipulation system，PMM-150FU；Prime Tech Ltd.，Ibaraki，Japan)將其注入完整的中期II卵母細(xì)胞(給予人絨毛膜促性腺激素后13-15小時)中。然后在細(xì)胞松弛素B(Sigma，St.Louis，MO)存在下除去含有各注射卵母細(xì)胞中期板的胞質(zhì)，用bisBENZIMIDE(Hoechst 33342；Sigma)染料染色，在紫外光下評估是否僅除去了卵母細(xì)胞染色體。3-4小時后，在細(xì)胞松弛素B存在下，使重建的卵母細(xì)胞在10mM氯化鍶(Sigma)中化學(xué)激活5小時，然后在G1/G2培養(yǎng)基(14)中37C5％CO2下培養(yǎng)4天，每日評價胚胎的發(fā)育。
ES細(xì)胞的衍生ES細(xì)胞基本上如(15)所述那樣分離，只是將所有胚胎培養(yǎng)在96孔組織培養(yǎng)板(Falcon，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)的單個孔內(nèi)。用細(xì)玻璃移液管切開一些胚泡上的透明帶，以幫助孵化。在高葡萄糖Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(TraceBioscientfic，Castle Hill，Australia)中分離ES細(xì)胞，該培養(yǎng)基含有20％胎牛血清(CSL，Melbourne，Australia)和2×103U/毫升LIF(Lindsay Williams贈與，Monash University，Clayton，Australia)，并含有標(biāo)準(zhǔn)濃度的非必需氨基酸、谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素(LifeTechnologies，Gaitherburg，MD)和2-巰基乙醇(Sigma)。一旦建立，就將ES細(xì)胞培養(yǎng)在明膠覆蓋的平皿中不加飼養(yǎng)細(xì)胞、含有10％胎牛血清的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中。用機(jī)械方法將第6代無飼養(yǎng)細(xì)胞的親代CC-ES細(xì)胞培養(yǎng)物的單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板的分開的明膠覆蓋孔內(nèi)，建立克隆亞系。
ES細(xì)胞的性質(zhì)鑒定如前所述(17)，測定堿性磷酸酶活性。
用SSEA-1特異性單克隆抗體(MC-480；Developmental Studies Hybridoma Bank，Iowa City，IA)檢測SSEA-1表達(dá)，并用與山羊抗小鼠免疫球蛋白偶聯(lián)的異硫氰酸熒光素(Dako，Carpinteria，CA)顯色。
如前(18)所述進(jìn)行Oct4 RT-PCR，采用改進(jìn)的引物5′-GTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3′(正向)和5′-ACTCGAACCACATCCTTCTC-3′(反向)，其中預(yù)計(jì)的Oct4 RT/PCR產(chǎn)物大小為311bp。作為mRNA質(zhì)量的對照，我們用相同的RT-PCR條件和下列引物測定polyA轉(zhuǎn)錄物5′-GTTGCAGGGTAACCGATGAA-3′(正向)和5′-TGTTGTGGGTATGCTGGTGT-3′(反向)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為361bp。
用標(biāo)準(zhǔn)的G顯帶技術(shù)來顯示染色體組型(計(jì)數(shù)到50個中期伸展體(spreads))。用基因組PCR測得缺少Smcy(19)，進(jìn)一步確證缺少Y染色體，該P(yáng)CR技術(shù)采用的引物是5′-TGAATCTTTGGCTTTGAG-3′(正向)和5′-CCGCTGCCAAATTCTTTGG-3′(反向)，PCR條件如下35輪的95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒(Dr David Threadgill，Department of Cell Biology，Vanderbilt University，Nashville，TN；個人通訊地址)。從Smcy(約290bp)及其X染色體同源的Smcx(約330bp)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
畸癌瘤形成在4-6周齡嚴(yán)重復(fù)合性免疫缺陷(SCID)小鼠的睪丸囊下注射CC-ES(親代和克隆的)單細(xì)胞懸液，建立畸癌瘤。外科手術(shù)后18-20天，取下睪丸，一部分作急速冷凍用于X-gal染色或以Bouinis固定劑固定，包埋在石臘內(nèi)，蘇木精和伊紅染色后作組織學(xué)檢查。
嵌合胎和幼崽的產(chǎn)生通過桑椹胚聚集(20)或胚泡注射(21)產(chǎn)生嵌合體。在轉(zhuǎn)移至假孕受體B6CBF1(C57BI/6JxCBA)小鼠(2.5dpc)之前，使親代CC-ES細(xì)胞與8細(xì)胞CD1胚胎一起聚集，或注射入C57BL/6J胚泡(3.5dpc)。
體外分化和性質(zhì)鑒定用視黃酸處理CC-ES細(xì)胞聚集體以便神經(jīng)元分化(22)，或使CC-ES細(xì)胞聚集體自發(fā)分化成搏動的肌肉(23)。用特異性的小鼠第一單抗和與抗小鼠免疫球蛋白偶聯(lián)的FITC(Dako)通過間接熒光免疫檢測分化的ES細(xì)胞中的特征性抗原，按照生產(chǎn)商說明書采用下列的抗體稀釋度抗肌動蛋白(1∶20；M0635，Dako)、抗結(jié)蛋白(1∶30；M0760，Dako)、抗MAP 2a，b(1∶100；AP20，Neomarkers，Union City，CA)和抗神經(jīng)絲蛋白68kDa和160kDa(純的；分別來自Amersham Pharmacia Biotech，Amersham，UK和BoehringerMannheim Biochemica，Indianapolis，IN)。
X-gal染色/lacZ PCR固定胚胎和冷凍組織切片，用如前(24)所述的5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal；Promega，Madison，WI)底物染色。用基因組PCR檢測lacZ的存在，PCR采用下列引物5′-ACTATCCCGACCGCCTTACT-3′(正向)和5′-TAGCGGCTGATGTTGAACTG-3′(反向)，在下列條件下30輪的95℃30秒、52℃30秒、72℃2分鐘。預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為172bp。
實(shí)施例3豬中胞核轉(zhuǎn)移和胞核增加的效率表1
實(shí)施例4胞核增加的豬中的效率和激活、融合以及后處理對其的作用重復(fù)實(shí)施例3的胞核增加，只是引入一系列變化以調(diào)節(jié)它們對效率的影響。這些變化包括用完整的MI卵母細(xì)胞代替MII卵母細(xì)胞，改變激活和融合步驟的次序和排列，用化學(xué)抑制劑來防止相互摻雜，以及除去或破壞基因組DNA。結(jié)果顯示在表2中。
表2胞核增加
注意1.后處理通常在激活之后，較佳的在1小時(或在12小時)之后，但是應(yīng)在正常的胚胎分裂前停止，后處理用來防止基因組和導(dǎo)入的DNA摻雜。
2.融合宜采用所述的電學(xué)、病毒或PEG方法。
3.激活宜采用所述的化學(xué)(乙醇、鍶鈣離子運(yùn)載體等)或電學(xué)方法。
4.細(xì)胞注射/插入是用顯微注射方法(壓電顯微注射)插入新的DNA(不是融合)而不破壞MI或MII板。
5.中期DNA的除去或破壞宜采用去核(顯微操作/抽提、壓電等)或化學(xué)或激光顯微外科方法。除去宜在第一次分裂前進(jìn)行，或用來停止中期DNA與插入/融合的核體DNA的結(jié)合。
實(shí)施例5延遲激活在豬卵母細(xì)胞中的效果表3
實(shí)施例6胞核轉(zhuǎn)移(NT)和胞核增加(NA)產(chǎn)生的豬胚胎中的基因轉(zhuǎn)移效率
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最后，應(yīng)當(dāng)理解在不脫離本文所述發(fā)明精神的情況下可作出各種變化、改變和/或添加。
權(quán)利要求
1.一種制備重新編程的二倍體細(xì)胞的方法，該方法包括提供供體細(xì)胞或供體胞核，和受體細(xì)胞；將供體細(xì)胞或供體胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；使該非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持足以使供體胞核重新編程的時間；任選地使非整倍體細(xì)胞經(jīng)歷激活步驟；和通過除去、破壞或失去所述重新編程的非整倍體細(xì)胞的受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中受體細(xì)胞是卵母細(xì)胞、受精卵或胚胎卵裂球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中卵母細(xì)胞是中期II卵母細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中受體細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞或其它多能性干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中供體胞核或細(xì)胞是體細(xì)胞或從體細(xì)胞衍生得到的胞核。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中供體胞核或細(xì)胞是卵丘細(xì)胞或從卵丘細(xì)胞衍生獲得的胞核。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中供體胞核或細(xì)胞是胚細(xì)胞或從胚細(xì)胞衍生獲得的胞核。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中供體胞核或細(xì)胞是生殖細(xì)胞或從生殖細(xì)胞衍生獲得的胞核。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中供體胞核或細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、原生殖細(xì)胞或軀體干細(xì)胞或從這些細(xì)胞衍生獲得的胞核。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中供體胞核或細(xì)胞通過壓電輔助的顯微操作轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在非整倍體細(xì)胞分裂之前大量除去或大量破壞受體細(xì)胞胞核或胞核DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中供體細(xì)胞重新編程至胚胎細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中重新編程的細(xì)胞能形成含有多能性胚胎細(xì)胞的動物胚胎。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中多能性干細(xì)胞從多能性胚細(xì)胞衍生獲得。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中產(chǎn)生了胚胎干細(xì)胞系。
16.一種制備重新編程的經(jīng)基因修飾的二倍體細(xì)胞的方法，所述方法包括提供供體細(xì)胞或供體胞核，該供體細(xì)胞或胞核已經(jīng)過基因修飾而除去或降低了不希望有的活性或提供或提高了所需的活性，和受體細(xì)胞；將供體細(xì)胞或胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；使該非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持足以使供體胞核重新編程的時間；任選地使非整倍體細(xì)胞經(jīng)歷激活步驟；和通過除去、破壞或失去所述重新編程的非整倍體細(xì)胞的受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的經(jīng)基因修飾的二倍體細(xì)胞。
17.一種制備重新編程的遺傳上異常的細(xì)胞的方法，所述方法包括提供供體細(xì)胞或供體胞核，該供體細(xì)胞或胞核從諸如患遺傳疾病的動物或人細(xì)胞等遺傳異常的細(xì)胞衍生獲得，和受體細(xì)胞；將供體細(xì)胞或胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；使該非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持足以使供體胞核重新編程的時間；任選地使非整倍體細(xì)胞經(jīng)歷激活步驟；和通過除去、破壞或失去所述重新編程的非整倍體細(xì)胞的受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的遺傳上異常的細(xì)胞，該細(xì)胞與所述異常的供體細(xì)胞胞核有相同的基因組成。
18.一種恢復(fù)或提高組織或器官功能的方法，所述方法包括提供動物，和一種或多種權(quán)利要求1所述的重新編程的細(xì)胞或所述細(xì)胞的衍生物；將所述細(xì)胞或其衍生物轉(zhuǎn)移給動物，較佳的轉(zhuǎn)移到所述組織或器官部位處或附近；和使轉(zhuǎn)移的細(xì)胞或其衍生物在所述組織或器官處重新增殖。
19.一種基因治療的方法，所述方法包括提供動物，和一種或多種權(quán)利要求16所述的經(jīng)基因修飾的重新編程的細(xì)胞或所述細(xì)胞的衍生物；將細(xì)胞或其衍生物轉(zhuǎn)移給該動物；和使所述細(xì)胞或其衍生物在所述動物中重新增殖以提供基因治療。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，它進(jìn)一步包括從所述重新編程的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞系、組織、器官或動物胚胎的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，它進(jìn)一步包括從所述動物胚胎產(chǎn)生非人動物的步驟。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，它進(jìn)一步包括從所述重新編程的細(xì)胞產(chǎn)生經(jīng)基因修飾的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織或器官或轉(zhuǎn)基因動物胚胎的步驟。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，它進(jìn)一步包括從所述動物胚胎產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物的步驟。
24.一種用權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
25.一種用權(quán)利要求16所述的方法產(chǎn)生的基因修飾的細(xì)胞。
26.一種用權(quán)利要求20所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官或動物胚胎。
27.一種用權(quán)利要求22所述的方法產(chǎn)生的基因修飾的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織或器官或轉(zhuǎn)基因動物胚胎。
28.一種用權(quán)利要求21所述的方法產(chǎn)生的非人動物。
29.一種用權(quán)利要求23所述的方法產(chǎn)生的非人轉(zhuǎn)基因動物。
30.一種產(chǎn)生動物胚胎的方法，該方法包括提供供體胞核，和受體細(xì)胞；和將供體胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；任選地使非整倍體細(xì)胞經(jīng)歷激活步驟；和通過除去、破壞或失去所述非整倍體細(xì)胞的受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞；和從所述重新編程的二倍體細(xì)胞產(chǎn)生動物胚胎。
31.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎的方法，所述方法包括提供供體胞核，它經(jīng)過基因修飾而除去或減少了不需要的活性或提供或提高了所需的活性，和受體細(xì)胞；將供體胞核導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生基因修飾的非整倍體細(xì)胞；任選地使非整倍體細(xì)胞經(jīng)歷激活步驟；和通過除去、破壞或失去所述非整倍體細(xì)胞的受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞；和從所述重新編程的二倍體細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎。
32.一種產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞或重新編程的二倍體細(xì)胞的方法，所述方法包括提供供體胞核，外源核酸分子，和受體細(xì)胞；將供體胞核和外源核酸分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；和任選地通過除去、破壞或失去受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞。
33.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎的方法，該方法包括提供供體胞核，外源核酸分子，和受體細(xì)胞；將供體胞核和外源核酸分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；和任選地通過除去、破壞或失去受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體細(xì)胞；和從非整倍體細(xì)胞或重新編程的二倍體細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物胚胎。
34.一種產(chǎn)生重新編程的二倍體胚細(xì)胞或胚胎的方法，該方法包括提供供體細(xì)胞或供體細(xì)胞胞核，和受體卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞；將供體細(xì)胞或供體細(xì)胞胞核導(dǎo)入受體卵母細(xì)胞或胚細(xì)胞中，產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞；使該非整倍體細(xì)胞在合適的環(huán)境中維持足以使供體細(xì)胞胞核被重新編程的時間；任選地使非整倍體細(xì)胞經(jīng)歷激活步驟；和通過除去、破壞或失去所述重新編程的非整倍體細(xì)胞或其一個或多個子細(xì)胞的受體細(xì)胞胞核或胞核DNA，從所述重新編程的非整倍體細(xì)胞產(chǎn)生重新編程的二倍體胚細(xì)胞或胚胎。
全文摘要
本發(fā)明涉及重新編程成年細(xì)胞核產(chǎn)生胚胎的方法。該方法包括:取供體下表或胞核;使該供體胞核與未去核的受體細(xì)胞融合,產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞;等待一段實(shí)踐使供體胞核重新編程;除去受體細(xì)胞胞核。該方法產(chǎn)生了具有重新編程胞核的胚胎。
文檔編號A01K67/027GK1361659SQ00809939
公開日2002年7月31日 申請日期2000年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月6日
發(fā)明者M·R·布蘭登, A·J·弗倫奇, 陳宏武, P·芒福德, M·J·芒西 申請人:干細(xì)胞科學(xué)控股有限公司