專利名稱：禽胚層細(xì)胞系的制作方法
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關(guān)于聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明的完成使用了聯(lián)邦政府的資金USDA 96-CRHR-0-6055。因此聯(lián)邦政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及能無限增殖的禽胚層細(xì)胞系和制造該細(xì)胞系的方法以及用于該方法的材料。這些細(xì)胞系對產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類和保持種系基因組而言是理想的。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種改善植物的商業(yè)價值的強(qiáng)效工具(如增加它們對疾病和除草劑的抗性)。然而，改善動物遺傳性狀的嘗試落后于植物的，大部分早期研究者重于采用動物作為生產(chǎn)合成性人用藥物的生物反應(yīng)器。至今用轉(zhuǎn)基因方法對家畜遺傳質(zhì)量的改善取得的進(jìn)展極小。
這種努力的具體進(jìn)展在于通常高密度飼育的家畜(如雞、鴨、鵝、火雞等)產(chǎn)業(yè)，而高密度飼養(yǎng)導(dǎo)致受疾病(如馬立克病和雞白血病)感染的危險性增加。因此商業(yè)飼養(yǎng)者設(shè)法選擇(用天然飼養(yǎng)方法)疾病抵抗能力增加的家畜。
曾經(jīng)作過某些設(shè)想將外源基因引入到家畜飼養(yǎng)的品種中，來增加對疾病的抵抗力。例如，采用對雞白血病病毒某一亞型的抗性增加的突變型ALV病毒感染一胚系。參見M.Federspiel等人，65 J.Virol.313-19(1991)。本文將該出版物和所引用的其它所有出版物全部納入作為參考。
還嘗試過引入選定的外源基因，通過將它們克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(如網(wǎng)狀內(nèi)皮病毒或雞白血病病毒)，將此重組病毒注射入受精卵中，讓病毒感染發(fā)育的胚胎(如原生殖細(xì)胞)，從而產(chǎn)生一種嵌合的性腺或卵細(xì)胞，并用如此得到的重組體設(shè)法將外源基因引入后代。然而，家畜業(yè)不愿將這種技術(shù)用作商業(yè)方法，因?yàn)椴《?天然狀態(tài)時)是病原，即使變異復(fù)制的感受態(tài)病毒載體有時也會誘發(fā)腫瘤，而且復(fù)制非感受態(tài)變體需要很高的劑量或多次量。而且，甚至復(fù)制缺陷型病毒構(gòu)建物可能具有與內(nèi)源病毒包膜重組而變成重組感受態(tài)的某些危險。另外，最近這些病毒限于尺寸相對小的DNA插入物(如2千個或以下的堿基對)。
還企圖將外源DNA注射入未發(fā)育的受精卵細(xì)胞，然后通過手術(shù)從母雞中取出。參見M.Perry，331 Nature(1998)。然而，這種方法需要將發(fā)育的胚胎在一系列的替代容器中培養(yǎng)。另外，還需要特定的產(chǎn)蛋禽群和廣泛實(shí)踐來得到所需的手術(shù)和專業(yè)技術(shù)。
技術(shù)上需要較低的現(xiàn)有方法包括將外源DNA引入已產(chǎn)下的卵的胚胎中。通常參見J.Petitte等人，76 Poult.Sci.，1084-92(1997)；R.Etches等人，62MethodsMol.Biol.，433-50(1997)；M.Naito等人，113 J.Reprod.Fertil，137-43(1998)；M.Nakamura等人，67 Okajimas Folia Anat Jpn.，473-7(1991)；J.Petitte等人，108Development，185-9(1990)；和美國專利5,340,740和5,656,479，J.Petitte等人。
還包括在產(chǎn)蛋后48小時或立即(當(dāng)原生殖細(xì)胞開始遷移到性腺肛原(analagen)時)將基因修飾的胚胎細(xì)胞或原生殖細(xì)胞注射入胚層。在該方法中，當(dāng)摻入發(fā)育的胚胎時，產(chǎn)生的胚層細(xì)胞培養(yǎng)物保留了它們分化成能產(chǎn)生細(xì)胞的功能性卵細(xì)胞或精子的能力。
可將這種類型的胚層細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行基因修飾然后注射入接收胚胎。接收胚胎通常已用γ射線預(yù)先進(jìn)行修飾而削弱了內(nèi)源性原生殖細(xì)胞，并給予注射的細(xì)胞在進(jìn)入性腺肛原時有利的選擇。然后被修飾的細(xì)胞成熟，產(chǎn)生能將轉(zhuǎn)基因傳遞給至少下一代(和較佳地以后幾代)的精子或卵細(xì)胞。
該方法成功的關(guān)鍵在于抑制分化時使培養(yǎng)物中的胚胎胚層細(xì)胞擴(kuò)增的能力。因此一些試驗(yàn)小組開發(fā)了基于添加各種克隆化因子和飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，在維持胚層細(xì)胞的原生殖細(xì)胞表型的同時進(jìn)行胚層細(xì)胞的短期(幾天到2周左右)擴(kuò)增。這些培養(yǎng)的細(xì)胞成功地產(chǎn)生了嵌合種系細(xì)胞，但大部分用該系統(tǒng)來表達(dá)轉(zhuǎn)染的DNA作為轉(zhuǎn)基因的嘗試都是不成功的。
另一方法依賴使用含有毒素的培養(yǎng)基。
因此，可以看出禽胚層細(xì)胞培養(yǎng)需要一種改進(jìn)的培養(yǎng)條件。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面提供了一種表達(dá)EMA-1表位的未分化禽(較佳地家禽如火雞、鴨、鵝和雞)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中該培養(yǎng)物當(dāng)存在禽臍分離物時(如胚胎禽臍的分離物)能維持其未分化的特性和其在擴(kuò)增期間(較佳地為6個月以上)表達(dá)EMA-1表位的能力。
本發(fā)明另一方面提供了一種產(chǎn)生能表達(dá)EMA-1表位的未分化胚層細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)物。在形成原條前，從禽胚盤收集禽細(xì)胞。然后在存在禽臍分離物(如火雞臍提取物)時培養(yǎng)這些禽細(xì)胞。
本發(fā)明的另一形式是提供了用于培養(yǎng)禽(如家禽)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)基，含有禽臍分離物。較佳地，該培養(yǎng)基宜還含有標(biāo)準(zhǔn)胚層培養(yǎng)物中存在的其它成分。
本發(fā)明的另一形式是提供了一種保存禽種系基因組的方法。這可以通過冷凍上述培養(yǎng)物之一完成。
本發(fā)明的另一形式是提供了由這種培養(yǎng)物衍生的重組禽類。
通過用含有禽臍分離物的培養(yǎng)基培養(yǎng)胚層細(xì)胞，可以獲得含有未分化原生殖細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)物。這就提供了能用于產(chǎn)生重組細(xì)胞的有效培養(yǎng)物。
得到的重組胚細(xì)胞可用于產(chǎn)生重組禽類和保存種系基因組。另外，似乎這種重組禽類有可能將這些外來性狀遺傳給它們的后代。
因此本發(fā)明的目的包括提供(a)能在較長時間保持不分化而無需飼養(yǎng)層或毒素的持續(xù)的禽原生殖細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)由這種細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的重組禽類；(c)產(chǎn)生這種培養(yǎng)物的方法(d)通過冷凍這種培養(yǎng)物來保存基因組的方法；和(e)用于進(jìn)行這些方法的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的這些及其它目的和優(yōu)點(diǎn)通過以下優(yōu)選實(shí)施例的敘述將會顯而易見。但應(yīng)將權(quán)利要求書作為判斷本發(fā)明整個范圍的依據(jù)。
發(fā)明詳述概述我們提供了一種穩(wěn)定的禽胚層細(xì)胞(“BDC”)培養(yǎng)系統(tǒng)，其無需飼養(yǎng)層或毒素，能維持活的BDC 6個月以上。該培養(yǎng)的BDC能表達(dá)EMA-1表位(原生殖細(xì)胞的一種標(biāo)記)。參見，A.Hahnel等人，15 Gamete Research 25-34(1986)和L.Urven等人，103Develop.299-304(1988)。用這種方法產(chǎn)生的培養(yǎng)細(xì)胞能提供造血細(xì)胞和各種其它細(xì)胞類型(當(dāng)它們被轉(zhuǎn)染，然后被插入到接收的雞胚胎時)。
材料供體胚層細(xì)胞和受體受精卵來源于Avian Disease and Oncology Laboratory(ADOL)。我們使用它們的細(xì)胞系0(MHC＝B21B21)、C(MHC＝B12B12)、71(MHC＝B2B2)、15I5x71(MHC＝B2B15)、N(MHC＝B21B21)、P(MHC＝B19B19)，部分是因?yàn)檫@些細(xì)胞系是已知的維持無常見病原病毒的細(xì)胞系。
我們的培養(yǎng)基如下。用無血清和無蛋白質(zhì)的雜交瘤培養(yǎng)基(SFPF，#S2897)來培養(yǎng)細(xì)胞系0 BDC。
用L-15 Leibovitz培養(yǎng)基/McCoy 5A改良培養(yǎng)基(L/M為1∶1，#L4386，#M4892)來培養(yǎng)細(xì)胞系0、細(xì)胞系7和15I5x71。
Dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基/ham營養(yǎng)混合物(DMEM/F-12，#D0547)用于細(xì)胞系C。
極限必需培養(yǎng)基eagle(MEM，#M0644)用于細(xì)胞系P。
總的來說，這些培養(yǎng)基通常含有水、無機(jī)鹽、維生素、氨基酸、緩沖液、葡萄糖、核苷酸前體/核苷酸、脂類、TCA循環(huán)中間體和各種微量添加劑。
在所有培養(yǎng)基中使用終濃度為1,000U/ml的青霉素和鏈霉素(Pen/Strep)來抑制細(xì)菌細(xì)胞的生長。
還添加毛喉素(#6886或#F3917)來促進(jìn)細(xì)胞系C中BDC的生長(20μg/100ml終濃度)。
所有上述培養(yǎng)基試劑都從Sigma Chemical Co.，St Louis，MO購得，在所有培養(yǎng)基中加入終濃度為20％的胎牛(小牛)血清(FBS，Gibco BRL Life Technonogies，Grand Island，NY)。
從管狀(piping)胚胎得到火雞臍。從環(huán)繞臍帶附著處的腹部區(qū)域切下各臍(0.7-1cm直徑)。除去殘留的臍帶。將臍合并置于冰冷的無血清培養(yǎng)基中(一個臍2ml培養(yǎng)基)，在冰浴中用組織粉碎器勻漿化，冷凍-解凍3次，并在4℃ 25，000×g離心30分鐘。用于此目的的冰凍培養(yǎng)基為無血清無蛋白質(zhì)的雜交瘤培養(yǎng)基(SFPF，#S2897)。關(guān)鍵特征是作為相關(guān)分離物的含水提取液是水溶性的。
保留上清液，用0.22μm膜除菌過濾(除去大于該尺寸的顆粒)，分成每個小瓶1ml等份，-20℃儲存。將此無菌過濾的火雞臍提取物(“TNE”)新鮮加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，為400μl TNE/10ml培養(yǎng)基(相當(dāng)于每100ml培養(yǎng)基2個臍)。
當(dāng)要孵化禽胚胎時，卵黃囊開始通過腹部區(qū)域(通常稱為臍區(qū))中的一個小開口縮回入胚胎的體腔內(nèi)。在卵黃囊縮回后幾分鐘內(nèi)該開口將愈合。參見A.Romanoff等人，“禽胚胎結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)育”，1051-1079，The MacmillanCompany，New York(1960)。
我們相信禽臍組織的細(xì)胞分泌加速臍閉合的生長/愈合因子。如果臍不完全愈合，孵化出的小雞在孵化后的早期易受感染。我們發(fā)現(xiàn)這些因子可用于我們的培養(yǎng)基。
對任選的添加劑而言，我們采用小雞胚胎提取物。將7日齡的小雞胚胎置于無血清無蛋白質(zhì)的雜交瘤培養(yǎng)基(SFPF，#S2897)，在冰浴中勻漿化，冰凍-凍融3次，4℃25,000×g離心30分鐘。用0.22μm膜除菌過濾。將無菌小雞胚胎提取物以每個小瓶約一個胚胎的當(dāng)量等份分裝(取決于所得提取物的量)，-20℃儲存。以相當(dāng)于每100ml培養(yǎng)基一個胚胎的量任選地加入此提取物。據(jù)信這種添加劑能提高細(xì)胞的增殖。
EMA-1單克隆抗體是A.Hahnel等人，15Gamete Research 25-34(1986)描述的。它能與原生殖細(xì)胞反應(yīng)。EMA-1表位被視為禽原生殖細(xì)胞的一種標(biāo)記。由U.of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank.(Iowa City，IA)得到EMA-1抗體。
我們將含有2.5％FBS和1％Pen/Strep、Hepe緩沖鹽水2x(HBS2x)溶液(140mM NaCl、1.5mM Na2H2PO4、50mM Hepe(#H9136，Sigma)，pH7.05)和2MCaCl2的去離子水溶液(dH2O)的培養(yǎng)基199(M199，#M7667)用作轉(zhuǎn)染液。
作為載體的例子，我們使用含有標(biāo)記蛋白質(zhì)“綠熒光蛋白”(pEGFP，CLONETECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的質(zhì)粒。我們還使用含有其它感興趣外源基因的載體。參見J.Fulton等人，25Eur，J.Immunol.2069-2076(1995)所述的ppZeoBFIVprom/FLAG/B21。
為了促進(jìn)不同培養(yǎng)階段細(xì)胞的分離，以無血清的L/M培養(yǎng)基將膠原酶(#17103，GibcoBRL Life Technologies)稀釋至0.2mg/ml。用細(xì)胞刮擦橡皮(#14-105B，F(xiàn)isher Scientific，Pittsburgh，PA)從培養(yǎng)插件中取出細(xì)胞。
為了得到胚胎重組體，我們需要接近剛產(chǎn)下的(18小時)雞蛋殼內(nèi)的卵。由于這要打開蛋殼，我們需要得到蛋殼膜的修補(bǔ)片。為此目的，將蛋敲開，棄去內(nèi)含物。從蛋殼剝下殼膜，并置于含有1％Pen/Strep磷酸鹽緩沖鹽水的150×20mm無菌培養(yǎng)板上。將殼膜切成約2cm2大小的片。
方法A.產(chǎn)生原生殖細(xì)胞系我們制備了本發(fā)明的胚層細(xì)胞培養(yǎng)物。用顯微解剖剪(#11-1020，BiomedicalResearch Instruments，Inc.，Rockville，MD)從IX-XIV期(H.Eyal-Giladi等人，49Develop.Bio.321-337(1976))未孵化的受精卵中切下胚盤的中央部分，用顯微解剖鑷子(#10-1605，BRI)取出，并置于5ml培養(yǎng)基中。將約30個胚盤合并，用裝在3ml針筒上的22G號針頭輕輕地抽吸幾次來分散細(xì)胞。
然后將這些細(xì)胞分布在細(xì)胞培養(yǎng)插件上(F.Villars等人，12 CellBiol.Toxicol.(1996))。為此目的，我們使用Transwell多孔細(xì)胞培養(yǎng)插件，75mm直徑，0.4μm孔徑，聚碳酸酯膜，#3419，Coming Incorporated，Corning，NY。
將15ml含有新鮮火雞臍提取物(任選含有小雞胚胎提取物)的培養(yǎng)基加到37℃培養(yǎng)的培養(yǎng)物中。BDC在2天內(nèi)附著到插件膜上，且在一周內(nèi)鋪滿。
另一合適培養(yǎng)基的例子含有82％雜交瘤培養(yǎng)基、15％胎牛血清、1％Pen/Strep、2個火雞臍的提取物和1個小雞胚胎的提取物。
鋪滿后，每5到7天用細(xì)胞刮棒從培養(yǎng)插件上刮下BDC，用新鮮培養(yǎng)基以1∶2到1∶3的比例稀釋。各代BOC對胰蛋白酶或膠原酶處理都敏感，因此至少在原代和早期代次培養(yǎng)物時應(yīng)避免用酶分離。
然后我們測試了培養(yǎng)不同時間這些細(xì)胞的EMA-1表位的表達(dá)。這些測試可以用各種標(biāo)準(zhǔn)方法完成。例如，可以從培養(yǎng)物中除去培養(yǎng)基(留下接種的培養(yǎng)物)。用PBS洗滌培養(yǎng)物3次。然后可將EMA-1抗體溶液加到培養(yǎng)板中。在室溫培養(yǎng)該系統(tǒng)15分鐘(或4℃培養(yǎng)半小時)。
然后從板中除去EMA-1溶液，用PBS洗滌3次。再加入FITC偶聯(lián)的羊抗小鼠IgM抗體，室溫培育15分鐘。用PBS洗滌3次后，在配有UV濾色鏡的顯微鏡下觀察培養(yǎng)板。結(jié)合的抗體是可見的并表示EMA-1表達(dá)。
B.冷凍在早期培養(yǎng)階段，得到的胚層細(xì)胞系不能成功地冷凍，因?yàn)榧?xì)胞中有高含量的脂質(zhì)顆粒。然而，在培養(yǎng)2個月后，我們能夠成功地冷凍、儲存然后再培養(yǎng)。
就冷凍而言用膠原酶分離從培養(yǎng)插件上取出胚層細(xì)胞，并重懸于冷凍小管中的冰凍培養(yǎng)基中。-70℃在泡沫聚苯乙烯盒中凍結(jié)這些小管過夜，然后短期保藏于-70℃。對長期保存而言，我們認(rèn)為細(xì)胞應(yīng)保存在液氮中。
我們用雜交瘤培養(yǎng)基50％(無小雞胚胎提取物或火雞臍提取物)和10％二甲基亞砜(DMSO，#D2650，Sigma Chemical)和40％胎牛血清作為細(xì)胞凍存培養(yǎng)基。經(jīng)冰凍和解凍實(shí)驗(yàn)，我們確定BDC培養(yǎng)2個月后能成功地凍存。
C.轉(zhuǎn)染然后我們用載體使我們的培養(yǎng)細(xì)胞重組。我們用改良的磷酸鈣沉淀方法開始轉(zhuǎn)染。用于轉(zhuǎn)染的胚層細(xì)胞已培養(yǎng)了2-6個月。將在20μl dH2O、120μl 2MCaCl2、860μl dH2O和1ml HBS 2x中的20μg測試質(zhì)粒/載體加到Falcon12×75mm無菌聚乙烯圓底試管中(#2058，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)。
用1ml移液管將空氣通入試管中1分鐘。室溫培育該試管30分鐘。然后將質(zhì)粒溶液(2ml)加到培養(yǎng)板中，板中用含有2.5％FBS的M199置換培養(yǎng)基，并在37℃持續(xù)培養(yǎng)8小時。然后，棄去M199培養(yǎng)基，用M199培養(yǎng)基洗滌該板，再將初始培養(yǎng)基加到培養(yǎng)板中。此方法的一個重要方面是使胚層細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)轉(zhuǎn)染(無化學(xué)選擇)。這大大提高了這些脆弱細(xì)胞的存活，同時將轉(zhuǎn)染的效率提高至30％。
D.注射外源宿主的胚胎用70％乙醇消毒新生受精卵的蛋殼，用照蛋器確定此氣胞并標(biāo)記。孵化18小時后，從孵卵器(Jamsway，強(qiáng)制通風(fēng)型)取出雞蛋置于室溫中。用皮帶砂光機(jī)(3型，#7451，3”×24”皮帶，amps 5.2，皮帶FT./分鐘1200，Black & Decker In.，Towson，MD 21210)在氣胞區(qū)域的蛋殼上磨出1cm直徑的孔。用平頭鑷子取出殼膜。
用約40μm孔徑的微細(xì)管針式移液管，將20μl含有10,000DiI飽和的或被轉(zhuǎn)染的BDC的培養(yǎng)基注射到雞胚胎的月牙區(qū)域。將DiI[DII1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四-甲基吲哚-羰花青-高氯酸酯；diI-C18-(3)](MolecularProbes，Eugene，OR)溶解于100％DMSO中。制備2.5mg/ml原液，在培養(yǎng)液中稀釋至終濃度為2.5μg/ml，來染色培養(yǎng)板中的胚層細(xì)胞8小時(在37℃培養(yǎng)過程中)。除去含有DiI的培養(yǎng)液后，用PBS洗滌培養(yǎng)板5次。
需注意這種方法是用來檢測組織中被DiI染色的細(xì)胞。例如，可以從胚胎中取出7日齡的胚胎性腺，固定在4℃的4％多聚甲醛中8小時，然后在4℃ 5％蔗糖PBS中過夜，然后在30％蔗糖PBS中8小時(4℃)，再在-70℃冰凍。在5μm冷凍切片上進(jìn)行熒光鏡檢?？捎昧_丹明濾光器或窄帶濾光器觀察DiI(R.Penza等人，13Biotechniques 580-587(1992))。
注射后，將蛋殼膜補(bǔ)丁(如上所述)置于氣胞的上端。待蛋殼膜干燥后，將OpSite帶(高M(jìn)VP透明敷料，#4008，Smith+Nephew，由地方藥店購得)來包扎蛋殼膜的頂部，然后將雞蛋放還到Jamesway孵卵器中繼續(xù)孵化。第19天將胚胎轉(zhuǎn)移到孵化籃中，將孵化出的小雞套上標(biāo)記環(huán)、編號(dubbed)并注射SB-1/HVTMarek病疫苗(按照制造商說明)。
結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)(FC)分析顯示在培養(yǎng)2周后約35-45％胚層細(xì)胞表達(dá)EMA-1表位。EMA-1陽性細(xì)胞的大小范圍為15-30μm。
培養(yǎng)2個月后約30％胚層細(xì)胞保持EMA-1陽性。細(xì)胞能形成胚胎干細(xì)胞樣集落，仍表現(xiàn)EMA-1表位。這些集落緊密且形態(tài)一致。它們看起來是穩(wěn)定的(在以下所述的培養(yǎng)條件下)原生殖細(xì)胞。
在培養(yǎng)液中不添加禽臍提取物，胚層細(xì)胞能復(fù)制1次但存活時間不超過2個星期。在培養(yǎng)液中補(bǔ)充火雞臍提取物，細(xì)胞能復(fù)制2到3次(取決于雞蛋來源的品種)。然后生長速率降低，細(xì)胞將維持休眠狀態(tài)約4星期。如果每天在培養(yǎng)物中加入火雞臍提取物則可以將休眠期縮短至2星期。
4星期休眠后，細(xì)胞重新復(fù)制，將它們傳代培養(yǎng)。在休眠復(fù)蘇后，用膠原酶溶液來促進(jìn)分離。培養(yǎng)2到6個月后，用供體細(xì)胞作細(xì)胞注射/移植。
當(dāng)將大量培養(yǎng)的BDC從培養(yǎng)插件轉(zhuǎn)移到常規(guī)組織培養(yǎng)板上(低細(xì)胞密度103個細(xì)胞/em2)時，BDC開始分化成成纖維樣細(xì)胞、類黑色素細(xì)胞、類神經(jīng)細(xì)胞和類肌肉細(xì)胞分化的細(xì)胞(可以通過形態(tài)鑒定)(沒有顯示資料)。這是多能性的表現(xiàn)。在本文所述培養(yǎng)液條件下的細(xì)胞培養(yǎng)插件使得BDC能從上部和下部多孔膜吸收營養(yǎng)，這看起來防止了自發(fā)分化過程。
當(dāng)BDC從休眠回復(fù)并重新生長后，將它們傳代3次以上，與DiI-C18紅色染料一起培養(yǎng)，注射入18小時的胚胎中。在一實(shí)施例中，在注射后6天，取出胚胎組織并冷凍切片成5μm厚度。用熒光顯微鏡，在性腺和其它組織中檢測到有紅色染料的細(xì)胞。這表明培養(yǎng)的BDC能成熟或分化成性腺和各種其它胚胎組織。
在另一試驗(yàn)中，通過磷酸鈣沉淀方法(無藥物篩選)，用3種質(zhì)粒/載體(pGFP、pHCl或BFIV-I類)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BDC(2個月或更長)3次(每次10天)。最后一次轉(zhuǎn)染后3天，從培養(yǎng)插件中取出轉(zhuǎn)染的BDC，用膠原酶溶液處理得到單細(xì)胞懸浮液。將BDC懸液重懸于含有1％小雞血清的PBS中，注射入18小時胚胎的胚月牙區(qū)域。
注射流程后孵化率為9.2％(供體細(xì)胞為0系MHC＝B21B21，受體蛋為15I5x71MHC＝B2B15)。從四周齡的子代小雞得到血液，并用流式細(xì)胞術(shù)分析。在受體B12B15血液中檢測到供體嵌合性B21B21細(xì)胞。在一些小雞中，供體細(xì)胞的百分比高達(dá)25％到33％。
另外，49只推定的嵌合小雞血液中有7只具有供體細(xì)胞類型的MHC抗原。在小雞的外周血液中未檢測到轉(zhuǎn)染接收者I類抗原的表達(dá)。5只轉(zhuǎn)染小雞中有一只血液細(xì)胞表達(dá)pHcl，約4％。一只轉(zhuǎn)染小雞中表達(dá)12％綠熒光蛋白。所以，外來性狀可由重組細(xì)胞培養(yǎng)物傳遞給活的后代禽類。
可以理解本發(fā)明適用于任何類型的禽類，但看來最有商業(yè)價值的商品禽類為雞、火雞、野雞、鴨和鵝。
較佳地提取物是從胚胎禽類(尤其是胚胎火雞)臍提取出的水解成分。但也可使用從其它禽類提取的類似提取物。提取物中物質(zhì)的類型很可能負(fù)責(zé)所賦予的特性，本文為蛋白質(zhì)(如很可能是生長因子如細(xì)胞因子)。
據(jù)信此細(xì)胞培養(yǎng)物含有原生殖細(xì)胞。但它們的最佳特征為EMA-1抗體的表達(dá)。
雖然已描述了上述優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在本發(fā)明范圍內(nèi)可有其它改進(jìn)。所以應(yīng)參照權(quán)利要求書來判斷本發(fā)明的范圍。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供了能長期培養(yǎng)的禽類原生殖細(xì)胞系，和維持和凍存這些細(xì)胞系的方法，這些方法所使用的材料和用這些方法產(chǎn)生的禽類。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)EMA-1表位的未分化禽胚層細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，當(dāng)存在禽臍分離物培養(yǎng)時，所述的培養(yǎng)物能維持其未分化的特性和其表達(dá)EMA-1表位的能力2個月以上。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述的禽臍是胚胎禽臍。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其特征在于，所述的禽胚層細(xì)胞選自火雞細(xì)胞、鴨細(xì)胞、野雞細(xì)胞、鵝細(xì)胞和雞細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)物，其特征在于，當(dāng)存在胚胎禽臍分離物培養(yǎng)時，所述的培養(yǎng)物能維持其未分化的特性和其表達(dá)EMA-1表位的能力6個月以上。
5.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)物，其特征在于，當(dāng)存在火雞臍分離物培養(yǎng)時，所述的培養(yǎng)物能維持其未分化的特性和其表達(dá)EMA-1表位的能力2個月以上。
6.一種產(chǎn)生能表達(dá)EMA-1表位的未分化胚層細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)物的方法，其特征在于，所述的方法包括在形成原條前，從禽胚盤收集禽細(xì)胞；和在存在禽臍分離物時培養(yǎng)這些禽細(xì)胞。
7.產(chǎn)生如權(quán)利要求6所述的持續(xù)培養(yǎng)物的方法，其特征在于，所述的禽臍是胚胎禽臍。
8.產(chǎn)生如權(quán)利要求6所述的持續(xù)培養(yǎng)物的方法，其特征在于，所述的分離物是火雞臍提取物。
9.一種用于培養(yǎng)禽胚層細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的培養(yǎng)基包含禽臍分離物、無機(jī)鹽、維生素、氨基酸和水。
10.如權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的禽臍是火雞臍。
11.一種保存禽種系基因組的方法，其特征在于，所述的方法包括凍存權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物。
12.一種從表達(dá)EMA-1表位的未分化禽胚層細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的重組禽類，其特征在于，所述的培養(yǎng)物含有禽臍分離物。
13.如權(quán)利要求12所述的重組禽類，其特征在于，所述的培養(yǎng)物能維持其未分化的特性和表達(dá)EMA-1表位的能力2個月以上。
14.如權(quán)利要求12所述的重組禽類，其特征在于，所述的禽臍是胚胎禽臍，重組禽類是從權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)物衍生的。
15.如權(quán)利要求12所述的重組禽類，其特征在于，所述的禽胚層細(xì)胞選自火雞細(xì)胞、鴨細(xì)胞、野雞細(xì)胞、鵝細(xì)胞和雞細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求12所述的重組禽類，其特征在于，所述的禽臍是火雞臍。
全文摘要
本發(fā)明公開了未分化禽原生殖細(xì)胞/胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物。當(dāng)存在禽臍(如火雞臍提取物)分離物下培養(yǎng)時,這種培養(yǎng)物能長時間維持它們的未分化特性和它們表達(dá)EMA－1表位的能力。還公開了用禽臍提取物培養(yǎng)這種培養(yǎng)物的方法以及含有禽臍提取物的培養(yǎng)基。還公開了從這些培養(yǎng)物衍生的重組禽類。這些培養(yǎng)物可以長期冰凍來保存種系基因組。
文檔編號A01K67/027GK1369006SQ00811492
公開日2002年9月11日 申請日期2000年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月11日
發(fā)明者H·察, H·D·亨特, L·D·培根, B·C·溫特沃斯, A·L·溫特沃斯 申請人:威斯康星校友研究基金會, 美國農(nóng)業(yè)部