專利名稱：一種中華絨螯蟹三倍體的誘導方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖方法，特別是涉及一種中華絨螯蟹三倍體的誘導方法。
在現(xiàn)有技術中，魚類和貝類三倍體的誘導方法研究的較多，而且某些種類如太平洋牡蠣等已經(jīng)進入大規(guī)模應用階段?，F(xiàn)有的中華絨螯蟹三倍體的誘導方法，一般先從母體卵巢中取出卵子，從納精囊中取出精子，然后進行人工受精，所得的受精卵在20℃下孵育，孵育15分鐘后，采用藥物或溫度處理或用濃度為1.5mg/L的細胞松弛素B(C.B)溶液處理，最后通過抑制第一極體的排放獲得三倍體胚胎。其中處理持續(xù)時間1.5分鐘，處理溫度40℃，囊胚期檢測得到三倍體最高誘導率50％。該方法的缺點是受限于中華絨螯蟹(河蟹)抱卵孵化的繁殖生物學特性，難以克服離體培養(yǎng)的困難，受精卵最多只能發(fā)育到囊胚晚期即死亡，故目前對中華絨螯蟹三倍體誘導的研究僅限于胚胎期，根本無法培育出幼蟹，因此也無法進入實用階段。盡管近年來有學者稱人工受精和體外培養(yǎng)受精卵可獲成功，但從其胚胎存活率和孵化率都難以進行規(guī)?；a(chǎn)。從受精開始就進行體外培養(yǎng)的受精卵只有部分能順利發(fā)育至囊胚晚期或早期原腸胚，隨后陸續(xù)停滯發(fā)育而夭折。所以，進行中華絨螯蟹的三倍體育種無論采用人工受精還是抑制第一極體首先必須克服受精卵離體培養(yǎng)的困難。
本發(fā)明的目的是提供一種新的中華絨螯蟹三倍體的誘導方法，它能克服現(xiàn)有方法的上述缺點，并且工藝流程可操作性強，誘導率高而穩(wěn)定，適于規(guī)模生產(chǎn)，不僅能培育出幼蟹而且還能養(yǎng)成。
一種中華絨螯蟹三倍體的誘導方法，包括將受精卵孵育，并用細胞松弛素B或熱休克處理或用6-DMAP處理，最后通過抑制受精卵極體的排放獲得三倍體幼體，其特征是所述的受精卵是中華絨螯蟹的母體自然產(chǎn)出的。
本發(fā)明的優(yōu)點是順應中華絨螯蟹抱卵孵化的繁殖生物學特性，無須離體培養(yǎng)，能批量獲得受精卵；在提高受處理卵同步率的基礎上，大大提高了三倍體的倍化率，低溫孵育大大延長了進行遺傳操作的有效時間段，使進行三倍體誘導的可操作性明顯提高；在第二極體排放前進行處理，使受精卵能安然粘附于母體腹肢剛毛上直至孵化，故可獲得中華絨螯蟹的三倍體幼體，并且三倍體誘導率穩(wěn)定在60-80％。
下面通過實施例說明本發(fā)明。
根據(jù)中華絨螯蟹的繁殖生物學特性和生殖發(fā)育學原理，針對已有誘導方法中存在的主要問題，本實例改人工受精為自然受精，受處理卵為中華絨螯蟹的母體自然產(chǎn)出，在較低溫度下將受精卵連同母體一起孵育，即將抱卵蟹整體作為處理對象，同時用6-DMAP作為誘導劑進行處理，最后通過抑制受精卵第二極體的排放獲得三倍體幼體。
改人工受精為自然受精獲得受精卵的具體作法是將雌雄蟹分別放入用于交配促產(chǎn)的圓形塑料缸中，溫度恒定在12℃，隨即將雌雄蟹按2∶1合并于同一缸中，促使其交配。確認蟹交配后移走雄蟹，同時觀察雌蟹的行為，等待產(chǎn)卵。開始產(chǎn)卵的時間記為受精零時。
將受精卵連同母體一起處理的具體作法是剛產(chǎn)出的受精卵呈稀釋流動狀，受刺激容易脫落。抱卵蟹在12-15℃下培育至4小時后，受精卵逐漸粘附于雌蟹腹肢的剛毛上，不易分離。當進行三倍體誘導時，將受精卵連同整只雌蟹個體一起浸泡于處理液中。在12-15℃下受處理卵發(fā)育的同步率明顯高于20℃，而受處理卵發(fā)育的同步性對獲得高而穩(wěn)定的誘導率是至關重要的。所以本實施例從雌雄蟹交配到雌蟹產(chǎn)卵均在12℃水溫下進行。從受精零時到產(chǎn)卵后4小時，培育水溫緩慢升到15℃。改抑制第一極體為抑制第二極體的具體作法是產(chǎn)卵后4小時的抱卵蟹的水溫已由12℃緩慢升到15℃，受精卵第一極體已經(jīng)排放，而第二極體還未開始排放。將此發(fā)育時期的抱卵蟹放入150-300umol/L 6-DMAP處理液中浸泡30分鐘，然后用海水沖洗抱卵蟹2-3次，最后將處理好的抱卵蟹放進孵化池中進行孵化。
本實施例中養(yǎng)殖水鹽度為20‰，PH值為7.8-8.5，囊胚期檢測得到三倍體最高誘導率80％，且繼續(xù)發(fā)育，得到了三倍體幼體。蚤狀幼體群體檢測，三倍體率達85.3％。幼蟹期檢測，隨機取26個個體，有16個是三倍體。
權利要求
1.一種中華絨螯蟹三倍體的誘導方法，包括將受精卵孵育，并用細胞松弛素B或熱休克處理或用6-DMAP處理，最后通過抑制受精卵極體的排放獲得三倍體幼體，其特征是所述的受精卵是中華絨螯蟹的母體自然產(chǎn)出的。
2.如權利要求1所述的誘導方法，其行征是所述的孵育是將受精卵與母體一起孵育。
3.如權利要求1所述的誘導方法，其特征是所述的孵育溫度為12-15℃。
4.如權利要求1所述的誘導方法，其特征是所述的抑制受精卵極體排放為抑制受精卵第二極體排放。
全文摘要
一種中華絨螯蟹三倍體的誘導方法,將受精卵與母體一起孵育,并用細胞松弛素B或熱休克處理或用6－DMAP處理,最后通過抑制受精卵第二極體的排放獲得三倍體幼體,所述的受精卵是中華絨螯蟹的母體自然產(chǎn)出的。本發(fā)明的優(yōu)點是:能批量獲得受精卵;大大提高了三倍體的倍化率,使三倍體誘導率穩(wěn)定在60－80%。低溫孵育大大延長了進行遺傳操作的有效時間段,使進行三倍體誘導的可操作性明顯提高。
文檔編號A01K61/00GK1385060SQ01114948
公開日2002年12月18日 申請日期2001年5月16日 優(yōu)先權日2001年5月16日
發(fā)明者相建海, 崔朝霞, 周嶺華, 蔡難兒 申請人:中國科學院海洋研究所