專利名稱：非洲菊離體快速繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體地講，是指一種采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)非洲菊離體培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖的方法。
植物組織培養(yǎng)是指用植物的任何器官、組織或細(xì)胞，在人工控制條件下進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程。該技術(shù)取材少，培養(yǎng)植物材料成本低，生長(zhǎng)周期短，管理方便。利用植物組織培養(yǎng)這種快速繁殖技術(shù)，能在短時(shí)間內(nèi)繁衍出大量保持母本生物特性和遺傳性狀的植株。據(jù)了解，我國(guó)快速繁殖的植物已有近干種。通常使用的基本培養(yǎng)基有數(shù)種，如MS、B5、White、N6等。在組織培養(yǎng)中，植物外植體要在植物生長(zhǎng)物質(zhì)的作用下，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)脫分化、恢復(fù)細(xì)胞分裂的能力、影響再分化、促進(jìn)器官形成等過(guò)程。植物外植體繁殖系數(shù)的大小，直接影響著生產(chǎn)后代植株的數(shù)量和質(zhì)量。
非洲菊(Gerbera jamesonil，又名扶郎花)，屬于菊科中的非洲菊屬，目前世界上大約有80多種，是一種觀賞價(jià)值較高、國(guó)內(nèi)外熱銷的鮮切花及盆栽名優(yōu)花卉，每年市場(chǎng)需求量上百萬(wàn)株。但非洲菊是異花傳粉植物，種子后代壽命短、發(fā)芽率低且變異率高，不能保持原品種種性，同時(shí)分株繁殖系數(shù)低(每株僅分5～6株)，且容易退化和傳播病害，所以常規(guī)的繁殖菊花方法難以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。有關(guān)非洲菊無(wú)性繁殖幼苗的組織培養(yǎng)方法在國(guó)內(nèi)已有報(bào)道[如黃濟(jì)明，倪躍元，林滿紅。非洲菊的快速繁殖。園藝學(xué)報(bào)，1987，14(1)125；魯雪華，林勇，郭文杰。非洲菊小花托的離體培養(yǎng)。亞熱帶植物通訊，1996，25(2)21；劉群良，黃皚冰，李華養(yǎng)等。非洲菊組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究。廣東園藝，2001，2(1)21等]，其方法一般包括如下步驟(1)外植體消毒以花托為外植體先后采用75％乙醇和0.1-0.2％升汞表面消毒各1分鐘和10-20分鐘(加入表面活性劑數(shù)滴)；(2)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生將已經(jīng)過(guò)表面消毒的外植體切成0.3-1厘米長(zhǎng)的方塊，分別放在1/2的MS、B5或White固體培養(yǎng)基中25-40天以誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，培養(yǎng)基中應(yīng)加入0.1-10mg/L的芐基嘌呤類細(xì)胞分裂素和0.1-2mg/L的吲哚類或萘類生長(zhǎng)素，其培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2000±50Lx，光照時(shí)間12-16小時(shí)/天；(3)培養(yǎng)生根將高度為3-7厘米的不定芽分切成單株，在生根固體培養(yǎng)基(一般采用1/2MS基本將高度為3-7厘米的不定芽分切成單株，在生根固體培養(yǎng)基(一般采用1/2MS基本培養(yǎng)基)上培養(yǎng)，培養(yǎng)基中應(yīng)加入0.1-5mg/L的吲哚類或萘類生長(zhǎng)素，培養(yǎng)條件同步驟(2)，25-50天可以誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生。由于非洲菊品種多，各品種間由花托誘導(dǎo)出不定芽的能力差異很大，由花托直接誘導(dǎo)的出芽率極低，所以該方法同樣不利于非洲菊的快速繁殖。
在調(diào)節(jié)控制植物材料離體培養(yǎng)過(guò)程中，其繁殖系數(shù)除與植物材料本身的特性以及營(yíng)養(yǎng)、光照、溫度等培養(yǎng)條件有關(guān)外，植物生長(zhǎng)物質(zhì)也起著重要的作用，其中影響最顯著的是生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。另有報(bào)道指出，在對(duì)木本植物的芽進(jìn)行離體培養(yǎng)前，進(jìn)行低溫預(yù)處理一段時(shí)間有益于離體培養(yǎng)生長(zhǎng)(黃學(xué)林，李筱菊編著。高等植物組織離體培養(yǎng)的形態(tài)建成及其調(diào)控，北京科學(xué)出版社，1995，78)，但目前未有草本植物方面的相同報(bào)道。
本發(fā)明的目的在于針對(duì)非洲菊已有組織培養(yǎng)方法的不足，提供一種快速繁殖的新方法，它能夠明顯提高非洲菊的無(wú)性繁殖系數(shù)，而且操作簡(jiǎn)便。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明在現(xiàn)有組織培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下改進(jìn)在步驟(1)中，在花托表面消毒之前，首先對(duì)花蕾進(jìn)行低溫處理。
本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)是在低溫處理的基礎(chǔ)上，步驟(2)中的培養(yǎng)基采用苯基脲類細(xì)胞分裂素替換芐基嘌呤類細(xì)胞分裂素，以提高誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的能力。
本發(fā)明的更佳方案是在上述兩步改進(jìn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)在步驟(3)中改變生長(zhǎng)素類物質(zhì)處理試管苗的方法，以縮短試管苗不定根發(fā)生的時(shí)間，即首先用吲哚類或萘類生長(zhǎng)素溶液浸泡試管苗基部，然后再轉(zhuǎn)入不含激素的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
本方法的具體要求如下低溫處理中溫度范圍為9±2℃，處理時(shí)間為1-5天，最好是3天；步驟(2)采用的培養(yǎng)基中，苯基脲類細(xì)胞分裂素可以采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(簡(jiǎn)稱CPPU)、(4-吡喃)-1，1-嘌呤氨基-9-氫吡喃基-9H嘌呤-4-氫吡喃基(簡(jiǎn)稱TDZ)等，最好是采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(簡(jiǎn)稱CPPU)，其在基本培養(yǎng)基中的含量為0.5-2mg/L，最好是1mg/L；步驟(3)中，吲哚類生長(zhǎng)素可采用吲哚乙酸、吲哚丁酸等，萘類生長(zhǎng)素采用萘乙酸。生長(zhǎng)素類物質(zhì)溶液含量為2mg/L-15mg/L，其優(yōu)選范圍為5-10mg/L，試管苗基部浸泡的時(shí)間為1天，在固體培養(yǎng)基中的繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為5-15天。
由于本發(fā)明采用低溫預(yù)處理方法，促進(jìn)了非洲菊的離體培養(yǎng)生長(zhǎng)，又進(jìn)一步采用苯基脲類細(xì)胞分裂素，提高了誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的能力，還改變生長(zhǎng)素類物質(zhì)處理試管苗的方法以縮短試管苗不定根發(fā)生的時(shí)間、提高不定根質(zhì)量，所以大大地提高了非洲菊的離體繁殖系數(shù)，有利于非洲菊的快速繁殖，達(dá)到了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1、經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，與常規(guī)方法比較，在接種前對(duì)花蕾進(jìn)行1～5天的9±2℃低溫處理，切取花托培養(yǎng)30天，不定芽的誘導(dǎo)頻率及每塊外植體產(chǎn)生的芽數(shù)均比常規(guī)法高；步驟(2)中，采用苯基脲類細(xì)胞分裂素替換芐基嘌呤類細(xì)胞分裂素，使培養(yǎng)基中的濃度減低，不定芽誘導(dǎo)率提高；提高生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素類物質(zhì)的濃度，采用浸泡法處理，不定根發(fā)生時(shí)間縮短，生根率增加，每株試管苗的生根數(shù)得到提高，而且長(zhǎng)勢(shì)良好，保證了試管苗不定根質(zhì)量。
2、本發(fā)明方法與已有的常規(guī)方法相比，無(wú)需增加專用設(shè)備，操作簡(jiǎn)便。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例1取清心橙紅品種非洲菊花托42個(gè)作為外植體，首先將花蕾置于9±2℃的環(huán)境中處理5天，然后按照常規(guī)法取出花托進(jìn)行表面消毒和接種培養(yǎng)，其培養(yǎng)基為1/2MS，含有0.5mg/L吲哚乙酸和10mg/L 6-芐基腺嘌呤，培養(yǎng)30天時(shí)發(fā)現(xiàn)，已有18個(gè)外植體發(fā)芽，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)41.9％，平均每個(gè)外植體發(fā)生3.3個(gè)芽。切割不定芽培養(yǎng)成苗，得到健康的幼苗，其不定根的生長(zhǎng)狀較好。而采用常規(guī)方法培養(yǎng)(不經(jīng)低溫處理)的對(duì)照組，其不定芽的發(fā)生率僅為22.2％，其不定根發(fā)生少，生長(zhǎng)慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例2其它操作及對(duì)照組同實(shí)施例1，清心橙紅外植體為56個(gè)，低溫處理花蕾的時(shí)間為3天，培養(yǎng)30天有24個(gè)外植體發(fā)芽，芽誘導(dǎo)率達(dá)42.9％，平均每個(gè)外植體有6個(gè)芽形成，經(jīng)培養(yǎng)生根，其不定根的生長(zhǎng)狀況較好，不定芽誘導(dǎo)率和不定根生長(zhǎng)狀況都明顯優(yōu)于對(duì)照組。
實(shí)施例3其它操作及對(duì)照組同實(shí)施例1，非洲菊采用清心大紅品種，低溫處理時(shí)間為1天，培養(yǎng)30天不定芽發(fā)生率達(dá)到14.3％，平均每個(gè)花托外植體形成的花芽數(shù)2個(gè)，經(jīng)培養(yǎng)生根，其不定根的生長(zhǎng)狀況一般。而對(duì)照組的不定芽誘導(dǎo)率僅為5％，平均每個(gè)花托外植體形成的花芽數(shù)1個(gè)，不定根的生長(zhǎng)困難，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例4其它同實(shí)施例3，非洲菊采用清心大紅品種，步驟(2)的培養(yǎng)基為1/2 B5，培養(yǎng)30天不定芽發(fā)生率達(dá)到12.5％，平均每個(gè)花托外植體形成的花芽數(shù)2個(gè)，其不定根的生長(zhǎng)狀況一般。而對(duì)照組的不定芽誘導(dǎo)率僅為5.8％，平均每個(gè)花托外植體形成的花芽數(shù)1個(gè)，不定根發(fā)生困難，已形成的不定根生長(zhǎng)緩慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例5其它同實(shí)施例3，步驟(2)的培養(yǎng)基為1/2 White，培養(yǎng)30天不定芽發(fā)生率達(dá)到13.0％，平均每個(gè)花托外植體形成的花芽數(shù)1.6個(gè)，有不定根發(fā)生，生長(zhǎng)狀態(tài)一般。而對(duì)照組的不定芽誘導(dǎo)率僅為5.8％，平均每個(gè)花托外植體形成的花芽數(shù)1個(gè)，不定根發(fā)生困難，已形成的不定根生長(zhǎng)緩慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例6其它同實(shí)施例1，非洲菊采用清心橙紅品種，低溫處理的時(shí)間為3天，步驟(2)中采用的培養(yǎng)基為1/2MS，其中細(xì)胞分裂素采用1mg/L的2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(簡(jiǎn)稱CPPU)，結(jié)果不定芽誘導(dǎo)率為43％，經(jīng)步驟(3)培養(yǎng)，不定根生長(zhǎng)狀況好，不定根產(chǎn)生數(shù)量多，生長(zhǎng)快和壯實(shí)。而采用常規(guī)方法(沒(méi)有低溫處理，細(xì)胞分裂素為10mg/L 6-芐基腺嘌呤)的對(duì)照組，其不定芽誘導(dǎo)率為34.7％，不定根生長(zhǎng)狀況較差，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例7其它同實(shí)施例6，非洲菊采用黑心橙紅品種，低溫處理的時(shí)間為3天，細(xì)胞分裂素采用0.5mg/L的2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(簡(jiǎn)稱CPPU)，結(jié)果其不定芽誘導(dǎo)率為20％，不定根生長(zhǎng)狀況較好，而對(duì)照組的不定芽誘導(dǎo)率為12.4％，不定根生長(zhǎng)狀況較弱，兩者均明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例8其它同實(shí)施例6，非洲菊采用黑心橙紅品種，低溫處理的時(shí)間為3天，細(xì)胞分裂素采用2mg/L的2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲(簡(jiǎn)稱CPPU)，結(jié)果其不定芽誘導(dǎo)率為22.2％，不定根生長(zhǎng)狀況較好，而對(duì)照組的不定芽誘導(dǎo)率為8.3％，不定根生長(zhǎng)狀況較弱，兩者均明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例9其它同實(shí)施例8，非洲菊采用黑心橙紅品種，低溫處理的時(shí)間為3天，細(xì)胞分裂素采用2mg/L的(4-吡喃)-1，1-嘌呤氨基-9-氫吡喃基-9H嘌呤-4-氫吡喃基(簡(jiǎn)稱TDZ)，結(jié)果其不定芽誘導(dǎo)率為20.3％，不定根生長(zhǎng)狀況較好，而對(duì)照組的不定芽誘導(dǎo)率為8.3％，不定根生長(zhǎng)狀況較弱，兩者均明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例10其它同實(shí)施例6，非洲菊采用清心粉紅品種，步驟(3)中用2mg/L萘乙酸溶液浸泡試管苗基部1天，然后在1/2MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果15天其不定根誘導(dǎo)率為50％，根生長(zhǎng)好，而三個(gè)步驟均采用常規(guī)方法的對(duì)照組，其不定根誘導(dǎo)率為20％，根發(fā)生很少，生長(zhǎng)極慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例11其它同實(shí)施例10，步驟(3)中用15mg/L吲哚乙酸溶液浸泡試管苗基部1天，培養(yǎng)15天其不定根誘導(dǎo)率為88％，不定根生長(zhǎng)較好，而三個(gè)步驟均采用常規(guī)方法的對(duì)照組，其不定根誘導(dǎo)率為20％，不定根發(fā)生少，根生長(zhǎng)慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例12其它同實(shí)施例10，步驟(3)中用5mg/L吲哚丁酸溶液浸泡試管苗基部1天，然后在1/2MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)15天其不定根誘導(dǎo)率為93％，不定根發(fā)生多，每株試管苗生長(zhǎng)的根數(shù)有2條，根生長(zhǎng)好，有須根。而三個(gè)步驟均采用常規(guī)方法的對(duì)照組，其不定根誘導(dǎo)率為18％，不定根發(fā)生少，根生長(zhǎng)慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實(shí)施例13其它同實(shí)施例10，非洲菊采用清心粉紅品種，步驟(3)中用10mg/L吲哚丁酸溶液浸泡試管苗基部1天，然后在1/2MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)15天，其不定根誘導(dǎo)率為100％，每株試管苗生長(zhǎng)的根數(shù)有2.2條。根長(zhǎng)，發(fā)育好，須根多，苗壯葉綠。而三個(gè)步驟均采用常規(guī)方法的對(duì)照組，其不定根誘導(dǎo)率為34％，每株試管苗生根數(shù)為1.3條，根細(xì)短小，須根少，生長(zhǎng)慢，明顯差于本發(fā)明方法。
權(quán)利要求
1.一種非洲菊離體快速繁殖的方法，包括外植體消毒、誘導(dǎo)不定芽發(fā)生和培養(yǎng)生根三個(gè)步驟，其特征在于在步驟(1)中，在花托表面消毒之前，首先對(duì)花蕾進(jìn)行低溫處理。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中所用培養(yǎng)基采用的細(xì)胞分裂素為苯基脲類細(xì)胞分裂素。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在步驟(3)中首先用吲哚類或萘類生長(zhǎng)素溶液浸泡試管苗基部，然后再將試管苗轉(zhuǎn)入不含激素的1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中對(duì)花蕾進(jìn)行低溫處理的溫度為9±2℃，處理時(shí)間為1-5天；步驟(2)中苯基脲類細(xì)胞分裂素在基本培養(yǎng)基中的含量為0.5-2mg/L；步驟(3)中生長(zhǎng)素采用吲哚乙酸、吲哚丁酸或萘乙酸，生長(zhǎng)素溶液中生長(zhǎng)素含量為2mg/L-15mg/L，試管苗基部浸泡的時(shí)間為1天，在固體培養(yǎng)基中的繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為5-15天。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(1)中對(duì)花蕾進(jìn)行低溫處理的時(shí)間為3天；步驟(2)中苯基脲類細(xì)胞分裂素采用2-氯-4-吡啶基-N-苯基脲，其在基本培養(yǎng)基中的含量為1mg/L；步驟(3)中生長(zhǎng)素溶液中生長(zhǎng)素含量為5-10mg/L。
全文摘要
非洲菊離體快速繁殖的方法,它在現(xiàn)有技術(shù)三步驟——外植體消毒、誘導(dǎo)不定芽發(fā)生和培養(yǎng)生根的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下改進(jìn):在步驟(1)中,在對(duì)花托進(jìn)行表面消毒之前,先對(duì)花蕾進(jìn)行低溫處理;步驟(2)中的培養(yǎng)基采用苯基脲類細(xì)胞分裂素;步驟(3)中先用生長(zhǎng)素溶液浸泡試管苗基部,再用不含激素的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。該方法能明顯提高非洲菊的無(wú)性繁殖系數(shù),而且操作簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1344489SQ0112982
公開(kāi)日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2001年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月29日
發(fā)明者黃群聲, 李玲, 張銘光 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)