專利名稱：促進動物生長的綠色添加劑及其生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種促進動物生長的綠色添加劑及其生產方法，更具體地說，涉及一種含促上皮細胞生長因子(PEGF)的玉米、水稻、小麥、大豆、油菜粉等類作物及其生產方法。
背景技術：
在現(xiàn)有技術中，用植物作表達載體來表達外源蛋白已有不少報道，但將PEGF基因于植物體上表達尚未見報道。目前的動物促生長添加劑技術中，有化學合成的促生長添加劑，如β-激動劑(俗稱“瘦肉精”)和生長激素，但因其是人工合成，具有頑固的熱穩(wěn)定性，使用后會在動物組織中形成累積性殘留。由于這類化合物具有口服活性，違法使用會給消費者帶來一些不良影響(如頭暈眼花，嘔吐等癥狀)，正受到國家的“封殺”。此外，市場上還有一些抗生素型促生長添加劑，它們通過抑制腸道內的有害細菌而達到促生長的目的，由于它們屬于抗生素，因此，必然面臨耐藥性和藥物殘留的問題。
用植物反應器高效表達促上皮細胞生長因子，既避免了生長激素必須注射所造成的不便，又可作為一種綠色環(huán)保促生長添加劑，不僅滿足了當今市場的需求，無毒副作用、無殘留，同時又可減少飼料轉化為脂肪的浪費，大幅提高飼料的利用率。
總而言之，促上皮細胞生長因子(PGEF)，具有如下幾個功能
1、促進mRNA，DNA和蛋白質的合成；2、促進細胞的擴散和分生；3、參與細胞保護功能；4、促進傷口的愈合；5、增強對營養(yǎng)物質的吸收如糖、氨基酸和電解質；6、改善腸道消化功能；7、促進卵母細胞的成熟，改善動物的繁殖性能；8、提高畜禽的瘦肉比例，減少脂肪沉積，提高飼料的轉化率。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有促進動物生長的飼料添加劑包括玉米、水稻、小麥、大豆、油菜粉及其生產方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案生產一種促進動物生長的飼料添加劑，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜粉等類作物，它們含促上皮細胞生長因子并可明顯地促進動物的生長，用以表達促上皮細胞生長因子的修飾基因為TGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCC+AACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGA+CATCATCATCATCATCAT。
上述PEGF修飾基因序列通過植物反應器能表達出相應的重組蛋白，并形成三級結構。
本發(fā)明較好的技術方案是實施過程中，進行基因重組和重組蛋白的制備，即(1)將上述促上皮細胞生長因子基因插入質粒載體采用分子生物學的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動子和終止子，基因經過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號肽基因，片段兩端為內切酶位點(Xba I和sal I)。用相應的內切酶切表達載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構建各自的重組質粒；(2)將上述重組質粒轉入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進行表達，獲得轉基因植物的種子將重組質粒轉化根癌農桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農桿菌細胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉基因種子；(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料添加劑的植物根、莖、葉、果實或種子。
在實施本發(fā)明的過程中，首先通過對豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的促上皮細胞生長因子基因進行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的片段進行重組。同時為了提高在植物中的表達量，我們把目的片段與植物本身的一段信號肽基因相融合，來防止mRNA的降解。然后人工合成此段基因，與植物的表達載體連接重組，通過農桿菌轉化和基因槍轉化的方法，把目的基因整合進植物的基因組中。
上述PEGF基因序列通過植物反應器表達出相應的重組蛋白，并形成三級結構，用含重組活性蛋白的作物粉作飼料添加劑，可起到明顯的促進動物生長的作用。
在實施本發(fā)明的過程中，促進動物生長的綠色添加劑的生產包括用目的基因的同源性分析、目的基因的人工修飾、目的基因的人工合成、基因重組、重組質粒轉化植物，促動物生長方法包括用含重組蛋白的作物粉制作飼料添加劑并飼喂家畜。首先通過對豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的促上皮細胞生長因子基因進行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的片段進行重組。同時，為了提高在植物中的表達量，把目的片段與植物本身的一段信號肽基因相融合，來防止mRNA的降解。采用分子生物學的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動子和終止子，基因經過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號肽基因，片段兩端為內切酶位點(Xba I和sal I)。用相應的內切酶切表達載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構建相應的重組質粒；將上述重組質粒轉入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進行表達，獲得轉基因植物的種子將重組質粒轉化根癌農桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農桿菌細胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉基因種子，并可經ELISA法和Westernblot法檢測確證。
實施過程中，將植物種子種于小杯中，在4℃暗室中放置48小時使其同步發(fā)芽。后轉至生長室20℃曝光16小時，用雙蒸水，也可以用礦物質水澆灌。重組質粒轉化根癌農桿菌細胞系(Agrobacterium tumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培養(yǎng)液中(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)離心收集細胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培養(yǎng)液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-芐氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重懸。待植物6-7周齡時，倒置培養(yǎng)杯將植物浸入含根癌農桿菌細胞(Agrobacterium)的重懸液中，真空5×106mpa浸潤滲透15分鐘，用水沖洗后放于生長室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/LMES(嗎啉乙烷磺酸morpholine ethanesulfonic acid)和50mg/ml卡那霉素的瓊脂凝膠(8g/lPH5.7)中篩選轉基因種子。兩周后，將轉基因植物移至土壤中培育成熟即可獲得促進動物生長的轉基因種子?；蛘哂弥亟M質粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進行轉化，經過培育和Southern blot檢測確認后獲得促進動物生長的轉基因種子。
轉基因植物的根、莖、葉、果實和種子中含有促上皮細胞生長因子(PEGF)的外源基因，經PCR檢測確證，所含外源蛋白可經ELISA和Western blot檢測確證。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點一是生產技術簡單，二是飼料添加劑中的重組蛋白具有生物活性，可明顯地促進動物的生長，家畜進食含上述添加劑的飼料后，其瘦肉率、增重率明顯高于空白對照組。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發(fā)明進行更加詳細的描述實施例首先通過對豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的促上皮細胞生長因子基因進行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的功能片段進行重組。同時，為了提高在植物中的表達量，把目的片段與植物本身的一段信號肽基因相融合，來防止mRNA的降解。采用分子生物學的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動子和終止子，基因經過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號肽基因，片段兩端為內切酶位點(Xba I和sal I)。用相應的內切酶切表達載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構建相應的重組質粒；將上述重組質粒轉入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進行表達，獲得轉基因植物的種子將重組質粒轉化根癌農桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農桿菌細胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉基因種子，并經ELISA法和Western blot法檢測確證。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時使其同步發(fā)芽，其后轉移至生長室20℃曝光16小時，用雙蒸水，偶爾用礦物質水澆灌。待植物6-7周齡時，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農桿菌細胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉基因植株。兩周后，將轉基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可獲得抗禽流感的轉基因種子?；蛘哂弥亟M質粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進行轉化，經過培育和Southern blot檢測確認后獲得促進動物生長的轉基因種子。
各個轉基因植物的根、莖、葉、果實或種子中所含外源基因PEGF，可經PCR檢測引物檢測其存在。
各個轉基因植物的根、莖、葉、果實或種子中所含的外源蛋白，經ELISA和Western blot檢測其存在，陽性對照為空質粒轉化的植物抽提物中混有人工合成的多肽PEGF(10ug/ml)，陰性對照為空質粒轉化的植物抽提物。結果顯示轉基因植物的根、莖、葉、果實或種子中含有外源蛋白PEGF，能夠與蛋白中相應的多肽血清發(fā)生明顯的反應。在Western blot檢測中，用抗PEGF的血清可檢測到特異性的條帶，分子量為1-10KDa，得出與ELISA相同的檢測結果。
家畜進食用上述作物制作的飼料添加劑后，與空白對照組相比較，瘦肉率、增長率明顯提高，超過了目前市場上銷售的促生長型添加劑的水平。
權利要求
1.一種促進動物生長的綠色添加劑，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜粉類作物，其特征在于該類添加劑含促上皮細胞生長因子(PEGF)，用以表達促進動物生長的PEGF修飾基因為TGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGGGTTGGCGTCC+AACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACGGTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTACGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGA+CATCATCATCATCATCAT。
2.生產權利要求1所述的綠色添加劑的方法，其特征在于進行基因重組和重組蛋白的制備，具體過程為(1)將PEGF修飾基因插入質粒載體采用分子生物學的方法人工合成PEGF基因，該基因含有啟動子和終止子，基因經過修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端加植物的信號肽基因，片段兩端為內切酶位點(Xba I和sal I)。用相應的內切酶切表達載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構建相應的重組質粒，然后(2)將上述重組質粒轉入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進行表達，獲得轉基因植物的種子將重組質粒轉化根癌農桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農桿菌細胞的重懸液中真空浸潤，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選含PEGF的轉基因種子，再(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料添加劑的植物根、莖、葉、果實或種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進動物生長的綠色添加劑及其生產方法,添加劑中的活性蛋白是由人工合成的促上皮細胞生長因子修飾基因表達而成,是在原料作物的根、莖、葉和種子中形成的立體結構的總和,通過將PEGF修飾基因插入質粒載體、重組質粒轉入植物中表達、不同轉基因種子種入土壤獲得可作為飼料添加劑的作物及將含重組活性蛋白的飼料添加飼喂家畜等過程,有效地解決了常規(guī)促生長添加劑的耐藥性和藥物殘留等問題、具有生產方法簡單、操作方便,并能明顯改善腸道功能、促進腸道消化、促進糖、氨基酸、電解質等的吸收,促進細胞擴散和傷口的愈合及促進動物卵母細胞的成熟等功能,廣泛適用于各類動物的促進生長之用。
文檔編號A01N63/00GK1349742SQ0112983
公開日2002年5月22日 申請日期2001年10月27日 優(yōu)先權日2001年10月27日
發(fā)明者鐘安清, 秦智鋒 申請人:深圳市三方圓信息技術有限公司