專利名稱：二苯醚誘導植物體系統(tǒng)性抗性的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求來自下述三個申請的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)申請日為2000年2月11日的美國臨時申請60/181,933；申請日為2000年2月11日的美國臨時申請60/181,707；和申請日為2000年2月11日的美國臨時申請60/181,686。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在植物中誘導抗病性的領(lǐng)域。更明確地說，本發(fā)明涉及通過使用一種含有二苯醚的制劑誘導天然地植物抗病性。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及一種通過在植物體中誘導產(chǎn)生異黃酮而抗擊植物病原體的方法。
背景技術(shù)：
在大豆中，大豆菌核腐(大豆白腐)引起的損害僅在美國就造成了估計約2千6百萬美元的年平均損失。由其它作物疾病，例如突死綜合癥(鏈孢菌種類)、褐莖腐病、疫霉菌種類等等，產(chǎn)生的損失顯著地增加到每年由大豆白腐引起的估計2千6百萬美元的損失之上。
控制大豆白腐和其它大豆疾病的嘗試包括使用應用于植物體表面的化合物和生物學控制方法。在致病生物進入生物體之前，這些方法試圖阻止它們的生長和發(fā)育。雖然這些方法是有效的，但它們的持續(xù)時間通常很短而且其效力依賴于環(huán)境條件。
控制植物疾病的第二種方法是使用抗病性栽培種。典型地，對這些植物體進行遺傳工程，以便產(chǎn)生對致病生物有毒的化合物。然而，這些有毒的化合物通常不會在植物體內(nèi)自然地產(chǎn)生。雖然這種疾病控制方法很有效，而且與使用噴灑到作物上的化合物這種方法比較，在時間和安全性上有了改進，然而在美國和國外公眾對使用了遺傳工程的作物的使用具有抵制情緒。
最近，研究者已經(jīng)致力于一種通過增加植物體的自然防御來控制植物疾病的新方法。植物體天生就以兩種方式來抵抗病原體的進攻，即預成障礙物和誘導機制。前者包括物理障礙物和持續(xù)表達的防御蛋白。它們主要是阻止最初的病原體進入，并且如果已經(jīng)有障礙物被破壞的話可以提供降低有害效應的方法。后者只有在受到刺激或預成障礙物被破壞時才被激活。例如，病原體的局部感染導致在感染部位誘導出物理性變化(包括細胞壁木質(zhì)化和乳突形成)(綜述在Kessmann，H.，Staub，T.，Hofmann，C.，Maetzke，T.，Herzog，J.，Ward，E.，Uknes，S.，and J.Ryals.1994.Induction of systemicacquired resistance in plants by chemicals.Annual Review ofPhytopathology 32439-459；Schneider，M.，Schweizer，P.，Meuwly，P.，and J.P.Metraux.1996.Systemic acquired resistance inplants.International Journal of Cytology 168303-340；Sticher，L.，Mauch-Mani，B.and J.P.Metraux.1997.Systemicacquired resistance in plants.Annual Review of Plant Pathology35235-270)。另外，信號轉(zhuǎn)導通路的激活導致植物體內(nèi)未受感染部位產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性(綜述于Mauch-Mani，B.，and J.P.Metraux.1998.Salicylic acid and systemic acquired resistance to pathogenattack.Annals Botany 82535-540)。因此，第一次感染使植物體處于抵抗未來侵犯狀態(tài)下，這類似于人類和其它動物的疫苗接種?？墒牵匾氖沁@種系統(tǒng)性抗性是廣譜的，是針對廣泛的、不同的病原體如真菌、細菌或病毒的，而不僅僅是引起最初感染的病原體。雖然與系統(tǒng)性抗性相關(guān)的條件性狀態(tài)通常是暫時性的，但在一些情況下卻是持久性的。條件作用也被稱為“引發(fā)”、“激活”、“增強”和“感受態(tài)”。
至少有兩種不同的信號轉(zhuǎn)導通路表現(xiàn)出與系統(tǒng)性抗性有關(guān)，盡管兩者在使植物體處于抵抗進一步病原體進攻上是相似的。系統(tǒng)性后天抗性(SAR)的特征在于植物體組織內(nèi)水楊酸(SA)的積聚，以及一類叫做病理相關(guān)蛋白(PR)的蛋白質(zhì)增加(綜述于Kessmann，H.，Staub，T.，Hofmann，C.，Maetzke，T.，Herzog，J.，Ward，E.，Uknes，S.，and J Ryals.1994.Induction of systemic acquiredresistance in plants by chemicais.Annual Review ofPhytopa thology 32439-459；Hunt，M.D.，and J.A.Ryals.1996Systemic acquired signal transduction.Critical Review in PlantScience 15583-606；Ryals，J.，Neuenschwander，U.，Willits，M.，Molina，A.，Steiner，H.Y.，and M.Hunt.1996.Systemic acquiredresistance.Plant Cell 81809-1819；Schneider，M.，Schweizer，P.，Meuwly，P.，and J.P.Metraux.1996.Systemic acquired resistance inplants.International Journal of Cytology 168303-340；Yang，Y.O.，Shah，J.，and D.F.Klessig.1997.Signal perception andtransduction in defence responses.Genes and Development111621-1639)。已經(jīng)提出SA通過增加細胞內(nèi)過氧化氫濃度而發(fā)揮作用(Chen，Z.，Silva，H.，and D.F.Klessig.1993.Active oxygenspecies in the induction of plant systemic acquired resistanceby salicylic acid.Science 2621883-1885)，觸發(fā)脂類過氧化作用(綜述于Goodman，R.N.and A.J.Novacky.1994.The hypersensitivereaction in plants to pathogens.St.PaulAPS Press)，誘導其它氧化酶和生熱反應(Raskin，I.，and B.J.D.Meeuse.1987.SalicylicacidA natural inducer of heat production in Arum lilies.Science2371601；Rhoads，D.M.and L.Maclntosh.1992.Salicylic acidregulation of respiration in higher plantsalternative oxidaseexpression.Plant Cell 41121-1139)，和提高激衛(wèi)素處理的隨后反應(綜述于Mauch-Mani，B.and J.P.Metraux.1998.Salicylic acid andsystemic acquired resistance to pathogen attack.Annals Botany82535-540)。通過這些機制，更直接的是，SA誘導了大量防御相關(guān)性基因和蛋白質(zhì)的表達(Hunt，M.D.and J.A.Ryals.1996.Systemicacquired resistance signal transduction.Critical Review inPlant Science 15583-606；Schneider，M.，Schweizer，P.，Meuwly，P.，and J.P.Metraux.1996.Systemic acquired resistance in plants，International Journal of Cytology 168303-340；Sticher，L.，Mauch-Mani，B.，and J.P.Metraux.1997.Systemic acquiredresistance.Annual Review of’Plant Pathology 35235-270；VanLoon.L.C.1997.Induced resistance in plants and the role ofpathogenesis-related proteins.European Journal of PlantPathology 103753-765Yang，Y.O.，Shah，J.，and D.F.Klessig.1997.Signal perception and transduction in defence responses.Genes and Development 111621-1639)。雖然有很多報導認為SA是這些信號轉(zhuǎn)導通路的最初成分，但還不清楚它是否是原始的系統(tǒng)性信號，或者是否是第二次被激活信號(Mauch-Mani，B.，and I.P.Metraux1998.Salicylic acid and systemic acquired resistance to pathogenattack.Annals Botany 82535-540)。
第二個信號轉(zhuǎn)導通路叫做誘導性系統(tǒng)抗性(ISR)，與SAR通路獨立起作用。一個例示性的實施例是這樣的一個研究，該研究表明促進植物生長的根瘤細菌(PGPR)在沒有SA積聚物積聚或PR基因表達的情況下誘導了一種系統(tǒng)性類抗性現(xiàn)象(Pieterse，C.M.J.，VanWees，S.C.M.，Hoffland，E.，Van Pelt，J.A.，and L.C.VanLoon.1996.Systemic resistance in Arabidopsis induced bybiocontrol bacteria is independent of salicylic acid accumulationand pathogenesis-related gene expression.Plant Cell81225-1237)。進一步的研究也表明SA和PR蛋白質(zhì)水平在誘導了ISR反應的時候沒有增加。在誘導ISR反應的時候，發(fā)現(xiàn)了硫堇和小的富含半胱氨酸的植物防御素(PDF)的積聚，而且認為它們是反應的效應物(Epple，P.，Apel，K.，and H.Bohlmann.1995.An Arabidopsisthaliana thionin gene is inducible via a signal transductionpathway different from that for pathogenesis-related protein.Plant Physiology 109813-820；Penninckx，I.A.M.A.，Eggermont，K.，Terras，F(xiàn).R.G.，Thomma，B.P.H.J.，DeSamblanx，G.W.，Buchala，A Metraux，J.P.，Manners，J.M.，and W.F.Broekaert.1996.Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene inArabidopsis follows salicylic acid-independent pathway.PlantCell 82309-2323)。這些研究也表明甲基茉莉酮酸酯可以是ISR的介體。該研究顯示將甲基茉莉酮酸酯添加到擬南芥屬植物中會導致硫堇2.1基因的誘導效應，但SA沒有這樣的效果(Epple，P.，Apel，K.，and H.Bohlmann.1995.An Arabidopsis thaliana thionin gene isinducible via a signal transduction pathway different from thatfor pathogenesis-related protein.Plant Physiology，109813-820)。同樣地，也發(fā)現(xiàn)甲基茉莉酮酸酯、乙烯、百草枯除草劑和孟加拉玫瑰誘導了抗真菌植物防御素PDF 1.2在擬南芥屬植物葉子上的積聚，而且這些化合物在PR-1 mRNA水平都沒有任何效果(Penninckx，I.A.M.A.，Eggermont，K.，Terras，F(xiàn).R.G.，Thomma，B.P.H.J.，DeSamblanx，G.W.，Buchala，A.，Metraux，J.P.，Manners，J.M.，and W.F.Brockaert.1996.Pathogen-induced systemicactivation of a plant defensin gene in Arabidopsis followssalicylic acid-independent pathway.Plant Cell 82309-2323)。相反，SA誘導了PR-1 mRNA的積聚而不是防御素或其mRNA的積聚(Penninckx，I.A.M.A.，Eggermont，K.，Terras，F(xiàn).R.G.，Thomma，B.P.H.J.，DeSamblanx.G.W.，Buchala，A.，Metraux，J.P.，Manners，J.M.，and W.F.Broekaert.1996.Pathogen-induced systemicactivation of a plant defensin gene in Arabidopsis followssalicylic acid-independent pathway.Plant cell 82309-2323)。在擬南芥屬植物中，nahG基因的過量表達(其特征在于非常低的SA水平)(Delancy，T.P.，Uknes，S.，Vernooij，B.，F(xiàn)riedrich.L.，Weymann，K.，Negrotto，D.，Gaffney，T.，Gutrella，M.，Kessmann，H.，Ward.E.，and J.Ryals.1994.A central role of salicylic acidin plant disease resistance.Science 266；1247-1250)；和在nprl突變體中(不能檢測到PR-1蛋白表達)(Cao，H.，Bowling.S.Gordon，A.，and X.Dong.1994.Characterization of Arabidopsis mutant thatis non-responsive to inducers of systemic acquired resistance.Plant Cell 61583-1592)，用無毒真菌類誘導會導致防御素的積聚，這說明在SAR通路上存在缺陷的植物體維持了功能性ISR通路。而且兩種擬南芥屬植物的突變體都表明，對ISR誘導物不能響應會導致與ISR相關(guān)的蛋白質(zhì)，而不是與SAR相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達降低。coiI和ein2都可以產(chǎn)生PR-l，而且在真菌誘導處理之后兩者都表現(xiàn)出對積聚PDF1.2植物防御素的能力大大降低，盡管coiI對甲基茉莉酮酸酯沒有反應(Feys，B.J.F.，Benedetti，C.E.，Penfold，C.N.，andJ.G.Turner.1994.Arabidopsis mutants selected for resistance tothe phytotoxin coronatine are male sterile，insensitive to methyliasmonate，and resistant to a bacterial pathogen.Plant Cell6751-759)，ein2對乙烯沒有反應(Guzman，P.，and J.Ecker.1990.Exploiting the triple response of Arabidopsis to identifyethylene-related mutants.Plant Cell 2513-523)。這些研究和其它的研究表明，ISR和SAR反應是獨特的、不同的。
不是所有的植物有這兩種信號轉(zhuǎn)導通路。例如，大豆被認為缺少SAR反應需要的成分。雖然用甲基茉莉酮酸酯或1-氨基環(huán)丙烷羧酸處理的大豆子葉組織能夠引起對于處理點遠端的細胞進行保護的效應(Park，D.-S.1998.Proximal cell competency and distal cellpotentiation in soybean resitance.Ph.D.Thesis.The Ohio StateUniversity)，但是SA不能誘導大豆防御通路中的任何可檢測到的變化。
除了這種ISR通路，也已經(jīng)暗示大豆可能含有另一種反應，這種反應可以“替代”在許多植物體中觀察到的SA反應。這種替代反應的特征在于異黃酮的高度積聚，包括黃豆苷原和異黃酮-染料木黃酮的共軛物(在大豆幼苗組織中的質(zhì)外體中以丙二酰葡糖基共軛物(MGC)的形式存在，可能由高度異黃酮特異性的非胞質(zhì)β-葡糖苷酶釋放(Hsieh，M.-C.1997.Purification and characterization of anisoflavone specific β-glucosidase from soybean.Ph.D.Thesis.The Ohio State University))。于是認為染料木黃酮在激活大豆細胞的防御潛能中以一定程度上類似于SA的方式起作用(T.L.Graham andM.Y.Graham 2000.Defense Potentiation and ElicitationCompetencyRedox Conditioning Effects of Salicylic Acid andGenistein.181-219.Plant-Microbe Interactions，G.Stacey and N.Keen，eds)。
異黃酮是在植物體內(nèi)自然產(chǎn)生的植物雌激素，這些植物包括那些屬于豆科的植物，尤其是包括大豆在內(nèi)的屬于蝶形花亞科的植物。最新研究表明可以對不屬于豆科的植物進行遺傳工程，以產(chǎn)生異黃酮。例如，已經(jīng)用允許產(chǎn)生染料木黃酮的單一酶對擬南芥菜進行轉(zhuǎn)化(Yu，Oliver；Jung，Woosuk；Shi，June；Croes，Robert A.；Fader，GaryM.；McGonigle，Brian；Odell，Joan T.2000.Production of theisoflavones genistein and daidzein in non-legume dicot andmonocot tissues.Plant Physiology 124781-793)。
異黃酮在植物體內(nèi)以附著在糖分子如葡萄糖上的非活性形式存在。被稱為“糖苷配基”著稱的自由異黃酮形式是病原體是在遭受病原體損傷或感染時釋放的。一旦被釋放，糖苷配基就在細胞發(fā)動有效防御反應能力的建立中扮演多種角色。例如，異黃酮黃豆苷原是植物抗生素“植物抗霉素”大豆抗霉素的前體，而且異黃酮染料木黃酮在引發(fā)大豆對具有觸發(fā)大豆抗霉素產(chǎn)生作用的來源于病原體的“誘導物”的識別能力(感受態(tài))上有幫助。而且，染料木黃酮本身具有一些抗生素活性。因此，這兩種糖苷配基的簡單釋放增強了植物防御的三個關(guān)鍵性的、互補的方面。甲基茉莉酮酸酯的使用大大地加強了這種反應(Graham，T.L.，and M.Y.Graham.1996.Signaling in soybeanphenylpropanoid responsedissection of primary，secondary andconditioning effects of light，wounding and elicitor treatments.Plant Physiology1101123-1133)。從而，異黃酮共扼物的積聚“負載”了大豆針對病原體的反應能力。由釋放的黃豆苷原形成的大豆抗霉素“流入”異黃酮庫中。
不幸的是，大豆中的異黃酮水平不總是足以有效地發(fā)動這些抗性反應。一些組織(如成熟的葉子)具有相對低的異黃酮水平，并且組織中的異黃酮含量在某些環(huán)境條件如低光照(陰天)下會降低。作為缺乏足夠異黃酮水平的后果，植物體對植物病原體的進攻的抗性有所降低。
“引發(fā)”植物抵抗植物病原體進攻的方法，通過觸發(fā)ISR和誘導植物體異黃酮水平的增加，都增加了植物栽培者，從農(nóng)民到家庭園丁，對抗擊植物病原體的可使用的選擇方案。本發(fā)明提供了一種用于觸發(fā)ISR和增加植物體異黃酮水平的在環(huán)境上安全的、有效且方便的制劑和方法。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一種在植物體內(nèi)觸發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性的方法，其包括將有效數(shù)量的含有二苯醚的有生物學活性的制劑應用于植物體的至少一部分表面，在植物體內(nèi)觸發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性的活化作用，從而誘導出針對至少一種病原體或疾病的系統(tǒng)性抗性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種增加植物產(chǎn)量的方法，其包括將有效數(shù)量的含有二苯醚的有生物學活性的制劑應用于植物體的至少一部分表面，在植物體內(nèi)觸發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性的活化作用，并維持或增加植物的總健康狀況，從而增加農(nóng)作物產(chǎn)量。
仍然在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種在植物體內(nèi)提高異黃酮水平的方法，其包括將有效數(shù)量的含有二苯醚的有生物學活性的制劑應用于植物體的至少一部分表面，并觸發(fā)異黃酮的釋放或產(chǎn)生，從而提高植物體內(nèi)異黃酮的水平。本方法也方便地提高了已被處理的植物體的大豆抗霉素誘導感受態(tài)。
本發(fā)明所述活性二苯醚優(yōu)選具有如下的結(jié)構(gòu)
其中R1是氫原子、氟原子或氯原子，或三氟甲基基團；R2、R3和R5獨立的是氫原子、氟原子或氯原子；R4是氫原子、NR6、NR6R6、OR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或環(huán)醚，其中R6是氫原子，具有1～4個碳原子的支鏈烷基基團或具有1～4個碳原子的直鏈烷基基團。
本發(fā)明所述活性二苯醚也優(yōu)選地具有如下結(jié)構(gòu)
其中R7是氧或氮原子；R8是氫原子、CH3、含有2～5個碳原子的脂肪鏈或HSO2CH3。
在每一個上述實施方案中，二苯醚更優(yōu)選地是氟鎖草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黃胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草靈、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。最優(yōu)選地，二苯醚是乳氟禾草靈。
在其它優(yōu)選的實施方案中，具有生物學活性的制劑進一步包括一種或多種佐劑，該佐劑選自作物油濃縮物、表面活性劑、肥料、乳化劑、分散劑、起泡劑、消泡劑和摻合劑。在更優(yōu)選的實施方案中，具有生物學活性的制劑中的一種或多種佐劑是作物油濃縮物、表面活性劑和肥料。附圖簡述


圖1描述了一種通過釋放異黃酮共軛物在大豆體中建立誘導感受態(tài)的工作模型?？梢栽谌缦聟⒖嘉墨I中找到該模型的詳細描述T.L.Grahamand M.Y.Graham.1999.Role of hypersensitive cell deathinconditioning elicitation competency and defensepotentiation.Physiol.Mol.Plant Pathol.5513-20。發(fā)明詳述
已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑在植物體內(nèi)觸發(fā)ISR并提高異黃酮水平。在本發(fā)明的一個實施方案中，用具有生物學活性的制劑處理植物體導致病原體或疾病引起的植物體破壞的發(fā)生率降低，這表現(xiàn)出ISR的有益效應。在本發(fā)明的另一個實施方案中，用具有生物學活性的制劑處理過的植物體更加強壯，并且在收獲時獲得了更高的產(chǎn)量，這意味著ISR是基于更廣的范圍且是非特異性的，從而允許植物在整個生長季節(jié)都不受障礙的生長。在本發(fā)明的第三個實施方案中，與沒有處理過的植物體相比，用具有生物學活性的制劑處理過的植物體具有更高的異黃酮水平。在所有測試的植物體部位中都發(fā)現(xiàn)了異黃酮的提高，包括種子、子葉、葉子和莖干。
在每一個這些實施方案中，所述具有生物學活性的化合物是二苯醚，其優(yōu)選地包括在以分子式(I)和/或分子式(II)表示的化合物中。
在本發(fā)明中，術(shù)語“誘導性系統(tǒng)抗性”或“ISR”是指一種可誘導的、整個植物體的抗性，該抗性是針對致病生物和疾病的發(fā)展和致病效應的。這種抗性可以是全面的或略低于全面的。而且，這種抗性可能是以治療或預防的方式被誘導的。ISR也可以與術(shù)語“免疫性”、“抗性”、“抗病性”和“誘導的抗病性”交換使用。
在此所用，術(shù)語“植物體”包括單子葉植物體或雙子葉植物體的所有形態(tài)和器官，其中包括但不限于種子、幼苗和成熟植物體。
1.含有二苯醚的具有生物學活性的制劑的制備
在本發(fā)明中，具有生物活性的制劑包括至少一種作為活性成分的二苯醚化合物(即具有一種在一個或兩個苯環(huán)上帶有期望取代基的核心結(jié)構(gòu)的化合物)。
正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解的，此處所使用的術(shù)語“二苯醚”包括該化合物的任何活性形態(tài)，包括酸性和鹽性形態(tài)、代謝物、立體或光學異構(gòu)體的外消旋混合物、純化的異構(gòu)體等。
為了觸發(fā)植物體內(nèi)誘導性系統(tǒng)抗性和/或增加植物產(chǎn)量，二苯醚優(yōu)選地具有如上邊(I)所示的結(jié)構(gòu)。適合用于本發(fā)明二苯醚的非限定性實施例包括氟鎖草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黃胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草靈、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。
在另一個實施方案中，該方法包括對植物施用一種農(nóng)用化學組合物，該化學組合物包括植物學上可接受的載體或稀釋劑以及有效數(shù)量的二苯醚，其優(yōu)選地具有如上邊(II)所示的結(jié)構(gòu)。下邊給出了在本方法中有用的、已經(jīng)被檢驗過的幾種優(yōu)選的二苯醚結(jié)構(gòu)。
乳氟禾草靈
氟鎖草醚
氟黃胺草醚
仍然在另一個實施方案中，二苯醚具有如分子式(III)表示的結(jié)構(gòu)
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3；R10是含有1～5個碳原子的支鏈脂肪鏈。分子式(II)和(III)所示的化合物在提高植物體內(nèi)異黃酮水平的方法中尤其有用。
本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑是通過將活性成分混合到水中獲得的?？梢詫⒁环N二苯醚化合物或其混合物用作活性成分。盡管本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解到，可以準備不同數(shù)量的具有生物學活性的制劑，這依賴于被處理區(qū)域的大小，但有效的量是15加侖。同樣地，可以在優(yōu)選的實施方案中將0.0050～0.50磅的活性成分混合到15加侖的水中來獲得本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑，更優(yōu)選的是O.050～0.125磅，最優(yōu)選的是大約0.1磅。當然，這些界線不是絕對的，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定出這些外圍界線。
在本發(fā)明中用作活性成分的優(yōu)選的二苯醚是乳氟禾草靈(C19H15ClF3NO7)(2-乙氧基-1-乙基-1-氧代乙基5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-2-硝基苯甲酸鹽)。用作活性成分的含有乳氟禾草靈的具有生物學活性的制劑一般是通過將乳氟禾草靈混合到水中得到的。優(yōu)選地是將0.005～0.50磅的乳氟禾草靈混合到15加侖的水中，更優(yōu)選地是0.050～0.125磅，最優(yōu)選地是大約0.1磅。
可以買到的乳氟禾草靈的代表性類型是由Valent U.S.A.Corporation生產(chǎn)的除草劑Cobra。Cobra已經(jīng)被批準用作一種選擇性的廣譜除草劑，其用于對敏感的闊葉雜草在出苗前和出苗后進行控制(美國環(huán)保署登記編號59639-34)。以重量百分比計算，可以買到的Cobra包括23.2％的乳氟禾草靈和76.8％的其它成分，以每加侖含2磅乳氟禾草靈的液體出售。包括Cobra的，含有作為活性成分的乳氟禾草靈的具有生物活性的制劑是通過將Cobra混合到水中獲得的。正如下邊的實施例中使用時和通常是在田地中使用時，優(yōu)選地將0.25～50液量盎司的Cobra混合到15加侖的水中，更優(yōu)選地是2.5～10液量盎司，最優(yōu)選地是大約6液量盎司。
乳氟禾草靈的其它有用的類型包括除草劑乳氟酰亞混劑，同樣也是Valent U.S.A.Corporation生產(chǎn)的(美國環(huán)保署登記號59639-92)。以重量百分比計算，乳氟酰亞混劑包括26.6％的乳氟禾草靈、7.6％的酰亞胺苯氧乙酸戊酯和65.8％的其它成分。酰亞胺苯氧乙酸戊酯是酰亞胺苯氧乙酸戊酯除草劑中的活性成分。
盡管本發(fā)明所述具有生物活性的制劑可以只包括二苯醚，優(yōu)選地該制劑也可以包括一種或多種佐劑。有用的佐劑包括，并不限于此，作物油濃縮物、表面活性劑、肥料、乳化劑、分散劑、起泡劑、消泡劑和摻合劑。佐劑通常會促進二苯醚活性成分通過植物細胞壁。植物學上可以接受的載體是一種生理學上可以接受的稀釋劑或佐劑。術(shù)語“生理學上可以接受的”是指不干擾二苯醚效力的無毒材料。特定佐劑或載體的有效性依賴于處于其它因素中的用本發(fā)明所述制劑處理的植物種類，植物的成長階段和相關(guān)的環(huán)境條件，施用途徑以及特定化合物或化合物在組合物中的組合。在更優(yōu)選的實施方案中，具有生物活性的制劑中的一種或多種佐劑是作物油濃縮物、表面活性劑和肥料。這些制劑的制備是在本領(lǐng)域技術(shù)水平之內(nèi)。
包括二苯醚、作物油濃縮物、表面活性劑和肥料的具有生物學活性的制劑是按照如下順序?qū)⒚糠N化合物混合到水中制備的肥料、二苯醚、作物油濃縮物、表面活性劑。盡管本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解到，可以準備不同數(shù)量的具有生物活性的制劑，這依賴于被處理區(qū)域的大小，但有效的量是15加侖。同樣地，本實施方案中的具有生物學活性的制劑可以通過將0.1～10磅的硫酸銨混合到15加侖的水中來制備，更優(yōu)選地是1～4磅，最優(yōu)選地是大約2磅。在本發(fā)明該實施方案的制劑中有用的代表性肥料包括硫酸銨。在本發(fā)明該實施方案的制劑中有用的第二種代表性肥料是尿素硝酸銨。在使用了尿素硝酸銨的實施方案中，優(yōu)選地將約1～200液量盎司的尿素硝酸銨混合到15加侖的水中，更優(yōu)選地是25～100液量昂司，最優(yōu)選地是大約50液量昂司。接著，優(yōu)選地將0.005～0.5液量昂司的二苯醚活性成分混合到制劑中，更優(yōu)選地是0.050～0.125磅，最優(yōu)選地是大約0.1磅。正如上邊提到的，可以將一種二苯醚化合物或其混合物用作活性成分。然后，接著優(yōu)選地將大約1～100液量昂司的作物油濃縮物混合到制劑中，更優(yōu)選地是大約5～25液量昂司，最優(yōu)選地是大約10液量昂司。通常，以重量百分比計算，作物油濃縮物包括65-96％的烴油或溶劑，其余為表面活性劑。烴油可以是石油或基于植物的。在本發(fā)明所述制劑中有用的代表性作物油濃縮物包括甲基化種子油，氨基磺酸銨(HelenaChemical Co.)和草乳混(Loveland Industries Inc.)。最后，將優(yōu)選數(shù)量的非離子型表面活性劑混合到制劑中，通常在大約0.1～25液量昂司范圍內(nèi)，更優(yōu)選地是大約2～10液量昂司，最優(yōu)選地是大約5液量昂司。表面活性劑可以從許多商業(yè)來源獲得。有用的形態(tài)包括陰離子型、陽離子型、非離子型和兩性表面活性劑。在本發(fā)明所述制劑中有用的代表性表面活性劑包括Kinetic(Helena Chemical Co.)和因杜斯(Helena Chemical Co.)。
在本發(fā)明進一步的實施方案中，具有生物學活性的制劑也可以包括一種或多種其它的活性化合物，如除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。正如本發(fā)明所使用，術(shù)語“其它的活性化合物”是指那些具有除了在植物體內(nèi)觸發(fā)ISR能力以外的活性的化合物，如殺蟲劑、除草劑、殺真菌劑、殺細菌劑等。在優(yōu)選的實施方案中，在具有生物學活性的制劑中的一種或多種其它活性化合物是除草劑?？山邮艿某輨┑姆窍薅ㄐ詫嵤├?，4-滴丁酸、喹禾靈/精喹禾靈、噻草平、氯嘧黃隆、唑嘧磺胺酯、精吡氟禾草靈、高噁唑禾草靈、咪氟混劑、咪異混劑、咪草煙、胺硝草、氯嘧噻黃隆、草甘瞵、抑草生(Select 2 EC)、滅草喹和噻黃隆。含有除草劑的具有生物學活性的制劑是通過將除草劑混合到水中制備的，隨后是肥料(如果需要)、二苯醚活性成分、作物油濃縮物(如果需要)和表面活性劑(如果需要)，并且以列出的順序加入。對于15加侖的具有生物學活性的制劑，可以通過將大約0.005～10磅的除草劑活性成分混合到15加侖的水中來制備混合物，優(yōu)選地是大約0.5～5磅，最優(yōu)選地是大約1磅。然后將剩余成分混合到如上邊指出的制劑中。在本發(fā)明所述制劑中有用的代表性除草劑是草甘瞵(Monsanto Corp.)，為一種在出苗后使用的非選擇性的系統(tǒng)性除草劑。
本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將理解到，本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑的所有實施方案也可能包括其它惰性成分，以便提供一種更令人滿意的制劑，只要是不減損本發(fā)明基本成分效果的惰性成分。組合物可以進一步包括或者提高二苯醚的活性或者補充其活性的其它試劑?？梢詫⑦@樣的附加因素和/或試劑包括在該組合物中，以便與二苯醚產(chǎn)生協(xié)同作用，或最大地降低副作用。該組合物可以進一步包括填充劑、鹽、緩沖液、穩(wěn)定劑、增溶劑和其它本領(lǐng)域非常熟知的材料。
2.具有生物學活性的制劑在植物體上的應用
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解到，盡管優(yōu)選地該制劑含有至少一種佐劑，但可以通過使用只包含二苯醚的制劑來實施本發(fā)明的這些方法。本發(fā)明所述方法可以通過使用包含二苯醚、一種或多種佐劑的制劑，包括或不包括其它活性化合物，包括或不包括其它惰性成分的組合物來實施。進一步可以理解到，可以同時或按順序(按照任何期望的順序)使用二苯醚、一種或多種佐劑、其它的活性化合物以及其它的惰性成分，只要每一種成分按照與本發(fā)明所述目的發(fā)揮作用。如果按照順序使用，每種成分可以在短時限或長時限內(nèi)使用。
可以將本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑用于種子、根部或葉子和莖干?？梢酝ㄟ^用可能含有“粘附劑”的粉狀組合物來涂敷種子的方式將該組合物施用于種子，或者以液體或顆粒形式用于土壤、或者用于種子和/或根部區(qū)域。在一次使用中，可以將該組合物應用于植物體的表面，直到植物的葉子部分變濕、完全變濕或從葉子上滴下。對植物體的處理也可能包括將該組合物加到植物體的供水系統(tǒng)，或如果植物體是在組織培養(yǎng)基中生長的話，就加到容器中。可以在白天或晚上的任何時間使用該制劑，均產(chǎn)生良好的抗病性，但優(yōu)選地用于生長正活躍的植物并且至少在預知下雨之前30分鐘使用。如果先前的誘導性抗性開始減弱，證據(jù)是觀察到了疾病癥狀，那么只要認為有用就可以不斷地重復使用該制劑，以一次或多次“加強”使用來應用于增強抗性。因此，該制劑被認為可能既是“預防性”又是“治療性”的。在優(yōu)選的實施方案中，通過將制劑噴灑到植物體上來使用該制劑。將制劑噴灑到植物體上的方法的非限定性實施例包括一個拖拉機懸臂式噴霧機、手動式煙霧劑噴霧機、鼓風噴霧機和直升機或機翼固定的飛機懸臂式噴霧機。優(yōu)選地，將噴霧機校準到每英畝噴灑約1～100加侖制劑，更優(yōu)選地是每英畝大約3～50加侖，最優(yōu)選地是每英畝大約15加侖。
對本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員來說顯而易見，在植物體內(nèi)觸發(fā)ISR需要的“有效數(shù)量”的二苯醚化合物可以在很大的范圍內(nèi)變化，這依賴于許多因素，包括植物的種類及其生長階段，行距及植物間距，環(huán)境條件，氣候等等。然而一般而言，已經(jīng)確定出具有生物學活性的制劑包括二苯醚，而且二苯醚的使用量通常是每英畝約0.001～10磅的活性成分，這個量足以在使用了該制劑的植物體內(nèi)觸發(fā)ISR。更優(yōu)選地，每英畝大約使用0.01～1磅的活性成分來觸發(fā)ISR。最優(yōu)選地，每英畝大約使用0.05～0.25磅的活性成分來觸發(fā)ISR。
用于誘導增加異黃酮水平的二苯醚的有效數(shù)量要足以在處理的植物體內(nèi)增加異黃酮的水平，如染料木黃酮和黃豆苷原，使其高于對比的未處理的植物體內(nèi)的異黃酮水平。可以通過例行檢驗來決定這個數(shù)量，例如用下邊提到高效液相色譜來測量。將該組合物施用一次就可以獲得這個有效數(shù)量。另外，還可以將該組合物多次施用于植物體來獲得這個有效數(shù)量。該組合物中二苯醚的數(shù)量依賴于使用的特定化合物或化合物的混合物、被處理的植物組織以及植物吸收該組合物的能力。例如，植物體的嫩葉子比老葉子要更容易地吸收大部分組合物。可以預測到用于實施本發(fā)明所述方法的不同組合物每劑應當包括約200微摩爾～2毫摩爾的二苯醚。
在優(yōu)選的實施方案中，應用于植物體的具有生物學活性的制劑包括肥料、二苯醚、作物油濃縮物和表面活性劑。優(yōu)選地，加到該制劑中的肥料的量要便于以每英畝約0.1～10磅的比率來使用肥料，更優(yōu)選地大約是每英畝1～4磅，最優(yōu)選地大約是每英畝2磅。優(yōu)選地，該優(yōu)選制劑使用的二苯醚在上邊討論的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，該制劑的作物油濃縮物以每英畝大約1～100液量盎司的比率使用，更優(yōu)選地是每英畝大約5～25液量盎司，最優(yōu)選地是大約每英畝10液量盎司。優(yōu)選地，該制劑的表面活性劑以每英畝大約0.1～25液量盎司的比率使用，更優(yōu)選地是每英畝大約2～10液量盎司，最優(yōu)選地是大約每英畝5液量盎司。此外，也應該預測到在這些總的指導方針下，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員能很容易地選擇合適的制劑和每英尺的使用量，以實現(xiàn)本發(fā)明的目標及優(yōu)勢。
用本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑觸發(fā)的ISR和/或增加的異黃酮水平會產(chǎn)生針對病原體和疾病的植物體抗性，并且依賴于使用方法和使用條件，本方法將提供特定的和/或廣譜的疾病控制，包括阻止真菌感染以及細菌、病毒和線蟲類病原體的感染。植物病原體的非限定性實施例包括昆蟲(如雙翅目、膜翅目、甲蟲類、鱗翅類、直翅目、半翅類和同翅類)、細菌(例如大豆中的丁香假單胞菌大豆致病變種和野油菜黃單胞菌菜豆病原變種)、病毒(例如大豆中的菜豆豆莢斑駁病毒、豇豆褪綠斑駁病毒、花生斑駁病毒、大豆矮縮病毒、大豆花葉病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草條紋病毒、菜豆黃色花葉病毒、黑豆斑駁病毒、豇豆和性斑駁病毒、豇豆烈性花葉病毒、印度尼西亞大豆矮縮病毒、綠豆黃花葉病毒、花生條紋病毒、大豆褪綠斑駁病毒、大豆皺葉病毒、大豆黃脈病毒和煙草花葉病毒)、霉菌(例如大豆中的大豆蛙眼葉斑、大豆棕霉(Chaetomium cupreum)、木豆炭疽、大豆莢莖腐爛復合病、大豆鐮刀菌根腐、大豆炭腐、大豆霜霉)和線蟲類(例如大豆中的大豆胞囊線蟲、紐帶線蟲、根斑線蟲、腎形腎臟線蟲、根結(jié)線蟲和刺線蟲)。
植物體疾病的非限定性實施例包括1)傳染病，如a)細菌疾病(例如大豆中的細菌疫病、細菌斑疹病、細菌褐色斑點、大豆野火病、細菌萎蔫病和冠癭病)；b)類菌支原體疾病(例如大豆中的Machismo病、芽增生病、叢枝病和變?nèi)~病)；c)葉子、莖干上部、豆莢和種子的真菌疾病(例如大豆中的鏈格孢葉斑死莢病、炭疽病、褐斑病、大豆紫染色疫葉斑病、小扁豆葉腐爛病原體所致葉枯病、霜霉、蛙眼葉枯病、葉點霉葉枯病、白粉病、紅葉斑枯病、絲核菌致地上部分立枯病、銹病、赤霉病和黑斑病)；d)根部和莖干下部的真菌疾病(例如大豆中的褐莖腐病、炭腐病、鏈孢菌枯病或萎蔫病、根腐病以及莢根頸腐病、莖腐病、莢莖枯病、大豆莢莖腐爛所致種子腐爛病、莖潰瘍、大豆猝倒、紅冠腐爛病、絲核菌病、菌核腐病、大豆南方疫病以及大豆串珠霉根腐病)；e)病毒疾病(例如大豆中的芽枯病、大豆花葉病)；f)線蟲疾病；g)種子的種傳細菌和細菌性疾病(例如大豆中的桿菌種子腐爛病)，h)種子的種傳真菌和真菌性疾病(例如大豆中的大豆黑斑所致莢種腐爛病、大豆紫斑病、大豆酵母斑(Nematospora Spot)和大豆莢莖腐爛所致種子腐爛病、)，I)種傳病毒；2)未知原因或原因不能確定的疾病(例如大豆中的葉枯病、突死綜合癥和黃葉斑點病)；和3)非感染性或逆境性疾病(如結(jié)殼和收縮、霜凍、冰雹、熱潰瘍、電害、日燒、缺水、礦質(zhì)營養(yǎng)缺乏和毒性、除草劑損害、殺蟲劑損害和空氣污染物)。施用的特定實施例將用于大豆疫霉根腐病、大豆菌核白霉病、褐莖腐病和大豆包囊線蟲的控制。
也出乎意料地被發(fā)現(xiàn)，用本發(fā)明所述具有生物學活性的制劑觸發(fā)的ISR和/或異黃酮水平的增加可以導致增加植物的產(chǎn)量。在本發(fā)明中，術(shù)語“產(chǎn)量”指植物產(chǎn)生的可用的植物產(chǎn)品。在本發(fā)明中，植物產(chǎn)量以每英畝的干重量表示，以蒲式耳為單位。與在相同環(huán)境條件下生長的但沒有使用本發(fā)明所述活性制劑的同樣的植物相比，當恰當?shù)厥褂帽景l(fā)明所述具有生物學活性的制劑時，該制劑至少可以使植物產(chǎn)量大約增加0.5％，更優(yōu)選地至少增加5％，最優(yōu)選地增加30％或更多。在有很多英畝土地的大農(nóng)場，即使產(chǎn)量增加0.5％，經(jīng)濟上的增加也會很顯著?？梢允褂门c上邊所列出的用于制備具有生物學活性制劑的通用指導原則以及在植物體上使用的有效比率來達到本發(fā)明的目的。
可以產(chǎn)生異黃酮的植物包括那些能自然產(chǎn)生異黃酮的植物，如豆科植物、蝶形花亞科植物，以及已經(jīng)使用了遺傳工程后能夠產(chǎn)生異黃酮的植物。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了含有ISR的植物，尤其是農(nóng)作物。尤其有用的一個方面是，ISR是長期持續(xù)的，通常會堅持到收割時間。如果期望的話，可以在最初使用了該制劑后的晚些時間使用免疫加強。如果最初的抗性開始減弱，也就是如果植物體出現(xiàn)疾病癥狀時就可以使用免疫加強。
本發(fā)明所述方法可以用于在很多種植物體內(nèi)觸發(fā)ISR和/或增加異黃酮水平，包括蔬菜和水果作物、豆類、谷類、果樹、漿果、森林樹種、觀賞植物以及其它植物如咖啡和棉花。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該方法被用來在豆類植物體內(nèi)觸發(fā)ISR和/或異黃酮水平的增加，如大豆、利馬豆、斑豆、青豆、豌豆、鷹嘴豆和綠豆。
本發(fā)明的范圍也適用于ISR和/或異黃酮水平增加很重要的農(nóng)作物。通過使用含有二苯醚的具有生物學活性的制劑，這些植物表現(xiàn)出抵抗一大批病原體和疾病進攻的系統(tǒng)性能力。與當前的植物保護方法相比，該方法有很多的優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括，但不限于1)廣譜控制，因為ISR比大多數(shù)殺真菌劑和殺細菌劑的專一性低；和2)使用頻率低，因為ISR比大多數(shù)殺真菌劑和殺細菌劑提供的保護更系統(tǒng)而且更持久。
已經(jīng)觀察到，本發(fā)明所述的ISR和/或異黃酮水平增加的觸發(fā)產(chǎn)生了至少可以持續(xù)好幾周(例如，4到6周)的系統(tǒng)性抗性，而且可以在整個生長季節(jié)和/或植物的整個生命周期中持續(xù)。另外，用本發(fā)明所述方法處理可能產(chǎn)生在某種程度上低于總疾病抗性的抗性。這種已降低的抗性仍然可以給植物體提供針對病原體和疾病的抗性。已降低的抗性可能不是完整的抗性，但可以充分地降低病原性生物體的生長，并降低這些生物體的病原效應。
本發(fā)明意想不到的一個優(yōu)勢是，用本發(fā)明所述方法誘導的抗性是非專一性的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明所述方法處理的植物體對于病原體生長及來自寬范圍的病原體疾病具有抗性，這些病原體包括細菌、霉菌和病毒。這種非特異性抗性與抗性栽培種的特異性抗性和控制疾病的其它化學方法大不相同。由于這種非特異性，ISR能夠保護植物體免遭仍然不知道可用其它方法處理的病原體的侵犯。
3.評價二苯醚在大豆系統(tǒng)中對于異黃酮產(chǎn)生和防御誘導物激活上的發(fā)生效應的方法
大豆子葉分析是評估大豆系統(tǒng)內(nèi)防御誘導物活性的標準分析。該分析方法存在兩種修改后的方式，它們可以用來決定細胞核受體的配體的有效濃度。
切割開的子葉分析
這種切割開的子葉分析被用來研究一種化合物(效應物)在植物體內(nèi)激活基礎(chǔ)誘導感受態(tài)的能力，以及評估二級化合物(誘導物)在植物體內(nèi)提高大豆抗毒素誘導感受態(tài)的能力，在該過程中，異黃酮庫是用效應物的作用“滿載”的。
在加入不同二苯醚之后，來測量子葉組織中的異黃酮水平，以確定每種二苯醚在誘導子葉組織中(效應物研究)異黃酮基礎(chǔ)產(chǎn)量的效果。在誘導物研究中，加入的二苯醚首先“激發(fā)”切割的子葉。也就是，響應來自大豆疫腐病原體的葡聚糖誘導物的植物抗毒素大豆抗毒素的誘導感受態(tài)已經(jīng)被先前加入的二苯醚部分激活。結(jié)果，在存在葡聚糖的情況下，大豆抗毒素的前體，即二苯醚誘導的、增加后的黃豆苷原水平被迅速轉(zhuǎn)換到大豆抗毒素。因此，也可以測量一種化合物通過“滿載”異黃酮庫而提高大豆抗毒素誘導感受態(tài)的能力。
從年齡7～8天的大豆幼苗的植物體上摘取子葉，在較低的表面切割開，暴露出表皮下的組織。在目的僅為研究效應物作用的實驗中，用15ul劑量的二苯醚或水(對照)處理子葉。在誘導物研究中，進一步用15ul劑量的來自真菌病原體，即大豆疫腐病原體或水(對照)的葡聚糖防御誘導物(30ug/ul)處理子葉。每次處理使用10個子葉，并且放在含有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，以便保持子葉濕潤。在大約200微愛因斯坦單位(uA)的光照及室溫條件下培育48小時后，收獲子葉組織，用來分析。用1號穿孔器從子葉上垂直切割細胞柱，來獲得用于分析的組織。然后細胞柱被用細胞切片的方式再次分割成次樣品，是從原始切割表面進行連續(xù)地切片。第一個切片大約是4層細胞厚，接下來的兩個切片大約是8層細胞厚。這樣可以使分別觀察處理的近端和遠端效果成為可能。用下邊提到的HPLC對組織進行分析?？梢栽诔霭嫖颎raham，T.L.，and Graham，M.Y.1991.Glyceollin ElicitorsInduce Major But Distinctly Different Shifts in IsoflavonoidMetabolism in Local and Distal Cell Populations.Mol.PlantMicrobe Inter.460-68中找到該分析的完整細節(jié)。
折斷的子葉分析
折斷的子葉分析是一種最小創(chuàng)傷分析，用于在無激發(fā)背景下研究試驗化合物的效果。將子葉折成兩半，并將葉柄側(cè)朝下放入0.5％的水瓊脂中來進行該分析。每次處理使用10個折斷的子葉，并且用正在檢查的葡聚糖防御誘導物和/或效應物(即二苯醚)處理因折斷而暴露的表皮下細胞。如同在切割開的子葉分析中一樣，在光照下將子葉培育48小時。收獲近端(第一個細胞層)和遠端(第二和第三個細胞層)組織用于HPLC分析(參考下文)。可以在出版物Graham，T.L.，andGraham，M.Y.1996.Signaling in soybean phenylpropanoid responsesdisscction of primary，secondary and conditioning effects oflight，wounding and elicitor treatments.PlantPhysiol.1101123-1133中找到該分析的完整細節(jié)。
折斷的子葉分析是“天然的”。也就是，它不是被預先安排或激發(fā)于響應葡聚糖誘導物的植物抗毒素大豆抗毒素的誘導感受態(tài)中。因此，用葡聚糖誘導物進行的處理誘導了異黃酮黃豆苷原和染料木黃酮，但大豆抗毒素很少形成。這是一種很優(yōu)秀的分析，用于研究一種化合物對異黃酮新陳代謝的效應是由其本身引起還是與葡聚糖結(jié)合而發(fā)揮作用。在不存在葡聚糖的情況下，該分析可以提供化合物單獨作用于異黃酮新陳代謝上的效果的優(yōu)質(zhì)圖象。在存在葡聚糖的情況下，該分析告訴我們試驗化合物是否可以誘導大豆抗毒素對葡聚糖反應的誘導感受態(tài)。
4.用二苯醚處理的子葉中的異黃酮水平的HPLC分析
高效液相色譜(HPLC)是一種精選的、用于確定大豆中異黃酮防御化合物水平的方法。在一個單一的HPLC分析中，人們可以得到一個高達50或更多個芳族化合物的完整的定量描述，包括所有的異黃酮和其共扼物以及植物抗毒素，包括大豆抗毒素。該方法只需要很少量的植物體組織，僅為20mg，并且可以容易地將該方法用于子葉、葉子或任何大豆組織。該分析方法允許我們確定每種代謝物的納摩爾數(shù)/克數(shù)，然后可以與水或葡聚糖處理的對照組織比較，很容易地進行處理，以便比較每種給定的代謝物的百分率的增加或減少。一般來說，組織是在80％的乙醇中提取的，然后在C18反相HPLC柱中用水/丙腈梯度洗脫?？梢栽诔霭嫖颎raham，T.L.1991.A Rapid High Resolution HighPerformance Liguid Chromatography Profiling Procedure for Plantand Microbial Aromatic Secondary Metabolites.PlantPhysiol.95584-593中找到該過程的完整細節(jié)。實施例
下面的實施例僅僅對本發(fā)明優(yōu)選的方面作了說明，不能理解為以任何方式限定本發(fā)明。
實施例1-大豆作物上的乳氟禾草靈效果的野外實驗
A)本實施例說明了包括乳氟禾草靈、表面活性劑和硫酸銨的制劑在大豆中觸發(fā)ISR的效果，正如保護大豆不受大豆菌核腐病病原體(S.sclerotiorum)的進攻中所證明的。實施例中所用的乳氟禾草靈的類型是Cobra。所用的表面活性劑的類型是因杜斯。草甘膦也被包括在一些制劑中，以控制試驗地中的雜草。制備5種不同的制劑，每種是15加侖。每種制劑中的每個成分的特征和濃度列在表1的第1欄。
按照完全隨機分組設(shè)計(RCBD)安排四種處理情況，以便對結(jié)果進行差異統(tǒng)計分析(ANOVA)。為四種處理情況中的每一種建立四個相同(樣地)。每一塊樣地寬25英尺，長200英尺。
當具有三個小葉的葉子中的三個已經(jīng)伸開，而第四個呈現(xiàn)杯狀處于在V3生長階段時，在第40天對每塊地使用不同的制劑。每種制劑都用拖拉機懸臂式噴霧機來施用，并將噴霧機調(diào)整到每英畝噴灑15加侖。在第40天分別在四塊地中每一塊使用處理情況1、2、3和4中的制劑1、2、3和4。在第47天，在處理情況4中的四塊地中使用制劑5。
在第104天，從四種處理情況中的每一種中，隨機地選擇5個縱行中的單個大豆植物體，并用來檢查大豆菌核腐病病原體(S.sclerotiorum)進攻的跡象。S.sclerotiorum進攻的跡象包括含有白色菌絲體的棕色莖干區(qū)域以及整個植物的枯萎。在發(fā)現(xiàn)一種處理的一個重復樣地中沒有疾病發(fā)生后，只在四種處理情況中每一種的其它三個相同樣地中進行檢查。在表1的第4欄對四種處理情況中的每一種的檢查結(jié)果的均值做了總結(jié)。在第110天，再次對四種處理情況的每一種(三個相同的樣地)中的單個大豆植物體進行檢查，以檢查S.sclerotiorum進攻的跡象。在表1的第5欄中，對每種處理情況的三個相同地塊的檢查結(jié)果的均值做了總結(jié)。用Student-Newman-Keuls試驗進行差異分析。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的不同。
在第142天，收割四種處理情況的每一種的大豆植物。每種處理情況的三個相同樣地的產(chǎn)量均值在表1的第6欄做了總結(jié)，其中將濕度調(diào)到13％。在同一天也確定出每一樣地中植物體水分含量的均值，其結(jié)果在表1的第7欄做了總結(jié)。
這些結(jié)果說明了，與處理情況1相比，用于處理情況2、3和4的制劑都顯著的降低了S.sclerotiorum進攻的發(fā)生率。處理情況2、3和4均使用了含有二苯醚乳氟禾草靈的制劑，而處理情況1則沒有使用。而且，在每一塊樣地使用了該制劑60天后，在處理情況2和3中，ISR在整個生長季節(jié)都對植物提供了保護。該結(jié)果也說明，處理情況2和3收獲的大豆產(chǎn)量在統(tǒng)計數(shù)字上比處理情況1高，處理情況4收獲的產(chǎn)量比處理情況1的顯著提高。這說明系統(tǒng)性抗性的誘導會使植物更健康、更茁壯，從而導致更高的產(chǎn)量。正如在表1中看到的，從四塊地收割植物時的濕度百分比沒有顯著地不同，這說明侵染和產(chǎn)量結(jié)果不受植物吸收和維持濕度的能力的影響。
表1斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的不同(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
B)表2概括了在俄亥俄州、伊利諾斯州和賓夕法尼亞州的不同農(nóng)場進行的大量實驗性野外實驗的結(jié)果。正如表2中可以看到的，盡管很多因素隨著不同的農(nóng)場有所改變(如所用的乳氟禾草靈的類型、制劑組合物、對照組合物、氣候條件、土壤條件、種植條件等)，與用不含乳氟禾草靈的對照制劑處理的大豆相比，含有乳氟禾草靈的制劑處理的大豆作物顯著地降低了S.scerotiorum損害的發(fā)生率。而且，用乳氟禾草靈處理的樣地的作物產(chǎn)量通常高于對照樣地的產(chǎn)量。在使用了乳氟禾草靈和對照植物之間的水分含量沒有顯著的變化。
在這些現(xiàn)場實驗中所用的乳氟禾草靈的類型或者是Cobra或者是乳氟酰亞混劑。在該實施例中所用的一種或多種制劑中所用的佐劑是作物油濃縮物、非離子型表面活性劑、硫酸銨和尿素硝酸銨。在該實施例中所用的一種或多種制劑中所用的其它活性化合物是除草劑草甘膦、Python、抑草生、唑嘧磺胺酯和咪異混劑。
表2斜體字表示的制劑是對照組
C)其它野外實驗表明，用乳氟禾草靈觸發(fā)的ISR可以保護大豆作物免遭大豆疫霉病原體(Phytophthora sojae)的進攻。大豆種子(Pioneer93B01 RR)是在寬25英尺、長300英尺的樣地中種植的。在一個RCBD中將處理情況重復3次。在同一田地中建立了2個獨立的試驗。在R1生長階段(第一天)使用乳氟禾草靈。在第64天，從每一樣地中取10個樣品，每一樣品包括行寬為5英尺長的區(qū)域中的植物。對每一樣品中的每一植物檢查P.sojae的跡象。表3概括了該研究的結(jié)果。正如從這些結(jié)果可以看到的，乳氟禾草靈顯著地降低了P.sojae的生長，并且增加了農(nóng)作物總產(chǎn)量。
表3斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的不同(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
D)進一步的野外實驗表明，用乳氟禾草靈觸發(fā)的ISR可以保護大豆作物免遭F.solani f.sp.glycines引起的突死綜合癥。大豆種子(BSR101、Asgrow A 3701(RR)品種，或Pioneer P9344(RR))是在感染了F.solani f.sp.glycines的土壤中種植的。處理是在1倍使用率，而且是在營養(yǎng)狀態(tài)下使用。正如從下邊的結(jié)果可以看到的，乳氟禾草靈顯著地降低了F.solani f.sp.glycines引起的破壞。
E)溫室研究進一步表明，用乳氟禾草靈觸發(fā)的ISR可以保護大豆作物免遭F.solani f.sp.glycines引起的突死綜合癥。大豆種子(BSR 101、Asgrow A 3701(RR)品種，或Pioneer P9344(RR))是在感染了F.solanif.sp.glycines的土壤中種植的。處理是在1倍使用率，而且是在營養(yǎng)狀態(tài)下使用。
從這些植物根部定期分離病原體表明，用根部腐爛嚴重程度測量的根部感染有了顯著的降低。在葉子部分使用乳氟禾草靈之后，大豆根部F.solani f.sp.glycines的無性繁殖的降低表明，針對F.solani f.sp.glycines的誘導性抗性是系統(tǒng)性的。
實施例2-乳氟禾草靈用于大豆的時間變化
該野外實驗是在賓夕法尼亞州的Muncy附近的一個農(nóng)場進行的，目的在于確定使用乳氟禾草靈的時間變化是否對ISR有影響，通過抑制S.sclerotiorum的生長來加以表明。在14個分離的行中種植大豆種子(Pioneer 9352)。四種處理以RCBD形式安排，即每種處理有四種相同的樣地。處理情況1是未處理的對照組。在處理情況2中僅使用了作物油濃縮物。在處理情況3中，當大豆處于V4生長階段時(第1天)，對大豆植物使用Cobra和作物油濃縮物。在處理情況4中，于R1生長階段(第12天)對大豆植物使用Cobra和作物油濃縮物。正如從表4概括的結(jié)果可以看到的，使用乳氟禾草靈的時間變化對乳氟禾草靈的ISR誘導能力沒有顯著的影響。
表4斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的不同(P＝.05，Student-Newman-Keuls)實施例3-乳氟禾草靈對大豆作物產(chǎn)量效果的野外實驗
表5概括了乳氟禾草靈處理的大豆與對照植物相比的作物產(chǎn)量的測量結(jié)果。大豆是從俄亥俄州的農(nóng)場收割來的。正如表5中可以看到的，盡管很多因素隨著不同的農(nóng)場有所改變(如所用的乳氟禾草靈的類型、制劑組合物、對照組合物、氣候條件、土壤條件等)，與對照組地塊相比，含有乳氟禾草靈的制劑所處理的大豆作物的產(chǎn)量通常有所提高。在使用了乳氟禾草靈的植物和對照組的植物之間的水分含量沒有顯著的變化。
在這些現(xiàn)場實驗中所用的乳氟禾草靈的類型是Cobra或乳氟酰亞混劑。在該實施例中所用的一種或多種制劑中所用的佐劑是作物油濃縮物和硫酸銨。在許多制劑中也使用了草甘膦。
表5斜體字表示的制劑是對照組實施例4-折斷的子葉處理情況中所示的異黃酮水平的誘導
植物體材料從年齡7天的威廉斯品種的大豆上摘取子葉；每次處理，使用10片子葉進行分析。
制劑/組合物被測試的二苯醚包括乳氟禾草靈、氟黃胺草醚和氟鎖草醚。在水中溶解二苯醚或首先在異丙醇中溶解以得到一種飽和溶液，接著在水中快速稀釋。異丙醇最終的濃度不要超過0.5％。從1mM連續(xù)進行3倍稀釋，在大約10uM～1mM的濃度范圍內(nèi)測試二苯醚。對二苯醚進行單獨測試，并在存在30ug/ml的來自真菌病原體phytophthora sojae的葡聚糖的誘導物的情況下進行測試。二苯醚的濃度及此處提到的葡聚糖的濃度就是經(jīng)過處理的子葉的最終濃度。
處理情況用7uL正在測試的二苯醚處理每個折斷的子葉所暴露的表面，接著用7uL的葡聚糖或水處理。在恒定的光照下(200uA)將子葉培育48小時。
分析在第48小時，從處理的子葉表面獲得一個薄的(半透明的)切片。在濃度為80％的乙醇中將每次處理的從10片子葉上獲得的切片混合并提取(每50毫克新鮮重量用400uL乙醇溶液)。然后如上邊描述的將提取物放到HPLC上。結(jié)果在表6中給出，這些結(jié)果表明二苯醚既能誘導異黃酮的基礎(chǔ)水平，也能“激發(fā)”子葉的感受態(tài)。表中的值是兩次獨立實驗的平均值。標準誤差低于所有值的平均值的15％。
表6
并且在切割開的子葉分析(威廉斯品種的子葉)中，在高于50～500uM的濃度范圍下，進行了二苯醚的測試。在這個濃度范圍內(nèi)，以異黃酮的增加范圍來表示，甲狀腺素活性是20～40％。實施例5-在其它植物體和植物器官中的異黃酮水平的誘導
A)如上邊實施例4所描述的，在切割子葉分析中，用含有乳氟禾草醚的組合物處理包括利馬豆、綠豆、青豆、花生和鷹嘴豆在內(nèi)的豆類。將該組合物用于分析中的適當年齡植物體的子葉上，即完全展開的、綠色的和未衰老的組織上。
以100～200uM的濃度使用乳氟禾草醚。當100uM的乳氟禾草醚被用于切割子葉時，可以觀察到在利馬豆、鷹嘴豆、青豆和花生中的芳族代謝物的增長范圍為20～500％。這些芳族代謝物沒有被明確地識別。然而，它們的紫外線光譜表明大部分是異黃酮。
B)以與如上邊實施例4所描述的方法相同的方法處理大豆植物的真葉?？梢杂脙煞N方法測試大豆或其它植物的真葉。在實驗室中，使用固定在水泵上的濾片平臺，用真空裝置吸入葉子上的一個小塊。將葉子放置在濾片平臺上，使用輕輕吸入方法。然后將一滴葡聚糖誘導物和/或化合物處理物放置在葉子的暴露表面上，并且允許通過葉子的氣孔滲透進組織中。而對于在溫室或田地中，則該化合物用于制劑中時，用表面活性劑將其乳化并分散。在每一分析中，用如上所描述的HPLC再次分析該組織。
如果滲透進大豆葉子組織中，使用100uM的乳氟禾草醚會使得異黃酮染料木黃酮共軛物增長6倍，使異黃酮黃豆苷原至少增長10倍，它們在在成熟大豆葉子中的水平幾乎檢測不到。
C)而且田地和溫室研究也被用來確定將乳氟禾草醚直接用于大豆葉子是否會誘導黃豆苷原和染料木黃酮的糖苷配基水平以及染料木黃酮共扼物的增加。下邊的表7以增加百分比列出了在整個適當對照處理情況中葉子組織對于乳氟禾草醚的響應。在田地中(俄亥俄州和賓夕法尼亞州)，每英畝使用6盎斯的Cobra，并且在處理后將葉子分析8天。在溫室中，以50微摩爾級使用乳氟禾草醚，并且在處理后將葉子分析48小時。
正如這些結(jié)果所表明的，大豆葉子對于乳氟禾草醚的響應是通過產(chǎn)生黃豆苷原和染料木黃酮的糖苷配基以及染料木黃酮共扼物的非常大量的增長而實現(xiàn)的。
表7實施例6-大豆種子中異黃酮水平的誘導
在每一樣地的兩個節(jié)點位置(每個樣地取出3個大豆植物體作樣品)進行分析，以分別確定黃豆苷原、共扼的黃豆苷原、染料木黃酮和共軛的染料木黃酮的水平。結(jié)果以四種指定的異黃酮的總量給出。將確定出的較低節(jié)點樣品的值與較高節(jié)點樣品的值相加，將所得到的值除以2就得到每一塊樣地的異黃酮水平的均值。每種處理是由3個相同樣地的總數(shù)與每塊樣地的2個樣品相乘構(gòu)成＝每次處理有6個樣品。
A)Chemgro2289是在位于賓夕法尼亞州的Waterford的Port農(nóng)場的田地里種植的。是在1999年6月24日，在V4/V5階段使用制劑的。大豆是于1999年10月6日，在處理之后的104天收割的。葉子樣品是在第四天和第45天取樣分析的。在這些樣地中沒有發(fā)現(xiàn)可評估的疾病。產(chǎn)量是在1999年10月7日測量的。在這些處理情況之間沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量差別。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝1951.141；SD＝555.345；CV＝2.24；處理概率(F)＝0.0125。
表8
斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有
顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
B)Garst 261 RR是在位于賓夕法尼亞州的Waterford的Port農(nóng)場的田地里種植的。是于2000年6月24日在R1的早期使用制劑的。大豆是于1999年10月6日收割的。在這些樣地中沒有發(fā)現(xiàn)可評估的疾病。產(chǎn)量是在1999年10月7日測量的。在這些處理情況之間沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量差別。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝3025.34；SD＝l334.75；CV＝7.4；處理概率(F)＝0.6493。
表9斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
C)Group 1.9 RR是在位于賓夕法尼亞州的Waterford的Port農(nóng)場的田地里種植的。是在1999年6月24日在R1的早期使用制劑的。大豆是于1999年10月6日收割的。在這些樣地中沒有發(fā)現(xiàn)可評估的疾病。產(chǎn)量是在1999年10月7日測量的。在這些處理情況之間沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量差別。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝2536.3；SD＝721.9；CV＝3.57；處理概率(F)＝0.6225。
表10斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
D)Pioneer 93B01 RR是在位于俄亥俄州MT.Vernon的Springer農(nóng)場的田地里種植的。是在1999年6月30日在R1的早期使用制劑的。大豆是于1999年10月26日收割的。有Phytophthoram的存在，并且是于1999年9月2日鑒定的。Cobra處理顯著的降低了Phytophthora的發(fā)生率，并且顯著增加了產(chǎn)量。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝3835.87；SD＝1919.86；CV＝9.36；處理概率(F)＝0.153。
表11斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
E)Pioneer 93B01 RR是在位于俄亥俄州MT.Vernon的Springer農(nóng)場的田地里種植的。是在1999年6月30日使用制劑的。大豆是于1999年10月26日收割的。有Phytophthora m的存在，并且是于1999年9月2日鑒定的。Cobra處理顯著的降低了Phytophthora的發(fā)生率，并且顯著增加了產(chǎn)量。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝4189.86；SD＝2097.06；CV＝10.47；處理概率(F)＝0.2878。
表12斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
F)Ohio FG1是在位于俄亥俄州Vab Wert的Profit農(nóng)場的田地里種植的。是在2000年7月20日使用制劑的。大豆是在正常生長季節(jié)的后期收割的。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝524.66；SD＝233.18。
表13斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
G)Ohio FG1是在位于俄亥俄州的Vab Wert的Profit農(nóng)場的田地里種植的。是在2000年7月130日使用制劑的。大豆是在正常生長季節(jié)的后期收割的。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝407.05；SD＝180.91。
表14斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)H)Ohio FG1是在位于俄亥俄州的Vab Wert的Profit農(nóng)場的田地里種植的。是在2000年7月10日使用制劑的。大豆是在正常生長季節(jié)的后期收割的。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝1137.79；SD＝505.68。
表15斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
I)Ohio FG1是在位于俄亥俄州Vab Wert的Profit農(nóng)場的田地里種植的。是在2000年7月10日使用制劑的。大豆是在正常生長季節(jié)的后期收割的。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝1355.94；SD＝602.64。
表16
斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有
顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
J)Pioneer 9305是在位于俄亥俄州St.Charles Seminary，Coldwater的田地里種植的。是在2000年7月1日使用制劑的。大豆是在正常生長季節(jié)的后期收割的。對于總異黃酮，如下計算LSD(P＝0.05)＝296.53；SD＝131.79。
表17
斜體字表示的制劑是對照組。后邊跟有相同字母的均值沒有
顯著的差別(P＝.05，Student-Newman-Keuls)
雖然本發(fā)明已經(jīng)做了很詳細的描述，而且參考其中的特殊實施例，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見，在此處做一些各種變化和修改都不會背離本發(fā)明的宗旨和范圍。
權(quán)利要求
1.一種在植物體內(nèi)觸發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性的方法，其中包括將有效數(shù)量的含有二苯醚的具有生物學活性的制劑應用于植物體的至少一部分表面，在植物體內(nèi)觸發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性的活性，從而誘導出針對至少一種病原體或疾病的系統(tǒng)性抗性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述二苯醚具有用下述分子式中之一表示的結(jié)構(gòu)
其中R1是氫原子、氟原子或氯原子，或三氟甲基基團；R2、R3和R5獨立的是氫原子、氟原子或氯原子；R4是氫原子，NR6、NR6R6、CR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或環(huán)醚，其中R6是氫原子、具有1～4個碳原子的支鏈烷基基團或具有1～4個碳原子的直鏈烷基基團；
其中R7是氧或氮原子；R8是氫原子、CH3、含有2～5個碳原子的脂肪鏈或HSO2CH3；和
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3，R10是含有1～5個碳原子的支鏈脂肪鏈。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述二苯醚具有如分子式(I)表示的結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述二苯醚是氟鎖草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黃胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草靈、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述二苯醚是乳氟禾草靈。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑進一步包括一種或多種選擇植物學上可以接受的載體、作物油濃縮物、表面活性劑、肥料、乳化劑、分散劑、起泡劑、消泡劑和摻合劑。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述佐劑是表面活性劑。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述佐劑是非離子表面活性劑。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述佐劑是作物油濃縮物。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述佐劑是硫酸銨或尿素硝酸銨。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑進一步包括一種或多種其它的活性化合物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述一種或多種其它的活性化合物是除草劑。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物體是選擇利馬豆、斑豆或大豆的豆科植物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述豆科植物是大豆。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述誘導性系統(tǒng)抗性是在由所述病原體引起的疾病發(fā)作之前被激發(fā)的。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述誘導性系統(tǒng)抗性一直持續(xù)到植物收獲時。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中進一步包括將所述制劑在首次施用后，施用于植物體表面的增強施用，從而誘導針對病原體的連續(xù)抗性。
18.一種增加植物產(chǎn)量的方法，其中包括將有效數(shù)量的含有二苯醚的具有生物學活性的制劑應用于植物體的至少一部分表面，在植物體內(nèi)觸發(fā)誘導性系統(tǒng)抗性的活性，并且維持或增加植物體總體健康狀況，從而增加農(nóng)作物產(chǎn)量。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述二苯醚具有用下述分子式中之一表示的結(jié)構(gòu)
其中R1是氫原子、氟原子或氯原子，或三氟甲基基團；R2、R3和R5獨立的是氫原子、氟原子或氯原子；R4是氫原子、NR6、NR6R6、CR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或環(huán)醚，其中R6是氫原子，具有1～4個碳原子的支鏈烷基基團或具有1～4個碳原子的直鏈烷基基團；
其中R7是氧或氮原子；R8是氫原子、CH3、含有2～5個碳原子的脂肪鏈或HSO2CH3；和
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3，R10是含有1～5個碳原子的帶支鏈的脂肪鏈。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述二苯醚具有如分子式(I)表示的結(jié)構(gòu)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述二苯醚是氟鎖草醚、苯草醚、治草醚、氯硝醚、草枯醚、消草醚、乙羧氟草醚、氟草醚、氟黃胺草醚、氟呋草醚、氟硝磺酰胺、乳氟禾草靈、除草醚、硝氟草醚或乙氧氟草醚。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述二苯醚是乳氟禾草靈。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述制劑進一步包括一種或多種選擇植物學上可以接受的載體、作物油濃縮物、表面活性劑、肥料、乳化劑、分散劑、起泡劑、消泡劑和摻合劑。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述佐劑是表面活性劑。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述佐劑是非離子表面活性劑。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述佐劑是作物油濃縮物。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述佐劑是硫酸銨或尿素硝酸銨。
28.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述制劑進一步包括一種或多種其它的活性化合物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述一種或多種其它的活性化合物是除草劑。
30.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述植物體是選自利馬豆、斑豆或大豆的豆科植物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述豆科植物是大豆。
32.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述誘導性系統(tǒng)抗性是在由所述病原體引起的疾病發(fā)作之前形成的。
33.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述誘導性系統(tǒng)抗性一直持續(xù)到植物收割時。
34.如權(quán)利要求18所述的方法，其中進一步包括將所述制劑在首次施用后，施用于植物體表面的增強施用，從而誘導針對病原體的連續(xù)抗性。
35.一種增加植物體內(nèi)異黃酮水平的方法，其中包括將有效數(shù)量的含有二苯醚的具有生物學活性的制劑應用于植物體的至少一部分表面，誘導異黃酮在植物體中的釋放和產(chǎn)生，從而增加植物體內(nèi)的異黃酮水平。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述二苯醚具有用下述分子式中之一表示的結(jié)構(gòu)
其中R1是氫原子、氟原子或氯原子或三氟甲基基團；R2、R3和R5獨立的是氫原子、氟原子或氯原子；R4是氫原子、NR6、NR6R6、CR6、COOR6、COOCHR6CO2R6、CONHSO2R6或環(huán)醚，其中R6是氫原子，具有1～4個碳原子的支鏈烷基基團或具有1～4個碳原子的直鏈烷基基團；
其中R7是氧或氮原子；R8是氫原子、CH3、含有2～5個碳原子的脂肪鏈或HSO2CH3；和
其中R9是H、Cl、I、Br、CF3，R10是含有1～5個碳原子的支鏈脂肪鏈。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述二苯醚具有如分子式(I)表示的結(jié)構(gòu)。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述二苯醚是氟鎖草醚、氟黃胺草醚或乳氟禾草靈。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述二苯醚是乳氟禾草靈。
40.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述制劑進一步包括一種或多種選擇植物學上可以接受的載體、作物油濃縮物、表面活性劑、肥料、乳化劑、分散劑、起泡劑、消泡劑和摻合劑。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述佐劑是表面活性劑。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述佐劑是非離子表面活性劑。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述佐劑是作物油濃縮物。
44.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述佐劑是硫酸銨或尿素硝酸銨。
45.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述制劑進一步包括一種或多利其它的活性化合物。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述一種或多種其它的活性化合物是除草劑。
47.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述植物體是選自利馬豆、斑豆或大豆的豆科植物。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述豆科植物是大豆。
49.一種增加植物體內(nèi)異黃酮水平的方法，其中包括將含有植物學上可接受的載體和有效數(shù)量的含有如分子式(II)所示二苯醚的組合物應用于植物體；
其中R7是氧或氮原子；R8是氫原子、CH3、含有2～5個碳原子的脂肪鏈或HSO2CH3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在植物體內(nèi)誘導系統(tǒng)性抗性的方法，從而保護植物體免受寬范圍的病原體和疾病的侵犯。本發(fā)明所述方法包括將含有二苯醚的具有生物學活性的制劑應用于植物體。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)觀察到該制劑的使用會在靶植物體內(nèi)產(chǎn)生誘導性系統(tǒng)抗性。而且根據(jù)本發(fā)明所述方法，所述制劑已經(jīng)表現(xiàn)出在植物體內(nèi)觸發(fā)針對許多病原體和疾病的長期的、非專一性的系統(tǒng)性抗性。進一步而言，本發(fā)明所述方法會導致植物體異黃酮水平的增加。
文檔編號A01N43/16GK1398159SQ01804740
公開日2003年2月19日 申請日期2001年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月11日
發(fā)明者W·J·阿達, N·P·巴登豪普, A·D·施塔門, T·G·比恩, T·L·格雷厄姆, L－M·Y·格雷厄姆, S·蘭迪尼 申請人:瓦倫特美國公司, 俄亥俄州立大學研究基金會