專利名稱：生產(chǎn)禽類配子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將原生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)入禽類體內(nèi)的方法，以便由所述禽類生產(chǎn)配子。所述方法可用于瀕危禽類物種的保存，縮短生產(chǎn)諸如火雞的、成長緩慢的物種生產(chǎn)精子所需要的時(shí)間，降低保持種禽種群的成本，以及改變后代種群的性別比例(例如，提高生產(chǎn)效率)。
背景技術(shù)：
對于禽類醫(yī)學(xué)和家禽生產(chǎn)來說，能更方便地生產(chǎn)特定禽類物種的配子的能力是極其有用的。對于諸如鳴鶴的瀕危物種來說，能夠方便地提供雄性精子是極其有用的。對于諸如火雞的商用禽類來說，希望能更快、更經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)出雄性精子。對于肉類生產(chǎn)家禽來說，需要有提高種群中雄性禽類比例的方法。因此，需要獲得禽類精子的新途徑。
嵌合體是由來自一個(gè)以上合子的細(xì)胞組成的復(fù)合生物。業(yè)已將實(shí)驗(yàn)嵌合體用于研究細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用，以及在發(fā)育期間的細(xì)胞系分析(A.McLaren，Mammalian Chimeras.Cambridge University Press，Cambridge，1976)。當(dāng)嵌合體是用來自非常早期的胚胎的材料生產(chǎn)的時(shí)，所發(fā)育成的生物含有完全混合的體細(xì)胞組織。如果所述原材料包括早期生殖細(xì)胞或其他前體，所得到的個(gè)體就能夠產(chǎn)生具有供體和受體基因型的配子。另外，嵌合體也可以是種內(nèi)的，即同一物種的兩個(gè)配子之間的，或種間的，即兩種不同物種之間的。
與其他脊椎動物生殖細(xì)胞類似，禽類原生殖細(xì)胞(PGCs)的來源也是性腺以外的，并且，必須經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的旅程才能到達(dá)性腺。通過胚層細(xì)胞和原生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生了禽類種系嵌合體。
禽類種系嵌合體生產(chǎn)的先驅(qū)Reynaud(J.Embryol.Exp.Morphol.21485-507，1969)報(bào)導(dǎo)了通過將分離的火雞生殖新月細(xì)胞通過血管內(nèi)途徑轉(zhuǎn)移到預(yù)先絕育的雞的胚胎中，來生產(chǎn)火雞-雞種系嵌合體(所述絕育是通過用紫外線照射受體生殖新月細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的)。通過機(jī)械分離生殖新月細(xì)胞(5期)的內(nèi)胚層獲得PGCs，將其注射到雞胚胎的血管中(培養(yǎng)3-5天)。在注射之前，用紫外線對8-10期(H&H)的受體胚胎進(jìn)行絕育；不過，所述絕育是不徹底的。雞胚胎中的火雞PGCs只能根據(jù)其核質(zhì)比來鑒定。這種鑒定方法困難并且煩瑣，而且不能用于有效分裂火雞PGCs，因此，分裂的生殖細(xì)胞會產(chǎn)生異常的核質(zhì)比。在隨后的研究中，讓轉(zhuǎn)移的PGCs在宿主性腺中成熟，并且表面上能夠產(chǎn)生配子，但是，這些配子不適合受精(Wilhelm Roux Arch.Dev.Bio.17985-100，1976)。所述精子不能使火雞卵受精。它能使雞卵受精，但是不能正常發(fā)育。雞的精子能活化從雌性種間嵌合體獲得的卵，但是它不能產(chǎn)生胚胎。當(dāng)所述卵是由火雞精子受精的時(shí)，它能發(fā)育成異常的胚胎，這種胚胎不能存活超過38期(H&H)。Reynaud用形態(tài)學(xué)作為唯一的區(qū)別特征，試圖從雞生殖細(xì)胞中鑒定火雞生殖細(xì)胞。單是形態(tài)學(xué)本身不足于鑒定嵌合體，因此必須補(bǔ)充其他標(biāo)記。另外，根據(jù)Aige-Gil和Simkiss的觀點(diǎn)(Brit.Poul.Sci.3247-438，1991)，火雞配子的存在不是通過實(shí)驗(yàn)交配鑒定的。因此，仍然需要實(shí)現(xiàn)禽類配子生產(chǎn)和轉(zhuǎn)移的新途徑。
發(fā)明概述一種用于生產(chǎn)和收集禽類精子的方法，包括以下步驟由供體禽類物種提供原生殖細(xì)胞；將所述原生殖細(xì)胞輸送到受體禽類物種的卵中；培養(yǎng)所述受體禽類物種，以便孵化；然后從所述受體禽類物種體內(nèi)收集所述供體禽類物種的精子。例如，所述供體禽類物種可以是鳴鶴，而所述受體禽類物種可以是沙丘鶴。在另一個(gè)例子中，所述供體禽類物種可以是火雞，而所述受體禽類物種可以是雞。
與哺乳動物不同，禽類的雄性是同配性別(ZZ)，而雌性是異配性別(Zw)。因此，在禽類中，是由雌性決定后代的性別，因?yàn)榇菩阅墚a(chǎn)生攜帶Z或w染色體的卵子。因此，正如下面所指出的，通過將雄性原生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移到雌性胚胎宿主內(nèi)，可以提高宿主所產(chǎn)生的具有Z卵子的百分比，并因此提高雄性后代的百分比。對于相應(yīng)的更高的飼料轉(zhuǎn)化比例，以及由此所獲得的更有效的肉類生產(chǎn)來說，提高肉雞種群中雄性后代的百分比，從經(jīng)濟(jì)上講是理想的。
因此，本發(fā)明的第二方面是一種提高由多枚禽卵孵化出的雄性禽類的數(shù)量的方法，包括以下步驟將雄性(ZZ)禽類原生殖細(xì)胞輸送到雌性禽類的卵中；培養(yǎng)所述雌性禽類，以便孵化；將所述雌性禽類飼養(yǎng)到性成熟；然后培育所述禽類，以便生產(chǎn)出多個(gè)可育的禽卵(由該禽所產(chǎn)生的雄性與雌性禽卵的比例，高于在沒有將所述雄性原生殖細(xì)胞輸送到禽的卵中時(shí)所獲得的雄性與雌性禽卵的比例)。通常，該方法還包括將多枚禽卵培養(yǎng)至孵化的步驟(由該多枚卵所產(chǎn)生的雄性與雌性禽的比例，高于在沒有將所述雄性原生殖細(xì)胞輸送到雌性禽的卵中時(shí)所獲得的雄性與雌性禽的比例)。所述雌性禽類可以是任何合適的物種，如雞或火雞，而所輸送的所述原生殖細(xì)胞，優(yōu)選來自與要輸送這種生殖細(xì)胞的雌性相同的物種。
在下面進(jìn)行的說明中將要對本發(fā)明的上述和其他目的和特征作詳細(xì)說明。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本文所使用的“禽類”或“禽類物種”是指任何禽類物種，包括，但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞和鴕鳥?？蓪⒍喾N其他物種的任意一種用于實(shí)施本發(fā)明，特別是將其用于保存諸如鳴鶴的瀕危物種(其中，受體物種應(yīng)當(dāng)是沙丘鶴)。
本文所使用的“卵”是指含有活的胚胎禽的禽卵。
本文所使用的“原生殖細(xì)胞”或“PGC”表示胚胎中大部分分化的二倍體細(xì)胞系，它最終會發(fā)育成單倍體配子(精子或卵子)。
“SSEA-1抗體”表示能專一性地結(jié)合時(shí)期專一性胚胎抗原1(SSEA-1)的抗體，優(yōu)選單克隆抗體(M.Buehr Exp.Cell Res.232，194-207，1997)。SSEA-1是由半乳糖β1→4巖藻糖α1→N乙酰葡糖胺鏈決定的糖類表位(H，Gooi等，Nature292，156-158，1981)。通過讓鼠骨髓瘤細(xì)胞與用來自F9畸胎癌細(xì)胞免疫過的小鼠的脾細(xì)胞融合，產(chǎn)生了SSEA-1的單克隆抗體(D.Solter and B.Knowles，Proc.Natl Acad.Sci.USA75，5565-5569，1978)。已知SSEA-1抗體是禽類免疫組織化學(xué)生殖細(xì)胞標(biāo)記(L.Karagenc et al.Dev.Genet.19，190-30l，1996)，優(yōu)選的是克隆MC480，它可以從開發(fā)研究雜交瘤庫獲得，衣阿華大學(xué)，衣阿華市，衣阿華，美國。
可以提供并配制本發(fā)明的原生殖細(xì)胞，以便通過任何合適的技術(shù)實(shí)施本發(fā)明，并且根據(jù)需要，在使用之前進(jìn)行保存、冷凍、培養(yǎng)等等。例如，可以在合適的胚胎階段，從供體胚胎中收集原生殖細(xì)胞(例如，參見V.Hamburger and H.L.Hamilton，A Series of Normal Stages in theDevelopment of the Chick，Journal of Morphology，88，49-92，1951，所述時(shí)期表示本文的H&H期，4期，或生殖新月細(xì)胞期，直到30期，細(xì)胞是從后一時(shí)期的血液或性腺中收集的)。一般，原生殖細(xì)胞的體積是體細(xì)胞的2倍，并很容易根據(jù)大小進(jìn)行區(qū)分和分離，可以通過任何合適的技術(shù)將雄性(或同配型)原生殖細(xì)胞(ZZ)與異配型原生殖細(xì)胞(Zw)加以區(qū)分，如從特定供體體內(nèi)收集生殖細(xì)胞，并對來自所述供體的其他細(xì)胞進(jìn)行分類，所收集的細(xì)胞的染色體類型與所述分類的細(xì)胞相同。通過分離細(xì)胞(例如，通過機(jī)械分離)，并將這些細(xì)胞與可以藥用的載體(例如，磷酸緩沖的鹽溶液)親密混合，制備用于輸送到動物體內(nèi)的細(xì)胞。所述原生殖細(xì)胞優(yōu)選性腺原生殖細(xì)胞或血液原生殖細(xì)胞(“性腺”或“血液”表示它在原始胚胎供體體內(nèi)的組織來源)，最優(yōu)選性腺原生殖細(xì)胞。所輸送的原生殖細(xì)胞可以是異配型的(Zw)或同配型的(ZZ)，這取決于輸送的特定目的。PGCs優(yōu)選用生理學(xué)可以接受的載體輸送，優(yōu)選pH為大約6-大約8或8.5，以合適的用量(例如，每個(gè)胚胎100-1000PGCs)輸送，以便獲得所需要的效果。輸送的PGCs可以不含其他成分或細(xì)胞，或者將其他細(xì)胞和成分與PGCs一起輸送。
可以在任何合適的時(shí)間，將所述原生殖細(xì)胞輸送到受體動物的卵內(nèi)，此時(shí)，PGCs仍然可以遷移到發(fā)育中的性腺中。一般，輸送優(yōu)選在胚胎發(fā)育的13或14期至18期(H&H)進(jìn)行，最優(yōu)選15期。對雞來說，輸送時(shí)間在胚胎發(fā)育的第1、2、3或4天，最優(yōu)選2-2.5天。通常，輸送是通過注射進(jìn)入任何的靶位點(diǎn)，如由羊膜(包括胚胎)、卵黃囊等所限定的區(qū)域。優(yōu)選注射到胚胎本身內(nèi)部(包括胚胎體壁)，特別優(yōu)選通過靜脈內(nèi)或體腔內(nèi)注射到胚胎中。本發(fā)明的方法可以在有或沒有事先對受體禽類卵進(jìn)行絕育的情況下進(jìn)行(“絕育”表示使得它基本上不能產(chǎn)生配子)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，原生殖細(xì)胞被方便地輸送到事先業(yè)已絕育的受體對象卵內(nèi)。在從所述受體中收集供體配子時(shí)，可以供體配子的混合物形式的收集，并且可以使用這種混合物，或者對該混合物進(jìn)行處理，以便提高其中供體配子的比例。
PGCs的輸送可以通過輸送PGCs本身進(jìn)行，或者通過輸送能在受體體內(nèi)發(fā)育成PGCs的前體細(xì)胞(特別是當(dāng)本發(fā)明被用于改變后代的性別比例時(shí))。例如，輸送可以通過用胚層細(xì)胞注射禽類完成，其中，所述胚層細(xì)胞能在所述禽類的體內(nèi)分化成原生殖細(xì)胞。
在用于生產(chǎn)并收集禽類配子(精子、卵子)時(shí)，將原生殖細(xì)胞輸送到受體物種的卵內(nèi)，所述受體物種與獲得PGCs的供體物種不同。然后培養(yǎng)所述受體至孵化，并飼養(yǎng)到性成熟，從所述受體動物體內(nèi)收集所述供體物種的精細(xì)胞或卵細(xì)胞，所有操作都是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的。例如，對于瀕危物種來說，所述供體禽類物種可以是鳴鶴，而所述受體禽類物種可以是沙丘鶴。在有關(guān)商業(yè)化家禽生產(chǎn)的另一個(gè)例子中，所述供體禽類物種可以是火雞，而所述受體禽類物種可以是雞。
在用于提高由一批卵中孵化出的雄性禽類的數(shù)量或比例時(shí)，本發(fā)明涉及將雄性禽類原生殖細(xì)胞輸送到雌性禽類的卵中?？梢灶A(yù)先確定或在孵化后確定所述卵內(nèi)的禽的性別。將所述禽類培養(yǎng)到孵化，如果必要的話，確定禽的性別，飼養(yǎng)到性成熟，并按照已知方法讓所述禽與合適的雄性種禽雜交進(jìn)行育種。然后收集由所述禽所產(chǎn)下的多枚可育的卵，并通常培養(yǎng)到孵化，然后讓所得到的禽生長至少2-3周。由所述雌禽所產(chǎn)生的雄性與雌性禽卵(或禽)的比例，高于在沒有將所述雄性原生殖細(xì)胞輸送到所述禽的卵內(nèi)時(shí)所獲得的雄性與雌性禽卵(或禽)的比例。所述方法通常被用于為了肉類生產(chǎn)而飼養(yǎng)的禽類物種上，如雞、火雞、鴨等。
卵內(nèi)輸送原生殖細(xì)胞可以通過任何合適的方法完成，可以通過手工方法或者是自動化方法進(jìn)行。優(yōu)選注射。卵內(nèi)輸送的機(jī)制不是關(guān)鍵的，但是，優(yōu)選不會過分損傷胚胎的組織和器官或者包圍它的胚胎外的膜的方法，以便所述處理不會過分降低孵化比例。裝有大約18-26號針頭的皮下注射器適用于這一目的。根據(jù)胚胎的準(zhǔn)確的發(fā)育時(shí)期和位置，1英寸的針頭將止于雞上部的體液中或止于雞本身內(nèi)。在插入針頭之前，可以在蛋殼上打或鉆一組孔，以免損壞或破壞針頭。如果需要，可以用諸如蠟之類的基本上是細(xì)菌不能滲透的密封材料密封所述卵，以便阻止不需要的細(xì)菌隨后進(jìn)入?？梢灶A(yù)料的是，用于禽類胚胎的高速注射系統(tǒng)，是特別適用于實(shí)施本發(fā)明的。現(xiàn)有多種這樣的裝置，例如，EMBREXINOVOJECTTM系統(tǒng)(披露于Hebrank的美國專利US4681063和4903625，以及Miller的美國專利US4040388；4469047和4593646中)。本文所引用的所有美國專利文獻(xiàn)的內(nèi)容都以全文形式收作本文參考。上述所有適用于實(shí)施本發(fā)明的裝置都包括一個(gè)裝有本文所披露的原生殖細(xì)胞制劑的注射器，將該注射器放置在能在由該裝置攜帶的卵的合適的位置進(jìn)行注射，如上文所述。另外，可以提供與注射裝置一起使用的密封裝置，以便在注射之后密封卵上的孔。
在下面的非限定實(shí)施例中對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明。
例1-8材料和方法例1質(zhì)粒分離和驗(yàn)證將M.Matzke博士所提供的轉(zhuǎn)化過的DH5α細(xì)胞劃線到含有抗生素氨芐青霉素(20微克/毫升)+甲氧西林(80微克/毫升)的LB平板上，并在37℃下生長一夜。挑選6個(gè)獨(dú)立的集落，并在含有上述抗生素的10毫升LB中生長一夜。采用Qiagen微量制備方法從以上6個(gè)不同集落中分離質(zhì)粒DNA。為了驗(yàn)證質(zhì)粒的身份，在2％的瓊脂糖凝膠上分離未消化過的質(zhì)粒、線性化的質(zhì)粒(EcoRI)和雙消化過的質(zhì)粒(EcoRI+HindIII)。隨后將所述6個(gè)集落中含有所述插入片段的2個(gè)用于大規(guī)模質(zhì)粒分離(Qiagen)。在2％的凝膠上分離未消化過的親本質(zhì)粒(PUC18)、未消化過的重組質(zhì)粒、線性化質(zhì)粒(EcoRI/HindIII/BamHI)和雙消化過的質(zhì)粒(EcoRI+HindIII和EcoRI+BamHI)，以便證實(shí)所分離質(zhì)粒的身份。
例2PCR標(biāo)記TM1探針根據(jù)其擴(kuò)增親本PUC18質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上的插入片段的能力，合成一對引物。這些引物是M13puc反向＝5’AAC AGC TAT GAC CAT G以及M13puc正向＝5’GTA AAA CGA CGG CCA GT。優(yōu)化的PCR混合物包括用Taq緩沖液(Idaho Tech)配制的3mM氯化鎂，0.5μM每一種引物，50納克DNA(TM1)環(huán)狀變性質(zhì)粒，5單位Taq聚合酶(Promega)，10微升PCR dig-標(biāo)記混合物(Boehringer Mannheim)。用無菌水將反應(yīng)物體積調(diào)整到100微升，PCR條件包括在96℃下開始變性5分鐘，然后進(jìn)行30輪以下的步驟變性(94℃)45秒，退火(50℃)55秒，然后在72℃下延伸60秒。所述PCR是在“微型循環(huán)儀”PTC150型(MJ研究公司，馬薩諸塞州)上進(jìn)行的。在擴(kuò)增之后，在2％的凝膠上對所有樣品進(jìn)行電泳。使用Qia快速凝膠提取試劑盒(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說明，將標(biāo)記過的插入片段從凝膠中洗脫出來。將所述探針在-20℃保存，并用于斑點(diǎn)吸印，并且用于原位雜交。在保存之前，按照Genius系統(tǒng)用戶濾膜雜交指南(Boehringer Mannheim)，估算DIG-標(biāo)記過的DNA的產(chǎn)量。
例3斑點(diǎn)印跡雜交為了驗(yàn)證TM1插入片段的精確性、靈敏度和專一度，對雄性和雌性火雞DNA(0-500納克)、雄性和雌性雞DNA(0-2微克)以及含有TM1插入片段的親本質(zhì)粒(10納克-1pg)的一系列稀釋液進(jìn)行變性，并斑點(diǎn)吸印到硝酸纖維素膜上。將所述印跡在80℃下烘烤1小時(shí)，然后用于雜交。用Engler-Blum方法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交(Anal Biochem.210235-244，1993)。在68℃下進(jìn)行雜交一夜；所使用的探針濃度為2.5納克cDNA探針/毫升。
在雜交和嚴(yán)格洗滌之后，將所述印跡放入洗滌緩沖液(0.1M馬來酸，0.15M氯化鈉，pH7.5)中。將所述膜放在封閉溶液(洗滌緩沖液+3％Tween20)中培養(yǎng)30分鐘，然后放入含有抗洋地黃毒苷堿性磷酸酶綴合物的封閉溶液中培養(yǎng)半小時(shí)。然后在洗滌緩沖液中將所述膜洗滌2次，隨后在檢測緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.1M氯化鈉，50mM氯化鎂，pH9.5)中培養(yǎng)。最后用化學(xué)發(fā)光底物CDP-STARTM檢測雜交(購自Boehringer Mannheim，德國)。用所述印跡對X光膠片曝光至少5分鐘。
例4火雞-雞種間胚胎種系嵌合體的生產(chǎn)在38.5℃下培養(yǎng)可育的火雞卵8-8.5天(27-28期H&H)。解剖胚胎，以便獲得性腺。將所述性腺收集在DMEM和10％FBS中，并通過讓它們從30號針頭中通過使其分散。在DMEM和10％FBS中培養(yǎng)所述細(xì)胞直到鋪滿(3-5天)?；|(zhì)細(xì)胞是分散的，并形成一個(gè)鋪滿層，而生殖細(xì)胞是與基質(zhì)細(xì)胞松散連接的。通過輕輕地移液收集生殖細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將存在于3-5微升培養(yǎng)基中的大約150-300個(gè)細(xì)胞注射到60或72小時(shí)大的雞胚胎的竇末端。然后在38.5℃下，在100毫米的培養(yǎng)皿中或者在它自身的蛋殼中將所述胚胎培養(yǎng)2-5天。在培養(yǎng)之后，從所述胚胎中分離DNA(n＝18)，并用于通過dig-標(biāo)記過的探針TM1進(jìn)行斑點(diǎn)印跡分析。
例5原位雜交在石蠟切片和低溫切片上進(jìn)行原位雜交。該方法以Rolighed和Lindeberg的方法為基礎(chǔ)(參見J.Rolighed，Detection of HPV II DNA inparaffin-embedded laryngeal tissue with a DIG-laberled DNA probe.In Non-radioactive In Situ Hybridization Application Manual Boehringer MannheimSecond Edition，pp122-125，1996)，進(jìn)行了某些改進(jìn)。
石蠟切片在相應(yīng)的時(shí)期，從火雞胚胎(9天)和雞胚胎中分離性腺，在4％的低聚甲醛中，在4℃下固定一夜。在PBS中洗滌性腺3次，共90分鐘。脫水，包埋在石蠟中，并且切片(10微米)。將切片收集在Probe-OnPlusTM載玻片(Fisher Scientific)上，在60℃下烘烤所述切片30分鐘，在二甲苯中脫蠟，并通過梯度乙醇系列(99％-水)進(jìn)行再水合。在TES(50mM Tris-HCl，pH7.4，10mMEDTA和10mM氯化鈉)中，在37℃和室溫下，用蛋白酶K(50微克/毫升和100微克/毫升)處理所述切片12-25分鐘。
低溫切片在4℃下，在用PBS配制的4％的低聚甲醛中將8.5天的火雞胚胎的軀干部分固定一夜。在37℃下，將TES中蛋白酶K的濃度在0-45微克/毫升的濃度范圍內(nèi)加以改變，并培養(yǎng)10、15或20分鐘。對于所述胚胎組織來說，在37℃下，用0.67微克/毫升和1.25微克/毫升的量培養(yǎng)15分鐘是最佳的蛋白水解處理。
制備探針/盲試混合物探針混合物含有10微升50倍Dendhart’s溶液，50微升硫酸葡聚糖(50％)，10微升桂魚精子DNA(9.4毫克/毫升)，100微升20倍SSC，500納克洋地黃毒苷標(biāo)記過的TM1探針，并添加蒸餾水到250微升的最終體積。最后將250微升甲酰胺加入該混合物。盲試混合物含有除標(biāo)記過的TM1探針以外的所有上述成分。通過渦旋攪拌混合所述混合物，并在-20℃下保存。
雜交在蛋白水解消化之后，將石蠟切片和低溫切片放在0.4％低聚甲醛中，在4℃下固定5分鐘。然后用蒸餾水洗滌所述切片(5分鐘)，并且風(fēng)干。然后將10或15微升探針混合物或盲試混合物(負(fù)對照)添加到每一種切片上。將硅氧烷化的蓋玻片蓋在所述切片上，然后在95℃下變性6分鐘。將所述載玻片在冰上放置1分鐘，并放入42℃的潮濕培養(yǎng)箱中16-20小時(shí)。對雜交的嚴(yán)格洗滌和檢測與Rolighed和Lindeberg所披露的方法類似(參見上文)，所不同的是，將便于制備的堿性磷酸酶底物NBT/BCIP(Amresco)用于檢測雜交。在檢測之后，用洋紅水溶液對載玻片進(jìn)行負(fù)染數(shù)秒鐘，并洗滌。將樣品安裝在水安裝介質(zhì)中，該介質(zhì)是通過將10克明膠溶解在60毫升溫度為70-80℃的水中而制備成的，向里面添加70毫升甘油和1毫升苯酚。
例6生產(chǎn)雞-火雞種間胚胎嵌合體將Barred Rock雞的胚胎培養(yǎng)到23-25期(H&H)。將來自10個(gè)胚胎的生殖線連同某些相鄰的組織一起收集到補(bǔ)充了10％SDS、谷氨酰胺、抗生素和抗真菌溶液的DMEM中。然后用PBS洗滌2次，并在37℃下，在0.02％EDTA中培養(yǎng)15分鐘。添加新的培養(yǎng)基，并用針頭剔所述生殖線。將所有細(xì)胞懸浮液收集到15毫升的試管中，并讓細(xì)胞團(tuán)沉淀2分鐘。收集細(xì)胞懸浮液，并以1500rpm的速度離心5分鐘。更換培養(yǎng)基，并且用臺盼蘭排除法確定細(xì)胞的生活力。取出所述細(xì)胞懸浮液的樣品并用SSEA-1抗體染色，以便測定注射的生殖細(xì)胞的數(shù)量。將含有25-30PGCs的大約5微升細(xì)胞懸浮液(PGCs在細(xì)胞懸浮液中的百分比大約為3.2％)注射到處在13-14發(fā)育期(H&H)的每一只Nicholas火雞胚胎(n＝10)的血管中。在37.5℃下，在用塑料密封膜覆蓋的玻璃培養(yǎng)皿中培養(yǎng)所述胚胎直到21-25期。在4℃下，在4％的低聚甲醛中，將受體胚胎的整個(gè)軀干部分固定一夜，用PBS洗滌3次，共90分鐘，包埋在明膠/蔗糖中，冷凍并切片。
火雞性腺PGCs是SSEA-1陰性的，而雞性腺PGCs是SSEA-1陽性的，可以用抗SSEA-1的抗體鑒定供體雞PDCs向所述胚胎種系嵌合體中的轉(zhuǎn)移。
例7生產(chǎn)火雞-雞種間胚胎種系嵌合體在38.5℃下將受精的火雞卵培養(yǎng)8-8.5天(27-28期，H&H)，解剖胚胎，以便獲得性腺。將性腺收集到PBS中，并在37℃下，在0.02％EDTA中培養(yǎng)12分鐘。添加新的培養(yǎng)基，并用針頭輕輕地挑所述生殖線。收集所有的細(xì)胞懸浮液，并以1500rpm的速度離心5分鐘。更換培養(yǎng)基，并測定細(xì)胞生活力。在37℃下，將所有細(xì)胞懸浮液預(yù)鋪在DMEM+10％FBS中培養(yǎng)6-7小時(shí)。在培養(yǎng)之后，輕輕地收集未附著的細(xì)胞，并離心。然后將含有大約150PGCs的2-3微升細(xì)胞懸浮液注射到14期(H&H)雞胚胎的血管中。密封所述受體卵，并在37.5℃下培養(yǎng)。在從19期到25期的不同培養(yǎng)時(shí)期收集受體胚胎。在PBS中漂洗所述胚胎3次，然后在4℃下，在4％的低聚甲醛中固定一夜。用PBS洗滌3次；總的洗滌時(shí)間根據(jù)胚胎的厚度而不同。將所述胚胎放入50％的乙醇中，并包埋在石蠟中。將切片脫蠟，再水合，并用PBS漂洗。
用于雙染色技術(shù)的對照(參見下文)是2個(gè)26期的雞胚胎和2個(gè)24期的火雞胚胎的橫向切片。對雞性腺區(qū)的42個(gè)切片和火雞性腺區(qū)的所有系列的切片進(jìn)行染色。
一共對8個(gè)受體雞胚胎進(jìn)行連續(xù)切片。8個(gè)胚胎中的5個(gè)是在19和20期固定的。2個(gè)胚胎是在22和23期固定的。最后一個(gè)胚胎是在25期固定的。將19和20期切片的大部分用于雙染色。只對22、23和25期胚胎的間隔的切片進(jìn)行雙染色。
例8用SSEA-1抗體和PAS染料進(jìn)行雙染色用Vectastain ABC-AP試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，California)進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。用PBS漂洗切片3次，共30分鐘。然后再用PBS配制的1.5％山羊血清中封閉20分鐘，以便消除非專一性結(jié)合。然后在抗SSEA-1的一級單克隆抗體中培養(yǎng)1小時(shí)(從發(fā)育研究雜交瘤庫獲得的克隆MC480，衣阿華大學(xué)，衣阿華市，衣阿華)，用PBS漂洗之后，在生物素化的二級抗體中培養(yǎng)胚胎切片(30分鐘)，然后用PBS漂洗，并在Vectastain ABC-AP試劑中培養(yǎng)(30分鐘)。最后用PBS洗滌，然后用堿性磷酸酶底物NBT/BCIP(Amresco，Solon，Ohio)染色20分鐘。
在免疫組織化學(xué)染色之后，用自來水漂洗所述切片，并放入高碘酸中6分鐘。然后用水漂洗切片10分鐘，并用Schiff試劑染色15分鐘。在用自來水漂洗之后，將所述切片安裝到水安裝介質(zhì)中。
例9-15結(jié)果Matzke等(Chromosoma1029-14，1992)業(yè)已鑒定了一種重復(fù)的DNA序列，該序列在火雞微染色體上比較豐富。這是一種41bp的重復(fù)因子，占基因組的5％(在一個(gè)細(xì)胞的二倍體基因組中大約有2.2×106個(gè)拷貝)。因此，將這種物種專一性DNA序列用于DNA-DNA雜交，以便檢驗(yàn)它是否能夠用于鑒定雞胚胎中的火雞DNA。
例9質(zhì)粒分離和驗(yàn)證根據(jù)凝膠電泳分析，親本質(zhì)粒puc18為2.69kb，而從Matzke博士那里獲得的線性質(zhì)粒為大約2.8kb長。對來自2號和5號集落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙消化，釋放出一種大約0.15-0.17kb的插入片段。這證實(shí)了送給我們的轉(zhuǎn)化過的H5細(xì)胞含有合適的重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有TM1片段(149kb)，該片段包括3個(gè)拷貝的火雞專一性的41bp的重復(fù)。
例10TM1探針的PCR標(biāo)記將環(huán)狀質(zhì)粒DNA與洋地黃毒苷-標(biāo)記過的核苷酸一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致了大約0.19-0.20kb的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。與插入片段(0.15-0.17kb)相比，擴(kuò)增產(chǎn)物大小的增加可能是由于整合了多個(gè)DIG標(biāo)記過的核苷酸。然后將PCR標(biāo)記過的探針用于斑點(diǎn)吸印雜交實(shí)驗(yàn)和DNA-DNA原位雜交。
例11斑點(diǎn)印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交的結(jié)果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)表明，所述探針以相同的強(qiáng)度結(jié)合雄性和雌性火雞DNA樣品，因此，證實(shí)了該探針不是性別專一性的。用火雞DNA的從500納克到0納克的一系列火雞DNA稀釋液進(jìn)行雜交。所述探針能檢測低到0.30納克的火雞DNA。與0-2微克雄性和雌性雞DNA的雜交證實(shí)，該探針是物種專一性的，并且它不能與雞DNA結(jié)合。將不同濃度的火雞DNA(10-0納克)與0-2微克雞DNA混合。用該DNA混合物進(jìn)行的雜交證實(shí)，在1微克雞DNA中可以檢測出少到1.25納克的雞DNA。
例12生產(chǎn)火雞-雞種間胚胎種系嵌合體用上述斑點(diǎn)印跡雜交方法不能檢測到火雞-雞種間胚胎種系嵌合體。不能檢測嵌合體，可能是因?yàn)橐环N會阻止火雞性腺PGCs向雞性腺轉(zhuǎn)移的內(nèi)在的生物學(xué)屏障。還可能是由于技術(shù)問題，即該方法(斑點(diǎn)印跡雜交)還沒有靈敏到可以在雞性腺中鑒定少數(shù)幾個(gè)供體生殖細(xì)胞的程度，后一種原因似乎更有可能；因此，進(jìn)行了開發(fā)一種更靈敏的技術(shù)的嘗試，即通過原位雜交來定位受體中的供體PGCs。
例13火雞切片的原位雜交分析理論上講，原位標(biāo)記系統(tǒng)是一種用于鑒定嵌合體中供體(火雞)細(xì)胞的合適的標(biāo)記。由于所述標(biāo)記位于細(xì)胞核內(nèi)，它是普遍存在的，并且不會泄露到其他細(xì)胞中，或者影響受體胚胎的發(fā)育。在本研究中，TM1序列能選擇性地結(jié)合火雞細(xì)胞核中的DNA(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在雞細(xì)胞中(數(shù)據(jù)未發(fā)表)或者是在與盲試混合物一起培養(yǎng)的切片中(數(shù)據(jù)未發(fā)表)都沒有檢測到陽性信號，這表明所述探針是位點(diǎn)專一性的，并且沒有非專一性信號。理想的是，在火雞胚胎的陽性對照切片中，每一個(gè)細(xì)胞核都是陽性染色的。不過，只有很小百分比的細(xì)胞是陽性染色的(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。另外，在相同的切片上，在相同的消化條件下，不同細(xì)胞群體之間的信號強(qiáng)度有所不同。這表明該技術(shù)存在著假陰性。假陰性百分比的降低，可以通過減弱嚴(yán)格條件而實(shí)現(xiàn)。不過，這樣一來又會導(dǎo)致假陽性。在胚胎種系嵌合體中，所述供體細(xì)胞只占總的胚胎切片或細(xì)胞的很小的百分比。另外，該標(biāo)記系統(tǒng)只能鑒定少數(shù)的陽性火雞細(xì)胞。因此，用TM1探針進(jìn)行的原位雜交不是鑒定嵌合體的有效方法。
例14
用SSEA-1染色鑒定雞-火雞種間胚胎嵌合體為了證實(shí)該方法沒有技術(shù)問題，通過靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移雞性腺生殖細(xì)胞，生產(chǎn)了雞-火雞種間種系嵌合體。由于在雞和火雞性腺PGCs上的SSEA-1抗原的表達(dá)存在物種差異，推測SSEA-1抗體可以用于鑒定雞-火雞胚胎種系嵌合體。對存活的5個(gè)胚胎中的4個(gè)進(jìn)行低溫切片。在這4個(gè)胚胎中的一個(gè)里面，在火雞胚胎的背隔膜中鑒定了19個(gè)SSEA-1陽性細(xì)胞(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，在火雞生殖腺中鑒定了SSEA-1標(biāo)記過的雞生殖細(xì)胞(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在第二個(gè)胚胎中，在所述性腺附近鑒定了2個(gè)SSEA-1陽性細(xì)胞。在其余2個(gè)胚胎中，沒有鑒定到供體PGCs。
根據(jù)以上結(jié)果，來自5天大的雞胚胎的性腺PGCs(PGCs是SSEA-1陽性的時(shí)期)，在通過靜脈內(nèi)途徑注射到13期火雞胚胎中時(shí)，不能夠再次轉(zhuǎn)移，使寄居在所述性腺上，并產(chǎn)生種系嵌合體。因此，由火雞性腺所產(chǎn)生的趨化物似乎不是物種專一性的。還驗(yàn)證了雞性腺PGCs保留了遷移的能力，即使是在它們已經(jīng)寄居到性腺上之后也是這樣。在本研究，種系嵌合體的較低的效率可能是由于在注射的細(xì)胞懸浮液中有較少數(shù)量的供體PGCs。
例15用SSEA-1和PAS染色鑒定火雞-雞種間胚胎嵌合體以前的研究業(yè)已通過火雞和雞PGCs證實(shí)了SSEA-1表達(dá)的種間差異。這種與標(biāo)準(zhǔn)PAS測試聯(lián)系在一起的抗原性波動，有可能被用于鑒定火雞-雞種系嵌合體。觀察雙染色的雞胚胎切片證實(shí)，雞PGCs是PAS陽性和SSEA-1陽性的(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在雞對照切片中沒有觀察到PAS陽性、SSEA-1陰性生殖細(xì)胞。用PAS和SSEA-1對24期火雞切片進(jìn)行雙染色證實(shí)了火雞PGCs能通過背隔膜轉(zhuǎn)移，并且寄居的性腺是PAS陽性的，而且不能表達(dá)SSEA-1表位(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。因此，對雞和火雞胚胎進(jìn)行的雙染色證實(shí)了所述雙染色技術(shù)可以用作在雞性腺中鑒定火雞生殖細(xì)胞的標(biāo)記。使用SSEA-1抗體和標(biāo)準(zhǔn)PAS染色，在8個(gè)受體雞胚胎中檢測到了4個(gè)種系嵌合體(表1)。將火雞PGCs注射到雞胚胎的血管中大約24小時(shí)之后，在雞胚胎中鑒定了SSEA-1陰性和PAS陽性火雞生殖細(xì)胞。在增厚的體腔上皮細(xì)胞中鑒定了火雞PGCs和雞PGCS(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。所述上皮位于體腔角和中腎之間，是將來性腺的部位。在較大的胚胎(22和23期)中，在兩個(gè)受體雞胚胎中都觀察到了供體火雞PGCs，某些生殖細(xì)胞位于背隔膜中(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，其他的生殖細(xì)胞業(yè)已進(jìn)一步轉(zhuǎn)移，并且寄居在雞的性腺上(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。通過雙染色技術(shù)分析潛在的嵌合體，證實(shí)了火雞性腺PGCs可被用于生產(chǎn)種間嵌合體。表1.生產(chǎn)火雞-雞胚胎種系嵌合體
盡管DNA-DNA雜交是物種專一性的，該方法不能檢測嵌合體。所述斑點(diǎn)印跡雜交方法還沒有靈敏到足以鑒定供體PGCs的程度，而原位雜交方法具有與之相關(guān)的高百分比的假陽性。所述雙染色方法似乎是鑒定火雞-雞嵌合體的成功的途徑。根據(jù)上述結(jié)果，來自雞和火雞胚胎的性腺PGCs在通過靜脈內(nèi)途徑注射時(shí)，可以再次遷移到性腺，并產(chǎn)生種系嵌合體。因此，由禽類性腺所產(chǎn)生的趨化物不是物種專一性的。還證實(shí)了即使是在寄居到性腺上之后，性腺PGCs還保留了其遷移的能力。
所述火雞-雞嵌合體的生產(chǎn)方法具有廣泛用途。雄性火雞PGCs的轉(zhuǎn)移可用于雞性腺的火雞精子發(fā)生。這樣可以加速精子發(fā)生，因?yàn)樵陔u體內(nèi)產(chǎn)生精子所需要的時(shí)間是18周，而在火雞體內(nèi)產(chǎn)生精子所需要的時(shí)間是30-32周。培養(yǎng)PGCs并生產(chǎn)種系嵌合體的能力，可以減少目前生產(chǎn)后代所需要的優(yōu)良火雞種雞的數(shù)量。用較小的和較便宜的禽類生產(chǎn)火雞精子的能力，也有利于家禽行業(yè)。
所述實(shí)驗(yàn)嵌合體還提供了一種研究生殖細(xì)胞和不同基因型的體細(xì)胞之間相互作用的模式，從而有可能了解它的相鄰的細(xì)胞是否會對生殖細(xì)胞的特征產(chǎn)生任何影響。該技術(shù)還可被用于將產(chǎn)卵率低的物種的PGCs轉(zhuǎn)移到產(chǎn)卵率較高的禽類體內(nèi)，并用于在出現(xiàn)意外死亡或疾病的情況下，或在天然交配條件下瀕臨滅絕的情況下保存PGCs(A.Tajima et al.，Theriogenology 40509-519，1993)。
以上是本發(fā)明的說明，而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明是由以下權(quán)利要求書限定的，還包括這些權(quán)利要求書的等同內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)和收集禽類精子的方法，包括以下步驟由供體禽類物種提供原生殖細(xì)胞；將所述原生殖細(xì)胞輸送到受體禽類物種的卵中，其中所述受體禽類物種與供體禽類物種是不同種；培養(yǎng)所述受體禽類物種，以便孵化；將所述受體禽類物種飼養(yǎng)到性成熟；和然后從所述受體禽類物種體內(nèi)收集所述供體禽類物種的精子。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述供體禽類物種是鳴鶴。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述受體禽類物種是沙丘鶴。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述供體禽類物種是火雞。
5.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述受體禽類物種是雞。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述輸送步驟是通過卵內(nèi)注射而實(shí)現(xiàn)的。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述原生殖細(xì)胞選自性腺原生殖細(xì)胞和血液原生殖細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述輸送步驟是在胚胎發(fā)育的13-18期進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述原生殖細(xì)胞具有一對雄性決定(Z)染色體。
10.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述原生殖細(xì)胞具有一個(gè)雌性決定(w)染色體。
11.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述輸送步驟是在不事先對所述禽類的卵進(jìn)行絕育的情況下進(jìn)行的。
12.一種提高由多枚禽卵孵化出的雄性禽類的數(shù)量的方法，包括以下步驟將雄性(ZZ)禽類原生殖細(xì)胞輸送到雌性禽類的卵中；培養(yǎng)所述雌性禽類，以便孵化；將所述雌性禽類飼養(yǎng)到性成熟；和然后培育所述禽類，以便生產(chǎn)出多個(gè)可育的禽卵；由該禽所產(chǎn)生的雄性與雌性禽卵的比例，高于在沒有將所述雄性原生殖細(xì)胞輸送到禽的卵中時(shí)所獲得的雄性與雌性禽卵的比例。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述原生殖細(xì)胞與所述雌性禽類屬于同一物種。
14.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述雌性禽類是雞。
15.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述雌性禽類是火雞。
16.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述輸送步驟是通過卵內(nèi)注射而實(shí)現(xiàn)的。
17.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述原生殖細(xì)胞選自性腺原生殖細(xì)胞和血液原生殖細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述輸送步驟是在胚胎發(fā)育的13-18期進(jìn)行的。
19.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述輸送步驟是在不事先對所述雌性禽類的卵進(jìn)行絕育的情況下進(jìn)行的。
20.如權(quán)利要求12的方法，其中，還包括將多枚禽卵培養(yǎng)至孵化的步驟；由該多枚卵所產(chǎn)生的雄性與雌性禽的比例，高于在沒有將所述雄性原生殖細(xì)胞輸送到雌性禽的卵中時(shí)所獲得的雄性與雌性禽的比例。
21.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述輸送步驟是通過用原生殖細(xì)胞注射所述禽類而實(shí)現(xiàn)的。
22.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述輸送步驟是通過用胚層細(xì)胞注射所述禽類而實(shí)現(xiàn)的，并且，其中，所述胚層細(xì)胞在所述禽類的體內(nèi)分化成原生殖細(xì)胞。
全文摘要
一種用于生產(chǎn)和收集禽類精子的方法，包括以下步驟由供體禽類物種提供原生殖細(xì)胞；將所述原生殖細(xì)胞輸送到受體禽類物種的卵中；培養(yǎng)所述受體禽類物種，以便孵化；然后，從所述受體禽類物種體內(nèi)收集所述供體禽類物種的精子。例如，所述供體禽類物種可以是鳴鶴，而所述受體禽類物種可以是沙丘鶴。在另一個(gè)例子中，所述供體禽類物種可以是火雞，而所述受體禽類物種可以是雞。
文檔編號A01K45/00GK1419409SQ01806931
公開日2003年5月21日 申請日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月23日
發(fā)明者S·L·帕迪, J·N·佩蒂特, S·德科斯塔 申請人:北卡羅萊納州立大學(xué)