專利名稱：用氯硫尼定處理玉米種子的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考本申請是2000年10月6日提交的美國臨時專利申請登記號No.60/238,405的非臨時申請，并且要求了它的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
(1)發(fā)明領(lǐng)域一般來說，本發(fā)明涉及防治通過攝食活動引起對玉米植物損害的害蟲，特別是涉及通過具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子和在播種之前用氯硫尼定(clothianidin)殺蟲劑處理這樣的種子的聯(lián)合來防治這樣的玉米植物害蟲。
相關(guān)領(lǐng)域的描述昆蟲和有關(guān)節(jié)肢動物每年都在美國破壞估計15％的農(nóng)作物，在發(fā)展中國家更甚。另外，競爭性雜草和寄生和腐生植物帶來更大的產(chǎn)量降低。
當(dāng)植物病原體，昆蟲和其他這樣的土壤生害蟲在播種之后損害種子時就發(fā)生一些這樣的損傷。在玉米生產(chǎn)中，其他大部分損害由以植物根部為食或者損害植物根部的昆蟲害蟲即根部蠕蟲引起；或者由切根蟲，歐洲玉米鉆孔蟲，和以植物的地上部分為食或者損害植物的地上部分的其他害蟲引起。害蟲對農(nóng)作物損害的類型和機(jī)理的一般性描述參見，例如Metcalf，Destructive and Useful Insects，(1962)；和Agrios，Plant Pathology，第三版，Academic Press(1988)。
玉米是美國中西部最重要的谷類作物。該地區(qū)最嚴(yán)重的玉米昆蟲害蟲是葉甲(Diabrotica)甲蟲三個種的幼蟲形式。包括西部玉米根蠕蟲，玉米幼芽根葉甲(Diabrotica vergifera vergiferaLeConte)，北部玉米根蠕蟲，Diabrotica berberi Smith和Diabrotica berberi Lawrence，和南部玉米根蠕蟲，十一星瓜葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)。事實上，與對于任何其他玉米害蟲相比有更多的殺蟲劑被用于防治玉米根蠕蟲，被處理的土地總面積大于在美國對于所有其他害蟲處理的面積。
玉米根蠕蟲(CRW)在蟲卵期在前一季生長過玉米的大田中過冬。從5月底至6月卵孵化。如果不在播種玉米作物的下一年接著播種另一批玉米作物，那么幼蟲會死亡，因此，在系統(tǒng)播種一茬又一茬玉米的大田里最直接發(fā)現(xiàn)玉米根蠕蟲的損害，這在美國中西部很典型。
孵化之后，幼蟲經(jīng)過三個幼蟲或齡蟲期，期間它們以玉米根系為食。幼蟲期的完成需要大約三個星期。幼蟲攝食引起的對玉米根系的損傷是玉米由于玉米根蠕蟲導(dǎo)致的收量減少的主要原因。根系主要部分疲軟或遭破壞之后大田中倒伏的玉米植物是損失主要部分的致因，因為該倒伏的玉米不能通過常規(guī)機(jī)械化機(jī)器收獲因此留在大田中。
幼蟲發(fā)育完成之后，幼蟲轉(zhuǎn)化為不動的蛹，并且從那以后轉(zhuǎn)化為成體甲蟲，整個夏天不斷從土壤中出現(xiàn)，出現(xiàn)時間取決于成長地點。出現(xiàn)之后，成體甲蟲在雌性開始產(chǎn)卵之前攝食大約兩周。最初，成蟲主要以它們出現(xiàn)的那塊地為食，但是隨后會遷移到其他大田中。成蟲最大活性一般在7月底或8月初發(fā)生在美國玉米地帶中連續(xù)種植玉米的大田中，但是可能在第一年較晚時候或者晚熟玉米大田中活性達(dá)到最大。在它們出現(xiàn)大約兩星期之后在玉米大田中根蠕蟲甲蟲開始產(chǎn)卵。(更多信息參見，例如，Corn Rootworms，F(xiàn)ield Crops Pest ManagementCircu1ar#16，Ohio Pest Management&Survey Program，The OhioState university，Extension Division，Columbus，Ohio；在www.ag.ohio—state.edu/ hioline/icm-fact/fc-16.html可在線獲得，2000年9月13日；和McGahen等，Corn Insect ControlCornRootworm，PEN頁數(shù)08801502，從Pennsylvania State University，State College，PA，1989可以獲得字幕)。
在目前常規(guī)農(nóng)業(yè)操作中，在玉米接玉米的情況下，施用殺蟲劑來保護(hù)玉米根系使得不受根蠕蟲幼蟲的嚴(yán)重攝食是正常的。傳統(tǒng)操作是處理成體甲蟲或者處理幼蟲。用于成體甲蟲的常規(guī)處理制劑包括用甲萘威殺蟲劑(例如，SEVIN80S，1.0-2.0lbs活性成分/英畝)；氰戊菊酯或S-氰戊菊酯(例如，PYDRIN2.4EC，0.1至0.2lbs活性成分/英畝，或者ASANA0.66EC，0.03至0.05lbs活性成分/英畝)；馬拉硫磷(57％E，0.9lbs活性成分/英畝)；芐氯菊酯(例如，AMBUSH，2.0EC，0.1至0.2lbs活性成分/英畝，或者POUNCE3.2EC，0.1至0.2lbs活性成分/英畝)或者PENNCAP-M，0.25-0.5lbs活性成分/英畝。
為了防治CRW幼蟲，常規(guī)操作是在種植之時或者之后施用土壤殺蟲劑，但是優(yōu)選盡可能接近卵孵化期。常規(guī)處理包括克百威殺蟲劑(例如，F(xiàn)URADAN15G，8oz/1000英尺行)；毒死蜱(例如，LORSBAN15G，8oz/1000英尺行)；地蟲硫磷(例如，DYFONATE，20G，4.5-6.0oz/1000英尺行)；甲拌磷(例如，THIMET，20G，6oz/1000英尺行)；特丁磷(例如，COUNTER，15G，8oz/1000英尺行)；七氟菊酯(例如，F(xiàn)ORCE，3G，4-5oz/1000英尺行)。
已知上面列出的化學(xué)殺蟲劑中很多一般對人體和對動物有害。這些殺蟲劑引起的環(huán)境污染經(jīng)常由于通過對葉子噴霧或者直接對土壤表面施用來使用殺蟲劑而更加惡化。隨風(fēng)漂移，浸析，和徑流能夠引起殺蟲劑大部分遷移出期望的作用地帶并且進(jìn)入表面水和直接接觸鳥類，動物和人。
因為關(guān)注化學(xué)殺蟲劑對公共健康和環(huán)境健康的影響，人們盡了很大努力來尋找減少使用化學(xué)殺蟲劑量的途徑。最近，這樣的努力有很多集中在開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物，這些作物經(jīng)工程處理而表達(dá)來自微生物的昆蟲毒素。例如，美國專利No.5,877,012，Estruch等，公開了在植物中克隆和表達(dá)來自芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，棍狀桿菌屬和根瘤菌等微生物的蛋白質(zhì)，獲得對黑切根蟲，粘蟲，一些鉆孔蟲和其他昆蟲害蟲有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。Privalle等公開的WO/EP97/07089教導(dǎo)了用編碼過氧化物酶的重組DNA序列轉(zhuǎn)化單子葉植物例如玉米來保護(hù)植株不受玉米鉆孔蟲、螟蛉和切根蟲的攝食。Jansens等，Crop Sci.，37(5)1616-1624(1997)，報道了包含編碼來自蘇云金芽孢桿菌(Bt)的晶體蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因玉米的生產(chǎn)，所述晶體蛋白防止歐洲玉米鉆孔蟲的產(chǎn)生。Koziel等人的美國專利No.5,625,136和5,859,336報道用來自蘇云金芽孢桿菌的編碼δ-內(nèi)毒素的基因轉(zhuǎn)化玉米，得到對歐洲玉米鉆孔蟲有改良的抗性的轉(zhuǎn)基因玉米。Armstrong等人，CropScience，35(2)550-557(1995)中提供了表達(dá)來自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米大田試驗的綜合報道。
已知野生型Btδ-內(nèi)毒素具有低的抗鞘翅目昆蟲活性，Kreig等，1983，報道第一次分離鞘翅目-毒性蘇云金芽孢桿菌菌株。(參見美國專利No.4,766,203)。美國專利No.4,797,279和4,910,016還公開了產(chǎn)生具有一定鞘翅目活性的蛋白質(zhì)的野生型和雜交蘇云金芽孢桿菌菌株。然而更近些時候，更精確的遺傳工程方法顯示有希望開發(fā)修飾的蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)，其具有比野生型親代產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的玉米根蠕蟲活性高得多水平的玉米根蠕蟲活性。(參見，例如，WO 99/31248，Ecogen，Inc.and Monsanto Company)。
但是，迄今為止還不知道在嚴(yán)重侵染的連續(xù)種植玉米的大田中是不是任何單獨的轉(zhuǎn)基因事件足夠有效來保護(hù)玉米不受玉米根蠕蟲的損害。事實上，并不長期期望任何一種轉(zhuǎn)基因事件全部防治玉米根蠕蟲損害，因為有可能產(chǎn)生目標(biāo)害蟲的抗性株。
另一種殺蟲劑應(yīng)用的常規(guī)形式是用殺蟲劑處理植物種子。有時使用殺真菌劑保護(hù)種子播種之后不受損害，使用低水平的殺蟲劑例如保護(hù)玉米種子不受金針蟲的損害已經(jīng)應(yīng)用了一段時間了。用殺蟲劑處理種子是有好處的，提供了對種子的保護(hù)，同時減少了需要的殺蟲劑的量，并且限制了接觸殺蟲劑的量和需要的不同大田施用的數(shù)目。
例如美國專利No.5,696,144提供了對植物種子直接施用殺蟲劑防治害蟲的一個例子，它公開了與從未處理種子生長的對照植物相比，以每公擔(dān)種子500克的比例用1-芳基吡唑處理的種子長成玉米植株較小受到歐洲玉米鉆孔蟲的攝食損害。另外，Turnblad等人的美國專利No.5,876,739(及其母專利美國專利No.5,849,320)公開了防治土壤生昆蟲的方法，包括用含有一種或幾種聚合物粘合劑和一種殺蟲劑的包衣處理種子。該篇文獻(xiàn)提供了鑒定為可以用于這種包衣的候選的殺蟲劑名單，還有很多可能的目標(biāo)昆蟲名單。母專利美國專利No.5,876,739闡明用含有特殊殺蟲劑的包衣處理玉米種子保護(hù)玉米根系不受玉米根蠕蟲的損害，但是它并沒有指明或者提示這樣的處理用于具有轉(zhuǎn)基因事件的種子。
有人提出過用硝基亞氨化合物或硝基胍化合物殺蟲劑處理具有轉(zhuǎn)基因事件的種子(參見，例如，WO 99/35913)，但是，沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)這樣的處理的潛在應(yīng)用或有效性的指示，或者有關(guān)這樣的處理如何實現(xiàn)等方面的詳細(xì)描述-例如每單位量的種子需要的活性成分的量，并且沒有給出使人相信提出的處理方法實際上提供合適的保護(hù)作用的證據(jù)的因此，盡管近來植物遺傳工程的發(fā)展提高了保護(hù)植株不受害蟲損害的能力而且不用使用化學(xué)殺蟲劑，并且與用殺蟲劑處理種子這樣的技術(shù)相比減少了殺蟲劑對環(huán)境的有害作用，還存在很多問題限制實際大田條件下成功施用這些方法。因此，提供改進(jìn)的保護(hù)植株的方法，特別是保護(hù)玉米植株不受害蟲攝食損害的方法是有用的。如果這樣的方法減少需要的常規(guī)化學(xué)殺蟲劑的施用比例，以及如果其限制對于作物播種和耕作所要求的獨立的大田操作的數(shù)目，將是特別用有的。
發(fā)明概述因此簡要地說，本發(fā)明涉及保護(hù)轉(zhuǎn)基因玉米植物不受一種或多種害蟲攝食損害的一種新的方法，該方法包括提供轉(zhuǎn)基因玉米植物種子，其中所述種子包括具有抵抗一種或多種害蟲中的至少一種害蟲的活性的轉(zhuǎn)基因事件；和用有效量氯硫尼定殺蟲劑處理種子。
本發(fā)明還涉及用以下方法處理的新的轉(zhuǎn)基因玉米植物種子提供轉(zhuǎn)基因玉米植物種子，其中所述種子包括具有抵抗一種或多種害蟲中的至少一種害蟲的活性的轉(zhuǎn)基因事件；和用有效量氯硫尼定殺蟲劑處理種子。
本發(fā)明還涉及新的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其提供了獲得的玉米植物抵抗一種或多種害蟲攝食損害的提高的抗性，包括具有抵抗一種或多種害蟲中的至少一種害蟲的活性的轉(zhuǎn)基因事件，該種子用有效量氯硫尼定處理過。
發(fā)現(xiàn)通過本發(fā)明方法實現(xiàn)的幾個好處中，可以注意到提供一種保護(hù)作物特別是玉米植物不受害蟲攝食損害的改進(jìn)的方法；提供這樣一種方法，其減少了需要的常規(guī)化學(xué)殺蟲劑的施用比例；還提供了這樣一種方法，其限制了農(nóng)作物種植和耕作所要求的獨立的大田操作次數(shù)。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)通過一種方法能夠保護(hù)玉米植物不受一種或多種害蟲的攝食損害，所述方法包括提供具有抵抗至少一種害蟲的活性的轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子，然后用有效量的氯硫尼定殺蟲劑處理該轉(zhuǎn)基因玉米種子。在優(yōu)選的實施方案中，發(fā)現(xiàn)具有抗玉米根蠕蟲活性的轉(zhuǎn)基因事件與用氯硫尼定處理種子的聯(lián)合出人意料地提供了保護(hù)玉米植物不受玉米根蠕蟲損害的卓越效益。特別地，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的聯(lián)合在保護(hù)玉米植物抵抗已知降低玉米產(chǎn)量的更嚴(yán)重水平的玉米根蠕蟲的損害方面出人意料地比單獨的轉(zhuǎn)基因事件或者比單獨的用氯硫尼定處理更優(yōu)越。
經(jīng)工程處理而包括來自蘇云金芽孢桿菌的編碼表達(dá)具有抗鞘翅目害蟲的活性的Cry3δ-內(nèi)毒素的外源基因的玉米植物和種子是已知的，用殺蟲劑處理種子(甚至是一些轉(zhuǎn)基因種子)的方法也是已知的。但是，在本發(fā)明之前沒有人意識到一些有效量的氯硫尼定會被用來處理具有這樣的Cry3事件的玉米種子，結(jié)果該項聯(lián)合出人意料地在提高殺蟲劑藥效和轉(zhuǎn)基因事件兩方面都卓越，并且會提供另外的好處，即提高與害蟲壓力相競爭的殺蟲活性的能力，降低處理和/或應(yīng)用成本，提高種子處理的安全性，和降低轉(zhuǎn)基因事件或殺蟲劑或者兩者對環(huán)境的影響。
特別地，相信在優(yōu)選的實施方案中對每100千克的種子用大約100克至大約400克的氯硫尼定處理能表達(dá)某些被修飾的Cry3Bb蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米種子能出人意料地提供抗玉米根蠕蟲的卓越保護(hù)作用。另外，相信這樣的聯(lián)合對于保護(hù)出芽的玉米植物抵抗黑切根蟲的損害也是有效的。還相信本發(fā)明的種子具有降低殺蟲劑使用成本的性質(zhì)，因為與不使用創(chuàng)新的方法相比，可以使用更少的殺蟲劑來獲得需要量的保護(hù)作用。此外，因為使用較少的殺蟲劑而且因為在播種前使用而不是獨立的大田施用，相信本發(fā)明方法因此對于操作者和對環(huán)境是安全的，可能比常規(guī)方法更節(jié)省。
當(dāng)說某些作用是“協(xié)同的”時，意思是包括轉(zhuǎn)基因事件和殺蟲劑聯(lián)合的殺蟲活性(或效力)的聯(lián)合的增效作用。但是，不是意指將這樣的協(xié)同作用限于殺蟲活性，而是應(yīng)該還包括這樣的意料之外的好處，如擴(kuò)大活性范圍，與損害降低的類型和量有關(guān)的有益的活性曲線，降低殺蟲劑和應(yīng)用成本，降低殺蟲劑在環(huán)境中的分布，減少生產(chǎn)，操作和種植玉米種子的人對殺蟲劑的接觸，和對本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它好處。
本發(fā)明還提供了提高殺蟲活性與害蟲壓力相競爭的能力的好處。這是指設(shè)計轉(zhuǎn)基因事件和殺蟲劑處理的聯(lián)合使得在目標(biāo)害蟲對種子或植株的攝食壓力達(dá)到最大時的時期對種子和得到的植株提供有效的殺蟲活性。作為舉例，當(dāng)對具有玉米根蠕蟲轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子施用殺蟲劑例如氯硫尼定時，可以在設(shè)計提供殺蟲劑受控釋放的包衣中施用殺蟲劑。選擇釋放速度使得殺蟲劑提供在抵抗玉米萌芽期之后受氯硫尼定控制的這樣的其它害蟲的保護(hù)作用，而轉(zhuǎn)基因事件在植株發(fā)育的更晚期-當(dāng)需要這樣的保護(hù)作用時，提供玉米根蠕蟲保護(hù)作用。
如這里使用的，術(shù)語″殺蟲作用″和″殺蟲活性″，或″活性″指抗害蟲毒性的作用。術(shù)語″抗(一種或多種)害蟲的活性″，也具有相同的意義。當(dāng)說一種種子或植株″受到保護(hù)以抵抗一種或多種害蟲的攝食損害″時，意思是這樣的種子或植株擁有這樣的特征，即對一種或多種害蟲具有直接或間接作用，與處于相同條件下對沒有這樣的特征的植物引起的攝食損害相比，導(dǎo)致所述害蟲對具有所述特征的植物的種子，根，芽和葉產(chǎn)生減輕的攝食損害。這樣的直接或間接作用包括誘導(dǎo)害蟲死亡，從植物種子，根，芽和/或葉排斥害蟲，抑制害蟲在植物種子，根，芽和/或葉上攝食，產(chǎn)卵，抑制或防止害蟲繁殖。
術(shù)語″殺昆蟲活性″和殺蟲活性具有相同的意義，除非它限于其中所述害蟲是昆蟲的那些例子。除非具體指明，當(dāng)這里使用術(shù)語″殺蟲劑″時，該術(shù)語指對種子外部施用的化學(xué)殺蟲劑，而不是指包括特定種子或者該特定種子長成的植株產(chǎn)生的活性物質(zhì)。然而，術(shù)語″殺蟲活性″和″殺昆蟲活性″可以指單獨的外部施用的殺蟲劑和/或種子或植物產(chǎn)生的物質(zhì)，或者兩者的活性。
本發(fā)明的一個特征是轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子。如這里所使用的，術(shù)語″轉(zhuǎn)基因玉米植物″意思是從轉(zhuǎn)化的玉米植物細(xì)胞或原生質(zhì)體產(chǎn)生的玉米植株或其后代，其中植物DNA包含原來相同品種天然的非轉(zhuǎn)基因植物中不存在的導(dǎo)入的外源DNA分子。
轉(zhuǎn)基因玉米種子是包含編碼殺蟲蛋白的外源基因的種子。這種類型的殺蟲蛋白描述于Schnepf等，Microbiology & MolecularBiology Reviews，62775-806(1998)，和ffrench-Constant和Bowen，CMSL Cell.Mol.Life Sci.，57828-833(2000)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述殺蟲蛋白是一種殺昆蟲蛋白。
優(yōu)選的是種子包含來自蘇云金芽孢桿菌菌株的外源基因，特別地，優(yōu)選所述外源基因是來自蘇云金芽孢桿菌的編碼殺蟲δ-內(nèi)毒素的基因。這樣的δ-內(nèi)毒素描述于WO 99/31248和美國專利No.6,063,597，并且包括Cry3毒素。本發(fā)明中有用的編碼修飾的蘇云金芽孢桿菌對鞘翅目有毒性的結(jié)晶蛋白的核酸片段描述于美國專利No.6,060,594，而美國專利No.6,023,013中討論了包括編碼這樣的殺昆蟲蛋白的核酸序列的昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的是本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素包括Cry3B蛋白，更優(yōu)選的是所述δ-內(nèi)毒素包括對鞘翅目有活性的Cry3B蛋白。Hfte和Whitely，Microbiol. Rev.，53242-255，1989中提出了蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲晶體蛋白的命名原則。修訂了該命名原則，并且在http//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html可以找到該修訂的命名原則。這里使用該修訂的命名原則描述轉(zhuǎn)基因事件特征和該轉(zhuǎn)基因事件編碼的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)。
當(dāng)這里使用術(shù)語″轉(zhuǎn)基因事件″時，這樣的術(shù)語意指上文描述的遺傳工程DNA，但是也包括修飾的基因編碼的蛋白質(zhì)。因此玉米種子或玉米植物中的轉(zhuǎn)基因事件包括表達(dá)蛋白質(zhì)的能力。當(dāng)說″轉(zhuǎn)基因事件具有抗害蟲活性″時，理解是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被表達(dá)并且接觸害蟲時實際上具有這樣的活性的基因編碼的蛋白質(zhì)。
WO 99/31248和美國專利No.6,063,597描述了遺傳工程方法處理蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素基因使得能夠表達(dá)修飾的δ-內(nèi)毒素的方法。修飾的δ-內(nèi)毒素與野生型蛋白質(zhì)的不同之處在于與野生型生物體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相比具有特定的氨基酸取代，添加或缺失。這里使用星號(*)鑒定這樣的修飾的δ-內(nèi)毒素，或者參照通過其鑒定號表示的特定蛋白質(zhì)。因此，遺傳工程修飾的Cry3δ-內(nèi)毒素可以表示為Cry3*，其例子包括但不限于Cry3Bb.11230，Cry3Bb.11231，Cry3Bb.11232，Cry3Bb.11233，Cry3Bb.11234，Cry3Bb.11235，Cry3Bb.11236，Cry3Bb.11237，Cry3Bb.11238，Cry3Bb.11239，Cry3Bb.11241，Cry3Bb.11242，和Cry3Bb.11098。
發(fā)現(xiàn)WO 99/31248和美國專利No.6,063,597中描述的修飾的δ-內(nèi)毒素中的一些具有增強(qiáng)的抗鞘翅目昆蟲活性，特別是葉甲，包括玉米根蠕蟲。如這里使用的，術(shù)語″增強(qiáng)的活性″指與沒有氨基酸修飾的相同毒素的活性相比，兩者都在相同的條件下測試時修飾的毒素具有增強(qiáng)的殺昆蟲活性。特別地，發(fā)現(xiàn)Cry3*δ-內(nèi)毒素具有增強(qiáng)的抗玉米根蠕蟲活性，因此在本發(fā)明中優(yōu)選使用。更優(yōu)選的是Cry3B*δ-內(nèi)毒素，甚至更優(yōu)選的是Cry3Bb*δ-內(nèi)毒素。甚至更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因事件是包括表達(dá)下表中列出的修飾的δ-內(nèi)毒素能力的那些。表中還給出了包含新的內(nèi)毒素表達(dá)基因的各個轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌菌株，和它們在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)at 1815 N.University Street，Peoria，I11.91904的保藏日期和保藏號。
還發(fā)現(xiàn)當(dāng)與含有具有一定水平抗所述害蟲的效力的轉(zhuǎn)基因事件的種子聯(lián)合應(yīng)用時降低害蟲攝食損害是本發(fā)明的優(yōu)選的應(yīng)用。為了詳細(xì)說明什么水平的效力是優(yōu)選的，下面的實施例將使用衣阿華根分級方法(Iowa.Root Rating Method)(Hills和Peters，J.Econ.Entomol，64764-765，1971)，其按1-6個等級測定玉米根蠕蟲對玉米根的攝食損害。分級是，1＝?jīng)]有損害或者只有極少的攝食疤痕；2＝攝食疤痕明顯但是植株的1.5英寸內(nèi)沒有根被吃掉；3＝植株的1.5英寸內(nèi)幾處根被吃掉，但是從來沒有相當(dāng)于根的整個結(jié)節(jié)被破壞；4＝一個根結(jié)節(jié)(root node)被完全破壞；5＝兩個根結(jié)節(jié)被完全破壞；和6＝三個或多個根結(jié)節(jié)被破壞。被破壞的根定義為已經(jīng)被吃掉至基部的1.5英寸內(nèi)的根。被吃掉的根不一定從單一結(jié)節(jié)發(fā)出，但是所有的被吃掉的根必須等于計數(shù)為被破壞結(jié)節(jié)的完整結(jié)節(jié)等同物。
如這里使用的，如果與沒有該轉(zhuǎn)基因事件的相同的農(nóng)作物相比，該事件在一定程度上降低了那種害蟲帶來的攝食損傷，但是沒有防止該目標(biāo)害蟲帶來的基本所有的損傷，則該轉(zhuǎn)基因事件在抵抗目標(biāo)害蟲優(yōu)選效力水平之內(nèi)。例如，如果10％的轉(zhuǎn)基因玉米遭受衣阿華1-6級的4級或更高級的玉米根蠕蟲損害，而80％的非轉(zhuǎn)基因玉米遭受4級或更高級損害，則可以說對轉(zhuǎn)基因玉米的損害是對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的(10/80)×100＝12.5％。對于本發(fā)明的目的，如果在相同的條件下，由于相同的害蟲，具有這樣的轉(zhuǎn)基因事件的玉米遭受的損害是非轉(zhuǎn)基因玉米遭受的損害的大約5％至大約50％，則認(rèn)為玉米中的轉(zhuǎn)基因事件在效力水平的優(yōu)選范圍內(nèi)。更優(yōu)選的是具有這樣的轉(zhuǎn)基因事件的玉米遭受在相同的條件下相同的害蟲對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約10％至大約40％，更優(yōu)選是相同的條件下相同的害蟲對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約15％至大約30％，更優(yōu)選是相同的條件下相同的害蟲對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約20％至大約30％。如這里使用的，當(dāng)使用術(shù)語″大約″來描述對玉米的損傷程度時，認(rèn)為損傷程度可以高于或低于描述的界限值1％或2％，并且還認(rèn)為是在描述的范圍內(nèi)。例如，4.5％損害水平被認(rèn)為是″大約5％″。
沒有期望受該理論或者其它任何理論的局限，相信當(dāng)與提供抗目標(biāo)害蟲優(yōu)選的效力范圍內(nèi)的保護(hù)作用的轉(zhuǎn)基因事件聯(lián)合時，殺蟲種子處理能夠提供顯著的好處。另外，相信在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的情況，具有優(yōu)選效力范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因事件是有益的。
本發(fā)明還包括具有一種以上轉(zhuǎn)基因事件的種子和植物。這樣的聯(lián)合稱之為″堆積的″轉(zhuǎn)基因事件。這些堆積的轉(zhuǎn)基因事件可以是針對相同的目標(biāo)害蟲的作用，或者它們可以針對不同的目標(biāo)害蟲。在一個優(yōu)選的方法中，具有表達(dá)Cry3蛋白能力的種子也具有表達(dá)至少一種不同于Cry3蛋白的一種另外的殺昆蟲蛋白的能力。
在另一個優(yōu)選的方法中，具有表達(dá)Cry3蛋白能力的種子還具有提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件。更優(yōu)選的是提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件是提供對草甘膦，N-(膦酰基甲基)甘氨酸，包括所述除草劑的異丙基胺鹽形式的耐受性的作用，更優(yōu)選的是提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件是提供對草甘膦的耐受性的作用，更優(yōu)選的是有效提供從圣路易斯孟山都公司獲得的ROUNDUP READY植物和種子的除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件。
在本發(fā)明方法中，用氯硫尼定(N-[(2-氯-5-噻唑基)甲基]-N’-甲基-N”-硝基，[C(E)]-(9Cl)-胍，CAS RN 210880-92-5，開發(fā)號為TI-435)處理具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米。
當(dāng)這里描述的是殺昆蟲劑氯硫尼定時，要明白描述意指包括殺昆蟲劑的鹽形式以及表現(xiàn)出和描述的殺昆蟲劑形式相同的具有殺昆蟲活性的殺昆蟲劑的所有同分異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體形式。本發(fā)明方法中使用的氯硫尼定殺昆蟲劑可以是市場上銷售的所述殺昆蟲劑的任何級別和純度。本發(fā)明方法和組合物還允許商售制劑中伴隨殺昆蟲劑的作為雜質(zhì)的其它材料，只要這樣的其它材料不破壞組合物的穩(wěn)定性或者不明顯降低或破壞任何殺昆蟲劑成分或者抗目標(biāo)害蟲的轉(zhuǎn)基因事件的活性。殺昆蟲劑生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易鑒定哪些雜質(zhì)可以允許哪些不允許。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法用來保護(hù)種子和植株抵抗寬范圍的農(nóng)業(yè)害蟲，包括昆蟲，螨，真菌，酵母，霉菌，細(xì)菌，線蟲，雜草，寄生的和腐生的植物。
當(dāng)一種昆蟲是本發(fā)明的目標(biāo)害蟲時，這樣的害蟲包括但不限于來自鱗翅目(Lepidoptera)，例如，長翅卷蛾(Acleris spp.)，褐帶卷蛾(Adoxophyes spp.)，透翅蛾(Aegeria spp.)，夜蛾(Agrotis spp.)，棉葉波紋夜蛾(Alabamaargillaceae)，Amylois spp.，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，黃卷蛾(Archips spp)，帶卷蛾(Argyrotaenia spp.)，紋夜蛾(Autographa spp.)，玉米蛀莖褐夜蛾(Busseola fusca)，干果斑螟(Cadra cautella)，Carposina nipponensis，二化螟(Chilo spp.)，色卷蛾(Choristoneura spp.)，Clysia ambiguella，縱卷葉野螟(Cnaphalocrocis spp.)，卷蛾(Cnephasia spp.)，細(xì)卷蛾(Cochylisspp.)，鞘蛾(Coleophora spp.)，Crocidolomia binotalis，蘋果異形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta)，小卷蛾(Cydia spp.)，灰桿草螟(Diatraea spp.)，展葉松夜蛾(Diparopsis castanea)，實蛾(Earias spp.)，干果斑螟(Ephestia spp.)，白小卷蛾(Eucosmaspp.)，Eupoecilia ambiguella，茶黃毒蛾(Euproctis spp.)，切根蟲(Euxoa spp.)，小食心蟲(Grapholita spp.)，Hedya nubiferana，夜蛾(Heliothis spp.)，菜心野螟(Hellula undalis)，美國白蛾(Hyphantria cunea)，茄莖麥蛾(Keiferia lycopersicella)，旋紋潛蛾(Leucoptera scitella)，細(xì)蛾(Lithocollethis spp.)，Lobesia botrana，毒蛾(Lymantria spp.)，潛蛾(Lyonetia spp.)，天幕毛蟲(Malacosoma spp.)，甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)，煙草天蛾(Manduca sexta)，尺蠖蛾(Operophtera spp.)，玉米螟(Ostrinia Nubilalis)，超小卷蛾(Pammene spp.)，褐卷蛾(Pandemis spp.)，小眼夜蛾(Panolis flammea)，紅鈴麥蛾(Pectinophora gossypiella)，馬鈴薯麥蛾(Phthorimaeaoperculella)，小菜粉蝶日本亞種(Pieris rapae)，毛連菜(Pierisspp.)，菜蛾(Plutella xylostella)，巢蛾(Prays spp.)，白螟(Scirpophaga spp.)，大螟(Sesamia spp.)，長須卷蛾(Sparganothis spp.)，夜蛾(Spodoptera spp.)，猛透翅蛾(Synanthedon spp.)，帶蛾(Thaumetopoea spp.)，卷葉蛾(Tortrixspp.)，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)和巢蛾(Yponomeuta spp.)；來自鞘翅目(Coleoptera)，例如，金針蟲(Agriotes spp.)，花象甲(Anthonomus spp.)，甜菜隱食甲(Atomaria linearis)，甜菜莖跳甲(Chaetocnema tibialis)，象甲(Cosmopolites spp.)，栗象(Curculio spp.)，皮蠧(Dermestes spp.)，葉甲(Diabrotica spp.)，豆瓢蟲(Epilachnaspp.)，Eremnus spp.，馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata)，稻象(Lissorhoptrus spp.)，鰓角金龜(Melolontha spp.)，Orycaephilus spp.，草莓根象甲(Otiorhynchus spp.)，Phlyctinusspp.，弧麗拔(Popillia spp.)，跳甲(Psylliodes spp.)，谷蠧(Rhizopertha spp.)，金龜甲科(Scarabeidae)，米象(Sitophilusspp.)，麥蛾(Sitotroga spp.)，粉蟲(Tenebrio spp.)，擬古谷(Tribolium spp.)和皮蠧(Trogoderma spp.)；來自直翅目(Orthoptera)，例如，蠊(Blatta spp.)，小蠊(Blattella spp.)，螻蛄(Gryllotalpaspp.)，馬德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)，飛蝗(Locusta spp.)，大蠊(Periplaneta ssp.)，和蚱蜢(Schistocerca spp.)；來自等翅目(Isoptera)，例如，犀白蟻(Reticulitemes spp)；來自嚙蟲目(Psocoptera)，例如，書虱(Liposcelis spp.)；
來自虱目(Anoplura)，例如，血虱(Haematopinus spp.)，長顎虱(Linognathus spp.)，虱(Pediculus spp.)，天皰瘡(Pemphigus spp.)和根瘤蚜(Phylloxera spp.)；來自食毛目(Mallophaga)，例如Damalinea spp.和嚙毛虱(Trichodectes spp.)；來自纓翅目(Thysanoptera)，例如，花薊馬(Franklinella spp.)，條薊馬(Hercinothrips spp.)，帶薊馬(Taeniothrips spp.)，薊馬(Thrips palmi)，煙薊馬(Thripstabaci)和非洲桔硬薊馬(Scirtothrips aurantii)；來自異翅亞目(Heteroptera)，例如，臭蟲(Cimexs pp.)，可可瘤盲蝽(Distantiella theobroma)，蛇莓(Dysdercus spp.)，Euchistus spp.，扁盾蝽(Eurygasterspp.)，稻緣蝽(Leptocorisa spp.)，綠蝽(Nezara spp.)，網(wǎng)蝽(Piesma spp.)，長紅獵蝽(Rhodnius spp.)，可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)，黑蝽(Scotinophara spp.)和錐蝽(Triatoma spp.)；來自同翅目(Homoptera)，例如，綿粉虱(Aleurothrixus floccosus)，Aleyrodes brassicae，圓盾蚧(Aonidiella spp.)，蚜科(Aphididae)，蚜(Aphis spp.)，圓盾蚧(Aspidiotus spp.)，團(tuán)扇薺(Bemisia tabaci)，蠟蚧(Ceroplaster spp.)，茶褐圓蚧(Chrysomphalus aonidium)，薔薇軟蚧(Chrysomphalus dictyospermi)，褐軟蚧(Coccushesperidum)，微葉蟬(Empoasca spp.)，蘋果綿蚜(Eriosomalarigerum)，斑葉蟬(Erythroneura spp.)，Gascardia spp.，飛虱(Laodelphax spp.)，Lacanium comi，牡蠣盾蚧(Lepidosaphesspp.)，長管蚜(Macrosiphus spp.)，瘤蚜(Myzus spp.)，Nehoteftixspp.，飛虱(Nilaparvata spp.)，Paratoria spp.，瘦綿蚜(Pemphigus spp.)，粉蚧(Planococcus spp.)，白蚧(Pseudaulacaspis spp.)，粉蚧(Pseudococcus spp.)，木虱(Psylla ssp.)，Pulvinaria aethiopica，圓盾蚧(Quadraspidiotus spp.)，縊管蚜(Rhopalosiphum spp.)，盔蚧(Saissetia spp.)，葉蟬(Scaphoideus spp.)，二叉蚜(Schizaphis spp.)，Sitobion spp.，溫室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)，Trioza erytreae和桔盾蚧(Unaspis citri)；來自膜翅目(Hymenoptera)，例如，Acromyrmex，切葉蟻(Atta spp.)，莖鋸蜂(Cephus spp.)，葉蜂(Diprio spp.)，鋸節(jié)葉蜂科(Diprionidae)，云杉葉蜂(Gilpinia polytoma)，實蜂(Hoplocampa spp.)，黑蟻(Lasiusspp.)，Monomorium pharaonis，鋸角葉蜂(Neodiprion spp)，水蟻(Solenopsis spp.)和胡蜂(Vespa ssp.)；來自雙翅目(Diptera)，例如，伊蚊(Aedes spp.)，Antherigona soccata，Bibio hortulanus，紅頭麗蠅(Calliphora erythrocephala)，蠟實蠅(Ceratitis spp.)，金蠅(Chrysomyia spp.)，庫蚊(Culex spp.)，黃蠅(Cuterebraspp.)，大實蠅(Dacus spp.)，果蠅(Drosophila melanogaster)，廁蠅(Fannia spp.)，胃蠅(Gastrophilus spp.)，舌蠅(Glossinaspp.)，皮蠅(Hypoderma spp.)，Hyppobosca spp.，潛葉蠅(Liriomysa spp.)，綠蠅(Lucilia spp.)，潛蠅(Melanagromyzaspp.)，舍蠅(Musca ssp.)，狂蠅(Oestrus spp.)，0rseolia spp.，瑞典麥稈蠅(0scinella frit)，黎泉蠅(Pegomyia hyoscyami)，麥蠅(Phorbia spp.)，蘋果實蠅(Rhagoletis pomonella)，潭蠅(Sciaraspp.)，螯蠅(Stomoxys spp.)，虻(Tabanus spp.)，Tannia spp.稻大蚊(Tipula spp.)，來自蚤目(Siphonaptera)，例如，角葉蚤(Ceratophyllus spp.)和東方鼠蚤(Xenopsyllacheopis)和來自嬰尾目(Thysanura)，例如，西洋衣魚(Lepisma saccharina)。
發(fā)現(xiàn)當(dāng)昆蟲害蟲是葉甲(Diabrotica spp.)，特別是當(dāng)害蟲是玉米幼芽根葉甲(Diabrotica virgifera)，Diabrotica barberi，或十一星瓜葉甲(Diabrotica undecimpunctata)時，本發(fā)明是特別有效的。
在本發(fā)明方法中，對轉(zhuǎn)基因玉米種子施加氯硫尼定。盡管相信本發(fā)明方法可以適用任何生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因玉米種子，但是優(yōu)選種子處于一個足夠耐受的狀態(tài)，在處理過程中不蒙受損害。典型地，所述種子是從大田收獲的種子；離開植物的；和離開玉米穗、莖、外殼、和包圍的果肉，或者其它非種子植物材料。種子還優(yōu)選生物學(xué)穩(wěn)定性達(dá)到處理對種子不引起生物學(xué)損傷的程度。在一個實施方案中，例如，對收獲的經(jīng)清理的干燥后含濕量低于大約15重量％的玉米種子施加處理。在另一個實施方案中，種子可以是干燥之后用水和/或其它材料處理，然后在用殺蟲劑處理之前或期間再次干燥的種子。在上述限度之內(nèi)，相信處理適用于種子收獲和種子播種期間任何時間的種子。如這里使用的，術(shù)語″沒有播種的種子″意在包括種子收獲和為植物的發(fā)芽和生長而在地中播種期間任何時間的種子。
當(dāng)說到用殺蟲劑“處理”沒有播種的種子時，這樣的處理不包括對土壤而不是對種子施用殺蟲劑的那些操作。例如，在播種種子的同時在區(qū)域，″T″-區(qū)，或者犁溝中施用殺蟲劑這樣的處理不認(rèn)為是包括在本發(fā)明中。
殺蟲劑，或者殺蟲劑的聯(lián)合可以以其本身施用，即，沒有任何稀釋成分或附加成分存在。但是，殺蟲劑一般以殺蟲劑制劑形式對種子施用。這種制劑可以含有一種或多種其它期望的成分，包括但不限于液體稀釋劑，作為殺蟲劑的基質(zhì)的粘合劑，在應(yīng)激條件下保護(hù)種子的填料，提高包衣的柔性，粘合力和/或擴(kuò)散能力的增塑劑。另外，對于含有極少或者不含填料的油性殺蟲劑制劑，可能會期望向制劑加入干燥劑，例如碳酸鈣，高嶺土或膨潤土粘土，珍珠巖，硅藻土或者任何其它吸附材料。在種子處理中使用這樣的成分是本領(lǐng)域公知的。參見，例如美國專利No.5,876,739。技術(shù)人員根據(jù)要處理的種子的類型和選擇的特殊殺蟲劑，容易選擇在殺蟲劑制劑中使用的期望的成分。另外，可以使用已知殺蟲劑的容易購得的商售制劑，如下面實施例中證明的。
可以用下面成分的一種或多種處理種子其它殺蟲劑，包括只在地下作用的化合物；殺真菌劑，例如克菌丹，福美雙，甲霜靈，(methoxam＝拆分的甲霜靈異構(gòu)體)，咯菌腈，惡霜靈，和各種所述物質(zhì)的異構(gòu)體等，除草劑，包括選自氨基甲酸酯類，硫代氨基甲酸酯類，乙酰胺類，三嗪類，二硝基苯胺類，甘油醚類，噠嗪酮類，尿嘧啶類，苯氧基化合物類，脲類，和苯甲酸類的化合物；除草安全劑，例如氧氮雜萘，二苯甲基衍生物，N，N-二丙烯基二氯乙酰胺，各種二鹵代?；瑦哼蛲榛袜邕蛲榛衔?，乙烷酮(ethanone)，萘二甲酸酸酐化合物，和肟衍生物；肥料；和生物控制劑，例如天然存在的或重組細(xì)菌和來自根瘤菌屬，芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，沙雷氏菌屬，木霉屬，球菌屬，膠球菌屬和菌根真菌的真菌。這些成分可以作為分開的層加到種子上或者可以作為殺蟲劑組合物的一部分加入。
優(yōu)選地，種子處理中使用的新的成分或其它成分的量應(yīng)該不抑制種子的發(fā)芽，或者對種子引起抑制植物生長的損害。
用來在本發(fā)明中處理轉(zhuǎn)基因玉米種子的殺蟲劑制劑可以是下面的形式混懸劑；乳劑；含水介質(zhì)(例如水)中顆粒漿液；可濕潤粉末劑；可濕潤顆粒劑(干燥可流動的)；和干燥顆粒。如果配制成混懸劑或漿液，制劑中活性成分的濃度優(yōu)選是大約0.5重量％至大約99重量％(w/w)，優(yōu)選5-40％。
如上所述，可以向制劑中摻入其它常規(guī)無活性或惰性成分。這樣的惰性成分包括但不限于常規(guī)粘著劑，分散劑例如甲基纖維素(Methocel A15LV或Methocel A15C，例如，作為用于種子處理的混合的分散劑/粘著劑)，聚乙烯醇(例如，Elvanol 51-05)，卵磷脂(例如，Yelkinol P)，聚合物分散劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVP/VA S-630)，增稠劑(例如，提高粘度并且減少顆粒懸浮液的沉積的粘土增稠劑例如Van Gel B)，乳液穩(wěn)定劑，表面活性劑，抗凍化合物(例如，尿素)，顏料，著色劑，等等。本發(fā)明中使用的其它惰性成分可以參見McCutcheon′s，vol.1，″Emulsifiers andDetergents，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996。本發(fā)明中使用的附加惰性成分可以參見McCutcheon′s，vol.2，″Functional Materials，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996。
通過任何標(biāo)準(zhǔn)的種子處理方法可以對種子施用本發(fā)明的殺蟲劑和殺蟲劑制劑，包括但不限于在容器(例如瓶子或袋)中混合，機(jī)械施用，鼓轉(zhuǎn)，噴霧，和浸漬。任何常規(guī)活性或惰性材料可以用于使本發(fā)明的殺蟲劑與種子接觸，例如常規(guī)包膜材料，包括但不限于例如Sepiret(Seppic，Inc.，F(xiàn)airfield，N.J.)和Opacoat(Berwind Pharm.Services，Westpoint，Pa.)這樣的水基包膜材料。
本發(fā)明的殺蟲劑可以作為種子包衣的成分對種子施用。當(dāng)通過加入本發(fā)明的殺蟲劑的混合物的實施方案之一予以改變時，本領(lǐng)域公知的種子包被方法和組合物是有用的。用于其應(yīng)用的所述包被方法和設(shè)備公開于，例如，美國專利Nos.5,918,413，5,891,246，5,554,445，5,389,399，5,107,787，5,080,925，4,759,945和4,465,017。種子包被組合物公開于，例如，美國專利Nos.5,939,356，5,882,713，5,876,739，5,849,320，5,834,447，5,791,084，5,661,103，5,622,003，5,580,544，5,328,942，5,300,127，4,735,015，4,634,587，4,383,391，4,372,080，4,339,456，4,272,417和4,245,432。
有用的種子包衣含有一種或多種粘合劑和至少一種本發(fā)明的殺蟲劑混合物。
本發(fā)明中使用的粘合劑優(yōu)選包括可以是天然的或合成的并且對要包被的種子沒有抑制植物生長作用的粘合劑聚合物。粘合劑可以選自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVA)；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纖維素，包括乙基纖維素，甲基纖維素，羥甲基纖維素，羥丙基纖維素和羧甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉，改性的淀粉，糊精，麥芽糊精，藻酸鹽和殼多糖；脂肪；油；蛋白質(zhì)，包括明膠和玉米醇溶蛋白；阿拉伯膠；蟲膠；亞乙烯基氯和亞乙烯基氯共聚物；木素磺化鈣；丙烯酸共聚物；聚丙烯酸乙烯酯；聚環(huán)氧乙烷；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羥乙酯，甲基丙烯酰胺單體；和聚氯丁烯。
優(yōu)選選擇粘合劑使得其可以作為本發(fā)明殺蟲劑的基質(zhì)。上面公開的粘合劑都可以用作基質(zhì)，具體的粘合劑取決于殺蟲劑組合的性質(zhì)。這里使用的術(shù)語″基質(zhì)″意思是一種或幾種粘合劑化合物的連續(xù)固相，本發(fā)明一種或多種殺蟲劑通過該連續(xù)固相分布為不連續(xù)相。任選地，基質(zhì)中也可以存在填料和/或其它成分。術(shù)語基質(zhì)理解是包括可以被看作是基質(zhì)體系，貯存體系或微膠囊體系。一般情況下，基質(zhì)體系由本發(fā)明的殺蟲劑和不均勻分布在聚合物中的填料組成，而貯存體系由包括本發(fā)明殺蟲劑的分開的相。(其物分散在周圍環(huán)境中，限速。)和聚合物相組成。微膠囊包括小顆?；蛞旱伟拢€有固相基質(zhì)中的分散物。
包衣中粘合劑的量可以變化，但是在種子重量的大約0.01至大約25％范圍內(nèi)，更優(yōu)選大約0.05至大約15％，甚至更優(yōu)選大約0.1％至大約10％。
如上所述，基質(zhì)可以任選地包括填料。填料可以是吸收劑或惰性填料，例如本領(lǐng)域公知的，并且可以包括木屑，粘土，活性炭，糖，硅藻土，谷粉，細(xì)谷粒無機(jī)固體，碳酸鈣，等?？梢允褂玫恼惩梁蜔o機(jī)固體包括膨潤土鈣，高嶺土，中國粘土，滑石，珍珠巖，云母，蛭石，硅酸鹽，石英粉，蒙脫石及其混合物。可以使用的糖包括糊精和麥芽糊精。谷粉包括小麥粉，燕麥粉和大麥粉。
選擇填料使得其為種子提供合適的微環(huán)境，例如使用填料提高活性成分裝載比例和調(diào)節(jié)活性成分的控制釋放。填料有助于包被種子的生產(chǎn)和對種子包被的過程。填料的量可以不同，但一般填料成分的重量是在種子重量的大約0.05至大約75％的范圍內(nèi)，更優(yōu)選大約0.1至大約50％，甚至更優(yōu)選大約0.5％至15％。
包衣中使用的殺蟲劑是這里描述的那些殺蟲劑。用于處理種子的殺蟲劑的量根據(jù)種子的類型和活性成分的類型而不同，但是處理包括使種子接觸殺蟲有效量的殺蟲劑。當(dāng)昆蟲是目標(biāo)害蟲時，該量是殺昆蟲有效量的殺昆蟲劑的量。如這里使用的，殺昆蟲有效量意思是殺死生長的幼蟲或蛹狀態(tài)的昆蟲害蟲，或者持續(xù)降低或延遲昆蟲害蟲產(chǎn)生的損害的量的殺昆蟲劑的量。
一般情況下，在處理中對種子施用的氯硫尼定的量的范圍是每100千克重量的種子大約10克至大約2000克殺蟲劑活性成分。優(yōu)選地，殺蟲劑的量在每100千克種子大約50克至大約1000克活性成分范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，殺蟲劑的量在每100千克種子大約100克至大約600克活性成分范圍內(nèi)。甚至更優(yōu)選地在每100千克種子重量大約200克至大約500克活性成分范圍內(nèi)?；蛘?，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選的是殺蟲劑的量是每100千克種子超過大約60克殺蟲劑活性成分的量，更優(yōu)選每100千克種子超過大約80克。
處理中使用的殺蟲劑一定要不抑制種子發(fā)芽，并且應(yīng)該在目標(biāo)昆蟲對種子或植株引起損害的目標(biāo)昆蟲生長周期的那段時間內(nèi)對保護(hù)種子和/或植物是有效的。一般情況下，播種之后大約0-120天包衣是有效的。
在本發(fā)明中，殺蟲劑以包衣形式對種子施用。在允許高殺蟲劑負(fù)荷的條件下施用包衣是特別有效的，這種條件一般是處理頑固性害蟲，例如玉米根蠕蟲所要求的，而且同時防止了由于提高的殺蟲劑負(fù)荷量帶來的不可接受的植物毒性。
任選地，在包衣制劑中可以使用增塑劑。一般使用增塑劑使包衣層形成的膜更有柔順性，來提高粘著性和擴(kuò)散性，來提高加工速度。提高的膜的柔順性對于將，貯存、處理或播種過程期間的破碎、破壞或剝落最小化是重要的?？梢允褂煤芏嘣鏊軇怯杏玫脑鏊軇┌ň垡叶?，甘油，鄰苯二甲酸丁基芐酯，苯甲酸乙二醇酯和相關(guān)的化合物。包衣層中增塑劑的范圍在大約0.1至大約20％重量比范圍內(nèi)。
當(dāng)包衣中使用的殺蟲劑是油型制劑并且存在極少或不存在填料時，通過將制劑干燥來加快干燥過程是有用的。任選的步驟可以通過本領(lǐng)域公知的方法來完成，并且可以包括添加碳酸鈣，高嶺土或膨潤土粘土，珍珠巖，硅藻土，或者優(yōu)選與殺蟲劑包衣層一起加入的吸收油或過量濕度的吸收材料。有效提供干燥包衣所需要的碳酸鈣或相關(guān)化合物的量在種子重量的大約0.5至大約10％范圍內(nèi)。
殺蟲劑形成的包衣優(yōu)選是能通過從基質(zhì)擴(kuò)散或移動到周圍介質(zhì)中而有效延緩殺蟲劑釋放速度的類型。
除了包衣層之外，可以用下面成分的一種或幾種處理種子其它殺蟲劑，包括殺真菌劑和除草劑；除草安全劑；肥料和/或生物控制劑。這些成分可以作為分開的層加入，或者可以在殺蟲劑包衣層中加入。
應(yīng)用常規(guī)包被技術(shù)和機(jī)器可以對種子施用殺蟲劑制劑，例如流化床技術(shù)，滾軸研磨方法，旋轉(zhuǎn)式種子處理機(jī)，和轉(zhuǎn)筒包被機(jī)。也可以使用其它方法，例如噴射床?？梢栽诎恢皩⒎N子按大小分開。包被之后，一般將種子干燥后轉(zhuǎn)移到用于篩分的篩分機(jī)。這樣的過程是本領(lǐng)域公知的。
也可以用一層膜在雙重包被殺蟲劑處理過的種子以保護(hù)殺蟲劑包衣。這樣的雙重包被是本領(lǐng)域公知的并且可以應(yīng)用流化床和轉(zhuǎn)筒膜包被技術(shù)來實施。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，利用固體基質(zhì)填充可以將殺蟲劑加到種子上或?qū)敕N子中。例如，一定量的殺蟲劑可以與固體基質(zhì)材料混合，然后使種子接觸固體基質(zhì)材料一段時間對種子引入殺蟲劑。然后任選地將種子與固體基質(zhì)材料分開并且貯存或使用，或者固體基質(zhì)材料加種子的混合物可以被貯存或者直接播種。本發(fā)明中使用的固體基質(zhì)材料包括聚丙烯酰胺，淀粉，粘土，二氧化硅，礬土，土壤，沙子，聚脲，聚丙烯酸酯，或者能吸收或吸附殺蟲劑一段時間并且將殺蟲劑釋放到種子中或種子上的任何其它材料。確定殺蟲劑與所述固體基質(zhì)材料彼此兼容是有用的。例如，應(yīng)該選擇固體基質(zhì)材料使得其能夠以合理的速度釋放殺蟲劑，例如經(jīng)過幾分鐘，幾小時或幾天。
本發(fā)明進(jìn)一步實施了作為用殺蟲劑處理種子的另一種方法的抑制。例如，植物種子可以與在溶劑例如水中含有大約1重量％至大約75重量％的殺蟲劑的溶液混合一段時間。優(yōu)選地，該溶液濃度是大約5重量％至大約50重量％，更優(yōu)選大約10重量％至大約25重量％。種子與溶液混合期間，種子吸收(浸滲)了一部分殺蟲劑。任選地，可以例如通過振蕩，旋轉(zhuǎn)，上下顛倒或其它方式攪拌植物種子和溶液的混合物。浸滲之后，從溶液中分出種子并且任選地干燥，例如通過輕拍或風(fēng)干。
在另一個實施方案中，粉末化殺蟲劑可以直接與種子混合。任選地，可以使用粘著劑讓粉末粘附種子表面。例如，一定量的種子可以混合粘著劑，并且任選地劇烈攪拌以利于用粘著劑對種子均勻涂層。然后將粘著劑包被的種子與粉末殺蟲劑混合?？梢岳缤ㄟ^上下顛倒來攪拌混合物，以利于粘著劑接觸粉末殺蟲劑，從而使得粉末殺蟲劑粘附于種子。
本發(fā)明還提供了通過上述方法用殺蟲劑處理過的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
本發(fā)明的處理過的種子可以以和常規(guī)處理過的玉米種子一樣的方式用于玉米植株的繁殖。可以以和任何其它殺蟲劑處理過的種子一樣的方式保存，處理，播種和耕種處理過的種子。采用合適的安全性量度來限制處理過的種子接觸人，食物或飼料，水和鳥以及野生或家養(yǎng)動物。
下面的實施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案?？紤]到這里公開的本發(fā)明的說明書或?qū)嵤┓桨?，?quán)利要求書范圍內(nèi)的其它實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。說明書和實施例的目的只是舉例說明性的，實施例后面的權(quán)利要求書指明本發(fā)明的范圍和精神。
下面的實施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案?？紤]到這里公開的本發(fā)明的說明書或?qū)嵤┓桨?，?quán)利要求書范圍內(nèi)的其它實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。說明書和實施例的目的只是舉例說明性的，實施例后面的權(quán)利要求書指明本發(fā)明的范圍和精神。除非另有說明，實施例中所有的百分含量以重量為基礎(chǔ)。
實施例1轉(zhuǎn)基因玉米種子的產(chǎn)生以及用氯硫尼定處理該種子。
通過WO 99131248，或者美國專利No.6,023,013中描述的方法制備表達(dá)蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素Cry3Bb.11231的玉米種子。
如下用氯硫尼定殺蟲劑處理有或沒有各自的轉(zhuǎn)基因事件的相同雜交物種的玉米種子。通過將測定量的氯硫尼定在作為載體的水中混合來制備期望的殺蟲劑的種子處理制劑，并且在旋轉(zhuǎn)種子處理機(jī)中室溫下對測定重量的玉米種子施加一分鐘的該制劑。計算殺蟲劑制劑和玉米種子各自重量，得到殺蟲劑對種子處理的期望比例。將殺蟲劑混合到足夠的水中使得制劑有效分布到該批量的所有的種子，同時將由于種子對制劑的吸收不足導(dǎo)致的處理制劑的損失最小化。在播種之前使處理過的種子敞開放置至少4小時。
實施例2玉米種子中轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與玉米根蠕蟲殺蟲劑種子處理聯(lián)合抵抗西部和北部玉米根蠕蟲的功效測定的大田試驗。
根據(jù)有關(guān)程序并且滿足USDA通知要求進(jìn)行大田試驗。試驗?zāi)康氖菧y定玉米種子中轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與玉米根蠕蟲殺蟲劑種子處理聯(lián)合抵抗西部和北部玉米根蠕蟲的功效。
對于每一個選擇的耕種點，小塊地設(shè)計包括如下
行間距 30英寸小塊地大小 1行×20英尺植株密度 1.5-2.0種子/英尺，取決于地點使用的雜交 MO17×A1重復(fù) 4次設(shè)計 隨機(jī)完全區(qū)組地點 5幼蟲來源 補(bǔ)充玉米根蠕蟲卵人工感染的天然感染，1200個卵/ft(V2生長期)對于各生長區(qū)域可以使用下面的種子處理組合序號玉米種子類型殺蟲劑和量(活性成分克數(shù)/100千克種子)1 同型雜交體(Isohybrid)2 Cry3Bb.112313 同型雜交體 氯硫尼定，100克活性成分/100千克4 同型雜交體 氯硫尼定，300克活性成分/100千克5 同型雜交體 氯硫尼定，400克活性成分/100千克6 Cry3Bb.11231 氯硫尼定，100克活性成分/100千克7 Cry3Bb.11231 氯硫尼定，300克活性成分/100千克8 同型雜交體 Force3G標(biāo)準(zhǔn)處理，0.15oz活性成分/1000英尺行，在種植時在土壤表面上以5”帶施用如實施例1所述進(jìn)行所有的殺蟲劑種子處理。接受序號1和2處理的種子沒有用預(yù)期抗玉米根蠕蟲有效的殺蟲劑處理。
對于采用了序號3-7的處理的種子，通過實施例1描述的方法施用殺蟲劑。對于采用了序號8的處理的種子，在播種時在5″帶對土壤施用商售的Force3G。給出了施用水平，并且是在標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)操作推薦的范圍內(nèi)。
應(yīng)該根據(jù)上面描述的方法在跨兩個美國中西部州玉米帶的5個不同地點播種和使要試驗的玉米種子生長。
根據(jù)下面的方法進(jìn)行玉米根蠕蟲損害測定。在VT-R1階段，通過工業(yè)上公知的方法進(jìn)行玉米根蠕蟲損害的評估，根據(jù)衣阿華1-6分級體系報道玉米根蠕蟲的損害。在該體系中，每小塊土地回收10株玉米植株的根系，并且使用1-6分級規(guī)格評分，其中1＝?jīng)]有損害或者只有幾處小的攝食疤痕，2＝攝食損害明顯，但是沒有根被吃到植株的1.5英寸內(nèi)；3＝至少一個根被吃掉至植株的1.5英寸內(nèi)，但是從來沒有根的整個結(jié)節(jié)被破壞；4＝一個根結(jié)節(jié)被吃掉至植株的1.5英寸內(nèi)；5＝兩個根結(jié)節(jié)(環(huán))被吃掉至植株的1.5英寸內(nèi)；6＝三個根結(jié)節(jié)(環(huán))被吃掉至植株的1.5英寸內(nèi)。
表1.在第一年的試驗中的7個生長地點，玉米根蠕蟲對同型雜交玉米植物和具有單獨的轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.1123以及聯(lián)合了氯硫尼定處理的玉米植物的損害
這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因事件和氯硫尼定提供了一定水平的抗玉米根蠕蟲損害的保護(hù)。在較高的損害水平(即損害水平4-6)，轉(zhuǎn)基因事件受到的損害是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?4.5％。因此，Cry3Bb.11231事件被認(rèn)為是在有效的效力范圍內(nèi)。
氯硫尼定在所有檢驗水平都是有效抗玉米根蠕蟲損害的，但氯硫尼定在所有水平的效力都低于單獨的轉(zhuǎn)基因事件的水平。用氯硫尼定處理轉(zhuǎn)基因種子的所有聯(lián)合都比任何單獨的殺蟲劑處理或單獨的轉(zhuǎn)基因事件更有效抗玉米根蠕蟲損害。Cry3Bb.11231與300克/100千克種子的氯硫尼定處理的聯(lián)合提供了與作為種植時的表面帶施用的每100英尺行4.25克FORCR3G的商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)處理基本相同的保護(hù)。用僅僅100克/100千克的氯硫尼定處理轉(zhuǎn)基因種子提供了幾乎相同水平的保護(hù)。
用氯硫尼定處理轉(zhuǎn)基因種子的優(yōu)點包括通過取消了要求殺蟲劑的獨立施用而簡化種植。此外，種植更簡便和安全，因為種植者不需要操作高濃度的殺蟲劑。
在玉米根蠕蟲損害的3個水平檢驗了氯硫尼定處理和具有Cry3Bb.11231轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子的聯(lián)合的可能協(xié)同作用。在第一個實驗中，如表2(a)所示，測定了對照和用兩個水平的殺蟲劑處理的種子以及具有單獨和聯(lián)合的轉(zhuǎn)基因事件的種子產(chǎn)生的實驗植物中具有衣阿華1-6分級中的3-6的損傷水平的百分比。用以下的公式計算“協(xié)同域值”(占對照Cry3Bb.11231的百分比)*(占對照氯硫尼定處理的百分比)/100將該域值與處理的聯(lián)合(即，Cry3Bb.11231與氯硫尼定100克/100千克的聯(lián)合，Cry3Bb.11231與氯硫尼定300克/100千克的聯(lián)合)占對照的百分比進(jìn)行比較。如果處理的聯(lián)合占對照的百分比低于域值，那么可以得出結(jié)論，證明該聯(lián)合具有協(xié)同作用。如果處理的聯(lián)合占對照的百分比高于域值，那么可以得出結(jié)論，證明該聯(lián)合沒有協(xié)同作用。對損害水平4-6和5-6重復(fù)該計算，計算的結(jié)果見表2(b)和2(c)。
認(rèn)為在較高損害水平(即3-4，4-6以及5-6級)測量根蠕蟲損害是聯(lián)系由于該損害導(dǎo)致的產(chǎn)量損失的有用的指標(biāo)。其原因是1-2的根蠕蟲損害很少導(dǎo)致玉米植物倒伏，并不認(rèn)為這種很小的根損失減少每穗的谷粒數(shù)或重量。然而，3級和3級以上的根損害增加了倒伏和產(chǎn)量損失。因此，認(rèn)為3-6、4-6以及5-6級的損害水平的總和為玉米根蠕蟲對玉米產(chǎn)量的損害提供了有用的指標(biāo)。
表2(a)用兩個水平的單獨的氯硫尼定和氯硫尼定與玉米轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231的聯(lián)合處理種子抗衣阿華1-6分級中3-6級的玉米根蠕蟲損害的效力
表2(b)用兩個水平的單獨的氯硫尼定和氯硫尼定與玉米轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231的聯(lián)合處理種子抗衣阿華1-6分級中4-6級的玉米根蠕蟲損害的效力
表2(c)用兩個水平的單獨的氯硫尼定和氯硫尼定與玉米轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231的聯(lián)合處理種子抗衣阿華1-6分級中5-6級的玉米根蠕蟲損害的效力
該分析表明，玉米Cry3Bb.11231轉(zhuǎn)基因事件與100克/100千克或300克/100千克的氯硫尼定處理的聯(lián)合是協(xié)同的，并且出乎意料地有效抗3-6級的玉米根蠕蟲損害。在4-6級損害，所有水平的氯硫尼定與轉(zhuǎn)基因事件的聯(lián)合都沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用，但低水平氯硫尼定處理(100克/100千克種子)的聯(lián)合具有接近于表現(xiàn)出協(xié)同作用所需要的保護(hù)水平。在5-6級損害，低水平氯硫尼定處理(100克/100千克種子)與Cry3Bb.11231事件的聯(lián)合表現(xiàn)出協(xié)同作用，而高水平氯硫尼定處理則沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用。然而，對于任何所檢驗的聯(lián)合，5-6級的損害非常低，比所檢驗的用常規(guī)表面帶處理的非轉(zhuǎn)基因玉米經(jīng)受的損害低得多(在5-6級，約5.6％損害)。
因此，可以得出結(jié)論，轉(zhuǎn)基因事件與氯硫尼定處理種子的聯(lián)合相對于單獨使用這兩種方法之一提供了顯著的優(yōu)勢，該保護(hù)作用在抗玉米根蠕蟲的嚴(yán)重?fù)p害的效力方面出乎意料地優(yōu)越。
這里參考的討論只是為了總結(jié)作者作出的主張，沒有承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成先有技術(shù)。申請人保留對引述的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和相關(guān)性表示異議的權(quán)利。
綜上所述，可以看到實現(xiàn)了本發(fā)明的幾個優(yōu)點并且獲得其他優(yōu)點。
可以對上述方法和組合物進(jìn)行各種改變而不超出本發(fā)明范圍，上面描述中包含的所有的事物只是詳細(xì)說明而不是限制的意思。
權(quán)利要求
1.一種保護(hù)轉(zhuǎn)基因玉米植物抵抗一種或多種害蟲的攝食損害的方法，該方法包括提供轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子，所述種子包括具有抵抗一種或多種害蟲中的至少一種的活性的轉(zhuǎn)基因事件；并且用有效量的氯硫尼定殺蟲劑處理種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包括表達(dá)昆蟲蛋白的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包括表達(dá)Cry蛋白的能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包括表達(dá)Cry3蛋白的能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包括表達(dá)Cry3*蛋白的能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述Cry3*蛋白是Cry3B*蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述Cry3B*蛋白選自Cry3Bb.11230，Cry3Bb.11231，Cry3Bb.11232，Cry3Bb.11233，Cry3Bb.11234，Cry3Bb.11235，Cry3Bb.11236，Cry3Bb.11237，Cry3Bb.11238，Cry3Bb.11239，Cry3Bb.11241，Cry3Bb.11242，和Cry3Bb.11098。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述Cry3B*蛋白是Cry3Bb.11231。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述Cry3B*蛋白是Cry3Bb.11098。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能減小玉米根蠕蟲引起的損害，使得當(dāng)這種損害表示為根據(jù)衣阿華玉米根蠕蟲1-6分級而測定的具有4-6分的玉米植物的百分比時，對轉(zhuǎn)基因玉米的損害是相同條件下對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約5％至大約50％。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能減小玉米根蠕蟲引起的損害，使得當(dāng)這種損害表示為根據(jù)衣阿華玉米根蠕蟲1-6分級而測定的具有4-6分的玉米植物的百分比時，對轉(zhuǎn)基因玉米的損害是相同條件下對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約10％至大約40％。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能減小玉米根蠕蟲引起的損害，使得當(dāng)這種損害表示為根據(jù)衣阿華玉米根蠕蟲1-6分級而測定的具有4-6分的玉米植物的百分比時，對轉(zhuǎn)基因玉米的損害是相同條件下對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約15％至大約30％。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能減小玉米根蠕蟲引起的損害，使得當(dāng)這種損害表示為根據(jù)衣阿華玉米根蠕蟲1-6分級而測定的具有4-6分的玉米植物的百分比時，對轉(zhuǎn)基因玉米的損害是相同條件下對非轉(zhuǎn)基因玉米的損害的大約20％至大約30％。
14.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述具有表達(dá)Cry3蛋白能力的種子也具有表達(dá)至少一種不同于Cry3蛋白的另外的殺昆蟲蛋白的能力。
15.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述具有表達(dá)Cry3蛋白能力的種子也具有提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中提供除草劑耐受性的所述轉(zhuǎn)基因事件抗草甘膦。
17.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件具有抗昆蟲活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述昆蟲選自鱗翅目，鞘翅目和半翅目。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述昆蟲是鞘翅目昆蟲。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述昆蟲是葉甲。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述昆蟲包括選自玉米幼芽根葉甲，Diabrotica barberi和十一星瓜葉甲中的至少一種。
22.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述氯硫尼定的有效量是每100千克重量的種子至少大約10克至大約2000克殺蟲劑活性成分。
23.根據(jù)權(quán)利要求22方法，其中所述氯硫尼定的有效量是每100千克重量的種子至少大約70克至大約1000克殺蟲劑活性成分。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述氯硫尼定的有效量是每100千克重量的種子至少大約100克至大約600克殺蟲劑活性成分。
25.根據(jù)權(quán)利要求24方法，其中所述殺蟲劑的有效量是每100千克重量的種子至少大約200克至大約500克殺蟲劑活性成分。
26.由權(quán)利要求1的方法處理的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
27.根據(jù)權(quán)利要求26方法，其中所述氯硫尼定的有效量是每100千克重量的種子至少大約200克至大約500克殺蟲劑活性成分。
28.一種給產(chǎn)生的玉米植物提供提高的抵抗一種或多種害蟲引起的攝食損害的抗性的種子，該種子包括具有抵抗一種或多種害蟲的至少一種的活性的轉(zhuǎn)基因事件，所述種子已經(jīng)用有效量的氯硫尼定處理過。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件是表達(dá)殺昆蟲蛋白的能力。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件是表達(dá)Cry蛋白的能力。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件是表達(dá)來自蘇云金芽孢桿菌的Cry3蛋白的能力。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件是表達(dá)來自蘇云金芽孢桿菌的Cry3Bb蛋白的能力。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件是表達(dá)來自蘇云金芽孢桿菌的Cry3Bb.11230，Cry3Bb.11231，Cry3Bb.11232，Cry3Bb.11233，Cry3Bb.11234，Cry3Bb.11235，Cry3Bb.11236，Cry3Bb.11237，Cry3Bb.11238，Cry3Bb.11239，Cry3Bb.11241，Cry3Bb.11242，或Cry3Bb.11098蛋白的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種保護(hù)玉米抵抗一種或多種害蟲攝食損害的方法，包括用有效抗這一種或多種害蟲中的一種或者另一種害蟲的氯硫尼定處理具有定向抗至少一種害蟲的轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子。
文檔編號A01N51/00GK1479574SQ01820056
公開日2004年3月3日 申請日期2001年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月6日
發(fā)明者J·阿斯拉, F·C·科恩, E·F·桑德斯, J 阿斯拉, 桑德斯, 科恩 申請人:孟山都技術(shù)有限公司