專利名稱：形成日本松蕈的人工shiro的方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請基于2001年1月26日提交的在先日本專利申請2001-018691，并要求其優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)引入本文作參考。
但是，在自然環(huán)境中，腐生生物和糖真菌優(yōu)先在美加紅松(即日本松蕈的宿主植物)生長的營養(yǎng)部位增殖。鑒于此，日本松蕈(共生真菌)難以形成其Shiro。
很久以前就曾進(jìn)行日本松蕈(Tricholoma Matsutake(S.Ito et Imai)Sing.)人工栽培的各種研究。但是，仍不能人工栽培日本松蕈。
日本松蕈人工栽培的研究結(jié)果將在以下進(jìn)行描述。
Masui試驗(yàn)表明日本松蕈形成與美加紅松根相連的菌根(Masui，K.(1927)，Mem.Coll.Sci.Kyoto Univ.B(2)2，149-279)。Tominaga研究了日本松蕈菌絲生長的最佳條件(Tominaga，Y.(1965)Bull.Hiroshima Agri.Coll.2242-246)。Ogawa等通過純性培養(yǎng)研究了日本松蕈子實(shí)體原基的形成(Ogawa，M和Hamada，M(1975)，Trans.Mycol.Soc.Japan 16406-415)。但是，還未見報(bào)道成功誘導(dǎo)日本松蕈Shiro形成。
為了完成本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)明者集中于日本松蕈菌絲生長極為緩慢的事實(shí)上。他們考慮菌絲生長緩慢可能是阻止日本松蕈人工栽培進(jìn)步的因素之一。到目前為止，為了大量生產(chǎn)日本松蕈，曾試圖通過將日本松蕈菌絲接種到宿主植物生長的森林中而人工形成新的Shiro。但是，通過此嘗試，日本松蕈菌絲沒有生長達(dá)到實(shí)際應(yīng)用程度地形成Shiro。因此，目前認(rèn)為難以人工栽培日本松蕈。
本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了能夠促進(jìn)日本松蕈菌絲生長的活性成分(active principle)。基于這一發(fā)現(xiàn)，他們建立了在短期內(nèi)增殖日本松蕈菌絲的方法，從而完成了本發(fā)明。更具體地說，通過以下描述的手段實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
(1)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作為活性成分的能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
(2)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作為活性成分的能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
(3)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作為活性成分的表面活性劑和/或天然植物油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
(4)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作為活性成分的脂肪酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
(5)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
(6)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
(7)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括
通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的表面活性劑和/或天然植物油的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
(8)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的脂肪酸酯的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
(9)按照(1)至(8)中的任一項(xiàng)的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中將含有濃度為0.2-10％(重量)的活性成分的溶液用作活性成分。
(10)按照(1)至(9)中的任一項(xiàng)的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中將用有機(jī)溶劑和蒸餾水制備的含有活性成分的溶液用作活性成分。
(11)按照(1)至(10)中的任一項(xiàng)的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中將粒積為3毫米或3毫米以下的土壤或粒積為2毫米或2毫米以下的人工培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基。
(12)按照(1)至(11)中的任一項(xiàng)的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中將活性成分以含有活性成分的溶液的狀態(tài)加入培養(yǎng)基中，且含有活性成分的溶液與總重量的重量比為15-30％(重量)。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將在下面的敘述中闡明，部分將從說明書中明顯得出，或者可以在本發(fā)明的實(shí)踐中得到。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)可以通過本文以下特別指出的手段和組合實(shí)現(xiàn)并得到。


圖1顯示通過加入吐溫80，日本松蕈菌絲的量的增加。
圖2顯示通過加入橄欖油，日本松蕈菌絲的量的增加。
作為本發(fā)明中使用的日本松蕈菌株，可以使用可從ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)得到的商品化菌株，如ATCC 34979、ATCC34981和ATCC 34988。優(yōu)選地，從商品化的菌株中篩選優(yōu)良菌株并可以將其投入使用。
日本松蕈菌株可以在通常在本領(lǐng)域中用于供養(yǎng)共生真菌的培養(yǎng)基中增殖，這些培養(yǎng)基諸如Ohta培養(yǎng)基(Ohta，A.(1990)Trans.Mycol.Soc.Japan 31323-334)、MMN培養(yǎng)基(Marx，D.H.(1969)Phytopathology 59153-163)，以及Hamada培養(yǎng)基(Hamada(1964)Matsutake(日本松蕈)，97-100)。在它們中，從其增殖效率的角度而言，Ohta培養(yǎng)基優(yōu)選用于日本松蕈菌株的增殖。通常，培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基(例如瓊脂)或液體培養(yǎng)基。
通常，日本松蕈菌株在暗處，在約20-25C的溫度下無菌傳代培養(yǎng)。
在本發(fā)明中，可以使用在上述培養(yǎng)基中在上述條件下傳代培養(yǎng)的任何日本松蕈儲備菌株的菌絲。活性成分的類型及其制備在本發(fā)明的一個(gè)方面，在含有作為活性成分的能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。在本發(fā)明中，能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)沒有特別的限制，只要其增強(qiáng)菌絲的細(xì)胞膜通透性。幾種類型的這些物質(zhì)可以組合使用。認(rèn)為這種能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)促進(jìn)酶，如纖維素酶(存在于菌絲中)從菌絲的釋放。這些能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的優(yōu)選的實(shí)例可以是表面活性劑和天然植物油。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在含有作為活性成分的能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。在本發(fā)明中，能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)沒有特別的限制，只要其促進(jìn)菌絲侵入培養(yǎng)基并對增加菌絲吸收營養(yǎng)物的量有貢獻(xiàn)。幾種類型的這些物質(zhì)可以組合使用。能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的優(yōu)選的實(shí)例可以是表面活性劑和天然植物油。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在含有作為活性成分的表面活性劑和/或天然植物油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲?？梢院斜砻婊钚詣┗蛱烊恢参镉妥鳛榛钚猿煞郑蛘呖梢院卸?。在本發(fā)明中，只要物質(zhì)在表面活性劑或天然植物油的范疇內(nèi)，即使其不一定控制菌絲的細(xì)胞膜通透性，也可以用作本發(fā)明的活性成分。類似地，在本發(fā)明中，只要物質(zhì)在表面活性劑或天然植物油的范疇內(nèi)，即使其不一定增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)，也可以用作本發(fā)明的活性成分。
在本發(fā)明中使用的表面活性劑沒有特別的限制，只要其被稱為表面活性劑。優(yōu)選地，可以使用非離子表面活性劑，更優(yōu)選地，可以使用吐溫類表面活性劑，如吐溫80和吐溫40。幾種類型的表面活性劑可以組合使用。
在本發(fā)明中使用的天然植物油沒有特別的限制，只要其被稱為天然植物油。例如，可以使用橄欖油、紅花油或葡萄籽油。幾種類型的天然植物油可以組合使用。
按照另一方面，在本發(fā)明中優(yōu)選使用的活性成分還可以是脂肪酸酯。在本發(fā)明的一個(gè)方面，在含有作為活性成分的脂肪酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。在本發(fā)明中，脂肪酸酯優(yōu)選是高級脂肪酸酯，更優(yōu)選是具有12-18個(gè)碳原子的脂肪酸酯，進(jìn)一步優(yōu)選是具有12-18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸酯，更進(jìn)一步優(yōu)選是油酸酯。例如，可以將含有上述優(yōu)選脂肪酸酯的脂肪和油用作活性成分。幾種類型的脂肪酸酯可以組合用作活性成分。并且，脂肪酸酯可以與能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的非脂肪酸酯物質(zhì)組合使用。脂肪酸酯可以與能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的非脂肪酸酯物質(zhì)組合使用。
脂肪酸酯可以在本發(fā)明中用作活性成分這一事實(shí)被認(rèn)為與一些表面活性劑和天然植物油含有上述脂肪酸酯這一事實(shí)密切相關(guān)。因此，如果一種物質(zhì)在脂肪酸酯的范疇內(nèi)，且表面活性劑或天然植物油含有該物質(zhì)，自然其可以在本發(fā)明中用作活性成分。
上述活性成分優(yōu)選以含有活性成分的溶液的狀態(tài)加入培養(yǎng)基中。含有活性成分，如能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)(例如，表面活性劑和/或天然植物油)的溶液優(yōu)選如下制備用有機(jī)溶劑(優(yōu)選為乙醇)和蒸餾水將其稀釋至期望濃度，然后將其加入培養(yǎng)基中。含有能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的溶液優(yōu)選通過將其稀釋到0.2-10％(重量)的濃度而制備。類似地，含有能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的溶液優(yōu)選通過將其稀釋到0.2-10％(重量)的濃度而制備。
更具體地說，當(dāng)表面活性劑用作活性成分時(shí)，表面活性劑的稀釋濃度通常是0.2％(重量)或更高，優(yōu)選是0.2-10％(重量)，更優(yōu)選是1-5％(重量)。低于0.2％(重量)的稀釋濃度不優(yōu)選的原因是不能發(fā)生表面活性劑對菌絲生長的顯著影響。
當(dāng)天然植物油用作活性成分時(shí)，天然植物油的稀釋濃度通常是0.2％(重量)或更高，優(yōu)選是0.2-5％(重量)，更優(yōu)選是0.5-2％(重量)。類似地，低于0.2％(重量)的稀釋濃度不優(yōu)選的原因是不能發(fā)生天然植物油對菌絲生長的顯著影響。
在表面活性劑和天然植物油共同用作活性成分時(shí)，將總稀釋濃度設(shè)置在0.2％(重量)或更高，優(yōu)選是0.2-10％(重量)，更優(yōu)選是0.5-5％(重量)。
當(dāng)脂肪酸酯用作活性成分時(shí)，脂肪酸酯的稀釋濃度通常為0.2％(重量)或更高，優(yōu)選是0.2-10％(重量)，更優(yōu)選是0.5-5％(重量)。
含有活性成分的溶液優(yōu)選通過將其如下稀釋而制備。將活性成分，如能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)(例如表面活性劑和/或天然植物油)溶解在有機(jī)溶劑(優(yōu)選為乙醇)中，將得到的溶液攪拌5到10分鐘，得到勻勻溶液。然后，將蒸餾水加入到勻勻溶液中，得到含有期望濃度活性成分的溶液。有機(jī)溶劑的終濃度通常調(diào)到0.2-5％(重量)，優(yōu)選是約2％(重量)。用于制備溶液的有機(jī)溶劑沒有特別的限制，只要它對日本松蕈菌絲的生長沒有負(fù)面影響。優(yōu)選使用乙醇。例如，含有1％(重量)吐溫80的溶液可以通過將1克吐溫80(商品化的)和2毫升99.5％乙醇混和，然后向其中加入98毫升蒸餾水而制備。以這種方式，可以制備含有活性成分，如表面活性劑和/或天然植物油的均勻溶液(本文以下也稱為“含有活性成分的制備溶液”)。培養(yǎng)基的制備用于添加上述活性成分(如能夠控制日本松蕈菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì))的培養(yǎng)基沒有特別的限制，只要日本松蕈菌絲能夠在其中生長。從自然環(huán)境中采集的土壤和人工培養(yǎng)基(例如，比例為1∶1的土壤和蛭石)都可以用作培養(yǎng)基。在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用黑土，其含有Kanto Plain的壤土層作為基底。
這種培養(yǎng)基優(yōu)選通過篩進(jìn)行篩分，使培養(yǎng)基的粒積較小并且均一。優(yōu)選將土壤粒積調(diào)節(jié)到約3毫米或3毫米以下，更具體地說，調(diào)節(jié)到約2-3毫米。對于人工培養(yǎng)基的情況，優(yōu)選將粒積調(diào)節(jié)到約2毫米或2毫米以下，更具體地說，調(diào)節(jié)到約1-2毫米。
如上所述使粒積均一的培養(yǎng)基可通過干熱干燥。作為實(shí)例，如果在約60℃進(jìn)行約20-30小時(shí)，那么干熱是充分的。
向干燥的培養(yǎng)基中加入前述活性成分。優(yōu)選地，向干燥的培養(yǎng)基中加入含有期望濃度活性成分如表面活性劑和/或天然植物油的制備溶液。此時(shí)，制備溶液優(yōu)選在培養(yǎng)基中完全擴(kuò)散，使得所得的培養(yǎng)基不以濕狀態(tài)獲得，而以接觸干燥(dry-touched)的狀態(tài)獲得。換句話說，優(yōu)選將培養(yǎng)基制備為含有制備溶液的量為總重量的15-30％(重量)，更優(yōu)選是20-25％(重量)。將活性成分如表面活性劑和/或天然植物油加入培養(yǎng)基中，然后將其滅菌，并用作日本松蕈菌絲的培養(yǎng)基。滅菌可以通過，例如在120℃高壓滅菌30分鐘或者50-60千戈瑞的γ-射線照射而進(jìn)行。
用這種方式制備的培養(yǎng)基適于日本松蕈菌絲生長。日本松蕈菌絲的培養(yǎng)將如上述制備的含有活性成分的培養(yǎng)基加入無菌容器(培養(yǎng)皿等)中。將含有日本松蕈菌絲的菌絲溶液接種到無菌容器中的培養(yǎng)基中，使菌絲溶液在培養(yǎng)基中完全擴(kuò)散。日本松蕈菌絲的培養(yǎng)可以在25±1℃在暗處進(jìn)行。培養(yǎng)日本松蕈菌絲1到3個(gè)月后，取一片生長的菌絲(即Shiro)作為樣品，基于麥角固醇的量確定菌絲的生長量。麥角固醇可以如下定量。將Shiro樣品凍干(EYELA，F(xiàn)DU-830)后，取1克樣品，并用2.5毫升乙醇(99.5％)提取。將得到的提取物加載于HPLC(高效液相色譜；HITACHI，L-7300柱，L-7400UV檢測器；L-7200自動(dòng)進(jìn)樣器；L-7100泵；D-7500積分儀)以定量提取物中的麥角固醇。就定量過程的細(xì)節(jié)而言，應(yīng)參閱Martin等，(1990)Mycol.Res.941059-1064。培養(yǎng)開始約1周后，觀察到菌絲在培養(yǎng)基的表面上生長。培養(yǎng)開始約4周后，發(fā)現(xiàn)菌絲的生長量增加。
如上所述，當(dāng)在含有活性成分(例如，表面活性劑和/或天然植物油)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲時(shí)，該日本松蕈菌絲的生長量明顯高于在不含活性成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的日本松蕈菌絲的生長量。根據(jù)本發(fā)明的形成人工Shiro的方法，可能在短至幾個(gè)月的培養(yǎng)期間形成含有菌絲的Shiro，其含菌絲的量相當(dāng)于產(chǎn)日本松蕈森林中的天然Shiro所含菌絲的量。因此，本發(fā)明的人工Shiro形成方法極為有用，因?yàn)槠涑蔀槿斯ぴ耘嗳毡舅赊Φ幕A(chǔ)。
如上所述，可以通過在含有前述活性成分如能夠控制日本松蕈菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)(例如，表面活性劑和/或天然植物油)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈的人工Shiro。優(yōu)選地，首先制備活躍生長的日本松蕈菌絲接種物，然后在含有前述活性成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該接種物。制備活躍生長的日本松蕈菌絲接種物的方法包括(1)誘導(dǎo)日本松蕈菌絲生長的步驟，和(2)制備日本松蕈菌絲接種物的步驟。
以下將解釋這兩個(gè)步驟。兩個(gè)步驟均無菌進(jìn)行。
(1)誘導(dǎo)日本松蕈菌絲生長的步驟通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來進(jìn)行誘導(dǎo)日本松蕈菌絲生長的步驟。
在這一步驟中，作為日本松蕈菌絲菌落，可以使用在固體培養(yǎng)基上無菌傳代培養(yǎng)的日本松蕈菌絲菌落。優(yōu)選地，可以通過取一片在固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)的菌落，將其接種到具有相同成分的液體培養(yǎng)基中，并在20-25℃在暗處進(jìn)一步培養(yǎng)2-3周而制備菌落(即，菌絲體)。
從培養(yǎng)基中取一片前述菌落，將具有相同成分的新鮮液體培養(yǎng)基加入菌落中，并將其無菌均化，從而得到菌絲細(xì)胞的懸浮液。本文中的無菌均化指每個(gè)菌絲細(xì)胞本身不被破壞，但是彼此分離。例如，無菌均化可以通過使用干熱滅菌勻漿器在超凈工作臺中進(jìn)行。可以用勻漿器均化菌落，勻漿器的轉(zhuǎn)速為80×100轉(zhuǎn)/分鐘到120×100轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選為100×100轉(zhuǎn)/分鐘，均化約4到8秒，優(yōu)選是6秒。
將通過均化得到的菌絲細(xì)胞的懸浮液在相同的液體培養(yǎng)基中在前述條件下進(jìn)一步培養(yǎng)3-5天。以這種方式，可能獲得活躍生長的日本松蕈菌絲的懸浮液。
通過均化上述菌落，將形成菌落的每個(gè)菌絲細(xì)胞粗略地彼此分離。由于分離，可以獲得具有快速生長能力的日本松蕈菌絲細(xì)胞。估計(jì)這是因?yàn)?，與菌落形式的菌絲細(xì)胞相比，每個(gè)分離的菌絲細(xì)胞從培養(yǎng)基中高速攝取營養(yǎng)，這加速菌絲細(xì)胞的頂端生長。
(2)制備日本松蕈菌絲接種物的步驟通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有上述步驟(1)中得到的誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而進(jìn)行制備日本松蕈菌絲接種物的步驟。
更具體地說，接種物的制備可以如下進(jìn)行。首先通過使用尼龍篩孔濾器(平均孔徑大小為24×30微米)過濾含有日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基(優(yōu)選是含有在上述步驟(1)中得到的具有快速生長能力的日本松蕈菌絲的液體培養(yǎng)基)。
然后，將通過過濾得到的菌絲用經(jīng)改性使其不含碳源的液體培養(yǎng)基(本文以下也稱為“改性液體培養(yǎng)基”)無菌淋洗。優(yōu)選用10毫升改性液體培養(yǎng)基進(jìn)行至少三次淋洗。用于淋洗的改性液體培養(yǎng)基沒有特別的限制，只要其是通過從能夠用于菌絲培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中去除碳源而得到的。優(yōu)選地，使用通過從SH液體培養(yǎng)基中去除葡萄糖而制備的改性液體培養(yǎng)基(Schenk R.U.和Hildebrandt A.C.(1972)Can.J.Bot.50199-204)。
淋洗菌絲后，將適量改性液體培養(yǎng)基加入菌絲，從而獲得菌絲接種物，其中初始液體培養(yǎng)基被不含碳源的改性液體培養(yǎng)基代替。
當(dāng)使用步驟(1)和(2)中制備的活躍生長的菌絲接種物誘導(dǎo)日本松蕈的人工Shiro時(shí)，本發(fā)明的有利效果更為顯著。
(1)日本松蕈菌絲接種物的制備從日本松蕈菌株(Tm 89；保存于本發(fā)明的發(fā)明者的實(shí)驗(yàn)室)儲備菌絲取一片菌絲，在Ohta瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周。Ohta培養(yǎng)基的成分如下。
表1 Ohta培養(yǎng)基
*N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸**無機(jī)溶液(每1000毫升)FeCl35毫克，MnSO4·4-6H2O50毫克，ZnSO4·7H2O 300毫克，CoSO4·7H2O 50毫克，CuSO4·5H2O 100毫克，NiSO4·6H2O 200毫克，乙酰丙酮3毫升***維生素溶液(每1000毫升)鹽酸硫胺素300毫克，煙酸5毫克，葉酸3毫克，生物素5毫克，鹽酸吡多醇0.5毫克，氯化肉堿1毫克，腺嘌呤·硫酸·2H2O 3毫克，氯化膽堿3毫克。
將生長的菌絲從瓊脂培養(yǎng)基以2毫米×2毫米的大小切下，并將其在新鮮液體Ohta培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。將得到的菌絲菌落用勻漿器均化并再培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，將得到的菌絲用無葡萄糖的液體培養(yǎng)基(改性SH液體培養(yǎng)基)淋洗三次，并懸浮于同樣的無葡萄糖液體培養(yǎng)基中。以這種方式制備日本松蕈菌絲接種物。無葡萄糖培養(yǎng)基的成分如下所示。
表2 改性SH液體培養(yǎng)基
(2)表面活性劑(吐溫80)添加劑的制備將吐溫80(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯，可從WakoPure Chemical Industries，Ltd.得到)與99.5％乙醇混合，并攪拌5分鐘。向得到的吐溫80/乙醇溶液中加入蒸餾水，以制備吐溫80添加劑。例如，通過將1克吐溫80(商品化的)加入到2毫升99.5％的乙醇中，接著加入98毫升蒸餾水而制備1％(重量)的吐溫80添加劑。乙醇的終濃度為約2％(重量)。
(3)用于培養(yǎng)日本松蕈菌絲的土壤的制備土壤取自東京大學(xué)校園矮灌木下的位置。通過篩對土壤進(jìn)行篩分，以將粒積調(diào)節(jié)至3毫米或3毫米以下。將土壤(粒積均一)用干熱滅菌器在60℃干燥24小時(shí)。將含有0％(重量)、1％(重量)、2％(重量)或5％(重量)吐溫80的吐溫80添加劑(在實(shí)施例1的步驟(2)中制備)加入土壤中并充分混合。在含有0％(重量)吐溫80的添加劑的情況中，加入與含1％(重量)、2％(重量)和5％(重量)吐溫80的吐溫80添加劑的情況中等量的乙醇，乙醇濃度在每種吐溫80添加劑中為2％。這樣制備土壤以使其含有占總重量20％(重量)的吐溫80添加劑，然后將土壤在高壓滅菌器中于121℃滅菌30分鐘。以這種方式得到用于培養(yǎng)日本松蕈菌絲的土壤。
(4)日本松蕈菌絲的接種將用于培養(yǎng)的土壤(實(shí)施例1步驟(3)中制備)以30毫升的量加入無菌培養(yǎng)皿(直徑為90毫米)中。將5毫升日本松蕈菌絲溶液(即實(shí)施例1步驟(1)中制備的接種物)接種到培養(yǎng)皿中的土壤中，以使其在土壤中完全擴(kuò)散。此后，將培養(yǎng)皿在暗處于25±1℃培養(yǎng)。培養(yǎng)開始1個(gè)月后，測定麥角固醇的量以確定菌絲的量，麥角固醇是日本松蕈菌絲細(xì)胞膜的成分(Martin等，(1990)Mycol.Res.941059-1064)。麥角固醇的量指示日本松蕈菌絲的量。麥角固醇量的測定如下進(jìn)行從每個(gè)樣品收集土壤(1克)，從中提取麥角固醇，并定量。作為對照，從產(chǎn)日本松蕈森林(Ina，Nagano縣，十月，2000年)中的天然Shiro取土壤，并進(jìn)行相同的測定。從麥角固醇的測定結(jié)果(
圖1)發(fā)現(xiàn)，通過加入吐溫80使日本松蕈菌絲的生長顯著增強(qiáng)。另一方面，來自產(chǎn)日本松蕈森林(Ina)的天然Shiro中麥角固醇的量為59.68微克/克干燥土壤。
(2)天然植物油(橄欖油)添加劑的制備將橄欖油(Ajinomoto Co.Inc.)與99.5％的乙醇混合，并攪拌5分鐘。向所得的橄欖油/乙醇溶液混合物中加入蒸餾水，以制備橄欖油添加劑。例如，通過將1克橄欖油(商品化的)和2毫升99.5％的乙醇混合，接著加入98毫升蒸餾水而制備含有1％(重量)橄欖油的添加劑。乙醇的終濃度為約2％(重量)。
(3)用于培養(yǎng)日本松蕈菌絲的土壤的制備除了將含有0％、1％或2％橄欖油的橄欖油添加劑(在實(shí)施例2步驟(2)中制備)加入用于培養(yǎng)的土壤中之外，以與實(shí)施例1步驟(3)中所描述的相同的方式進(jìn)行用于培養(yǎng)日本松蕈菌絲的土壤的制備。
(4)日本松蕈菌絲的接種將用于培養(yǎng)的土壤(實(shí)施例2步驟(3)中制備)以30毫升的量加入無菌培養(yǎng)皿(直徑90毫米)中。將5毫升日本松蕈菌絲溶液(即，實(shí)施例2步驟(1)中制備的接種物)接種到培養(yǎng)皿中的土壤中，以使其在土壤中完全擴(kuò)散。此后，將培養(yǎng)皿在暗處于25±1℃培養(yǎng)。培養(yǎng)開始3個(gè)月后，測定麥角固醇的量以確定菌絲的量，麥角固醇是日本松蕈菌絲細(xì)胞膜的成分(Martin等，(1990)Mycol.Res.941059-1064)。麥角固醇量的測定如下進(jìn)行從每個(gè)樣品收集土壤(1克)，從中提取麥角固醇，并定量。作為對照，從產(chǎn)日本松蕈森林(Ina，Nagano縣，十月，2000年)中的天然Shiro取土壤，并進(jìn)行相同的測定。從麥角固醇的測定結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，通過加入橄欖油使日本松蕈菌絲的生長顯著增強(qiáng)。另一方面，來自產(chǎn)日本松蕈森林(Ina)的天然Shiro中麥角固醇的量為59.68微克/克干燥土壤。通過加入橄欖油，經(jīng)3個(gè)月的培養(yǎng)后所得到的人工Shiro中的麥角固醇量增加，其水平幾乎與來自產(chǎn)日本松蕈森林的天然Shiro中的水平相同。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)目前，還沒有實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)日本松蕈。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，通過向培養(yǎng)基如無菌土壤或人工培養(yǎng)基中加入活性成分，如能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)和/或能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)，將日本松蕈菌絲的生長誘導(dǎo)到令人滿意的水平，而不使用其他營養(yǎng)成分。本發(fā)明的方法在以下方面具有優(yōu)勢在短時(shí)期內(nèi)形成日本松蕈Shiro，其含有與產(chǎn)日本松蕈森林中的天然存在的Shiro同樣量的菌絲。
可以通過使用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的人工Shiro將日本松蕈菌絲直接接種到天然美加紅松森林中。本發(fā)明的快速形成日本松蕈的人工Shiro的方法成為建立人工栽培日本松蕈技術(shù)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易想到的。因此，本發(fā)明不限于本文所示和描述的具體細(xì)節(jié)和代表性實(shí)施方案。因此，在不背離本所附權(quán)利要求書所定義的總的發(fā)明構(gòu)思的實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改。
權(quán)利要求
1.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作為活性成分的能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
2.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作為活性成分的能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
3.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作為活性成分的表面活性劑和/或天然植物油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
4.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作為活性成分的脂肪酸酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
5.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
6.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
7.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的表面活性劑和/或天然植物油的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
8.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通過無菌均化日本松蕈菌絲菌落，并在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)得到的菌絲來誘導(dǎo)日本松蕈菌絲的生長；通過用不含碳源的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基無菌替換含有誘導(dǎo)生長的日本松蕈菌絲的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基而制備日本松蕈菌絲接種物；以及在含有作為活性成分的脂肪酸酯的培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)日本松蕈菌絲接種物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任一項(xiàng)權(quán)利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于將含有濃度為0.2-10％(重量)的活性成分的溶液用作活性成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任一項(xiàng)權(quán)利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于將含有用有機(jī)溶劑和蒸餾水制備的活性成分的溶液用作活性成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任一項(xiàng)權(quán)利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于將粒積為3毫米或3毫米以下的土壤或粒積為2毫米或2毫米以下的人工培養(yǎng)基用作培養(yǎng)基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)權(quán)利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于將活性成分以含有活性成分的溶液的狀態(tài)加入培養(yǎng)基中，且含有活性成分的溶液與總重量的重量比為15-30％(重量)。
全文摘要
本發(fā)明涉及形成日本松蕈的人工Shiro的方法,所述方法包括在含有作為活性成分的能夠控制菌絲的細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲;本發(fā)明還涉及另一種形成日本松蕈的人工Shiro的方法,所述方法包括在含有作為活性成分的能夠增強(qiáng)菌絲的親水性質(zhì)的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)日本松蕈菌絲。
文檔編號A01G1/04GK1366804SQ0210285
公開日2002年9月4日 申請日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月26日
發(fā)明者鈴木和夫, 亞歷克西·介朗－朗蓋特, 祿敏·瓦里奧 申請人:東京大學(xué)