專利名稱：一種動(dòng)物精子的性別分選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物精子的性別分選方法。
家畜性別的人為控制技術(shù)較多，主要涉及的環(huán)節(jié)包括胎兒水平，如超聲性別鑒別，胚胎水平，如胚胎的性別鑒定和精子水平，如體外精子性別分選。前兩者均在胚胎形成后進(jìn)行性別鑒定，因此，造成50％的胚胎和50％載育母體的資源浪費(fèi)。同時(shí)，胚胎的體外性別鑒定，不但會(huì)對(duì)胚胎自身造成創(chuàng)傷，還可以導(dǎo)致母體的受孕率降低。所以，體外精子的性別分選和利用分選后的精子進(jìn)行人工授精，生產(chǎn)期望性別的子代，是家畜繁殖研究工作者的一個(gè)重要課題。
幾十年來(lái)，人們嘗試了多種方法來(lái)分離攜帶X染色體的精子(雌性)和攜帶Y染色體的精子(雄性)，但這些方法大都缺乏良好的可靠性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。流式細(xì)胞分選技術(shù)是目前公認(rèn)的可靠，準(zhǔn)確性高和高效率的精子分選方法，其原理是根據(jù)攜帶X染色體的精子與攜帶Y染色體的精子DNA含量的不同，通過熒光染色，使被激發(fā)后的X精子熒光量大于Y精子的熒光量，通過高精確度的檢測(cè)和捕獲系統(tǒng)，收集具有期望特性的精子，從而達(dá)到分選的目的(美國(guó)專利5135759 5985216 6071689)。但這一技術(shù)的不足之處是，作為商業(yè)化生產(chǎn)，其費(fèi)用太高，同時(shí)精子分選后的活力損失較大，影響授精效果。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種動(dòng)物精子的性別分選方法，包括以下步驟1)將動(dòng)物的原精液用稀釋液稀釋后，進(jìn)行熒光染色；2)在4℃條件下用細(xì)胞流式儀對(duì)精液進(jìn)行分選，獲得需要類型的精子。
分選得到的精子在4℃條件下濃縮后即可凍存?zhèn)溆谩?br> 為了確保被分選精子的活力，所述稀釋液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃中的至少一種物質(zhì)，所述檸檬酸鈉、果糖和蛋黃占緩沖液的重量百分比分別為0.2-1.6％、0.5-1.5％和5-25％。
其中，優(yōu)選的稀釋液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有0.2-1.6％的檸檬酸鈉、0.5-1.5％的果糖和5-25％蛋黃(占緩沖液的重量百分比)。
為了使精子在分選期間的溶液環(huán)境與凍存液相近，以保存精子活力，所述分選用鞘液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃中的至少一種物質(zhì)，所述檸檬酸鈉、果糖和蛋黃占緩沖液的重量百分比分別為0.2-1.6％、0.5-1.5％和2-10％。
其中，優(yōu)選的鞘液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有0.2-1.6％的檸檬酸鈉、0.5-1.5％的果糖和2-10％的蛋黃(占緩沖液的重量百分比)。
上述稀釋液和鞘液中所用的基礎(chǔ)緩沖液為多樣的，只要是能夠被動(dòng)物細(xì)胞接受的緩沖液均可，例如可以是磷酸緩沖液、生理鹽水或臺(tái)式緩沖液等。
利用本發(fā)明的方法對(duì)動(dòng)物精子進(jìn)行分選，通過控制環(huán)境溫度和分選過程中緩沖液及鞘液的組分，降低了精子的能量消耗和緩沖液對(duì)精子平衡的影響，縮短了分選后至冷凍所需的時(shí)間，在保持現(xiàn)有的分選精確度和分選速度的基礎(chǔ)上，明顯提高了分選后冷凍精液的活力及質(zhì)量，分選周期明顯縮短，分選費(fèi)用顯著降低，分選方法更為簡(jiǎn)單，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，具有巨大的商業(yè)價(jià)值。
與現(xiàn)有的動(dòng)物精子分選技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有以下幾方面的突出優(yōu)點(diǎn)1、現(xiàn)有的分選技術(shù)在熒光染色后，所有的操作均在室溫下進(jìn)行。由于分選過程所需時(shí)間較長(zhǎng)，而在室溫下，精子一直處于有力活動(dòng)狀態(tài)，耗能大，可導(dǎo)致部分精子死亡。同時(shí)精子在冷凍前，需在4℃條件下平衡2-3小時(shí)以保存精子應(yīng)有的活力，因此分選周期較長(zhǎng)。本發(fā)明巧妙地通過控制環(huán)境溫度，使熒光染色后的精子，在分選前、分選中及分選后均置于4℃環(huán)境中，一方面降低了精子的活動(dòng)及能量消耗，同時(shí)使精子在熒光染色后即進(jìn)入必要的4℃平衡狀態(tài)，顯著縮短了精子在采集后至凍存所需的時(shí)間，即提高了精子成活率，又縮短了分選周期。
2、在現(xiàn)有的動(dòng)物精子分選技術(shù)中，原精液的稀釋液有含牛血清白蛋白(BSA)的Hepes緩沖液，有含有乳酸、丙酮酸、白蛋白的臺(tái)氏緩沖液，有含BSA的Tris緩沖液等，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，精子在上述緩沖液中長(zhǎng)時(shí)間放置，可明顯影響其活力。本發(fā)明創(chuàng)造性地設(shè)計(jì)了含有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃的稀釋液，使精子活力在分選期間內(nèi)，基本上能夠保持常規(guī)精液的活力。
3、在現(xiàn)有的動(dòng)物精子分選技術(shù)中，分選用鞘液有生理鹽水，磷酸緩沖液，臺(tái)氏緩沖液等，其組成同凍存液相差較大，影響精子活力的維持，同時(shí)這些緩沖液均需含有0.1％-1.0％的牛血清白蛋白，且用量較大，而牛血清白蛋白價(jià)格較高，致使分選成本昂貴。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種含有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃的緩沖液作為鞘液，使精子在分選期間的溶液環(huán)境，與凍存液基本相近，一方面使精子活力得以保存，另一方面使分選成本得以大大下降。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
圖2為用本發(fā)明的方法分選得到的精子PCR反應(yīng)后的電泳圖。
在該實(shí)施例中，如果想得到Y(jié)精子，則在細(xì)胞流式儀上對(duì)精液進(jìn)行Y型分選。
在該實(shí)施例中，所用的稀釋液和鞘液中還可以只加檸檬酸鈉、果糖和蛋黃三中物質(zhì)中的一種或二種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入一種或二種物質(zhì)時(shí)雖然精子的存活率及準(zhǔn)確性略有下降，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，差異不顯著(P≤0.05)。
實(shí)施例2、用流式細(xì)胞分析法鑒定本發(fā)明方法精子分選的準(zhǔn)確性將用實(shí)施例1的方法分選得到的精子用超聲破碎儀去除精子的尾巴，然后再經(jīng)熒光染色，在細(xì)胞流式儀上分析其分選純度。結(jié)果如


圖1所示，連續(xù)5次分選結(jié)果表明，經(jīng)X分選后，X精子的純度為92.2±3.1％(89-95％)，Y分選后，Y精子的純度為93.5±3.8％(90-96％)。
實(shí)施例3、用PCR法鑒定本發(fā)明方法精子分選的準(zhǔn)確性用實(shí)施例1的方法獲得分選精子。將分選后的精子通過多級(jí)稀釋，選取含有單一精子的試管進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用BOV97m引物特異性擴(kuò)增Y染色體片段，采用利用牛1.715衛(wèi)星DNA序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增?；蚪MDNA片段作為陽(yáng)性控制。PCR擴(kuò)增采用2-3級(jí)放大法，即在完成第一級(jí)35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)后，取一半反應(yīng)液加入另一反應(yīng)管中進(jìn)行第二級(jí)35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)放大，以陽(yáng)性DNA對(duì)照片段出現(xiàn)為有效反應(yīng)。分析100個(gè)分選后精子的結(jié)果表明，如圖2所示，X分選后X精子占91％，Y分選后Y精子占93％，說明本發(fā)明方法可靠、準(zhǔn)確。
實(shí)施例4、不同分選溫度對(duì)精子活力的影響取采集的新鮮奶牛精液，分為室溫、4℃分選和4℃不分選三組，在實(shí)施例1介紹的緩沖液中，32℃溫育40分鐘后，4℃分選和4℃不分選組均置于4℃冷藏箱中，室溫組置于25℃條件下，然后在預(yù)先調(diào)好的細(xì)胞流式儀上進(jìn)行精液的分選，4℃分選組在4℃條件下分選，室溫組在25℃條件下分選，4℃不分選組在4℃條件下平衡。分選后將所有的精子凍存，然后復(fù)溫，記錄存活率。
結(jié)果表明4℃不分選和4℃分選的精子存活率基本相近，分別為51.5±8.6％和48.9±9.2％。而室溫組的精子存活率明顯低于前者，為40.2±10.5％，說明分選期間環(huán)境溫度影響精子的存活率及復(fù)溫后精子的質(zhì)量。
實(shí)施例5、不同精液稀釋液對(duì)精子質(zhì)量的影響取采集的新鮮奶牛精液，分別用含1％BSA的HEPES液，含1％BSA的臺(tái)氏液和含1％BSA的Tris液及實(shí)施例1中本發(fā)明的磷酸稀釋液稀釋，32℃溫育40分鐘，置于4℃冷藏箱，然后在4℃環(huán)境經(jīng)細(xì)胞流式儀分選，濃縮并凍存所有分選后的精液，再?gòu)?fù)溫，記錄存活率。
結(jié)果表明HEPES液精子存活率為42.6±9.8％，臺(tái)氏液精子存活率為45.9±8.2％，Tris液精子存活率為38.9±12.2％，本發(fā)明稀釋液精子存活率為47.6±8.9％，說明本發(fā)明所設(shè)計(jì)的稀釋液不僅造價(jià)低廉，同時(shí)可保持良好的精子質(zhì)量。
實(shí)施例6、不同鞘液對(duì)于分選精子質(zhì)量的影響取采集的新鮮奶牛精液，分為含1％BSA的臺(tái)氏液組，含1％BSA的磷酸緩沖液組和實(shí)施例1中介紹的本發(fā)明鞘液組。按照實(shí)施例1的方法用本發(fā)明的磷酸稀釋液稀釋，并用上述不同的鞘液在4℃環(huán)境下，經(jīng)細(xì)胞流式儀分選，濃縮，凍存，然后復(fù)溫，記錄精子存活率。
結(jié)果表明，臺(tái)氏液組精子存活率為48.6±10.2％，磷酸緩沖液組精子存活率為43.9±7.6％，本發(fā)明鞘液組精子存活率為50.8±8.9％，說明本設(shè)計(jì)鞘液不僅造價(jià)低廉，同時(shí)可保持良好的精子質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物精子的性別分選方法，包括以下步驟1)將動(dòng)物的原精液用稀釋液稀釋后，進(jìn)行熒光染色；2)在4℃條件下用細(xì)胞流式儀對(duì)精液進(jìn)行分選，獲得需要類型的精子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于分選得到的精子在4℃條件下濃縮后凍存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述稀釋液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃中的至少一種物質(zhì)，所述檸檬酸鈉、果糖和蛋黃占緩沖液的重量百分比分別為0.2-1.6％、0.5-1.5％和5-25％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述基礎(chǔ)緩沖液為磷酸緩沖液、生理鹽水或臺(tái)式緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述稀釋液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃，它們占緩沖液的重量百分比分別為0.2-1.6％、0.5-1.5％和5-25％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述基礎(chǔ)緩沖液為磷酸緩沖液、生理鹽水或臺(tái)式緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述分選用鞘液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃中的至少一種物質(zhì)，所述檸檬酸鈉、果糖和蛋黃占緩沖液的重量百分比分別為0.2-1.6％、0.5-1.5％和2-10％。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述基礎(chǔ)緩沖液為磷酸緩沖液、生理鹽水或臺(tái)式緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述鞘液為在基礎(chǔ)緩沖液的基礎(chǔ)上加有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃，它們占緩沖液的重量百分比分別為0.2-1.6％、0.5-1.5％和2-10％。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的動(dòng)物精子的性別分選方法，其特征在于所述基礎(chǔ)緩沖液為磷酸緩沖液、生理鹽水或臺(tái)式緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種動(dòng)物精子的性別分選方法。本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物精子的性別分選方法，用該方法分選的精子在保證分選精度的基礎(chǔ)上，能夠確保被分選后的精子活力，并且成本低，適用于商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟1.將動(dòng)物的原精液用稀釋液稀釋后，進(jìn)行熒光染色；2.在4℃條件下用細(xì)胞流式儀對(duì)精液進(jìn)行分選，獲得需要類型的精子。分選得到的精子在4℃條件下濃縮后即可凍存?zhèn)溆?。為了確保被分選精子的活力，所述稀釋液及分選用鞘液均含有檸檬酸鈉、果糖和蛋黃中的至少一種物質(zhì)。用本發(fā)明的方法分選動(dòng)物精子，明顯提高了分選后冷凍精液的活力及質(zhì)量，分選時(shí)間短，分選費(fèi)用低，分選方法簡(jiǎn)單，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，具有巨大的商業(yè)價(jià)值。
文檔編號(hào)A61D19/00GK1443519SQ0210414
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2002年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月11日
發(fā)明者劉鳳鳴, 劉世明, 賈俊英 申請(qǐng)人:劉鳳鳴