專利名稱：一種海洋真菌培養(yǎng)物的提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種南海紅樹林內(nèi)生真菌培養(yǎng)物的提取物及其制備方法，以及該提取物在制備抗棉鈴蟲和魚類寄生蟲中華鳋的農(nóng)藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉鈴蟲Heliothis armigera(Hühner)是棉花蕾鈴期主要害蟲之一。棉鈴蟲發(fā)生期早、為害時(shí)間長(zhǎng)、發(fā)生量大、發(fā)生面廣、發(fā)生不平衡，世代重疊。適應(yīng)性強(qiáng)是90年代棉鈴蟲發(fā)生重的內(nèi)因，棉鈴蟲食性雜，除為害棉花外，還能取食玉米、小麥、大豆、花生、果樹、蔬菜等多種植物，繁殖力強(qiáng)，產(chǎn)卵量大，對(duì)溫度的適應(yīng)范圍廣，使棉鈴蟲得以充分利用各種植物資源最大限度地繁衍種群。不合理用藥，棉鈴蟲抗藥性增強(qiáng)，天敵減少，90年代以前棉鈴蟲僅在少數(shù)年份發(fā)生重，大部分年份發(fā)生較輕，發(fā)生為害集中，在卵高峰期用藥即可。進(jìn)入90年代后，棉鈴蟲接連大發(fā)生，為害時(shí)間長(zhǎng)，在卵高峰用藥偏遲，有的甚至完全憑借經(jīng)驗(yàn)，有蟲三遍藥，無(wú)蟲藥三遍，沒(méi)有抓住防治的最佳時(shí)期。連續(xù)使用同一種或作用機(jī)制相同的同一類藥劑，任意加大使用濃度或降低用量，使用次數(shù)增多，任意藥劑復(fù)配，導(dǎo)致田間較高的藥劑選擇壓力，使抗性種群不斷擴(kuò)大，棉鈴蟲的抗性增強(qiáng)。過(guò)早使用化學(xué)農(nóng)藥，殺傷大量棉鈴蟲天敵，破壞了良好的生態(tài)環(huán)境，失去了天敵對(duì)棉鈴蟲的控制作用，形成了惡性循環(huán)。
抗藥性棉鈴蟲是嚴(yán)重為害棉花和多種作物的害蟲，近年來(lái)在我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域以及新疆等主要產(chǎn)棉區(qū)發(fā)生量大，并且對(duì)常用的3種不同類型化學(xué)農(nóng)藥即有機(jī)磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥均產(chǎn)生了不同程度的抗性，尤其是對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的抗性發(fā)展速度最快，給有效防治造成了很大困難，使我國(guó)的棉花生產(chǎn)遭受了很大損失。因此，從海洋微生物中開發(fā)研究生物農(nóng)藥以防治抗藥性棉鈴蟲具有重要意義。
中華鳋(Sinergasilus spp)是魚的常見嚴(yán)重寄生蟲，常常造成魚減產(chǎn)和大批死亡。目前防治此類寄生蟲的藥劑主要是敵百蟲等藥劑。這些藥劑的長(zhǎng)期使用已造成寄生蟲對(duì)藥劑產(chǎn)生抗藥性。因此，尋找新的生物農(nóng)藥是當(dāng)務(wù)之急。[潘金培，魚病診斷與防治手冊(cè)，上?？萍汲霭嫔?上海)，1997，P117-126；陳萬(wàn)義等，新農(nóng)藥研究與開發(fā)，化學(xué)工業(yè)出版社，(北京)，1995，P121-143]從海洋生物中尋找新的生物農(nóng)藥，是一種有效的途徑。一個(gè)非常成功的例子是日本開發(fā)的巴丹，它是從海洋沙蠶毒素發(fā)展出來(lái)的，是一種高效廣譜的農(nóng)藥，占日本殺蟲劑總消耗量20％以上，并大量出口。[龍康侯，巫中德，海洋天然產(chǎn)物化學(xué)(第一卷)，海洋出版社(北京)，1983，P282]本發(fā)明所涉及的海洋真菌是一種紅樹林內(nèi)生真菌。植物內(nèi)生真菌(Endophytic fung)生活在高等植物的組織中，對(duì)于內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝物的研究還較為缺乏，據(jù)保守的估計(jì)內(nèi)生真菌的種類繁多，大約有1.5×106種，由于數(shù)量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態(tài)關(guān)系，使這類真菌成為潛在的具有產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝物的來(lái)源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有潛在農(nóng)藥價(jià)值的海洋真菌培養(yǎng)物的提取物及其提取分離方法，以及該提取物在制備抗棉鈴蟲和魚類寄生蟲中華鳋農(nóng)藥的用途。
本發(fā)明所用的海洋真菌是南海紅樹林內(nèi)生真菌NO1893，該真菌已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCCNOM202035，保藏日為2002年9月9日。該真菌以下簡(jiǎn)稱為海洋真菌CCTCC M202035。
本發(fā)明的海洋真菌培養(yǎng)物提取物，是海洋真菌CCTCC M202035培養(yǎng)物的乙酸乙酯提取物中的有效部分油狀物。
本發(fā)明提取物可以從海洋真菌CCTCC M202035的培養(yǎng)物(發(fā)酵液)的乙酸乙酯提取物中提取分離而得到。其具體制備方法包括以下步驟a.海洋真菌CCTCC M202035的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(按重量比)葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯化鈉3-5，水100；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養(yǎng)5-7天；b.海洋真菌CCTCC M202035的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量比)葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，氯化鈉3-5，水100；將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1-2月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗，然后用乙酸乙酯/石油醚＝50％為洗脫劑洗脫；e.收集50％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，濃縮得棕色油狀物即為所需的本發(fā)明提取物。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的提取物(油狀物)能殺死棉鈴蟲和魚類寄生蟲中華鳋。具體效果可達(dá)到1000μg/ml，24hr，100％殺滅棉鈴蟲；1.2μg/ml，48hr，100％殺滅中華鳋。所以，本發(fā)明的提取物可用于制備抗棉鈴蟲的農(nóng)藥和用于制備抗魚類寄生蟲中華鳋的農(nóng)藥。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1 本發(fā)明提取物——棕色油狀物的分離制備方法a.真菌NO1893的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(按重量比)葡萄糖1，酵母提取物0.1，蛋白胨0.2，瓊脂1，氯化鈉3，水100；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，35℃培養(yǎng)7天；b.真菌NO1893的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(按重量比)葡萄糖2kg，酵母提取物0.2kg，蛋白胨0.4kg，氯化鈉6kg，水200L；將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1.5月；
c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的50L，用等量乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，得到8g濃縮物，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗，然后用乙酸乙酯/石油醚＝50％為洗脫劑洗脫；e.收集洗脫液，濃縮得棕色油狀物3.3g。實(shí)施例2 本發(fā)明提取物——棕色油狀物殺滅中華鳋和棉鈴蟲活性試驗(yàn)1.抗棉鈴蟲試驗(yàn)將實(shí)施例1得到的棕色油狀物按1000μg/ml進(jìn)行系列濃度稀釋，然后均勻地將其噴霧到菜心葉子上，自然晾干后，將人工養(yǎng)殖的2～3齡棉鈴蟲用毛筆接到各處理的葉子上，在26℃的條件下養(yǎng)殖，每24小時(shí)調(diào)查一次各處理棉鈴蟲的死亡百分率，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。結(jié)果1000μg/ml，24hr，100％殺滅棉鈴蟲。
2.抗魚類寄生蟲中華鳋的試驗(yàn)用500ml三角瓶將實(shí)施例1得到的棕色油狀物進(jìn)行系列濃度稀釋，然后將中華鳋接到各處理的三角瓶中，在26℃的條件下養(yǎng)殖，每4小時(shí)調(diào)查一次各處理中華鳋的死亡百分率，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1的結(jié)果數(shù)據(jù)可知本發(fā)明提取物對(duì)魚類寄生蟲中華鳋具有明顯的殺滅作用，而且存在明顯的量效關(guān)系當(dāng)8μg/ml濃度時(shí)，4小時(shí)便能100％殺滅害蟲；而從1.2-2μg/ml，則需要48小時(shí)；0.8μg/ml，基本無(wú)活性.。
表1.本發(fā)明提取物對(duì)中華鳋的殺滅效果

權(quán)利要求
1.一種海洋真菌培養(yǎng)物的提取物，其特征是該提取物是海洋真菌CCTCC M202035培養(yǎng)物的乙酸乙酯提取物中的有效部分油狀物。
2.權(quán)利要求1所述提取物的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟a.海洋真菌CCTCC M202035的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，瓊脂1-1.5，氯化鈉3-5，水100；制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培養(yǎng)5-7天；b.海洋真菌CCTCC M202035的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，粗海鹽1.5，水100；將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25-35℃靜置1-2月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體；d.將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/3-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以乙酸乙酯/石油醚＝15％清洗后，再用乙酸乙酯/石油醚＝50％為洗脫劑洗脫；e.收集50％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，濃縮得棕色油狀物即為所需的提取物。
3.權(quán)利要求1所述的提取物用于制備抗棉鈴蟲的農(nóng)藥。
4.權(quán)利要求1所述的提取物用于制備抗魚類寄生蟲中華鳋的農(nóng)藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種南海紅樹林內(nèi)生真菌的培養(yǎng)物的乙酸乙酯提取物有效部分油狀物及其制備方法和該提取物在制備殺滅棉鈴蟲[Heliothis armigera(Hühner)]和魚類寄生蟲中華鳋(Sinergasilus spp)的農(nóng)藥中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1409967SQ0213496
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2002年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者林永成, 陳光英, 佘志剛, 李厚金, 周世寧, 林壁潤(rùn), 關(guān)利平 申請(qǐng)人:中山大學(xué)