專利名稱：大豆莖尖轉(zhuǎn)化超聲波輔助的外源基因?qū)敕椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆莖尖轉(zhuǎn)化超聲波輔助的外源基因?qū)敕椒?，是一種利用超聲波為輔助手段的外源基因?qū)氪蠖梗瑥亩牧即蠖沟倪z傳性狀的的操作方法，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明在農(nóng)桿菌介導(dǎo)BT基因?qū)Υ蠖骨o尖轉(zhuǎn)化的過程中，采用了超聲波輔助方法，大豆種子經(jīng)萌發(fā)、預(yù)培養(yǎng)之后，進(jìn)行農(nóng)桿菌感染時(shí)輔以超聲波侵染處理，使種子在一定選擇壓力超聲波的空氣化效應(yīng)過程中，氣泡團(tuán)閉合形成瞬間高壓，連續(xù)不斷的高壓象一連串小“爆炸”不斷的沖擊材料表面，造成許多微損傷，避免了以往用刀割傷口對(duì)外植體造成的過度損傷，同時(shí)也增加了農(nóng)桿菌與外植體之間的接觸面積，提高農(nóng)桿菌的感染效率。再經(jīng)共培養(yǎng)、不定芽培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根，得到轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
本發(fā)明的方法包括如下具體步驟1.取大豆種子用自來水反復(fù)沖洗，放在70％的酒精中浸泡0.5～1分鐘，轉(zhuǎn)入含有飽和次氯酸鈉溶液中浸泡15分鐘，用無菌水沖洗4～5次，然后將種子置于無菌水中浸泡18～24小時(shí)，使種子萌發(fā)。
2.剝?nèi)シN皮，去除子葉，在解剖鏡下去除兩片原葉，暴露出頂端分生組織區(qū)，從中取出約0.5cm的莖尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。
3.將預(yù)培養(yǎng)的莖尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理15～20分鐘。
4.侵染完畢，將材料取出，用無菌濾紙吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天。
5.轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液體)連續(xù)培養(yǎng)3天，每天換新鮮培養(yǎng)基。
6.轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固體)，每2周轉(zhuǎn)接一次，至不定芽出現(xiàn)伸長(zhǎng)到2～3cm。
7.切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
本發(fā)明采用超聲波在外植體上制造微小傷口，增加了農(nóng)桿菌與外植體之間的接觸面積，在導(dǎo)入BT基因的過程中起到了很好的效果，與普通農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法相比，明顯提高了農(nóng)桿菌的感染效率，有效的提高了出芽數(shù)量和轉(zhuǎn)化苗的數(shù)量。
取大豆種子用自來水反復(fù)沖洗，放在70％的酒精中浸泡0.5分鐘，轉(zhuǎn)入含有飽和次氯酸鈉溶液中浸泡15分鐘，用無菌水沖洗4次，然后將種子置于無菌水中浸泡18小時(shí)。剝?nèi)シN皮，去除子葉，在解剖鏡下去除兩片原葉，暴露出頂端分生組織區(qū)，從中取出約0.5cm的莖尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，使種子萌發(fā)。
將預(yù)培養(yǎng)的莖尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理20分鐘。
侵染完畢，將材料取出，用無菌濾紙吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天。
轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液體)連續(xù)培養(yǎng)3天，每天換新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固體)，每2周轉(zhuǎn)接一次，至不定芽出現(xiàn)伸長(zhǎng)到2cm。
切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
獲得轉(zhuǎn)BT基因的大豆植株東43號(hào)34株。
取大豆種子用自來水反復(fù)沖洗，放在70％的酒精中浸泡1分鐘，轉(zhuǎn)入含有飽和次氯酸鈉溶液中浸泡15分鐘，用無菌水沖洗5次，然后將種子置于無菌水中浸泡24小時(shí)。剝?nèi)シN皮，去除子葉，在解剖鏡下去除兩片原葉，暴露出頂端分生組織區(qū)，從中取出約0.5cm的莖尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，使種子萌發(fā)。
將預(yù)培養(yǎng)的莖尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理15分鐘。
侵染完畢，將材料取出，用無菌濾紙吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天。
轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液體)連續(xù)培養(yǎng)3天，每天換新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固體)，每2周轉(zhuǎn)接一次，至不定芽出現(xiàn)伸長(zhǎng)到3cm。
切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根20天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
獲得轉(zhuǎn)BT基因的大豆植株吉林27號(hào)36株。
取大豆種子用自來水反復(fù)沖洗，放在70％的酒精中浸泡0.7分鐘，轉(zhuǎn)入含有飽和次氯酸鈉溶液中浸泡15分鐘，用無菌水沖洗5次，然后將種子置于無菌水中浸泡19小時(shí)。剝?nèi)シN皮，去除子葉，在解剖鏡下去除兩片原葉，暴露出頂端分生組織區(qū)，從中取出約0.5cm的莖尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)，使種子萌發(fā)。
將預(yù)培養(yǎng)的莖尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理18分鐘。
侵染完畢，將材料取出，用無菌濾紙吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天。
轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液體)連續(xù)培養(yǎng)3天，每天換新鮮培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固體)，每2周轉(zhuǎn)接一次，至不定芽出現(xiàn)伸長(zhǎng)到2cm。
切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根18天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
獲得轉(zhuǎn)BT基因的大豆植株合豐35號(hào)37株。
本發(fā)明的方法能適合于大豆轉(zhuǎn)各種基因，能快速得到較高頻率的大豆轉(zhuǎn)化植株。
權(quán)利要求
1.一種大豆莖尖轉(zhuǎn)化超聲波輔助的外源基因?qū)敕椒ǎ涮卣髟谟诎ㄈ缦虏襟E1)大豆種子沖洗后放在70％的酒精中浸泡0.5～1分鐘，轉(zhuǎn)入含有飽和次氯酸鈉溶液中浸泡15分鐘，用無菌水沖洗后將種子置于無菌水中浸泡18～24小時(shí)，使種子萌發(fā)；2)去種皮，去除子葉，在解剖鏡下去除兩片原葉，暴露出頂端分生組織區(qū)，從中取出約0.5cm的莖尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)；3)將預(yù)培養(yǎng)的莖尖取出，置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于功率500W、工作頻率50kHz的超聲波洗器中，超聲波侵染處理15～20分鐘；4)侵染完畢，將材料取出，用無菌濾紙吸干，放入MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天；5)轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液體)連續(xù)培養(yǎng)3天，每天換新鮮培養(yǎng)基；6)轉(zhuǎn)入MSB+6-BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固體)，每2周轉(zhuǎn)接一次，至不定芽出現(xiàn)伸長(zhǎng)到2～3cm；7)切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
全文摘要
一種大豆莖尖轉(zhuǎn)化超聲波輔助的外源基因?qū)敕椒?，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)BT基因?qū)Υ蠖骨o尖轉(zhuǎn)化的過程中，采用了超聲波輔助方法，大豆種子經(jīng)萌發(fā)、預(yù)培養(yǎng)之后，進(jìn)行農(nóng)桿菌感染時(shí)輔以超聲波侵染處理，再經(jīng)共培養(yǎng)、不定芽培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根，得到轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。本發(fā)明采用超聲波在外植體上制造微小傷口，增加了農(nóng)桿菌與外植體之間的接觸面積，在導(dǎo)入BT基因的過程中起到了很好的效果，明顯提高了農(nóng)桿菌的感染效率，有效地提高了出芽數(shù)量和轉(zhuǎn)化苗的數(shù)量。
文檔編號(hào)A01H1/06GK1411702SQ0215077
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月28日
發(fā)明者邱承祥, 武天龍, 馬曉紅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)