專利名稱：超聲波輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超聲波輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法，是一種生物培養(yǎng)的工藝，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案中，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織區(qū)的方式，在感染過程中采用超聲波輔助轉(zhuǎn)化來提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明將大豆種子經(jīng)過消毒后放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)，去除頂芽并造成表皮分生細(xì)胞損傷，作為外植體，放在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，在超聲場(chǎng)中進(jìn)行農(nóng)桿菌感染，通過在功率500W、工作頻率50kHz的超聲波條件下空氣化效應(yīng)過程中，氣泡團(tuán)閉合形成瞬間高壓，連續(xù)不斷的高壓象一連串小“爆炸”不斷的沖擊材料表面，造成許多微損傷，以避免以往用刀割傷口對(duì)外植體造成的過度損傷，15～20分鐘處理后，取出放在共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，放在含有頭孢霉素的除菌培養(yǎng)基上除菌，再用一定量的硫酸卡那霉素加入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，誘導(dǎo)生根移栽，得到較多的再生苗和轉(zhuǎn)化的大豆植株。
本發(fā)明的具體方法包括如下步驟1.大豆種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，去頂芽并制造傷口，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天。
2.置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理15～20分鐘。農(nóng)桿菌感染10～20分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上除菌2周。
3.除菌后的外植體放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽。伸長(zhǎng)到1～2cm時(shí)切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm。
4.切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆直至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步。本發(fā)明在轉(zhuǎn)化過程中輔助采用超聲波和特定的培養(yǎng)基，形成高頻的轉(zhuǎn)化植株。與用子葉、子葉節(jié)等外植體相比，本發(fā)明的外植體在一定的超聲波條件下、一定的時(shí)間處理后，進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化更易再生不定芽，這些再生不定芽更易伸長(zhǎng)成植株，具有較高的轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)時(shí)間80～110天，能縮短20～30天。與普通農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法相比，轉(zhuǎn)化率更是大幅度提高。
種子消毒后接種在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天；
去頂芽制造傷口得到外植體；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；置于100ml的三角瓶中，加入制備好的B.t基因農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理15分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L培養(yǎng)基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培養(yǎng)基上每2周轉(zhuǎn)接一次，篩選至出現(xiàn)不定芽，長(zhǎng)至1～2cm時(shí)可切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根15～20天；移栽到大盆，獲得轉(zhuǎn)B.t.基因的大豆植株合豐35號(hào)71株。
種子消毒后接種在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天；去頂芽制造傷口得到外植體；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；置于100ml的三角瓶中，加入制備好的gna基因農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理18分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L培養(yǎng)基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培養(yǎng)基上每2周轉(zhuǎn)接一次，篩選至出現(xiàn)不定芽，長(zhǎng)至1～2cm時(shí)可切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根15～20天；移栽到大盆，獲得轉(zhuǎn)gna基因的大豆植株合豐35號(hào)75株。
種子消毒后接種在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天；去頂芽制造傷口得到外植體；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；置于100ml的三角瓶中，加入制備好的pta基因農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于超聲波洗器(功率500W，工作頻率50kHz)的中央，超聲波侵染處理20分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L培養(yǎng)基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培養(yǎng)基上每2周轉(zhuǎn)接一次，篩選至出現(xiàn)不定芽，長(zhǎng)至1～2cm時(shí)可切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根15～20天；移栽到大盆，獲得轉(zhuǎn)pta基因的大豆植株合豐35號(hào)71株。
本發(fā)明的方法適合于大豆轉(zhuǎn)各種基因，能快速、較高頻率得到大豆轉(zhuǎn)化植株。
權(quán)利要求
1.一種超聲波輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于具體包括如下步驟1)大豆種子經(jīng)過消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，去頂芽并制造傷口，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天；2)置于100ml的三角瓶中，加入制備好的農(nóng)桿菌菌液(OD600nm≈0.5)，三角瓶浸于功率500W，工作頻率50kHz的超聲波洗器中央，超聲波侵染處理15～20分鐘，農(nóng)桿菌感染10～20分鐘，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上除菌2周；3)除菌后的外植體放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽，伸長(zhǎng)到1～2cm時(shí)切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；4)切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆直至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
全文摘要
一種超聲波輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法，將種子經(jīng)過消毒放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)，取去除頂芽后的外植體，放在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，在超聲場(chǎng)中進(jìn)行農(nóng)桿菌感染，通過在一定的超聲波條件下空氣化效應(yīng)過程中，氣泡團(tuán)閉合形成的瞬間高壓造成許多微損傷，以避免刀割傷口對(duì)外植體造成的過度損傷，處理后取出放在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，放在含有卡那霉素的除菌培養(yǎng)基上除菌，放在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上篩選不定芽，然后誘導(dǎo)生根移栽。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織區(qū)的方式，在感染過程中采用超聲波輔助轉(zhuǎn)化的方法，從而提高轉(zhuǎn)化率，得到較多的轉(zhuǎn)化植株。
文檔編號(hào)A01H3/00GK1411703SQ0215077
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月28日
發(fā)明者武天龍, 邱承祥, 馬曉紅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)