專利名稱：真空滲透輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真空滲透輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法，是一種生物培養(yǎng)的工藝，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案中，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織區(qū)的方式，在大豆轉(zhuǎn)化過(guò)程中輔助采用真空滲透法，來(lái)達(dá)到提高轉(zhuǎn)化率的效果。本發(fā)明先將大豆種子消毒后放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)五天，去除頂芽，并造成表皮分生細(xì)胞損傷，作為外植體放在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，再進(jìn)行真空條件下農(nóng)桿菌感染，放在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。通過(guò)在0.06-0.08MPa真空壓力條件下、處理10～20分鐘后，放在含有卡那霉素的除菌培養(yǎng)基上除菌，放在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上篩選不定芽，然后在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根移栽，得到較多的再生苗和轉(zhuǎn)化的大豆植株。
本發(fā)明的具體方法包括如下步驟1、大豆種子經(jīng)過(guò)消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，去頂芽并制造傷口，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天。
2、在0.06-0.08MPa真空壓力條件下，農(nóng)桿菌感染10～20分鐘(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上除菌2周。
3、除菌后的外植體放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽。伸長(zhǎng)到1～2cm時(shí)切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm。
4、切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆直至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，具有突質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，與用子葉、子葉節(jié)等外植體相比，用本發(fā)明的外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在一定的超聲波條件下、一定的時(shí)間處理后，進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化更易再生不定芽。這些再生不定芽能更易伸長(zhǎng)成植株，具有較高的轉(zhuǎn)化率；培養(yǎng)時(shí)間80～110天，能縮短20～30天。與普通農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法相比，轉(zhuǎn)化率更是大幅度提高。
種子消毒后接種在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天；去頂芽制造傷口得到外植體；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；在0.06MPa真空壓力條件下，感染具有B.t.基因農(nóng)桿菌10分鐘(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L培養(yǎng)基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培養(yǎng)基上每2周轉(zhuǎn)接一次，篩選至出現(xiàn)不定芽，長(zhǎng)至1～2cm時(shí)切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根15天；移栽到大盆，獲得轉(zhuǎn)B.t.基因的大豆植株合豐35號(hào)71株。
種子消毒后接種在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天；去頂芽制造傷口得到外植體；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；在0.08MPa真空壓力條件下，感染具有g(shù)na.基因農(nóng)桿菌15分鐘(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L培養(yǎng)基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培養(yǎng)基上每2周轉(zhuǎn)接一次，篩選至出現(xiàn)不定芽，長(zhǎng)至1～2cm時(shí)切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根18天；移栽到大盆，獲得轉(zhuǎn)gna基因的大豆植株合豐35號(hào)77株。
種子消毒后接種在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天；去頂芽制造傷口得到外植體；放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；在0.07MPa真空壓力條件下，感染具有pta基因農(nóng)桿菌20分鐘(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天；放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L培養(yǎng)基上除菌2周；放在MSB+卡那霉素80mg/L培養(yǎng)基上每2周轉(zhuǎn)接一次，篩選至出現(xiàn)不定芽，長(zhǎng)至1～2cm時(shí)可切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；切下不定芽放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根20天；移栽到大盆，獲得轉(zhuǎn)pta基因的大豆植株合豐35號(hào)74株。
本發(fā)明的方法適合于大豆轉(zhuǎn)各種基因，能快速、較高頻率得到大豆轉(zhuǎn)化植株。
權(quán)利要求
1.一種真空滲透輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于包括如下具體步驟1)大豆種子經(jīng)過(guò)消毒，放在MSB+6-BA0.4mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，去頂芽并制造傷口，得到外植體，放在MSB+6-BA10mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)一天；2)在0.06-0.08MPa真空壓力條件下，農(nóng)桿菌感染10～20分鐘(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+頭孢霉素300mg/L+羧芐青霉素300mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上除菌2周；3)除菌后的外植體放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，每2周轉(zhuǎn)接一次，進(jìn)行篩選至出現(xiàn)不定芽，伸長(zhǎng)到1～2cm時(shí)切除子葉，至伸長(zhǎng)到3～4cm；4)切下外植體上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH5.8)培養(yǎng)基上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化芽誘導(dǎo)生根15～20天，移栽到大盆直至獲得轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的種子。
全文摘要
一種真空滲透輔助大豆原位叢生芽轉(zhuǎn)化的方法，將種子經(jīng)過(guò)消毒放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)，取去除頂芽后的外植體，放在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，在真空條件下進(jìn)行一定時(shí)間的農(nóng)桿菌感染處理后，放在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。取出后放在含有卡那霉素的除菌培養(yǎng)基上除菌，放在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上篩選不定芽，然后誘導(dǎo)生根移栽。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化腋芽分生組織區(qū)的方式，在感染過(guò)程中采用真空滲透的方法，從而提高轉(zhuǎn)化率，得到較多的轉(zhuǎn)化植株。
文檔編號(hào)A01H3/00GK1411704SQ0215077
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月28日
發(fā)明者武天龍, 馬曉紅, 邱承祥, 唐冬梅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)