專利名稱：哺乳類動物的臟器保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在生物體外長期保存哺乳類動物的臟器的技術(shù)。
背景技術(shù)：
人類的肺、心臟、肝臟、腎臟、胰腺等臟器的臨床移植治療早已被實用化、日?；?，但相對于每年增加的等待移植的患者的捐贈者不足的問題非常嚴重，等待手術(shù)的時間延長了。另外，即使臟器移植的捐贈者出現(xiàn)了，目前的狀況是像血液這樣長期保存或者供給體制的配備不充分。
特別是在移植臟器方面，低溫保存是主流，對臟器移植的有效的保存時間的界限是保存約4～24小時(Cooper JD，Patterson GA，Trulock EPet all；J.Thorac.Cardiovasc.Surg.107，460-471，1994)。
在實際使用University of Winsconsin Solution液(UWS液)進行的大鼠、兔子、狒狒的摘出心臟的低溫保存和再生中，限度為6～18小時(Makowka I，Zerbe TR，Champman F，et all；Transplant Proc.21，1350，1989 and Yen T，Hanan SA，Johson DE，et all；Ann.Thorac.Surg.49，932，1990)。
另外，組合使用該UWS液和全氟化碳介質(zhì)保存大鼠的心臟并移植成功，為24小時(5只全部)到48小時(5只中的4只)(Kuroda Y，KawamuraT，Tanioka T，et all；Transplantation，59，699-701，1995)。該理由的根據(jù)在于摘出的心臟一旦暴露在4℃的低溫或者受到缺血傷害，則細胞膜受到損傷，因此組織細胞不能再生(Pegg DE；Organ presevation.Surg，Clin.Notth Am.66，617，1986OzMC，Pinsky DJ，Koga S，et all；Circulation 88，291-297，1993and Heffner JE，Pepine JERev.Pespir.Dis.140，531-554，1989)。
哺乳動物的活體組織的長期保存·再生的技術(shù)一直只在血液、精子、卵子等單細胞方面進行開發(fā)。有關(guān)作為細胞的集合的組織或者由若干個組織構(gòu)成的臟器的低溫保存，也正在朝實用化進行，總之，目前的狀況是必須在最大24小時以內(nèi)進行移植(Kalayoglu M，Sollinger HW，Strarra RJ，et all；Lancet，2，617，1988)。
附帶說一下，海藻糖是在自然界廣泛分布的非還原性的二糖類，據(jù)報導(dǎo)在各種應(yīng)激下，對細胞膜構(gòu)造具有穩(wěn)定化或保護的作用(Crowe JH，CroweLM，Chapman D；Science 233，701-703，1984 and Wiemken A；Ant inei VanLeeunwenhoek.58，209-217，1990)。據(jù)報導(dǎo)，心臟一旦暴露在4℃的低溫或者受到缺血傷害，海藻糖就會對細胞膜顯示出保護作用(Stringham JC，Southhard JH，Hegge J，et all；Transplantation，58，287-294，1992and Hirata T，F(xiàn)ukuse T，Liu CJ，et all；Surgery，115，102-107，1994)。另外，據(jù)報導(dǎo)，在緩步類動物的高靜水壓實驗中，一旦成為無水狀態(tài)，則海藻糖增大10倍(Crowe JH，Crowe LM，Chapman D；Science 233，701-703，1984 and Crowe JH，Crowe LM，Chapman D，Aurell Wistorm C；Biochemical Journal，242，1-10，1987)。該緩步類動物由約40000個細胞構(gòu)成，是也具有神經(jīng)細胞的多細胞生物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了干燥狀態(tài)的緩步類動物等在全氟化碳液中，可以耐受所謂極限為600Mpa這樣的高水壓環(huán)境的負荷，保持著生命力(KunihiroSeki et al；Nature Vol.395，No.6705，pp.853-854，29 Oct.1998，和特開平11-289917號；該內(nèi)容引入本說明書中，作為參考)。緩步類動物的干燥狀態(tài)通過大桶狀態(tài)或酒桶狀態(tài)形成。其生理機理雖然不十分明了，但可知緩步類動物的體內(nèi)的水分量極端減少，成為脫水狀態(tài)。
上述以往的臟器的冷藏保存是通過降低臟器的溫度，使其代謝功能降低，從而維持其生存狀態(tài)。通過溫度降低，雖然代謝功能降低了，但在作為極性介質(zhì)的水分中存在豐富的離子，它們成了隨著時間流逝引起細胞的自崩潰、細胞死亡、壞死(Necrosis)的原因。
因而，冷藏保存的保存時間越長，就不可避免地具有嚴重的血栓或功能障礙急增的可能性，其保存時間存在質(zhì)的界限。
另一方面，一般動物的組織細胞如果沒有水分則不能生存。如果是由不同種組織構(gòu)成的高等臟器的話，容易預(yù)計由干燥狀態(tài)的再生是不可能的。以往已經(jīng)開發(fā)出干燥保存植物或各種細菌的技術(shù)，但還沒有看到干燥保存高等動物的器官本身之后使其再生的實驗例。
令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在一定的條件下，從哺乳類動物摘出的臟器除去大量的水，將該臟器浸在惰性介質(zhì)中并在低溫下保存時，達到和緩步類動物以酒桶狀態(tài)長時間維持生命時一樣的假死狀態(tài)(apparentdeath)狀態(tài)(特開2000-72601將該申請引入本說明書中，作為參考)。
特別令人驚奇的是，確認了哺乳類動物的多細胞且多組織的臟器從極度脫水狀態(tài)再生，以及再生的心臟的跳動。這些臟器的各細胞被認為處于氧消耗量極端地降低至正常時的1/1000或以下或者氧消耗實質(zhì)上停止了的假死狀態(tài)。
用特開2000-72601所公開的方法保存的臟器，再生后可以采集活的神經(jīng)或干細胞，可以將臟器自體或采集的組織用在移植治療中。另外，在病理組織學(xué)的研究中，重大的意義在于可以長期保存可再生的生物體材料而不是壞死的標本。
上述保存方法可以防止在活體外保存的臟器的細胞或組織的隨時間流逝的自崩潰，可以大幅度增加保存的天數(shù)，但該脫水方法依賴于與臟器接觸的脫水劑。為了進一步改良該保存方法，需要探索更優(yōu)異的脫水方法。
發(fā)明的公開本發(fā)明涉及哺乳類動物的心臟這樣的臟器的保存方法，包括從臟器除去水分且殘留可以再生的水分量的脫水步驟，和將臟器浸漬在惰性介質(zhì)中，保持在冷藏溫度下的步驟。
本發(fā)明的哺乳類動物的臟器的保存方法包括，脫水步驟，該步驟從含有生理學(xué)上正常水分量的臟器，通過其血管系統(tǒng)導(dǎo)出該臟器內(nèi)的水分，來除去相對于脫水前的臟器總重量，重量比為約10％或以上或25％或以上的水分，且相對于脫水前的總水分量，殘留重量比為約10～約20％或以上的水分；和將該臟器浸漬在惰性介質(zhì)中，并保持在冷藏溫度下的步驟。上述臟器可選自心臟、肝臟、腎臟、胰腺和肺。
本發(fā)明的哺乳類動物的心臟的保存方法包括，脫血步驟，該步驟將生理鹽水溶液灌注到心臟中，將心臟內(nèi)的血液置換為生理鹽水溶液；脫水步驟，該步驟從脫血的心臟，通過其血管系統(tǒng)導(dǎo)出該臟器內(nèi)的水分，來除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分；以及將該心臟浸漬在惰性介質(zhì)中，并保持在約1～約8℃的冷藏溫度的步驟。另外本發(fā)明理論上也可以包括除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約25％～約60％的水分的脫水步驟。
利用上述血管系統(tǒng)的脫水，包括向臟器或者心臟的血管系統(tǒng)送入氣體。例如，將氣體灌注到心臟的大動脈時，通過該氣體的流動，從該心臟的血管系統(tǒng)導(dǎo)出水分。即通過該氣體的流壓，水分被擠出到臟器外。優(yōu)選流壓是恒壓。而且，上述脫水步驟也可以進一步包括使脫水劑與浸漬在惰性介質(zhì)中的臟器接觸。特別是在使用氣體的脫水中，為了避免血液和灌注的氣體接觸而凝固的問題，優(yōu)選在脫水步驟之前，用生理鹽水溶液對臟器進行脫血處理。最優(yōu)選的是流壓是恒壓的脫血灌注。
送入到血管系統(tǒng)中的氣體優(yōu)選使用空氣、O2-CO2混合氣體，但也可以使用N2、He、Ar、Ne、Kr或者Xe等惰性氣體。例如，使用用于灌注生理鹽水溶液的灌注裝置，可以送入氣體來取代該生理鹽水溶液。通過向血管系統(tǒng)灌注氣體，臟器內(nèi)的體液被擠出，而且，從一個個細胞經(jīng)毛細管導(dǎo)出水分。
作為送入到血管系統(tǒng)中的液體，包括濃度比臟器的體液高的高滲溶液那樣的利用滲透壓差從細胞轉(zhuǎn)移水分的溶劑。另外也可以是后面所述的惰性介質(zhì)或者醇類。
通過上述介質(zhì)進入到上述血管系統(tǒng)的毛細管中而產(chǎn)生流壓，使氣體大致相等地到達全體臟器組織，因此，氣體在毛細管中循環(huán)(例如從動脈血管到靜脈血管)，能夠達到血管系統(tǒng)的另一端。該脫水由于利用在臟器中固有的水分供給路徑，所以可以以各個組織或細胞為目標，慢慢地制造出均勻的脫水狀態(tài)。即使是哺乳類動物的多細胞且多組織的臟器，也可以不對生物體組織施加無用的應(yīng)激，向高度的脫水狀態(tài)轉(zhuǎn)移。因而，通常即使是對生物體組織成為應(yīng)激的10wt％或以上或者25wt％或以上的脫水，臟器也可以不伴有缺血障礙或生物體組織的損傷，達到極其穩(wěn)定的假死狀態(tài)。于是，在恢復(fù)水分時，功能復(fù)原，不僅其細胞或組織，而且臟器自體的功能也可以再生。
一般假死狀態(tài)意指生物學(xué)上的假死，但在本發(fā)明中意圖的假死意指通過高度的脫水狀態(tài)，不能確認外觀上的生命現(xiàn)象，但在恢復(fù)水分時，可以再次確認生命現(xiàn)象的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂的“再生”意指從該脫水狀態(tài)恢復(fù)水分時，可以確認組織的電生理學(xué)反應(yīng)或者作為器官的生物學(xué)的生命活動的現(xiàn)象。
在其它方面，本發(fā)明涉及哺乳類動物的心臟的保存方法，包括，在含有生理學(xué)上正常水分量的臟器表面上形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內(nèi)的水分蒸發(fā)到該氣體中，由此除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約10％或以上的水分的步驟和將該臟器保持在約1～約8℃，優(yōu)選約2～約4℃的冷藏溫度下的步驟。
本發(fā)明還涉及哺乳類動物的心臟的保存方法，包括向心臟灌注生理鹽水溶液，將心臟內(nèi)的血液置換為生理鹽水溶液的脫血步驟、在脫血的心臟的表面形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內(nèi)的水分蒸發(fā)到該氣體中，由此除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分的步驟和將該臟器保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
采用本發(fā)明的方法，一旦除去來自臟器的組織和細胞的游離水，則難于受到可使生物體膜等的生物結(jié)構(gòu)在水相中活化的物質(zhì)，特別是金屬離子的攻擊。另外，可認為該生物結(jié)構(gòu)被其周圍被稱為結(jié)合水的結(jié)晶狀態(tài)的水包圍而受到保護。使生物組織惡化的極性介質(zhì)被除去的結(jié)果是，組織或細胞可以逃避不可逆的經(jīng)時崩潰，從而謀求臟器的保存狀態(tài)的質(zhì)的改善。此時，保存液中的海藻糖賦予生物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化。
通過將被加熱到體溫程度的體液或者代用體液，例如上述生理鹽水溶液、人工血液和/或血液灌注到其血管系統(tǒng)中，用本發(fā)明的方法保存的心臟、肝臟、腎臟、胰腺或者肺可以再生。對于再生的臟器，可以將該臟器或從該臟器采集的組織移植到人體中。另外，從再生的臟器采集神經(jīng)組織、其它活的組織或細胞，可用在藥理試驗等中。
另外，本發(fā)明可適用于以向人體異種移植為目的的除人之外的哺乳類動物的臟器，由此，可以提供因捐贈者不足估計在臨床上的需要增大的動物臟器的保存技術(shù)。特別是本發(fā)明在養(yǎng)殖的豬的心臟、肝臟、胰腺等的可大量生產(chǎn)的臟器的保存中也是有用的，提供可耐受長時間的輸送，尤其是超過數(shù)十小時的航空輸送的保存技術(shù)。
再者，如本發(fā)明可長期保存的技術(shù)對臟器庫的建立是有用的。例如，通過培養(yǎng)具有像胚胎干細胞這樣具有全能性的干細胞，可以再生所需的組織或器官，本發(fā)明可適用在它們的保存中。在發(fā)現(xiàn)疾病前，通過保存預(yù)備的臟器，發(fā)病后可馬上接受移植。而且本發(fā)明對腦或其它神經(jīng)組織等的保存也是有用的。
術(shù)語的定義本發(fā)明中所謂的“除去約10％或以上的水分”或“除去約25％或以上的水分”是指除去血管系統(tǒng)內(nèi)的體液以及各個細胞和細胞間的游離水。另外，本發(fā)明中所謂的“保留約10～約20％或以上的水分”是指包括在生物組織內(nèi)的結(jié)合水，對于再生具有充足量的水分。在本發(fā)明中，一般認為控制保存的臟器的新鮮度的主要是游離水的量，理論上，為了實現(xiàn)保存時間的長期化，優(yōu)選盡可能除去游離水。另外，為了保持再生能力，優(yōu)選殘留可以保持結(jié)合水的范圍的水分量。所謂結(jié)合水是可觀測到水合狀態(tài)或者結(jié)晶狀態(tài)的水，游離水可定義為結(jié)合水以外的水。
血管系統(tǒng)在解剖學(xué)上被分為血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)。本發(fā)明中所謂的“血管系統(tǒng)”優(yōu)選包括用于向臟器的各個細胞補充水分和養(yǎng)分的營養(yǎng)血管系統(tǒng)。另外，如果是心臟，可將灌注裝置和與心房和心室連接的固有的血管連接，向與心臟的營養(yǎng)血管系統(tǒng)連接的冠狀動脈和冠狀靜脈間接地施加流壓。進而，所謂像肝臟這樣的營養(yǎng)血管系統(tǒng)是具有另外與門脈循環(huán)有關(guān)的功能血管系統(tǒng)的臟器，也可以利用這樣的功能血管系統(tǒng)。
在本發(fā)明中所謂的“含有生理學(xué)上正常水分量的臟器”是指，典型地從活體摘出后的狀態(tài)的臟器，另外，例如在包括脫血步驟的發(fā)明中，可理解為是通過用于脫血的灌注，其血液被置換為生理鹽水溶液的狀態(tài)的臟器。將具有這樣的生理學(xué)上正常的水分量的臟器的重量作為基準，可以特別指定上述脫水量。
在本發(fā)明中所謂的“生理鹽水溶液”是和血液一樣的具備生物學(xué)活性的代用體液，已知代表性的是林格液(Ringer’s solution)，例如是KH(Kreps-Henseleit)液。可以在這種生理鹽水溶液中溶解使用有助于脫水狀態(tài)的生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的多糖類。這種多糖類優(yōu)選海藻糖。另外，作為其它的生物結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也可以將蘋果酸、甘露糖醇、甘油、甜菜堿、脯氨酸、1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-吡啶甲酸等氨基酸溶解在生理鹽水溶液中使用。
本發(fā)明中所謂的“惰性介質(zhì)”是在水和油中不溶解的介質(zhì)，是在保存溫度下為液狀的氟化烴液體，特別優(yōu)選全氟化碳液體。另外，只要滿足類似于其的條件，不限于液體，也可以使用氣體、溶膠或者凝膠。再者，作為其它惰性介質(zhì)，可以使用水銀或者硅酮油。
附圖的簡單說明


圖1是在實施例3的實驗8中紀錄的心電圖。
圖2是在實施例3的實驗9中紀錄的心電圖。
圖3是在實施例4的實驗1中紀錄的心電圖。
圖4是在實施例4的實驗2中紀錄的心電圖。
圖5是在實施例5的實驗中紀錄的心電圖。
實施發(fā)明的最佳方式包括利用血管系統(tǒng)的脫水的發(fā)明的方式一般來說，一旦血液和氣體接觸，或者暴露在低溫下，就會凝固而引起血栓，這會妨礙后面所述的脫水或者再生。因此，保存對象的臟器，例如通過手術(shù)摘出的臟器，要被洗凈，脫血。作為用于脫血的灌注裝置，可以使用公知的Langendorff的裝置，對于該脫血灌注的技術(shù)，作為Langendorff法(Doring H.J，Dehnert H；Biomesstechnik-Vertag MatchGmb，Germany，1988)，本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。按照Langendorff法，對于臟器，將灌注用的導(dǎo)管(或者套管)安裝到其血管系統(tǒng)的大動脈上，向血管系統(tǒng)送入海藻糖-KH(Kreps-Henseleit)混合液，將臟器的血液置換為生理鹽水溶液。對該生理鹽水溶液預(yù)先充入氧氣，臟器內(nèi)經(jīng)常被送入新鮮的代用液體。利用該灌注進行脫血時，臟器的溫度降低至1～8℃，使臟器的活動停止。脫血完了，接著進入脫水步驟。
脫水步驟利用在上述脫血中使用的Langendorff的裝置來完成。例如，在規(guī)定的流壓下，從灌注裝置向脫血完了的臟器的大靜脈送入氣體來代替生理鹽水溶液。人工灌注手段不限于單方面從大動脈送入氣體的手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解也包括在大動脈和大靜脈之間連接的封閉循環(huán)系統(tǒng)。即，上述氣體灌注不限于送入氣體的方法，也可以是將血管內(nèi)抽真空的方法。
利用上述灌注裝置向血管系統(tǒng)施加流壓時，生理鹽水溶液從臟器內(nèi)的大靜脈側(cè)流出，進行脫水。優(yōu)選進入到血管內(nèi)的氣體通過各個毛細血管流向大靜脈側(cè)，而且各個細胞和細胞間的水分因其蒸汽壓而進入到流過血管內(nèi)的氣體中。最終，各組織和細胞內(nèi)的游離水的大部分通過血管系統(tǒng)向臟器外排出。
利用上述血管系統(tǒng)的脫水與接觸脫水劑的處理不同，而是利用在臟器內(nèi)均勻分布的毛細血管的極其廣大的表面積的脫水，雖然是慢慢地，但可以在比較短的時間里將組織和各個細胞目標性脫水。與上述脫水劑相比較，脫水較均勻且脫水的臟器的變色情況也不嚴重，從這一點就可以看出其優(yōu)點。如后面所述的實施例所示，在利用氣體灌注的脫水中，實際上再生率非常高，且可以看到再生狀態(tài)的改善。另外，用氣體的脫水是從外部有效控制的主動的處理，對于要求迅速且慎重處理的臟器來說是應(yīng)激少且有效的手段。
送入到血管系統(tǒng)中的氣體可以是在市售的鋼瓶中裝滿的便宜的壓縮氣體。如果是O2-CO2混合氣體的話，優(yōu)選含有低于5％CO2的混合氣體。另外，在后面所述的實施例中，使用的是干燥的氣體，但也可以使用含有濕氣的氣體。而且作為脫水用的氣體，更優(yōu)選可使用N2、Ne、Ar、Ne、Kr或者Xe等惰性氣體。在惰性氣體中，Xe價格高，但由于有報導(dǎo)其對生物組織有麻醉作用，所以預(yù)期在本發(fā)明的脫水中使用Xe的優(yōu)點較大。另外，使用惰性氣體也意味著可以避免由活性氧造成的生物組織的損傷。
除了用上述氣體灌注的脫水之外，也可以輔助性合并使用保存時使脫水劑直接或間接地與臟器接觸的脫水方法。
在脫水步驟中使用脫水劑的場合，將調(diào)整到所需容量的脫水劑和臟器一起浸漬在后面所述的惰性介質(zhì)中的方法是簡單的。具體地說，將例如用硅膠、分子篩、沸石等包圍的臟器收納在相對于保存用的惰性介質(zhì)是惰性材質(zhì)的金屬絲網(wǎng)、合成纖維網(wǎng)等中，使它們浸漬在惰性介質(zhì)中。
使用的脫水劑的量可以從該臟器所需的后面所述的除水率來計算，另外，浸漬后，也可在適當(dāng)?shù)臅r間除去、追加或交換脫水劑。
另外，在本發(fā)明人的緩步類動物的實驗中，在高濕度，優(yōu)選80％濕度的環(huán)境下進行脫水處理時，再生率可達到100％。如果考慮此情形，可認為臟器在高濕度下進行脫水處理是優(yōu)選的。
上述氣體灌注的條件的一個例子是在0.05～0.2kgf/cm2，優(yōu)選0.1kgf/cm2的流壓下，1小時～1小時30分鐘或以上，將空氣灌注到大鼠的心臟的大動脈中。最優(yōu)選在恒壓下的灌注。通過這樣的空氣灌注，對于即將該脫水之前的臟器，可以達到25wt％或以上的除水率。
即將脫水前的臟器是具有代用體液，含有生理學(xué)上正常水分量的臟器，為了長期保存，從該水分量盡可能除去大量的游離水。在本發(fā)明中，用以下式表示的臟器總重量作為基準的水分除去率(重量比)規(guī)定應(yīng)該除去的水分量。
水分除去率(重量比)＝100-(脫水后的臟器總重量÷脫水前的臟器總重量×100)在特定上述脫水狀態(tài)時，除了作為重量比的水分除去率之外，還可以使用NMR，規(guī)定臟器內(nèi)的水分子的絕對量或其狀態(tài)。NMR是在生物組織中的水的狀態(tài)的研究中一直最為廣泛使用的手段。
對于使用NMR的生物組織中的水的最初的研究是由Belton，P.S.，Jackson，R.R.，Packer，K.J.Pulsed NMR studies of water in strainedmuscle，I.Transverse nuclear spin relaxat ion times and freezingeffects；Biochem.Biophys.Aata.28616-25(1972)報導(dǎo)的。而且，用NMR的水的結(jié)構(gòu)解析是由例如Hazlewood，C.F.，Chang，D.C.，Woessner，D.E.，Nichols，B.C.Nuclear magnetic resonance transverserelaxation times of water protons in skeletal muscle. Biophys.J.14583-605(1974)報導(dǎo)的。
Belton等下結(jié)論為水由3個狀態(tài)構(gòu)成，約8％的水分子是與細胞膜的內(nèi)膜、蛋白質(zhì)、核酸這樣的生物體內(nèi)分子結(jié)合的結(jié)合水，約82％的水分子是結(jié)合水以外的游離水，殘存的10％的水分子是與細胞膜的外側(cè)相接的游離水。該結(jié)合水和其它的水分子不同，確保一定優(yōu)勢的配行，基于和生物高分子直接結(jié)合的水分子，在數(shù)個分子層中處于定向的狀態(tài)。
一般可理解為在生物組織內(nèi)的總水分量中，結(jié)合水占約10～約20％，游離水占約80～約90％。在大鼠的心臟內(nèi)，以臟器總重量為基準，一般總水分量為約80質(zhì)量％，結(jié)合水為8～16質(zhì)量％，游離水為64～72質(zhì)量％。
在本發(fā)明涉及的脫水步驟中，理論上可認為可以除去臟器總重量的約25～60wt％的水分。如果是該程度，一般認為除去的水全部是游離水。
因而，脫水的結(jié)果，大鼠心臟內(nèi)殘存的自由水的質(zhì)量％降至數(shù)％～40％左右，但結(jié)合水的絕對量沒有變。即使實際的水分量因動物種類或臟器的種類多少有些不同，通過除去相對于脫水前的臟器總重量，重量比為約25％或以上的游離水，也可以殘留相對于脫水前的總水分量，重量比為約10～20％或以上的水分(含結(jié)合水)。
臟器所允許的自由水的除去率因脫水方法、臟器的種類、所希望的保存期、其它的保存條件而異。目前，認為對于大鼠心臟來說，約25～35％是安全的。對豬的心臟來說，一般認為約10～50％，特別是15～25％比較合適。
在現(xiàn)階段，上述的脫水狀態(tài)與在臟器的保存時間的增加如何相互關(guān)聯(lián)的機理不十分明了。根據(jù)本發(fā)明人的研究，至少可以判斷為，保存時間的增加不取決于保存液的成分，在很大程度上取決于臟器的組織或細胞內(nèi)的水分子的絕對量。從通過各組織和細胞的脫水沒有發(fā)現(xiàn)實質(zhì)性的生命活動的臟器在其后再生的事實，可認為臟器達到假死狀態(tài)(apparent death)。該假死狀態(tài)可以稱為“不死的狀態(tài)”或者學(xué)術(shù)上稱為“crypotbiotic狀態(tài)”(Vreeland H.R.et al；Nature Vol.407 pp.897-900，19 Oct.2000Cano J.R at al；Science Vol.268 pp.1060-1064，19 May.1995)。
被脫水的臟器在作為在水和油中不溶的惰性介質(zhì)的全氟化碳中保存。臟器浸漬到惰性介質(zhì)中一般在常壓下的密閉狀態(tài)下進行，還可以根據(jù)需要在加壓狀態(tài)下進行。此時，如上所述，也可以與脫水劑一起保存。另外，惰性介質(zhì)優(yōu)選被純氧充氣。
本發(fā)明中所謂的“冷藏溫度或以下的溫度”是在約+1～約+8℃，優(yōu)選約+2～約+4℃附近，在該保存狀態(tài)下可以保持規(guī)定的天數(shù)。另外，如果充分除去臟器的自由水，理論上也可以在冷藏溫度，例如在液氮內(nèi)保存。
臟器從保存狀態(tài)的再生可以利用上述Langendorff法。首先從全氟化碳中取出保存的臟器，如果有脫水劑，將其除去。將該臟器放入+4℃的培養(yǎng)皿內(nèi)的KH液體中，優(yōu)選用純氧充氣的KH液中。將灌注用的導(dǎo)管固定到該臟器的大動脈上，優(yōu)選將連續(xù)用O2-CO2混合氣體充氣且在加熱至37℃的KH液體通過灌注泵產(chǎn)生的一定流量下送入大動脈側(cè)的導(dǎo)管中。通過該灌注謀求臟器的再生。
在哺乳類動物的臟器的保存中成為問題的是在必須驗證保存后臟器的哪個組織真的生存下來了等方面。作為其手段，有組織解剖學(xué)的手段、實際移植而驗證的移植法、電生理學(xué)的手段等。無論采用這些手段的哪一種，首先都必須驗證組織細胞是否生存。
在本發(fā)明中，作為驗證組織細胞的再生的方法，使用電生理學(xué)手段，例如對心臟使用心電圖測定。心電圖可以實時紀錄神經(jīng)細胞組織的活動，可以在神經(jīng)細胞的活動消失的時點，判斷細胞死亡發(fā)生的情況。另外，輔助性的，可以用目視觀察臟器組織的變色情況，除此之外，如果是心臟，通過確認有無心臟跳動，可以觀察作為臟器的再生狀態(tài)。
包括油膜的形成以及通過暴露在氣體中達到脫水的發(fā)明該發(fā)明使用將臟器暴露在氣體中而達到水分蒸發(fā)來代替上述從血管系統(tǒng)的脫水。其脫血步驟和再生步驟基本上與從上述的血管系統(tǒng)脫水的發(fā)明相同。對于通過暴露在氣體中的發(fā)明，其保存步驟既可以應(yīng)用，也可以不應(yīng)用將臟器浸漬在惰性介質(zhì)中的上述保存方法。在不將臟器浸漬到惰性介質(zhì)中的場合，干燥的臟器可以在所需的保存期間，在冷藏溫度下保持在適當(dāng)?shù)臐穸鹊臍怏w中。
將脫血的臟器和套管一起從灌注裝置中取下，輕輕地浸漬在油中。在臟器的整個表面形成油膜。油膜的形成可以防止因在干燥氣體下的水分除去而擔(dān)心摘出的心臟的干燥速度的不平衡以及由此造成的心臟表面的收縮或角質(zhì)化。
使用的油對臟器是無害的，優(yōu)選具有可在臟器的表面形成適當(dāng)厚度的油膜的粘度，典型的是硅油。硅油由有機氧化硅的聚合物構(gòu)成，在生理學(xué)上幾乎無害，且是化學(xué)惰性的物質(zhì)。在后面所述的實施例中使用的硅油的動粘度為100mm2/s(攝氏25℃)，且是不揮發(fā)性的，一般認為適合于保護以免經(jīng)過長時間心臟表面過量干燥。一旦在心臟的表面形成油膜，就可以用目視確認在沒有油膜時，由干燥產(chǎn)生的心臟表面的裂紋等物理性傷害減輕了。
對于使用的氣體，一般可以使用空氣，或者O2-CO2混合氣體，但對它們沒有限定。作為干燥用的氣體，優(yōu)選O2-CO2混合氣體。
如后面所述的實施例所示，作為保存用的氣體，可以使用含有Xe的氣體。由于氙氣是不具有極性的惰性氣體，所以與周圍的水疏水性水合，從而可以抑制水分子的熱運動。如果水的構(gòu)造化提高，分子運動緩慢的話，水的粘度就會上升，而且由于生物體反應(yīng)通過水進行，所以一般認為如果水的粘度上述的話，細胞的代謝就會受到抑制。除了除去自由水以及在低溫下保持之外，如果在保存氣體中使用氙氣的話，臟器的代謝可進一步受到抑制。
另外，氙氣的離解壓(攝氏0℃)是1.15個大氣壓(0.1115MPa)，已知在比較低的加壓下，容易制造氣體水合物。因而，在使用氙氣的場合，在加壓下保存臟器比較好。一般認為，在加壓環(huán)境下，氙氣在臟器(包括細胞內(nèi)和細胞外)內(nèi)的水相中的溶解度會提高。如果對包圍臟器的氙氣加壓，可推測可以促進臟器內(nèi)的水的構(gòu)造化，臟器的代謝將顯著受到抑制。
對于使用暴露在氣體中的脫水方法，例如放入干燥劑硅膠，并將脫血后的臟器放入保持在冷藏溫度下的密閉容器中，經(jīng)規(guī)定時間將臟器暴露在干燥的氣體中。應(yīng)達成的脫水率因臟器的重量而異，是脫水前的臟器總重量的10-50wt％。但是，在同一干燥條件下，由于要達到的脫水率取決于臟器的大小(重量等)，所以優(yōu)選適用考慮了該情況的干燥條件。
用于脫水的時間因臟器的重量和干燥劑的量而異。例如，如果是大鼠的心臟，則在24～48小時左右，如果是豬的心臟，則在1周左右，對它們沒有限定。在各干燥期間后，將臟器保存在惰性介質(zhì)中比較好。用該脫水方法可以不傷害臟器，從而達成在長期保存中所希望的高的脫水率。由于臟器的損傷少，所以在比較短的時間保存下，再生狀態(tài)非常好，另外，即使在長時間保存下，再生率也上升了。
在后面所述的實施例4中，使豬臟器在37天后再生成功了。在以往的冷藏保存中這是豬臟器腐敗的期間，但在此卻確認了臟器的心肌組織再生了。
實施例實施例1(通過血管系統(tǒng)使之脫水的大鼠心臟的保存)按照美國的NIH的實驗動物基準，使用人工繁殖的7周齡的Wistar系雄性大鼠(體重300g)作為實驗動物。
在大鼠的腹腔內(nèi)注射給藥戊巴比妥鈉0.25ml和肝素鈉(肝素鈉鹽)5mg，測定體重后，開始摘出心臟。將摘出的心臟放置在恒溫槽中，向大動脈插入導(dǎo)管后，使用溶解有海藻糖117mmol并充入了95％O2-5％CO2混合氣體的KH液體，進行Langendorff式的脫血灌注。降低恒溫槽的溫度并使心臟停止，結(jié)束脫血灌注。
測定心臟重量后，通過其灌注裝置，向心臟送入上述95％O2-5％CO2混合氣體并開始脫水。一面測定心臟的重量并記錄水分除去率，一面在從脫水開始進行氣體灌注，到約1小時30分鐘后停止氣體灌注。在僅擦拭去外表面的水分的狀態(tài)下測定心臟的總重量。
將脫水的心臟浸漬在預(yù)先充入了1分鐘純氧的4℃的全氟化碳液體(住友スリ-エム社制，フロリナ-トFC77；C8F17)500ml中，將其裝入密閉容器中，保存在冷藏庫內(nèi)。
規(guī)定的時間后，從全氟化碳液體取出保存的心臟，向大動脈插入導(dǎo)管，并使用充入了上述混合氣體的熱的KH液體，試著進行了通過Langendorff式灌注的再生。
·實驗1(4小時的保存)R349(Wistar大鼠，5周齡，雄性)2000年9月11日室溫24℃15:39體重測定130g15:51開始心臟摘出15:53心臟摘出以及插入導(dǎo)管結(jié)束15:53脫血灌注開始恒溫槽溫度5.0℃，速度1.0～3.8ml/min16:14心臟停止，脫血灌注結(jié)束恒溫槽溫度5.0℃，心臟溫度18.2℃16:14心臟重量測定0.663g16:18用混合氣體灌注的脫水開始氣壓0.05kgf/cm2，恒溫槽溫度2.8℃16:48心臟重量測定0.516g，水分除去率22.2％16:50脫水繼續(xù)氣壓0.05kgf/cm2，恒溫槽溫度1.1℃17:20心臟重量測定0.458g，水分除去率30.9％17:21脫水繼續(xù)氣壓0.05kgf/cm2，恒溫槽溫度1.6℃17:51心臟重量測定0.394g，水分除去率40.6％17:55浸漬在PFC液中，保存4小時0.6℃21:54保存結(jié)束，撈出心臟(室溫26℃)21:55心臟重量測定0.436g21:55再生灌注開始恒溫槽溫度34.4℃，速度1.0～3.8ml/min23:40再生灌注結(jié)束恒溫槽溫度33.7℃評價KH灌注開始后4分鐘，雖然可以看到心肌的微弱收縮，但心房沒有動。心肌繼續(xù)動直至停止灌注，心臟略微膨脹。
·實驗2(8小時的保存)R350(Wistar大鼠，5周齡，雄性)2000年9月12日室溫25℃19:10體重測定150g19:20開始心臟摘出19:22心臟摘出以及插入導(dǎo)管結(jié)束
19:22脫血灌注開始恒溫槽溫度5.0℃，速度1.0～3.8ml/min19:37心臟停止，脫血灌注結(jié)束恒溫槽溫度4.6℃，心臟溫度15.7℃19:39心臟重量測定0.718g19:43用混合氣體灌注的脫水開始氣壓0.1kgf/cm2，恒溫槽溫度4.4℃20:13心臟重量測定0.647g，水分除去率9.9％20:15脫水繼續(xù)氣壓0.1kgf/cm2，恒溫槽溫度2.4℃20:35心臟重量測定0.550g，水分除去率23.4％20:48脫水繼續(xù)氣壓0.05kgf/cm2，恒溫槽溫度4.8℃20:18心臟重量測定0.483g，水分除去率32.7％17:55浸漬在PFC液中，保存8小時0.6℃2000年9月13日05:21保存結(jié)束，撈出心臟(室溫27℃)05:23心臟重量測定0.523g05:24再生灌注開始恒溫槽溫度33.6℃，速度1.0～3.8ml/min07:25再生灌注結(jié)束恒溫槽溫度36.6℃評價從05:29開始，心肌劇烈收縮，但約10秒鐘就停止了。0600的時候，確認了肺動脈周圍(右心)附近微弱運動。心臟相當(dāng)膨脹，在外觀上幾乎不能確認跳動，但在停止灌注并去掉心臟的KH液時，可以清楚地看出在跳動。
·實驗3(16小時的保存)R351(Wistar大鼠，5周齡，雄性)2000年9月13日室溫24℃16:22體重測定120g16:28開始心臟摘出16:31心臟摘出以及插入導(dǎo)管結(jié)束16:31脫血灌注開始恒溫槽溫度26.9℃，速度1.0～3.8ml/min16:44心臟停止，脫血灌注結(jié)束恒溫槽溫度4.6℃，心臟溫度16.2℃16:45心臟重量測定0.605g16:50用混合氣體灌注的脫水開始氣壓0.1kgf/cm2，恒溫槽溫度3.3℃
17:20心臟重量測定0.534g，水分除去率11.7％17:23脫水繼續(xù)氣壓0.1kgf/cm2，恒溫槽溫度1.3℃17:53心臟重量測定0.517g，水分除去率14.5％17:55脫水繼續(xù)氣壓0.2kgf/cm2，恒溫槽溫度0.5℃18:25心臟重量測定0.522g，水分除去率13.7％18:30浸漬在PFC液中，保存16小時2.8℃2000年9月14日10:28保存結(jié)束，撈出心臟(室溫25℃)10:30再生灌注開始恒溫槽溫度32.9℃，速度1.0～3.8ml/min17:25再生灌注結(jié)束恒溫槽溫度34.5℃評價由于心臟的膨脹劇烈，跳動的狀態(tài)不明了，因此采取通過心電圖的記錄。
·實驗4大鼠R443(24小時的保存)2001年2月6日16:10心臟摘出16:20脫血灌注開始恒溫槽溫度26.8℃→7.9℃16:45脫血灌注結(jié)束，心臟重量測定0.582g16:45一邊從大動脈灌注空氣(0.1kgf/cm2)，一邊浸漬在PFC液中2001年2月7日16:48從PFC液撈出心臟16:50心臟重量測定0.430g，水分除去率26.1％16:50KH液的灌注開始(恒溫槽27.0℃→35.5℃)18:30再生確認，有穩(wěn)定的跳動再生·實驗5大鼠R444(24小時的保存)2001年2月7日18:55給藥戊巴比妥鈉0.2ml18:57給藥肝素鈉5mg
18:57體重測定19:00心臟摘出19:03溶解海藻糖的KH液灌注(恒溫槽27.6℃→5.5℃)19:23灌注結(jié)束，心臟重量測定0.767g19:27在瓶內(nèi)空氣灌注(0.1kgf/cm2，0.8℃)19:57灌注結(jié)束，心臟重量測定0.483g，水分除去率34.8％20:00PFC浸漬2001年2月8日20:25從PFC(0.5℃)撈出心臟20:27心臟重量測定20:27KH液灌注開始(恒溫槽溫度26.9℃→35.4℃)21:27再生確認，跳動數(shù)次，停止實施例2(通過血管系統(tǒng)使之脫水的大鼠心臟的保存)實驗動物按照美國的NIH實驗動物基準，使用繁殖的Wistar大鼠(5周齡，雄性)。在下述的各實驗例中，分別各使用5只大鼠。作為惰性介質(zhì)，使用全氟化碳(PFC)。
·實驗1(4小時的保存)給大鼠腹腔內(nèi)給藥戊巴比妥鈉0.2ml后，腹腔內(nèi)給藥將肝素鈉5mg溶解在0.3ml的生理鹽水中的溶液。將大鼠開胸并摘出心臟后，將導(dǎo)管插入到摘出的心臟的大動脈上并用棉線結(jié)扎。將插入導(dǎo)管的摘出心臟裝配在定流量灌注裝置上，以3.2ml/min灌注溶解了117mmol海藻糖的27℃的KH液體。KH液體時常用95％O2-5％CO2的混合氣體充氣。慢慢降低灌注液的溫度并使心臟停止，測定完全停止的心臟的重量后，用導(dǎo)管在0.1kgf/cm2的流壓下灌注空氣來干燥心臟。測定干燥的心臟的重量后，在時常用混合氣體充氣下，將其浸漬保存在保冷到4℃的PFC中。4小時后，從保存液取出心臟，將其安裝在定流量灌注裝置上，以3.2ml/min灌注經(jīng)常用混合氣體充氣的27℃的KH液體。摘出的心臟保存后再次開始灌注時，組織細胞如果維持生命的話，就會自動再生，神經(jīng)活動顯現(xiàn)，這一點是已知的。在再生的心臟上安裝電極，用描筆式記錄器記錄表面心電圖。
·實驗2(16小時的保存)除了將保存時間定為16小時之外，和上述實驗例12一樣進行。
上述各大鼠的氣體灌注時間和水分除去率如下所示。實驗1的脫水率1-1 1小時34分，44.1％1-2 2小時37分，32.8％1-3 2小時37分，44.4％1-4 2小時37分，47.5％1-5 3小時7分， 41.1％實驗2的脫水率2-1 1小時35分，44.4％2-2 2小時37分，41.2％2-3 1小時3分， 45.8％2-4 3小時12分，41.3％2-5 2小時9分， 41.4％實驗例2的結(jié)果在實驗1和實驗2的雙方中，所有的試樣再生了。在上述實驗1和2中可以看到，水分除去所需的時間和水分除去率顯著的參差不齊?？烧J為原因是摘出時的心臟的狀態(tài)不一定。從插入到大動脈的導(dǎo)管送入的空氣從左右冠狀動脈口遍布在心肌的毛細血管中，使各心肌細胞干燥，但在毛細血管中，即使很少，但一旦產(chǎn)生有血栓，則空氣就不會達到其前面的細胞，時間和除去率就不成比例?？傊?，令人驚奇的是，在此次實驗中，水分除去率40％或以上的大鼠心臟保存4小時和16小時，可以確認100％的再生。
實施例3(暴露在氣體中使之脫水的大鼠心臟的保存)在本實施例中，將硅油涂布到從大鼠摘出的心臟上，在干燥氣體的加壓下，在4℃保存該心臟3天。
在本實驗中使用的大鼠是按照美國的NIH的實驗動物基準，使用人工繁殖的7周齡的Wistar系雄性大鼠(300g)。從大鼠摘出心臟，進行脫血后，用導(dǎo)管注入心肌保護液(Miotecter持田制藥制)2ml，使心臟停止。將硅油(WF·30和光純制藥)涂布到灌注結(jié)束的心臟的表面上，將心臟包裹在滅菌紗布(120×120mm)中，放入標準瓶(60ml)中。將放入了心臟的瓶子放置到鋪滿硅膠的耐壓室內(nèi)并密封。用混合氣體(氧氣95％，二氧化碳5％)置換室內(nèi)后，充入混合氣體以達到0.2Mpa。處理后，將室保存在攝氏4度的冷藏庫中。
根據(jù)需要，每24小時打開室，將硅油涂布到摘出的心臟上，進行修整。經(jīng)過規(guī)定時間后，從室內(nèi)的硅油取出心臟，放在恒壓灌注裝置中。從充滿了用氧95％，二氧化碳5％的混合氣體連續(xù)充氣的KH液的灌注液貯留槽導(dǎo)出的灌注液在恒壓(約60mmHg)下送入到大動脈導(dǎo)管中。摘出的心臟在攝氏37度下開始灌注。在灌注中，將心電圖記錄用電極安裝到左心室和大動脈開口部，使用生物放大器(Bioview-ENEC三榮制)連續(xù)記錄雙曲誘導(dǎo)下的心電圖·基本的實驗順序如下。
1.將摘出的心臟浸在充滿了KH液的培養(yǎng)皿中。
2.在培養(yǎng)皿中將套管插入到大動脈，用棉線固定。
3.將套管安裝在Langendorff式恒壓灌注裝置上，向心臟脫血灌注KH液。在此時的KH液中添加青霉素鉀20萬u/L。灌注溫度約37℃，灌注壓力60mmHg。
4.20分鐘的灌注后，將約2ml心停止液(心肌保護液)ミオテクタ一灌注到心臟中，促進心臟停止。
5.從灌注裝置與套管一起取下心臟，用紗布擦去表面的水分，測定心臟的重量。
6.將心臟輕輕地浸在硅油中，在表面形成硅油層。
7.用紗布慢慢包裹心臟，放入容器中。
8.將放入了心臟的容器收容在耐壓室中。在室內(nèi)的底部鋪滿硅膠。
9.將室密閉，送入混合氣體(95％氧，5％二氧化碳)加壓直至達到0.3MPa。根據(jù)需要，使用氙氣(例如氙氣約0.1MPa和混合氣0.2MPa)。
10.加壓完了后，與室一起放入冷藏庫，在2～4℃保存。
11.3天后，從冷藏庫取出室后，排出氣體。
12.打開室，取出心臟，測定重量。
13.將心臟安裝在Langendorff式恒壓灌注裝置上，開始灌注。例如，灌注溫度為37.0℃，灌注壓力為60mmHg。
14.如果確認了再生，則測定心臟表面的心電圖。
另外，根據(jù)試樣改變充入到室內(nèi)的氣體，或者改變干燥期間。將干燥期結(jié)束的試樣浸漬到保存液(硅油·PFC)中，和干燥時一樣，在室內(nèi)加壓保存。
應(yīng)用上述方法被確認再生的實驗如下所示。
·實驗1保存前的心臟重量1.46g保存開始的日期和時間2001年12月30日21:07使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月2日16:09再生開始前的心臟重量0.97g(3天除去35％的水分)·實驗2保存前的心臟重量1.29g保存開始的日期和時間2001年12月30日21:07使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月2日17:42再生開始前的心臟重量0.89g(除去35％的水分)·實驗3保存前的心臟重量1.37g保存開始的日期和時間2002年1月8日19:20使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月11日14:34再生開始前的心臟重量0.98g(除去32％的水分)·實驗4保存前的心臟重量1.41g保存開始的日期和時間2002年1月8日19:20
使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe 0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月11日15:42再生開始前的心臟重量1.10g(除去27％的水分)·實驗5保存前的心臟重量1.60g保存開始的日期和時間2002年1月9日10:16使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月12日17:42再生開始前的心臟重量0.94g(除去46％的水分)·實驗6保存前的心臟重量1.63g保存開始的日期和時間2002年1月15日19:13使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月18日13:49再生開始前的心臟重量1.12g(除去31％的水分)·實驗7保存前的心臟重量1.41g保存開始的日期和時間2002年1月15日19:13使用的氣體混合氣體0.3Mpa再生開始的日期和時間2002年1月18日16:02再生開始前的心臟重量1.04g(除去35％的水分)·實驗8保存前的心臟重量1.43g保存開始的日期和時間2002年1月8日19:20使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月11日18:54再生開始前的心臟重量1.07g(除去28％的水分)
圖1是在本實驗中的心臟表面心電圖(21:04測定)·實驗9
保存前的心臟重量1.61g保存開始的日期和時間2002年1月9日20:16使用的氣體混合氣體0.2Mpa，還有Xe0.1MPa再生開始的日期和時間2002年1月12日19:18再生開始前的心臟重量1.00g(除去42％的水分)圖2是在本實驗中的心臟表面心電圖(20:25測定)實施例4(暴露在氣體中使之脫水的豬心臟的保存)在該實施例中，將豬心臟暴露在混合氣中使之脫水，在該混合氣下保存7～8天·實驗1(7天)保存前的心臟重量31.9g保存開始的日期2002年2月16日使用的油硅油使用的氣體混合氣(沒有加壓)程序用聚氨酯泡沫包裹涂布了油的心臟，并收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室內(nèi)，進行向混合氣的置換。將其放入冷藏庫中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。每天取出臟器，涂布硅油，進行修整。
再生開始的日期2002年2月23日再生開始前的心臟重量25.6g(除去19.7％的水分)圖3是保存7天后使之再生的該心臟表面的心電圖。
·實驗2(8天)保存前的心臟重量31.2g保存開始的日期2002年2月17日使用的油硅油使用的氣體混合氣(沒有加壓)程序用聚氨酯泡沫包裹涂布了油的心臟，并收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室內(nèi)，進行向混合氣的置換。將其放入冷藏庫中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。每天取出臟器，涂布硅油，進行修整。
再生開始的日期2002年2月25日再生開始前的心臟重量23.5g(除去24.6％的水分)圖4是保存8天后再生的該心臟表面的心電圖。
實施例5(暴露在氣體中使之脫水的豬心臟的長期保存)在該實驗中，應(yīng)用將豬心臟暴露在氣體中的脫水，試驗長期保存(37天)。
豬體重5kg，保存前的心臟重量32.6g保存開始的日期和時間2001年12月16日使用的氣體混合氣(沒有加壓)程序用聚氨酯泡沫包裹涂布了油的心臟，并收容在容器(瓶子)中，和容器一起放入室內(nèi)，進行向混合氣的置換。將其放入冷藏庫中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。每天取出臟器，再次涂布硅油。從脫水開始至1周后，浸漬到惰性介質(zhì)(PFC)中，保持在2～4℃的冷藏溫度下。
再生開始的日期和時間2002年1月22日從脫水開始37天后，取出臟器，進行用于再生的灌注。
再生開始前的心臟重量25.1g(除去23％的水分)如圖5所示，再生開始后(19:04)，心臟表面(溫度29.0℃)的心電圖顯現(xiàn)。從1mV至最大5mV，記錄了每分鐘8次～40次的脈沖。
權(quán)利要求
1.一種哺乳類動物的臟器的保存方法，包括脫水步驟，該步驟從含有生理學(xué)上正常水分量的臟器，通過其血管系統(tǒng)，導(dǎo)出該臟器內(nèi)的水分，除去相對于脫水前的臟器總重量，重量比為約10％或以上的水分，且相對于脫水前的總水分量，殘留重量比為約10～約20％或以上的水分，和將該臟器浸漬在惰性介質(zhì)中，并保持在冷藏溫度下的步驟。
2.一種保存方法，包括脫血步驟，該步驟將生理鹽水溶液灌注到心臟中，將心臟內(nèi)的血液置換為生理鹽水溶液；脫水步驟，該步驟從脫血的心臟，通過其血管系統(tǒng)導(dǎo)出該臟器內(nèi)的水分，除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分；以及將該心臟浸漬在惰性介質(zhì)中，并保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
3.一種保存方法，包括脫血步驟，該步驟將生理鹽水溶液灌注到心臟中，將心臟內(nèi)的血液置換為生理鹽水溶液；脫水步驟，該步驟從脫血的心臟，通過其血管系統(tǒng)導(dǎo)出該臟器內(nèi)的水分，除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約25～約60％的水分；以及將該心臟浸漬在惰性介質(zhì)中，并保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
4.權(quán)利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟包括送入氣體作為導(dǎo)出水分的介質(zhì)。
5.權(quán)利要求4所述的保存方法，上述脫水步驟包括向心臟的大動脈灌注氣體，通過該氣體的流動，從該心臟的血管系統(tǒng)導(dǎo)出水分。
6.權(quán)利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟包括向臟器或者心臟的血管系統(tǒng)送入空氣。
7.權(quán)利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟包括向臟器或者心臟的血管系統(tǒng)送入以O(shè)2為主要成分的O2-CO2混合氣體。
8.權(quán)利要求1～3任一項所述的保存方法，上述脫水步驟進一步包括使浸在惰性介質(zhì)中的該臟器與脫水劑接觸。
9.權(quán)利要求1或2所述的保存方法，在上述生理鹽水溶液中溶解使用海藻糖。
10.權(quán)利要求1～3任一項所述的保存方法，在上述惰性介質(zhì)中使用全氟化碳液體。
11.權(quán)利要求1所述的保存方法，上述臟器選自心臟、肝臟、腎臟、胰腺和肺。
13.權(quán)利要求1所述的保存方法，上述臟器是豬的心臟。
14.一種哺乳類動物的心臟的保存方法，包括在含有生理學(xué)上正常水分量的臟器表面形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內(nèi)的水分蒸發(fā)到該氣體中，來除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約10％或以上的水分的步驟和將該臟器保持在約2～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
15.一種哺乳類動物的心臟的保存方法，包括向心臟灌注生理鹽水溶液，將心臟內(nèi)的血液置換為生理鹽水溶液的脫血步驟、在脫血的心臟的表面形成油膜的步驟、通過將該心臟暴露在氣體中，使該心臟內(nèi)的水分蒸發(fā)到該氣體中，以除去相對于脫水前的心臟總重量，重量比為約10～約50％的水分的步驟和將該臟器保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
16.權(quán)利要求14或15所述的保存方法，進一步包括將除去水分的上述臟器浸漬在惰性介質(zhì)中，并保持在約1～約8℃的冷藏溫度下的步驟。
17.權(quán)利要求14或15所述的保存方法，上述臟器選自心臟、肝臟、腎臟、胰腺和肺。
18.權(quán)利要求17所述的保存方法，上述臟器是豬的心臟。
全文摘要
本發(fā)明涉及哺乳類動物的臟器的保存方法，包括從含有生理學(xué)上正常水分量的臟器，通過血管系統(tǒng)導(dǎo)出該臟器內(nèi)的水分，除去相對于脫水前的臟器總重量，重量比為約10％或以上，優(yōu)選25％或以上的水分的脫水步驟，和將該臟器浸漬在惰性介質(zhì)中并保持在冷藏溫度下的步驟。
文檔編號A01N1/02GK1505474SQ0280888
公開日2004年6月16日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月6日
發(fā)明者關(guān)邦博 申請人:生物庫株式會社