專利名稱：注射鳥卵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)含有胚的卵進(jìn)行操作的一些方法，并且特別涉及到向含有鳥胚的卵中引入物質(zhì)或者從中取出物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
有許多的應(yīng)用需要對(duì)含有早期鳥胚的卵進(jìn)行注射。例如，可能需要向一種早期胚，例如胚盤(blastoderm)中遞送某種物質(zhì)。例如，在家禽業(yè)中可能需要對(duì)早期胚進(jìn)行卵內(nèi)操作以向發(fā)育中的胚內(nèi)引入某種外源核酸分子(即產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因鳥類)或者引入某種外源細(xì)胞(即產(chǎn)生一種嵌合(chimeric)鳥類)。
類似地，經(jīng)過改進(jìn)的向含有早期胚的卵內(nèi)進(jìn)行注射的方法還可被用于從卵中取出樣品，該樣品包括胚物質(zhì)和胚外物質(zhì)。進(jìn)一步，其它的應(yīng)用可能需要在含有胚的卵內(nèi)插入某種傳感裝置以從中收集信息。
目前對(duì)含有早期胚的鳥卵進(jìn)行操作的方法可能不甚理想，這是因?yàn)檫@些方法導(dǎo)致了不可接受的低孵化率。據(jù)認(rèn)為孵化率降低是在卵殼上產(chǎn)生開口、向卵中引入氣泡、胚外膜或者胚本身的損傷或者這些因素綜合的結(jié)果。
因此，在本領(lǐng)域中需要經(jīng)過改進(jìn)的操作含有早期胚的鳥卵的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種對(duì)含有胚，特別是早期胚的鳥卵進(jìn)行操作的方法，該方法對(duì)胚的損傷較低，提高了存活率和孵化率。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一些改進(jìn)的方法，這些方法用于向含有胚，特別是早期胚(例如胚盤)的鳥卵中，插入或者植入多種裝置(例如遞送裝置、取樣裝置和/或檢測(cè)器裝置等等)，該方法可在受操作的胚中引起較低水平的致病率和致死率。本發(fā)明的方法在向鳥進(jìn)行疫苗、維生素、促生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)因子、酶、細(xì)胞因子、核酸和/或細(xì)胞的卵內(nèi)遞送的方法中特別有用。例如，該方法可用于產(chǎn)生一種嵌合鳥類(即含有外源細(xì)胞)或者轉(zhuǎn)基因鳥類(即含有外源核酸序列)。本發(fā)明的方法還可用于卵內(nèi)收集鳥的樣本或者信息，例如，用于性別篩選、測(cè)定胚活力和/或獲取該胚遺傳特征的信息的方法。
本發(fā)明的方法可在單一的卵內(nèi)或者多個(gè)卵內(nèi)進(jìn)行。進(jìn)一步，本發(fā)明的方法可以手工操作、自動(dòng)操作或者半自動(dòng)操作。
相應(yīng)地，作為第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括以下步驟將含有胚盤的鳥卵在預(yù)定的位置上定向；向該卵的卵殼上引入一個(gè)小開口；通過卵殼上的開口伸入一種裝置；以該裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入裝置之前基本完好；將該裝置從卵中收回。
所述裝置可以為，例如，遞送裝置、取樣裝置或者檢測(cè)器裝置。在優(yōu)選的情況下，在卵殼上的開口被產(chǎn)生于該卵鈍端的氣室之上。
作為進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括以下步驟將鳥卵的鈍端在預(yù)定的位置上定向，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在該卵的鈍端于氣室之上在卵殼上引入一個(gè)小開口；在卵殼的小開口之下的外殼膜中引入一個(gè)小的開口；通過卵殼以及外殼膜上的開口伸入遞送裝置；以該遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并且將該物質(zhì)沉積于胚盤中的某個(gè)位置或者緊鄰于該位置；將遞送裝置從卵中收回。在特定的實(shí)施方案中，卵被定向于大體向上的位置。
作為更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括以下步驟將含有胚盤的鳥卵在預(yù)定的位置上定向；向該卵的卵殼上引入一個(gè)小開口；通過卵殼上的開口伸入取樣裝置；以該取樣裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入取樣裝置之前基本完好；以取樣裝置從卵中取出樣品；將該取樣裝置從該卵中收回。
作為更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括以下步驟將含有胚盤的鳥卵在預(yù)定的位置上定向；向該卵的卵殼上引入一個(gè)小開口；通過卵殼上的開口伸入檢測(cè)器裝置；以該檢測(cè)器裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在插入檢測(cè)器裝置之前基本完好；以檢測(cè)器裝置檢測(cè)卵內(nèi)的信息；將該檢測(cè)器裝置從卵中收回。
如下文所詳述的，本發(fā)明可有利地被用于任何一種需要對(duì)含有早期胚(例如胚盤)的鳥卵的內(nèi)容物進(jìn)行操作或者從中獲得信息的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明可被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚或者嵌合胚或者進(jìn)行任何基于染色體或者DNA的測(cè)定(例如，性別篩選或者評(píng)估胚的遺傳特征)?；蛘?，本發(fā)明可用于從含有早期胚的鳥卵中取出任何胚的或胚外的體液或組織的樣本。另外，或者在替代的情況下，本發(fā)明可用于從卵或者胚中獲取信息，該方法可與遞送或者取樣方法聯(lián)合使用。
本發(fā)明的這些或者其它方面在下文中更為詳盡地描述。
附圖簡(jiǎn)述


圖1為一個(gè)流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明對(duì)卵進(jìn)行操作的方法。
圖2為一個(gè)流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在注射之前制備鳥卵的方法。
圖3為一個(gè)流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在注射之前對(duì)胚進(jìn)行定向或者定位的方法。
圖4為一個(gè)流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在卵內(nèi)引入一個(gè)開口的方法。
圖5為一個(gè)流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在注射之前測(cè)定胚的位置的方法。
圖6為一個(gè)流程圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案在卵內(nèi)插入某種裝置的方法。該裝置可為，例如遞送裝置、取樣裝置或者檢測(cè)器裝置，或這些裝置的組合。
圖7所示為來自于開口(windowed)的卵的兩日齡胚的照片。各組中(a)代表性的參照胚，來自于無開口卵。(b-h)實(shí)驗(yàn)性胚，來自于開口卵。實(shí)驗(yàn)性胚同參照相比較在發(fā)育階段和形態(tài)學(xué)上實(shí)際上是相同的。
圖8所示為對(duì)經(jīng)過2天培養(yǎng)的受體胚的體節(jié)(somite)中熒光標(biāo)記細(xì)胞(綠色)的檢測(cè)。
圖9為一系列的顯微照片，所示為在X期鳥胚中的細(xì)胞死亡的原位檢測(cè)。所有的照片均來自于X期雞胚的明區(qū)(area pellucida)的中央?yún)^(qū)域。頂排中顯示的胚(組a-d)是在亮視野光下所拍攝，中排(組e-h)所示為在外加熒光照射(epifluorescence illumination)下使用若丹明濾鏡組(filter-set)所拍攝的相同視野。底排(組i-l)所示為上部?jī)膳诺臄?shù)碼合并，以此來展示胚盤中的細(xì)胞死亡的精確定位。熒光像素計(jì)數(shù)(底排)顯示了來自數(shù)字化熒光成像的紅色像素的數(shù)目，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞死亡數(shù)量的定量比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明將在此參考附圖進(jìn)行描述，在這些附圖中展示了優(yōu)選的實(shí)施方案。然而，本發(fā)明可以以不同的形式實(shí)現(xiàn)并且不應(yīng)被解釋為受限于本文所提出的實(shí)施方案。提供這些實(shí)施方案是使本發(fā)明的公開徹底而完整，并且完全地向本領(lǐng)域技術(shù)人員傳達(dá)了本發(fā)明的范圍。
應(yīng)當(dāng)注意，在本發(fā)明的一些備選的實(shí)施方案中，
圖1-6的流程圖的單元(block)中所提示的功能可以不按照所提示的順序出現(xiàn)。例如，連續(xù)的兩個(gè)或者多個(gè)單元實(shí)際上可以基本上同時(shí)進(jìn)行或者這兩個(gè)或者多個(gè)單元在某些情況下可以按照相反(或者不同)的次序進(jìn)行實(shí)施。進(jìn)一步，在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，
圖1-6所展示的功能可以平行進(jìn)行或者依次進(jìn)行。更進(jìn)一步，在其它的實(shí)施方案中，特定的單元可以被完全省去。
除非另外定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)所具有的含義同本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解的相同。本發(fā)明的說明書所使用的術(shù)語(yǔ)僅僅為了描述特定的實(shí)施方案，該術(shù)語(yǔ)并不意味著對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定。
本發(fā)明的說明書和所附權(quán)利要求的描述中所使用的單數(shù)形式“一個(gè)/一種(a或an)”和“該(the)”也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地指出并非如此。
本文所提及的所有的出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)在此全文引為參考。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“鳥類”和“鳥類對(duì)象”包括任何鳥類的雄性和雌性，但主要包括出于商業(yè)目的而被飼養(yǎng)用于產(chǎn)卵、肉食或者作為寵物的家禽。因此，術(shù)語(yǔ)“鳥類”或者“鳥類對(duì)象”特別包括雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、長(zhǎng)尾鸚鵡、鸚鵡、大冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋等等。雞和火雞是優(yōu)選的鳥類對(duì)象，雞最為優(yōu)選?；蛘?，該鳥類或者鳥類對(duì)象為瀕危鳥種。
本發(fā)明提供了對(duì)含有鳥胚的卵進(jìn)行操作的經(jīng)改進(jìn)的方法?！斑M(jìn)行操作”或者“操作”意指在該卵的卵殼、外殼膜和內(nèi)殼膜上產(chǎn)生開口并且向其中植入或者插入某種物質(zhì)或者裝置。
本文所使用的“早期胚”指的是從產(chǎn)卵(胚盤期)直至原生殖細(xì)胞(PGC)遷移的大致發(fā)育階段的鳥胚。對(duì)于雞胚，“早期胚”一般約為胚20期(H&H)或者更早的胚。雞胚的發(fā)育階段在本領(lǐng)域?yàn)槿怂熘?，例見，The Atlas of Chick Development，R.Bellairs & M.Osmond，eds.，Academic Press，1998。在特定的實(shí)施方案中，早期雞胚約為4期到約18期的胚，或者約為12期到約17期(H&H)的胚，或者，在替代的情況下約為13期到約15期(H&H)的胚(例如，用于PGC的遞送)。根據(jù)下文所述，在其它的特定實(shí)施方案中，早期胚為胚盤期的胚。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“胚盤”在本領(lǐng)域中具有被充分了解的含義。一般來說，在本發(fā)明的實(shí)踐中，胚盤包括從產(chǎn)卵之時(shí)到原腸胚形成終了的胚。胚盤有時(shí)在本領(lǐng)域中使用替代性的名稱“germinal disc”或者“embryonic disc”。胚盤可被描述為在早期胚分裂時(shí)形成的平整的細(xì)胞盤，并且該細(xì)胞盤維持至原腸胚形成的結(jié)束。產(chǎn)卵之時(shí)可見該胚盤有兩個(gè)主要的區(qū)域，中央位置的明區(qū)和位于周邊的暗區(qū)(areaopaca)(The Atlas of Chick Development，R.Bellairs & M.Osmond，eds.，Academic Press，1998)。對(duì)于雞胚，典型特征的胚盤為從產(chǎn)卵之時(shí)(即，IX期或者X期EG&K)到約為XIII期(EG&K)的胚。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，該雞胚為約VIII期到XIII期(EG&K)的胚，或者，在替代的情況下為約IX期到約XII期(EG&K)的胚。在其它的實(shí)施方案中，該雞胚為約X期到約XI期(EG&K)的胚。在另外的實(shí)施方案中，該雞胚為約X期(EG&K)的胚。
目前所應(yīng)用的對(duì)含有早期胚的卵進(jìn)行操作的方法可能并不能滿足商業(yè)目的，這是因?yàn)檫@些方法可能導(dǎo)致不可接受的高水平的致病率和致死率。在特定的實(shí)施方案中，該鳥胚可以是轉(zhuǎn)基因的(即含有一個(gè)外源核苷酸序列)。
用裝置注射或者插入“緊鄰”于胚或者胚盤指的是該裝置被正好注射入或者插入于早期胚或者胚盤的上方、下方或者附近或者其附近的結(jié)構(gòu)，例如，在該早期胚或者胚盤的約10、8、5、3、2或者1mm或者更小的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“緊鄰”于該胚盤包括用某種裝置注射或者插入于該胚的胚下腔、介于暗區(qū)和卵黃膜之間、介于明區(qū)和卵黃膜之間和/或加入明區(qū)和暗區(qū)之間。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“注射”和“進(jìn)行注射”包括將某種裝置(典型情況下為延伸裝置)插入卵或者胚中的方法，包括將某種物質(zhì)遞送入或者散布于卵或者胚中的方法、從卵或者胚中取出某種物質(zhì)(即樣品)的方法和/或?qū)z測(cè)器裝置插入卵或者胚中的方法。
術(shù)語(yǔ)“嵌合鳥類”或者“嵌合胚”分別指的是某種“受體鳥類”或者胚，這種鳥類或者胚含有來自于被稱為“供體”的另一種鳥類或者胚的細(xì)胞(即體細(xì)胞和/或配子細(xì)胞)。所產(chǎn)生的嵌合鳥類或者胚在典型的情況下應(yīng)同時(shí)含有來自于受體和供體的細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，該嵌合鳥類中可以有至少約5％、10％、25％、35％、50％、65％、75％、85％、90％、95％或者更多的體細(xì)胞來自于供體。類似地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，基本上所有的體細(xì)胞來自于供體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合鳥類或者胚中至少有一部分配子(例如，至少約5％、10％、25％、35％、50％、65％、75％、85％、90％、95％或者更多)來自于該供體。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，基本上所有的配子來自于該供體。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因鳥類”和“轉(zhuǎn)基因胚”在本文中的使用同這些術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中的一般理解相一致。轉(zhuǎn)基因鳥類或者轉(zhuǎn)基因胚在一個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞中含有外源的核酸序列。該外源核酸可來自于不同的物種(例如，鳥類、哺乳類、昆蟲、細(xì)菌、原生動(dòng)物、酵母、真菌、病毒)或者來自同物種。例如，可以引入來自同物種的野生型編碼序列或者突變形式的編碼序列的額外拷貝。根據(jù)下文的詳述，該外源核酸可編碼多肽、反義RNA或者其它非翻譯的RNA。該外源核酸一般被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化入該轉(zhuǎn)基因鳥類或者胚的一個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞，例如，通過穩(wěn)定整合入基因組或者引入被該宿主細(xì)胞穩(wěn)定維持的游離型結(jié)構(gòu)體。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)定位置”指的是卵內(nèi)的一個(gè)固定位置或者深度(例如，該卵可被置于一個(gè)預(yù)定朝向并且將該裝置在固定點(diǎn)插入該卵的固定深度)。在備選的實(shí)施方案中，注射可根據(jù)從卵中所獲得的信息而進(jìn)行，例如，根據(jù)胚(例如胚盤)的位置或者其中的區(qū)室、該卵中的卵黃膜等等(例如，所需的區(qū)室的位置可以使用傳感器或者探針而測(cè)定并且根據(jù)該信息而插入該裝置)。
術(shù)語(yǔ)“基本完好”在用于描述該卵殼或者殼內(nèi)膜或者殼外膜時(shí)意指其上無明顯的穿孔或者裂縫。術(shù)語(yǔ)“基本完好”在用于描述殼內(nèi)膜時(shí)意指意指內(nèi)殼膜上無明顯的穿孔或者裂縫。典型情況下，內(nèi)殼膜唯一的可見部分位于在卵殼上形成的窗口或者開口之下，并且根據(jù)開口下的這一暴露部分對(duì)內(nèi)殼膜的情況進(jìn)行測(cè)定。
美國(guó)專利5,897,998(Speksnijder)描述了一種用于對(duì)鳥卵的內(nèi)含物進(jìn)行操作的方法，該操作通過在該卵殼上與其長(zhǎng)軸平行的位置產(chǎn)生一個(gè)開口而進(jìn)行，其中該開口被開在該卵頂側(cè)的卵殼上。隨后將一滴液體加于卵殼的開口上“從而使該開口被完全覆蓋”(美國(guó)專利5,897,998；摘要)。隨后切除底下的膜并且將某種溶液通過殼上的開口微注射進(jìn)該卵，并且封緘該開口。
本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過一滴液體將裝置插入卵是不必要的。進(jìn)一步，如果滴注該液體，不需要如美國(guó)專利5,897,998所述將暴露的膜以及該卵殼中的開口完全覆蓋。進(jìn)一步，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可通過在將該裝置插入卵之前保持內(nèi)殼膜基本完好而改善經(jīng)操作的胚的存活。
為進(jìn)行闡示，在向鳥卵引入物質(zhì)的一個(gè)優(yōu)選和示例性的方法中，該卵被定向于一個(gè)預(yù)定的位置，在該卵的殼中制造了一個(gè)小的開口從而使內(nèi)殼膜在注射之前維持基本完好。將一個(gè)遞送裝置伸入卵殼上的開口并且使用遞送裝置(例如，微量移液器或者微注射針頭)刺穿內(nèi)殼膜，并且通過遞送裝置釋放物質(zhì)并將該物質(zhì)沉積于卵內(nèi)的所需位置。該物質(zhì)一般以約1到10微升(典型情況下低于5或者10微升)體積的預(yù)定劑量進(jìn)行釋放。需遞送的體積不是關(guān)鍵，只要該體積并不過度地傷害胚并且被有效地遞送便可。
在卵殼上的“小開口”指的是一種開口，該開口小得足以對(duì)發(fā)育中的胚不造成過度傷害并且可在需要的情況下被封緘或者閉合。在特定的實(shí)施方案中，在卵殼上的“小開口”直徑可約為35mm或者更低，例如，直徑約為10mm到30mm或者約為15mm到25mm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該“小開口”在直徑上低于約10mm，低于約5mm或者低于約3mm、2mm或者甚至低于1mm。
在典型的情況下，遞送裝置應(yīng)從卵中被收回，除非該遞送裝置是一種留在卵內(nèi)的可移植的裝置。一般情況下，在卵上的開口被封緘，除非再向其上引入開口之前對(duì)卵殼使用了一種自封材料(即，一種封閉劑)。接受操作的卵可隨后被置于保溫器中或者進(jìn)行保存直至孵化或者其它任何所需的終點(diǎn)。
在卵殼上的開口可被在任何適當(dāng)?shù)奈恢蒙现瞥?，例如在卵上接近赤道軸的一側(cè)或者位于該卵任意一端。在一個(gè)特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵殼上的開口被引入于該卵的鈍端的氣室之上。根據(jù)該實(shí)施方案，在外殼膜上也引入了小的開口。通過氣室而同外殼膜相分離的內(nèi)殼膜在注射之前保持基本完好。內(nèi)殼膜被遞送裝置刺穿并且通過其將某種物質(zhì)釋放進(jìn)入該卵的所需位置。
在外殼膜上的“小開口”與上文關(guān)于卵殼上的小開口的描述基本相同。
本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到，無論卵是水平置放、豎直置放或者成一個(gè)角度置放，早期胚(例如胚盤)在典型情況下應(yīng)定位于該卵的最上部位的區(qū)域或其附近。由此，在該卵殼上的開口一般應(yīng)被制成于位于早期胚(胚盤)的預(yù)期位置附近的卵最上部，除非進(jìn)行了測(cè)定而將該胚位置定于該卵內(nèi)的其它位置。
在特定的實(shí)施方案中，在卵殼中的開口被制成于該卵的頂側(cè)位置(即，沿著該卵的長(zhǎng)軸)。根據(jù)該實(shí)施方案，該卵在典型的情況下應(yīng)被定向于一個(gè)大體上水平的位置，即，使長(zhǎng)軸同水平的傾斜角度低于約45度。在特定的實(shí)施方案中，以卵的長(zhǎng)軸為準(zhǔn)該卵同水平的傾斜角度低于約30、20、15、10或者5度。在其它的實(shí)施方案中，該卵被置于一個(gè)基本水平的位置，即，該卵沿其長(zhǎng)軸基本上無傾斜(例如，同水平的傾斜低于約5％或者10％)。
當(dāng)裝置被注射入該卵的側(cè)面時(shí)，該裝置一般應(yīng)同時(shí)插入于內(nèi)殼膜和外殼膜之中。在其它的特定實(shí)施方案中，該膜可在將開口制成于卵殼之上時(shí)被取出。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，在將裝置通過內(nèi)殼膜插入之前在外殼膜上制出小開口，在該情況下內(nèi)殼膜在將裝置通過其插入之前保持基本完好。
在特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，以該卵的長(zhǎng)軸為準(zhǔn)卵被定向于豎直位置，該卵的鈍端被定向于大體上朝上的位置?！按篌w上朝上的位置”指的是該卵被豎直定位并且長(zhǎng)軸同豎向的傾斜角度低于約45度。在特定的實(shí)施方案中，以該卵的長(zhǎng)軸為準(zhǔn)該卵同豎向的傾斜角度低于約30、20、15、10或者5度。在其它的實(shí)施方案中，卵被置于一個(gè)基本直立的位置，即，該卵沿其長(zhǎng)軸基本上無傾斜(例如，同豎向的傾斜低于約5％或者10％)。根據(jù)該實(shí)施方案，該卵總體上的傾斜使得早期胚(例如胚盤)被定位于該卵鈍端的氣室之下。
卵殼膜中的開口可被制成于一個(gè)預(yù)定的位置(例如，位于卵的鈍端的中央或者位于卵的鈍端氣室的中央)，或者可被制成于一個(gè)由早期胚(例如胚盤)的位置所決定或者至少部分決定的位置。
本發(fā)明還可被有利地用于向早期胚中或者從早期胚中進(jìn)行卵內(nèi)的物質(zhì)遞送或者取出(如上描述)。在特定的實(shí)施方案中，早期胚為胚盤(亦如上述)。同樣優(yōu)選的情況還有，早期胚處于卵中的氣室可檢測(cè)的階段。
物質(zhì)可被釋放于胚(例如胚盤)本身之中(例如，于明區(qū)或者暗區(qū)之中)?；蛘?，物質(zhì)可被釋放于早期胚附近(例如，正在其上、其下或者鄰近)，其同胚(例如胚盤)的距離在約10、8、5、3、2或者1mm之內(nèi)或者更近。根據(jù)這一實(shí)施方案，物質(zhì)可被釋放于胚的胚下腔、介于暗區(qū)和卵黃膜之間、介于明區(qū)和卵黃膜之間和/或加入明區(qū)和暗區(qū)之間。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，物質(zhì)被釋放于卵黃心和/或釋放入潘德而氏核。
遞送PGC的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且一般通過將PGC注射進(jìn)入胚的血管(例如背動(dòng)脈)中或者注射進(jìn)外胚膜中任何一條足夠大的血管(例見，專利出版物WO99/06533；University of Massachusetts)而進(jìn)行實(shí)施。類似地，可從胚的血管中或者從PGC期胚的外胚膜的血管中進(jìn)行血樣的收取。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種向含有早期胚(例如胚盤)以及氣室的鳥卵中遞送某種物質(zhì)的方法，該方法包括將卵定向以使卵的鈍端處于一個(gè)預(yù)定的位置(例如，如前所定義處于一個(gè)大體向上的位置)，在卵的鈍端于氣室之上向卵殼以及外殼膜中引入一個(gè)小開口，該情況下內(nèi)殼膜保持基本完好的狀態(tài)，通過在卵殼和外殼膜上的開口伸入一種遞送裝置，以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，以及通過該遞送裝置將某種物質(zhì)釋放進(jìn)入胚盤或者其附近。
在外殼膜上形成開口以及刺穿內(nèi)殼膜的步驟可通過將裝置穿過此兩種膜而在基本上同步實(shí)施。在特定的實(shí)施方案中，一個(gè)開口應(yīng)首先被制成于外殼膜上，并且隨后該裝置應(yīng)被插透內(nèi)殼膜以在其上產(chǎn)生開口。類似地，卵殼中的開口可在外殼膜上開口的形成之前形成(例如，首先將一個(gè)開口穿入卵殼并隨后開口被穿入外殼膜)或者基本上同時(shí)形成(即作為單一步驟)。
根據(jù)上文所述，在優(yōu)選的情況下穿過內(nèi)殼膜的注射并不是通過將一個(gè)液滴沉積在內(nèi)殼膜上而完成。在那些通過液體進(jìn)行注射的實(shí)施方案中，在優(yōu)選的情況下該液體為一種水性液體(例如，一種白蛋白溶液)并且僅僅有小體積(例如，二至十微升)沉積于內(nèi)殼膜上。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，本發(fā)明的方法可在多個(gè)鳥卵上實(shí)施，例如，在商業(yè)化的家禽作業(yè)中實(shí)施。當(dāng)本發(fā)明的方法在多個(gè)鳥卵上實(shí)施時(shí)，可以在禽群整體水平上觀察到提高的孵化率和降低的發(fā)病率，盡管經(jīng)受卵內(nèi)操作的個(gè)體鳥類中仍然存在一定的發(fā)病率和致死率。
在優(yōu)選的情況下，接受操作的卵中的孵化率至少約為40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者更高。同樣優(yōu)選的情況下，接受操作的卵中的孵化率類似于在未經(jīng)操作(例如，未在殼中產(chǎn)生開口，等等)的參照卵中所觀察到的孵化率，或者孵化率同參照卵相比較的減少低于約25％、15％、10％、5％、3％、2％或者甚至1％。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明可被用于向含有早期胚(例如，胚盤)的卵中遞送某種物質(zhì)或者向早期胚本身遞送某種物質(zhì)。任何物質(zhì)均可通過本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行注射，包括細(xì)胞、疫苗、多肽、生長(zhǎng)刺激物、原生培養(yǎng)物，例如競(jìng)爭(zhēng)性排它培養(yǎng)基(competitive exclusionmedia)、抗生素、異源核苷酸序列(包括基因轉(zhuǎn)移載體)、維生素和/或標(biāo)記物，例如染料等等，但不限于這些。這些物質(zhì)可單獨(dú)注射或者聯(lián)合注射(例如，抗生素可被包括入其它物質(zhì)的遞送之中)。作為另一個(gè)闡示性的例子，一種染料或者其它標(biāo)記物可被包括于其它的物質(zhì)之中進(jìn)行注射以提供一種測(cè)定該遞送是否達(dá)到所需位置的方法。
本文所使用的“多肽”包括蛋白質(zhì)和肽。用于向卵或者胚本身中遞送的多肽包括抗體、抗原(例如，用于免疫化)、生長(zhǎng)因子、激素以及其它生長(zhǎng)或者性能增強(qiáng)性多肽、酶、細(xì)胞因子等等。
“生長(zhǎng)或者性能增強(qiáng)”指的是生長(zhǎng)速度、動(dòng)物體的最終體積、投入產(chǎn)出比(feed to gain ratio)、卵產(chǎn)量、肉產(chǎn)量等等有所提高。
疫苗有機(jī)體包括死亡、活體或者減毒的病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌，包括這些不同的有機(jī)體的多種生活期在內(nèi)。
該方法還可被有利地應(yīng)用于向發(fā)育中的胚內(nèi)引入所需的核苷酸序列(在優(yōu)選的情況下，核苷酸序列被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化進(jìn)入胚細(xì)胞)，即，用于產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因的鳥類(如前所述)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，讓所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因鳥類的每個(gè)細(xì)胞均含有該轉(zhuǎn)基因是不必要的。核苷酸序列可以為DNA或者RNA，并且序列可編碼任何目的多肽或者可編碼非翻譯RNA(例如，反義RNA或者核酶)。在核苷酸序列編碼多肽的實(shí)施方案中，多肽可為一種報(bào)告多肽(例如，諸如綠色熒光蛋白或者堿性磷酸酶這樣的酶)、一種治療性多肽、一種免疫源性多肽(即，用于接種疫苗)、一種生長(zhǎng)或者性能增強(qiáng)性多肽，等等。
可以使用本領(lǐng)域所已知的任何載體和方法將核苷酸序列引入胚。例如，可以使用病毒載體(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒)或者DNA載體以攜帶目的外源核苷酸序列。在特定的實(shí)施方案中，病毒載體不被用于將核苷酸序列引入胚。向細(xì)胞中進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和裸露的DNA載體的引入(例如，使用脂質(zhì)體或者電穿孔)的方法在本領(lǐng)域中是已知的。用于卵內(nèi)電穿孔的裝置包括BTX ECM 2001電穿孔裝置(www.genetronics.com)。
在其它的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明被用于將一種“外源”或者“供體”細(xì)胞引入受體胚(即，用于產(chǎn)生一種嵌合胚并且根據(jù)情況產(chǎn)生嵌合鳥類，如上文所定義)。供體細(xì)胞可以是一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或者具有任何其它用于向胚中進(jìn)行引入的目的特征。如前所述，供體細(xì)胞在典型情況下應(yīng)為一種鳥類細(xì)胞。
在特定的實(shí)施方案中，受體胚和供體細(xì)胞來自于相同的鳥種?；蛘?，供體細(xì)胞可來自于一種與受體胚不同的鳥種(例如，將一種火雞細(xì)胞送入一種雞胚)。作為進(jìn)一步的備選，胚和供體細(xì)胞可來自于相同的鳥種，但來自于不同的品種(breed)或者品系(strain)(例如，雞的兩種不同的品種或者品系)。受體或者供體細(xì)胞可來自一種頻危的鳥種。
進(jìn)一步，供體細(xì)胞還可來自于表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類。在典型的情況下，表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類被用作為育種禽群以產(chǎn)生具有所需性狀的譜系。本發(fā)明有利地實(shí)現(xiàn)了對(duì)來自于單個(gè)表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類的細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)移從而一步便產(chǎn)生了多個(gè)“后代”，而非通過連續(xù)傳代擴(kuò)展品系的傳統(tǒng)方法，該傳統(tǒng)方法可導(dǎo)致一些所需性狀的消褪或者喪失。這些表現(xiàn)出色或者血統(tǒng)優(yōu)良的鳥類可在任何所需的性狀(例如，在商業(yè)上重要的性狀)上有所改善或者具有優(yōu)越性，包括，增高的肌肉產(chǎn)量、減少的脂肪成分、改善的疾病抗性、不同的體積(例如，較小的鳥類)、羽毛減少的降低或者不同的羽毛組成，和/或不同的雄鳥比例，但不限于這些。
在典型的情況下，供體細(xì)胞將選自胚盤細(xì)胞、干細(xì)胞、培養(yǎng)的干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、原生殖細(xì)胞以及胚生殖細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，在引入供體細(xì)胞之前使受體胚中的細(xì)胞受損是需要的。使胚細(xì)胞受損的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。使胚受損的適當(dāng)?shù)姆椒òǎズ?從受體胚中取出細(xì)胞)、機(jī)械傷害(例如，撕裂)、伽瑪照射、微波、軟X-射線、化學(xué)處理(例如，氨氣)、熱、激光處理和/或低溫冷凍等等，但不限于這些。在特定的實(shí)施方案中，放射照射、加熱、化學(xué)處理以及軟X-射線可被用于全卵。在其它的實(shí)施方案中，紫外照射、微波、熱、激光處理、低溫處理、機(jī)械傷害和去核可被用于通過卵殼上的開窗對(duì)胚進(jìn)行損傷。
胚的受損程度可通過本領(lǐng)域中所知的任何方法進(jìn)行測(cè)定，例如，通過染料，特別是熒光染料，該方法選擇性地對(duì)死亡細(xì)胞(例如，碘化丙啶)或者凋亡細(xì)胞(例如，Hoeschst 333342染料)進(jìn)行染色。或者，可對(duì)本領(lǐng)域已知的指示死亡或者凋亡狀態(tài)的mRNA轉(zhuǎn)錄本或者多肽進(jìn)行檢測(cè)。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生嵌合鳥類的方法，該方法包括的步驟有，將一個(gè)小的開口引入卵殼中，通過在卵殼上的開口伸入一種遞送裝置，以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在被插入遞送裝置之前保持基本完好，在足以產(chǎn)生嵌合胚的條件下通過遞送裝置釋放一種供體細(xì)胞，并將供體細(xì)胞沉積在胚盤之上或其附近(如上所述)，從卵之中收回遞送裝置，并且將嵌合胚溫育直至孵化以產(chǎn)生嵌合鳥類。
這些細(xì)胞向胚盤之中的成功遞送和/或嵌合體的產(chǎn)生可通過本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行估測(cè)。例如，可以使供體細(xì)胞接觸某種染料(例如，熒光染料諸如羧基熒光素-二乙酸-琥珀酰酯)、金顆粒，或者任何本領(lǐng)域中已知的可以在細(xì)胞向受體胚的遞送之后被檢測(cè)到的其它標(biāo)記物?；蛘撸w細(xì)胞可以攜帶特定的表位或者核酸序列，這些表位或者核酸序列可以使用抗體或者標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)以對(duì)供體細(xì)胞或其后代在胚盤、胚或者所產(chǎn)生的鳥類中的存在進(jìn)行鑒定。另外，在替代的情況下，供體細(xì)胞可攜帶某種或者某些基因，該基因產(chǎn)生一種特定的表型性狀，該表型性狀可容易地在胚或者孵化后的鳥體中進(jìn)行檢測(cè)(例如，羽色)。
本發(fā)明的上文說明主要涉及將某種物質(zhì)遞送入卵或者早期胚(例如，胚盤)的方法。對(duì)卵進(jìn)行注射的方法還可以被用于將一種取樣裝置插入于卵之中以從該卵(例如，如上文所述，從胚中)之中收取物質(zhì)(即樣品)或者對(duì)來自卵的信息進(jìn)行檢測(cè)(例如，來自胚)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可將某種取樣裝置插入于卵之中以從其中收取樣本。樣本可取自于卵的外胚部分(例如，卵黃或者白蛋白)。例如，可從白蛋白中收取樣品以測(cè)定微生物污染(例如，沙門氏菌)在其中的存在與否。在其它的實(shí)施方案中，樣品取自于早期胚(例如，胚盤)，例如明區(qū)、暗區(qū)和/或胚下腔。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，樣本含有胚盤細(xì)胞。在典型的情況下將對(duì)樣品進(jìn)行收取以獲得來自其中的信息。例如，樣品的收取可同性別鑒定或者測(cè)定胚的活力的方法聯(lián)合使用。為加以說明，可從胚中收取含有細(xì)胞的樣品，并且根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行分析(在典型的情況下進(jìn)行于從卵中的收取之后)以測(cè)定性別染色體或者染色體上的性別特異性序列。樣品還可被用于任何其它的基于DNA的分析，例如，用于測(cè)定某種特定的目的基因或者等位基因在胚中的存在。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將一種檢測(cè)器裝置插入卵以檢測(cè)其中(即，來自卵和/或來自胚)的信息。檢測(cè)器可被插入于卵中的一個(gè)胚外位置(例如，卵黃或者氣室)?；蛘邫z測(cè)器可被置于胚的明區(qū)或者暗區(qū)之中或者胚下腔中。
檢測(cè)器裝置可被用于收集信息，這些信息包括，胚的大小、胚的位置、胚的發(fā)育階段、胚的性別和/或胚的活力，但不限于這些。在優(yōu)選的情況下，檢測(cè)器裝置獲得的信息涉及胚和胚下腔的位置。信息可由同檢測(cè)器相聯(lián)結(jié)的儀器(例如，計(jì)算機(jī)或者其它數(shù)據(jù)處理器)進(jìn)行捕獲。
對(duì)于特定的實(shí)施方案，卵接受了鑒定，從中收取了樣品或者使用檢測(cè)器對(duì)信息進(jìn)行檢測(cè)。涉及樣品或者由檢測(cè)器所獲得的信息可同卵的標(biāo)識(shí)一起保存。示例性的檢測(cè)器裝置在下文中進(jìn)行更為詳盡的討論。
圖1-6為展示本發(fā)明的特定實(shí)施方案的流程圖。
如
圖1中所顯示，根據(jù)本發(fā)明的對(duì)含有早期胚(例如，胚盤)的鳥卵進(jìn)行注射的一個(gè)特定的實(shí)施方案包括的步驟有，在注射之前對(duì)卵進(jìn)行準(zhǔn)備1000，將胚在卵中進(jìn)行定位2000，將一個(gè)開口引入卵之中3000，對(duì)胚的位置進(jìn)行定位4000，以及將一種裝置插入卵內(nèi)的所需位置之中5000。
如圖2中所顯示，卵可根據(jù)情況在注射之前進(jìn)行準(zhǔn)備。卵的表面，至少是注射位置周圍，受到了消毒處理以降低微生物污染1200(例如，使用酒精或者其它消毒溶液)，卵可進(jìn)一步在一個(gè)預(yù)定位置進(jìn)行定向1300(例如，使卵的鈍端處于大體朝上的位置)。在特定的實(shí)施方案中，對(duì)卵在注射前進(jìn)行貯存1100。在典型的情況下，對(duì)卵進(jìn)行貯存的時(shí)間足以輔助將胚定位或者“定向”于卵內(nèi)所需的位置，但不足以對(duì)胚產(chǎn)生不可接受的致病或者致死發(fā)生率。為進(jìn)行說明，卵可被貯存六小時(shí)、十二小時(shí)、二十四小時(shí)或者更長(zhǎng)。只要活力不受到不適當(dāng)?shù)膿p害或者胚的發(fā)育不超過適于本發(fā)明的時(shí)間點(diǎn)，則貯存時(shí)間沒有特定的限制。這些卵在注射前可被貯存長(zhǎng)達(dá)約30或者甚至約60天。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，卵在注射前可被貯存約30天或更短，約14天或更短，約10天或更短，或約7天或更短。在其它的特定的實(shí)施方案中，卵在注射之前被貯存約1、2、3、4、5、7、8、10、14或21天；或者約1-21天、約1-14天、約1-7天、約1-4天、約4-8天或者約6-12天。
一般情況下，對(duì)卵進(jìn)行貯存的條件(例如，溫度)應(yīng)不促進(jìn)卵內(nèi)的胚的發(fā)育或者可避免超過所需的發(fā)育階段(例如，胚盤期)的發(fā)育。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)會(huì)意識(shí)到，在貯存期間可發(fā)生一些細(xì)胞分裂；但是，總體上胚的發(fā)育在貯存期間被暫時(shí)中止或者明顯地延遲。
在貯存期間，卵可被定向于一個(gè)水平或者豎直位置(以長(zhǎng)軸為準(zhǔn))，或者處于一定的角度。在特定的實(shí)施方案中，卵被貯存的方向與注射所使用的相同。進(jìn)一步，卵可被維持于一個(gè)固定的位置(例如，在裝置中)，在該位置中側(cè)向(side to side)移動(dòng)以及繞長(zhǎng)軸的轉(zhuǎn)動(dòng)都受到限制或者受阻。
在特定的實(shí)施方案中，如上文所述，胚可進(jìn)一步在對(duì)胚的注射之前受損。
如前文所指出，在注射之前對(duì)胚進(jìn)行定向或者定位是理想并且有利的，特別是對(duì)于對(duì)卵進(jìn)行注射的自動(dòng)或者半自動(dòng)方法。對(duì)于圖3，如上所述，卵可在注射2100之前進(jìn)行貯存以促進(jìn)胚盤定位于卵黃的頂端中心表面。在替代的情況下，或者與此同時(shí)，可對(duì)卵進(jìn)行振動(dòng)(agitate)(例如，進(jìn)行搖晃)2200、轉(zhuǎn)動(dòng)2300、離心2400和/或旋轉(zhuǎn)2500以輔助胚的定向。在替代或者進(jìn)一步的情況下，卵的內(nèi)容物可受到溫度條件的變化，變化通過加熱2600(例如，加熱至溫度介于約55°F或者約60°F到低于約75°F、80°F或者95°F之間)或者降溫2700。根據(jù)上文所討論，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，卵被應(yīng)用于足夠溫和的加熱處理(時(shí)間×溫度)從而使胚并不發(fā)育超過所需的階段。作為進(jìn)一步的替代性或者進(jìn)一步的處理，卵可受到化學(xué)處理(例如，使用氨氣處理白蛋白)2800以輔助胚定向于所需位置。另外，或者在替代的情況下，卵周圍的空氣濕度可受到控制2900(例如，高于或者低于約75％)。
在特定的實(shí)施方案中，這些卵受到導(dǎo)致白蛋白稀薄(即，破裂卵中穩(wěn)固程度的喪失或者減低的Haugh單位)的處理(例如，化學(xué)或者機(jī)械處理)。據(jù)信較稀的白蛋白輔助胚盤定位于卵黃頂部中心表面?；蛘撸瑏碜暂^老的禽群的卵和/或較大的卵可被用于本發(fā)明的方法。由較老的產(chǎn)卵禽只產(chǎn)生的卵以及較大的卵均更有可能具有相對(duì)較稀的白蛋白。
氨氣在文獻(xiàn)中已經(jīng)被報(bào)道可導(dǎo)致白蛋白的稀薄。卵可被暴露于任何可導(dǎo)致胚盤定位于所需位置的適當(dāng)水平的氨氣。適當(dāng)濃度的氨氣可低于約100、150、250、500、750、1000、1500、2000、2500、3000或者3 500、4000、5000、6000、7000或者8000mg/kg或者更高，在足夠的時(shí)間內(nèi)使用(例如，約0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5或者6小時(shí))。在特定的實(shí)施方案中，這些卵在相對(duì)較短的期間(例如，約0.5到1小時(shí))被暴露于相對(duì)較高水平的氨氣(例如，約2000到4000mg/kg)。在其它的實(shí)施方案中，卵在約0.5到2小時(shí)的期間被暴露于低劑量的氨氣，濃度為約250-1000或者500-1500mg/kg。
在特定的實(shí)施方案中，一些手段的聯(lián)合被用于幫助該胚盤定位或者定向于卵黃的頂部中央表面。例如，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該卵在約65℃到約75℃之下被貯存了約2到7天，同時(shí)在貯存期間轉(zhuǎn)動(dòng)該卵。進(jìn)一步，被選用與這一處理的卵可為較大的卵和/或來自較老產(chǎn)卵禽只的卵。
對(duì)于圖4，一個(gè)小的開口被引入卵殼3300以及外殼膜3400。盡管這些步驟被分別實(shí)施，它們也可以基本上同時(shí)實(shí)施，特別是在自動(dòng)或者半自動(dòng)的方法中。作為進(jìn)一步的備選步驟，可對(duì)位于卵鈍端的氣室的位置進(jìn)行測(cè)定3100，該步驟在典型情況下在向卵殼內(nèi)引入開口之前進(jìn)行。作為進(jìn)一步備選的步驟，可在卵殼3200中產(chǎn)生開口之前或者之后對(duì)其使用一種密封劑，從而使在卵殼內(nèi)的開口基本上自行封閉。在替代的情況下，或者進(jìn)一步的情況下，可在使用裝置刺穿內(nèi)殼膜之前或者之后對(duì)內(nèi)殼膜使用密封劑。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，裝置將以預(yù)定的深度和位置被插入卵。在其它的實(shí)施方案中，裝置將根據(jù)卵中的特定區(qū)室或者結(jié)構(gòu)的位置插入卵，例如，根據(jù)卵中的胚或者胚下腔。胚或者胚下腔的位置的測(cè)定可與注射(或者取樣)同時(shí)進(jìn)行或者在此之前進(jìn)行。對(duì)胚進(jìn)行定位的優(yōu)選方法示于圖5。對(duì)于手動(dòng)或者半自動(dòng)注射方法，胚可簡(jiǎn)單地通過在卵殼上的開窗進(jìn)行觀察(使用或者不使用放大裝置)4200。卵可進(jìn)一步被旋轉(zhuǎn)4100以使胚進(jìn)入視野?？赏ㄟ^以特定波長(zhǎng)的光(例如藍(lán)色)通過卵殼上的開口對(duì)卵內(nèi)部進(jìn)行直射或者通過加入反差劑(例如，一種著色或者熒光染料)而增強(qiáng)胚和背景的反差。使用本領(lǐng)域中所已知的工藝，早期胚的觀察還可以通過對(duì)雌雞喂以可以影響卵黃顏色(例如，成為紫色陰影或者黃色的不同陰影)的食料或者化合物。
在其它的實(shí)施方案中，特別是在自動(dòng)或者半自動(dòng)注射方法中，涉及胚或者其它區(qū)室在卵中的位置的信息可以使用檢測(cè)器裝置進(jìn)行檢測(cè)4300。檢測(cè)器裝置在下文詳細(xì)討論，可以是侵入性或者非侵入性裝置。然而，在典型的情況下，某種裝置將被插入卵殼和外殼膜的開口中以收集同測(cè)定胚在卵內(nèi)的位置相關(guān)的信息。檢測(cè)步驟可基本上同遞送和/或取樣步驟同時(shí)進(jìn)行?；蛘?，這些步驟可以依次進(jìn)行。用于同步進(jìn)行卵內(nèi)注射和檢測(cè)的裝置在美國(guó)專利No.6,244,214(Hebrank)中有所描述。
根據(jù)上文描述并且如圖6所示，內(nèi)殼膜在通過其插入某種裝置之前被維持于基本完好的狀態(tài)(如上所述)。一個(gè)小開口被制成于內(nèi)殼膜中5100，典型情況下該開口位于胚之上方或著其附近。在典型的情況下，開口通過刺穿內(nèi)殼膜而制成，過程通過將某種裝置穿過內(nèi)殼膜進(jìn)行插入而完成。裝置可為遞送裝置5200，取樣裝置5300，或者檢測(cè)器裝置5400。在一些實(shí)施方案中，裝置可含有檢測(cè)器、遞送和/或取樣功能。
在一些實(shí)施方案中，向卵殼和外殼膜中引入開口的步驟以及根據(jù)情況進(jìn)行的刺穿內(nèi)殼膜的步驟被同步實(shí)施，即，在一個(gè)步驟中進(jìn)行。但是，在典型的情況下，開口將作為一個(gè)單獨(dú)的步驟被引入卵殼，這是因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明所使用的裝置基于其功能(例如，微注射針頭)可能會(huì)具有過細(xì)的直徑而不能刺透卵殼。類似地，盡管本發(fā)明可通過同時(shí)穿過外殼膜和內(nèi)殼膜的注射而實(shí)施(特別是在對(duì)卵的側(cè)面進(jìn)行注射的情況下，此二種膜融合于該處)，當(dāng)對(duì)卵的鈍端進(jìn)行注射時(shí)這些步驟一般將會(huì)分開實(shí)施。
本文所描述的注射方法可是完全手動(dòng)、完全自動(dòng)或者半自動(dòng)。例如，如
圖1所示，卵的準(zhǔn)備步驟和對(duì)胚進(jìn)行定位的步驟可更能適于手工方法。在卵殼和外殼膜中引入開口的步驟、定位胚并且插入裝置的步驟可以是手工步驟，但在優(yōu)選的情況下為自動(dòng)步驟。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中使用了一種多位點(diǎn)的注射或者取樣裝置，例如，根據(jù)美國(guó)專利No.6,032,612的描述(Williams等)。其它的優(yōu)選的遞送或者取樣裝置包括在美國(guó)專利No.5,136,979(Paul等)；美國(guó)專利No.4,681,063和4,903,635(Hebrank)；以及美國(guó)專利No.4,040,388、4,469,047、4,593,646(Miller)中描述的裝置。
在進(jìn)一步的一個(gè)實(shí)施方案中，一種進(jìn)一步含有一種檢測(cè)器的注射裝置被用于在向卵中進(jìn)行注射(用于取樣和/或向卵或者胚中遞送物質(zhì)的目的)之前或者與之同時(shí)收集有關(guān)胚(例如，胚盤)或者其它區(qū)室的位置的信息，注射器根據(jù)美國(guó)專利No.6,244,214(Hebrank)中的描述。
檢測(cè)步驟的時(shí)機(jī)取決于方法的具體目的和待檢測(cè)的項(xiàng)目，以及用于注射的材料或者被收取的樣本的性質(zhì)。一般情況下，檢測(cè)步驟可在遞送或者取樣步驟之前、之后或者同時(shí)進(jìn)行。
電子傳感器、光學(xué)傳感器、化學(xué)傳感器、溫度傳感器、聲傳感器、壓力傳感器或者其它用于檢測(cè)物理或者化學(xué)參數(shù)的裝置可在實(shí)施本發(fā)明的這一方面中內(nèi)用作為檢測(cè)手段或者檢測(cè)器。檢測(cè)器或者傳感器可聯(lián)至注射裝置的外壁，或者對(duì)于電子檢測(cè)器以及在裝置有導(dǎo)電的金屬材料而非絕緣或者多聚物材料制成的情況下，注射裝置的外壁本身可作為檢測(cè)器，其中具有適當(dāng)?shù)碾娐放c之相聯(lián)。檢測(cè)器可以是一個(gè)或者兩個(gè)(或多個(gè))電極，這些電極由一種不導(dǎo)電的注射裝置攜帶或者裝在一種導(dǎo)電的注射裝置的絕緣部分之上。應(yīng)會(huì)受到認(rèn)可的是，出于感受在卵解剖結(jié)構(gòu)中的深度或者位置的目的，多個(gè)不同的物理或者化學(xué)參數(shù)可被感知或者檢測(cè)，只要這些參數(shù)為該卵是否應(yīng)被注射或者是否已經(jīng)達(dá)到了特定的深度或者位置提供了有用的指示信息。
傳感器可被置于注射裝置的頂端，或者位于其外壁上的預(yù)定位置，以及/或者離開注射裝置的頂端。
生物傳感器可被用于實(shí)施本發(fā)明。已知多種生物傳感器。例見，美國(guó)專利No.5,804,453、5,770,369、5,496,701、4,682,895、5,646,039、5,587,128和4,786,396。
當(dāng)使用電子傳感器時(shí)，可能需要提供第二個(gè)電極同第一個(gè)電極進(jìn)行操作聯(lián)結(jié)。在使用兩個(gè)電極的情況下，它們可同時(shí)與注射裝置相聯(lián)，或者一個(gè)與注射裝置相聯(lián)而另一個(gè)通過卵殼上的同一開口另行插入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二個(gè)電極同卵的外部相接觸。一個(gè)電信號(hào)可通過此二電極，并且檢測(cè)這兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)的存在與否。當(dāng)?shù)诙姌O簡(jiǎn)單地同卵的外部相接觸時(shí)，信號(hào)在優(yōu)選的情況下為交流電信號(hào)，從而使第二電極同卵的內(nèi)容物電容性耦聯(lián)(capacitively couple)。在優(yōu)選的情況下，各個(gè)卵(或者容有多個(gè)卵的平板)在使用電子檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)之前被置于一種導(dǎo)電材料的頂部(例見，涉及導(dǎo)電聚氨酯泡沫的美國(guó)專利No.5,591,482)。
當(dāng)使用電子檢測(cè)器對(duì)諸如胚下腔這樣的充液區(qū)室的位置進(jìn)行感測(cè)時(shí)，電子檢測(cè)器對(duì)進(jìn)入液體區(qū)室的探頭的進(jìn)入進(jìn)行感測(cè)，并且由此而用作為深度檢測(cè)器(術(shù)語(yǔ)“深度檢測(cè)器”在此包括“位置感測(cè)器”)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)器和/或相聯(lián)的注射裝置的移動(dòng)在檢測(cè)器和/或裝置進(jìn)入?yún)^(qū)室時(shí)被中斷。通過該方式，注射裝置可在剛好刺透胚下液后并且完全刺透該腔之前停止前進(jìn)。
光學(xué)傳感器可包括光導(dǎo)纖維，并且可同注射裝置的外壁部分相聯(lián)?？赏ㄟ^第二個(gè)光導(dǎo)纖維提供一個(gè)光源，第二光導(dǎo)纖維與該裝置同時(shí)插入卵，或者將一個(gè)外部照明源照在該卵之上。光傳導(dǎo)或者透射特征可被用于測(cè)定胚或者胚下腔的位置。光還可以檢測(cè)某種顏色標(biāo)記物，該標(biāo)記物用于生理測(cè)量、疾病測(cè)量或者性別測(cè)量。
化學(xué)傳感器可以以生物傳感器領(lǐng)域中的技術(shù)人員所知的任何形式進(jìn)行提供。例如，可以通過來自Becton Dickinson MicrobiologySystems，Cockeysville，美國(guó)馬里蘭的BBL脂質(zhì)體技術(shù)或者根據(jù)美國(guó)專利NO.4,703,017和4,743,560中的描述而提供一種化學(xué)傳感器。當(dāng)這些組件被裝配于注射裝置之上時(shí)，這樣一種分析的結(jié)果可根據(jù)上文通過使用光導(dǎo)纖維而讀出。其它的化學(xué)分析可通過電化學(xué)檢測(cè)而實(shí)施。這樣的傳感器可被用于，例如，測(cè)定卵之中的胚的位置或者性別。以及用于檢測(cè)卵中的可能的微生物感染。
化學(xué)傳感器可為裝配于注射裝置上的pH傳感器，pH測(cè)量被用于檢測(cè)可能的微生物污染、將死卵和活卵區(qū)分等等。還可以使用檢測(cè)不同陽(yáng)離子或陰離子種類的離子特異性電極，如下文所進(jìn)一步描述。離子和pH探頭通過存在于卵的多種區(qū)域和區(qū)室的生物液體的化學(xué)性質(zhì)的差異而感測(cè)卵內(nèi)區(qū)室間的移動(dòng)。
溫度傳感器可被用于將活卵同死卵進(jìn)行區(qū)分或者用于根據(jù)溫度對(duì)胚和/或胚下腔進(jìn)行定位，或者用于卵的性別分選。
聲傳感器可被用作為被動(dòng)或者主動(dòng)傳感器(即，同聲信號(hào)源相聯(lián)，例如同卵外部相接觸的轉(zhuǎn)導(dǎo)器)以檢測(cè)深度、將可孵卵和不可孵卵加以區(qū)分、測(cè)定胚或者胚下腔的位置，等等。
通過多種工藝可植入一種位置或者深度傳感器。同氣室膜的電接觸可被用于控制裝置相對(duì)卵的預(yù)定區(qū)室的刺穿，例如，相對(duì)于氣室膜下的預(yù)定深度，或者被用于確保在胚下腔內(nèi)、在胚內(nèi)或者任何其它位置的更為精準(zhǔn)的注射，等等?；蛘撸梢允褂靡环N壓力傳感器感測(cè)深度，傳感器估測(cè)該裝置在卵內(nèi)的區(qū)室之間(例如，從氣室到胚；從胚到胚下腔；等等)進(jìn)行移位的期間的壓力變化。感應(yīng)該傳感器的位置的一個(gè)適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)包圍該傳感器的卵介質(zhì)加諸于傳感器上的壓力進(jìn)行測(cè)量。例如，可使用注射裝置或者充滿空氣或者液體的中空管，對(duì)將氣體或者液體注入包圍著位于傳感器中的出口的介質(zhì)所需的壓力進(jìn)行測(cè)量。所需的釋放壓力在出口從充氣區(qū)室(例如，氣室)移動(dòng)到充液區(qū)室時(shí)有所提高；當(dāng)出口從充液區(qū)室移入胚時(shí)再度提高。壓力的變化可通過放在卵外部的壓力測(cè)量裝置進(jìn)行測(cè)量。
光傳感器可同外部光源或者由裝置所攜帶的光源進(jìn)行聯(lián)合使用，從而對(duì)裝置是否位于諸如氣室這樣的充氣區(qū)室、諸如胚下腔或者卵黃這樣的充液區(qū)室或者諸如胚這樣的細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行區(qū)分。
傳感器可以是用于檢測(cè)卵之中的細(xì)菌污染或者其它微生物污染的診斷傳感器，這些污染的例子如，大腸桿菌、沙門氏菌或者單核細(xì)胞增多性李斯特菌對(duì)卵的污染。診斷型傳感器可通過任何適當(dāng)?shù)氖侄伪恢踩?，在典型情況下為一種化學(xué)傳感器或者生物傳感器。對(duì)被污染卵的檢測(cè)可被用于觸發(fā)一個(gè)信號(hào)以用于隨后對(duì)被污染卵同未污染卵進(jìn)行分選。
多個(gè)傳感器可同裝置進(jìn)行連接。例如，在需要對(duì)卵的微生物污染進(jìn)行檢測(cè)、測(cè)定卵中的結(jié)構(gòu)的位置的情況下，或者在需要對(duì)卵進(jìn)行性別分選的情況下，提供兩種不同的或者各異類型的數(shù)據(jù)以提供所需條件的更為精準(zhǔn)的指示可能是有利的。
檢測(cè)步驟可通過從卵中收取樣本放入一個(gè)處理系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)施，在處理系統(tǒng)中進(jìn)行了隨后的分析。例如，一個(gè)液體樣本可被收取并且進(jìn)行分析以從其中獲得所需的信息，獲得信息的方式與用于處理小液體樣本的分析系統(tǒng)的方式(例如，在該系統(tǒng)中樣品通過液體處理線內(nèi)的氣障而被分離)相同。在該情況下，提供一種用于鑒定進(jìn)行了樣本收取的卵的方法是優(yōu)選的，例如，通過提供硬件、軟件或者硬件和軟件的綜合以用于對(duì)這些卵和各個(gè)卵的相對(duì)位置進(jìn)行計(jì)數(shù)。并且同取樣的時(shí)間相關(guān)聯(lián)并且將這樣的信息進(jìn)行短期或者長(zhǎng)期存儲(chǔ)直至該信息在所需的方式下被使用(例如，用于排除某種特定的卵、用于間別鳥的性別并且進(jìn)行性別分選、或者用于提供關(guān)于被注射的卵的質(zhì)量和其它一些信息的龐大數(shù)據(jù)庫(kù))。
應(yīng)意識(shí)到，本發(fā)明可提供一種途徑以對(duì)被注射的卵的大量信息進(jìn)行記錄和存儲(chǔ)。例如，可獲得種群信息以用于質(zhì)量控制程序、或者用于對(duì)卵的先期處理進(jìn)行修正、或者修正選擇孵化程序。在這些情況下，被注射卵的表示可以成為該卵同特定批次卵的聯(lián)系，而不僅僅是其作為該批次卵中的特定個(gè)體的標(biāo)識(shí)。
因此，本發(fā)明提供了對(duì)含有早期胚(例如，胚盤)的鳥卵進(jìn)行操作的方法，以及對(duì)胚本身進(jìn)行操作的方法。本發(fā)明可被用于，例如，從卵中收集信息、從卵中收取樣本，和/或向卵遞送物質(zhì)。
已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，可參考具體的實(shí)施例例示本發(fā)明，這些實(shí)施例僅僅用于例示性的目的，非意味著對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1下文為一種示例性的方法，該方法用于將液體或者細(xì)胞通過卵的鈍端對(duì)受體雞胚盤進(jìn)行卵內(nèi)注射。
1.通過以100％乙醇進(jìn)行擦拭對(duì)E0日的卵的整個(gè)卵的表面進(jìn)行表面消毒。
2.對(duì)光檢查該卵以對(duì)氣室進(jìn)行定位。使用鉛筆在殼的表面標(biāo)記該氣室的位置。
3.通過將殼dremeling away而在卵的鈍端(在氣室的中心)制出小開窗(小開口)。小心保持外殼膜的完好。
以下所有的步驟在優(yōu)選的情況下在層流凈化罩(laminar hood)或者干凈的房間內(nèi)進(jìn)行實(shí)施4.在外殼膜通過殼上的開窗暴露的情況下，再度使用70％的乙醇對(duì)卵的鈍端以及周圍區(qū)域進(jìn)行消毒。
5.使用鑷子和解剖刀(#11刀刃；Personna Medical)小心地除去外殼膜，同時(shí)小心不要在膜上留下鋸齒狀邊緣。
6.胚盤可見于氣室膜(即內(nèi)殼膜)下，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
7.使用玻璃微移液吸頭(或針頭)刺穿氣室膜并且注射進(jìn)入胚盤的胚下腔液。約3-5微升液體(含有100g/ml的青霉素-鏈霉素)被注射。使用Sutter P-30推進(jìn)器推進(jìn)微移液吸頭；溫度-800，Pull-950。
8.注射之后，將經(jīng)過剪切以適應(yīng)開窗的防水膠帶(Johnson &Johnson，1英寸寬)粘貼其上并且壓入位置。
9.硅樹脂(GE Silicone II，干凈)封膠隨后被灑在膠帶的整個(gè)表面上，其重點(diǎn)在于封緘膠帶的邊緣。
10.在將這些卵轉(zhuǎn)入溫育器中之前，將硅樹脂干燥約30-45分鐘。
實(shí)施例2進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估實(shí)施例1的手工注射對(duì)于將液體或者細(xì)胞卵內(nèi)注射入受體雞胚盤(約為X期)的胚下腔的應(yīng)用。供體細(xì)胞也來自于X期的雞胚盤。在一些情況下，受體胚在注射前受損。在早期的實(shí)驗(yàn)中，一小滴(幾微升)的白蛋白溶液被滴于胚盤上方的內(nèi)殼膜上并且通過白蛋白液滴而刺穿該膜而進(jìn)行了注射。在較晚的實(shí)驗(yàn)中，該步驟被省去。這些卵在處理之前不經(jīng)保存或者保存4-8天。
對(duì)參照卵和經(jīng)操作的卵的孵化率進(jìn)行了測(cè)定。成功的嵌合體的產(chǎn)生率也經(jīng)受了評(píng)估。結(jié)果示于表1之中。
表1
a 縮寫R×R＝Rhode Island Red Cross；BPR＝Barred Plymouthb HyVac和Bovans是Leghorn雞品系實(shí)施例3對(duì)胚進(jìn)行物理?yè)p傷的特定方法，例如紫外(UV)照射或者激光切除，可通過卵殼和殼膜上的開窗進(jìn)行實(shí)施。我們已經(jīng)開發(fā)了一種方法用于在卵的側(cè)面產(chǎn)生開窗、將其封緘、并且將卵在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行溫育(99F，滾動(dòng))，這樣使高百分比(＞90％)的胚在兩天內(nèi)正常發(fā)育(圖7)。該方法可被用于估測(cè)在胚發(fā)育的兩天之中的損傷效率和嵌合體的產(chǎn)生。進(jìn)一步，該方法可被用于對(duì)卵的側(cè)面的注射。
簡(jiǎn)而言之，該卵受到如下的處理1.在60F、75％得濕度下貯存這些卵0-7天，長(zhǎng)軸平置(on their longaxis)，從而將胚盤定位于卵側(cè)面的中心位置。
2.使用sharpie pen對(duì)朝上的位置進(jìn)行標(biāo)記。
3.貯存之后，在卵的側(cè)面的筆標(biāo)記位置上鉆出7-mm的洞。
4.除去殼。通常內(nèi)殼膜和外殼膜保持完好，并且將這些膜也除去。
5.對(duì)胚盤進(jìn)行鑒定，胚盤在卵殼上被制出的開口附近或者直接位于其下。僅僅在胚盤直接位于開口之下的情況下卵才被用于這一特定的實(shí)驗(yàn)，這樣可允許多種損傷處理的應(yīng)用，例如UV光照。
6.將洞保持開放5-10分鐘。
7.使用GE Silicon II和J&J防水膠帶將洞封緘。
8.將Silicon干燥約30分鐘。
9.將這些卵置于溫育器中，鈍端朝上，洞在其側(cè)，并且在99F下溫育兩天，每3小時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)一次。
10.從卵中收集胚以用于照相。
代表性的參照和受處理胚的照片示于圖7之中。
實(shí)施例4一種對(duì)胚盤細(xì)胞在受體胚中的整合進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法被開發(fā)出來。該方法適用于對(duì)新鮮分離自任何鳥類或者品系的胚盤細(xì)胞進(jìn)行追蹤，并且應(yīng)可容易地應(yīng)用于對(duì)其它細(xì)胞的整合進(jìn)行監(jiān)測(cè)，例如胚性干細(xì)胞。概括該方法，新鮮分離的胚盤細(xì)胞在注射之前被暴露于羧基螢光素二乙酸琥珀酰酯(CFDA SE)。CFDA SE為一種氨基反應(yīng)化合物，該化合物在同細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)之后熒光升高。一旦該化合物摻入胚盤細(xì)胞，這些細(xì)胞可以通過熒光顯微鏡在受體胚中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
在下文所示的實(shí)驗(yàn)中，以CFDA SE對(duì)新鮮分離的胚盤細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記并將其微注射入X期胚盤，微注射通過穿過在卵鈍端的內(nèi)殼膜的注射而進(jìn)行(如
圖1所描述)。當(dāng)在溫育兩天之后通過顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，在多種組織中發(fā)現(xiàn)了熒光標(biāo)記的供體細(xì)胞。圖8顯示了整合入溫育兩天的受體胚的體節(jié)中的被標(biāo)記的供體細(xì)胞，從而產(chǎn)生了一個(gè)嵌合體胚。對(duì)于使用遺傳修飾細(xì)胞以對(duì)供體細(xì)胞在早期胚中的整合進(jìn)行跟蹤，熒光染料標(biāo)記可為一種吸引人的備選或者互補(bǔ)手段。
實(shí)施例5為對(duì)雞嵌合體的產(chǎn)生進(jìn)行優(yōu)化，可對(duì)受體胚進(jìn)行‘損傷’或者預(yù)處理以使這些胚更易接受供體細(xì)胞。被最廣泛接受的損傷方法涉及到將供體卵暴露于600rad的γ射線照射之下。為對(duì)供體胚上的各種處理效果進(jìn)行估測(cè)，我們已經(jīng)開發(fā)了一些工藝以對(duì)受體胚盤中的細(xì)胞死亡進(jìn)行原位測(cè)定。
為對(duì)死亡細(xì)胞進(jìn)行原位鑒定，我們已經(jīng)對(duì)使用碘化丙啶(PI)進(jìn)行的染色標(biāo)記進(jìn)行了估定，該試劑為一種熒光DNA染料，該染料主要對(duì)于死亡細(xì)胞是可透過的。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)脆弱的胚盤進(jìn)行的最小量的操作和洗滌，PI有效地標(biāo)記了死亡細(xì)胞。這些細(xì)胞可被鑒定并且通過熒光顯微鏡進(jìn)行照像，并且通過數(shù)字成像分析測(cè)定細(xì)胞死亡的相對(duì)量(見圖9)。死亡細(xì)胞在胚盤中的精確位置也可通過數(shù)字成像分析進(jìn)行確定(見圖9)。據(jù)我們所知，這是第一次在活體鳥胚中對(duì)細(xì)胞死亡進(jìn)行原位測(cè)量。
在該實(shí)驗(yàn)中，PI標(biāo)記工藝被用于未受處理的、經(jīng)物理?yè)p傷的和經(jīng)熱處理的胚。未經(jīng)處理的胚盤(圖9，第一欄)表現(xiàn)出低水平的背景細(xì)胞死亡。在本實(shí)驗(yàn)中造成的物理?yè)p傷(第二和第三欄)是胚盤的分離過程所導(dǎo)致的非故意的損傷。注意細(xì)胞死亡精確地定位于胚盤內(nèi)的撕傷周圍區(qū)域(圖9，組j和k)。熱處理(在水浴中55C保溫15分鐘)基于先前的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明這樣的處理完全阻止了孵化。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所示(圖9，第四欄)，孵化上的減低有可能是緣于胚盤中極高水平的細(xì)胞死亡。熒光像素計(jì)數(shù)(圖9，底排)可被用于定量測(cè)量以及在各種處理之間比較細(xì)胞死亡的數(shù)量。
凋亡細(xì)胞(與死亡細(xì)胞對(duì)比)的檢測(cè)也可通過使用熒光染料Hoechst 333342進(jìn)行測(cè)定，染料對(duì)活體和凋亡細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分染色。凋亡和/或死亡細(xì)胞的測(cè)量可被用于測(cè)定受體胚受損的程度。
實(shí)施例6以下研究被用于測(cè)定胚盤在卵中的位置和直徑，卵在商業(yè)孵化所貯存條件下進(jìn)行貯存。在一周的基礎(chǔ)上對(duì)來自單一禽群的白來亨雞卵(Bovans)進(jìn)行測(cè)量；該禽群被研究至其產(chǎn)卵循環(huán)的結(jié)束。收到卵后，這些卵在60F和75％的相對(duì)濕度下保存于平板上6或7天，保存方式類似于這些卵在商業(yè)孵卵場(chǎng)所中的貯存。每周測(cè)量平板上的59個(gè)卵。對(duì)于在平板上保存了6或7天的卵，胚盤的平均離中心距離為5.24，有3.05％的胚離中心太遠(yuǎn)難以看到。
另外對(duì)一種Hy-Ling W-36白來亨雞禽群進(jìn)行了研究。這些卵在產(chǎn)后最多48小時(shí)被收取。這些卵在60F和75％的相對(duì)濕度下保存6或7天。對(duì)于在平板上保存了6或7天的卵，胚盤的平均離中心距離為5.86mm，有3.96％的胚離中心太遠(yuǎn)難以看到。
在對(duì)胚盤位置進(jìn)行測(cè)量時(shí)還對(duì)這些胚盤的直徑進(jìn)行了測(cè)量，包括明區(qū)的直徑在內(nèi)。在商業(yè)孵化所貯存條件下的結(jié)果見下表2。這些卵被保存了7天，這些胚被典型地認(rèn)作為X期胚。
表2
實(shí)施例7為測(cè)定胚是否可通過調(diào)整貯存條件而被動(dòng)地進(jìn)行定位而進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)。這些卵或者根據(jù)商業(yè)條件在平板上貯存(參照)，或者在一種被稱為“固定器(fixture)”，該固定器使卵保持于固定的豎直位置(鈍端向上)，其中基本上防止了側(cè)向移動(dòng)和繞垂直軸的轉(zhuǎn)動(dòng)。
在進(jìn)行中的使用Bovan禽群的研究中(這些母雞處于其產(chǎn)卵的第69周；它們產(chǎn)卵高達(dá)約70周，無換羽)，總共2,766枚卵于60F和75％RH下在平板或者固定器中貯存7天(30枚卵貯存于平板中，30枚卵貯存于固定器中，在31周中每周均進(jìn)行)，在一臺(tái)Acu-Gage光學(xué)CoordinateMeasuring Machine(CMM)中對(duì)這些卵進(jìn)行測(cè)量，該裝置具有一個(gè)藍(lán)色光纖光源以增強(qiáng)胚盤的對(duì)比度?；谒占臄?shù)據(jù)，在平板上保存7天的卵的胚盤平均離心距離為5.24mm。對(duì)于在固定裝置中保存7天的卵，該離心距離改善至平均4.58mm，該裝置固定卵以使卵的長(zhǎng)軸豎直。在保存于平板上的卵中，3.05％的胚離中心太遠(yuǎn)難以看到，而對(duì)在保存于固定器的卵中，僅僅2.53％離心太遠(yuǎn)。來自于Elizabethtown，Pennsylvania的Hy-Line W-36卵也接受了測(cè)量。總計(jì)1,649枚卵被測(cè)量，其中這些卵在60F和75％的相對(duì)濕度下保存6或7天。對(duì)于在平板上保存了6或7天的卵，胚盤的平均離中心距離為5.86mm，有3.96％的胚離中心太遠(yuǎn)難以看到。對(duì)在固定器中進(jìn)行保存以使其長(zhǎng)軸豎直的卵，其離心距離略為好一些，平均為5.31mm，并且4.81％的胚離中心太遠(yuǎn)難以看到。
對(duì)這些數(shù)據(jù)(Bovans，23-69周；Hy-Line，26-42周)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析以確定在固定器中固定卵是否可以影響胚盤的位置。來自不育或者受損的卵的數(shù)據(jù)被排除在外。如果胚盤離中心太遠(yuǎn)以致難于測(cè)量則使用13.716作為該值。使用協(xié)方差分析，該分析將位置作為因變量并且固定保存裝置(在固定器或者卵平板中)，該分析針對(duì)禽種分別進(jìn)行。同在平板上相比較，在固定器中進(jìn)行貯存對(duì)胚盤位置的影響見下表3，該影響是全部禽群年齡的匯總。
表3
在固定器中進(jìn)行貯存的效果對(duì)于Bovans(P≤0.001)以及Hy-Line(P≤0.004)是顯著的；貯存于固定器中的卵使得胚盤顯著地距中心更為接近。
對(duì)貯存于固定器中的卵的數(shù)據(jù)組進(jìn)行了分析以測(cè)定是否胚盤離心位置同禽群年齡和/或卵重量相關(guān)聯(lián)。進(jìn)行了協(xié)方差分析，該分析以位置為因變量并且固定禽群，以卵重量作為共變量(covariate)。以禽種劃分該分析。Bovans卵顯示出很明顯(P≤0.001)的禽群年齡對(duì)貯存于固定器中的卵的影響，而Hy-Line并未顯示出胚盤位置同禽群年齡之間的相關(guān)性(P≥0.05)。
不出所料，卵重量隨著禽群年齡有所提高；對(duì)于卵重量同胚盤離卵中心的距離觀察到了相反的關(guān)系。Bovan數(shù)據(jù)組顯示卵重量為顯著的共變量(P≤0.05)；而卵重量對(duì)于Hy-Line卵并非顯著的共變量。卵重量在Hy-Line分析中不是顯著的共變量的原因可能是禽群年齡并未超出42周，因此卵重量可能還未成為影響因素。盡管Bovan數(shù)據(jù)組的回歸分析顯示出卵重量同胚盤位置的顯著關(guān)聯(lián)，據(jù)顯示低于1％的胚盤位置變化可被解釋由卵重量造成(R2＝0.007)。
上述實(shí)驗(yàn)的參照組由貯存于平板紙上的卵組成。這些平板為一些存放卵的紙板；這些卵在置于這些平板紙上時(shí)可繞其垂直軸相對(duì)自由地移動(dòng)。孵化場(chǎng)所使用塑料平板。在這些平板上卵繞其垂直軸僅僅具有受限水平的移動(dòng)。為測(cè)定在塑料平板及紙板上貯存卵和在固定器中貯存卵的影響，在60F，75％RH下，在塑料平板或者紙平板上以及固定器中將Bovan卵貯存6天。如下表4所示，在貯存于塑料平板的卵中，胚盤離心位置有所降低，但在貯存于固定器的卵中，胚盤離心距離有很大改善。
表4
實(shí)施例8進(jìn)行了一些研究以測(cè)定不同貯存時(shí)間對(duì)胚盤位置的影響。先前的一項(xiàng)研究表明，貯存7天(60F以及75％相對(duì)濕度)的卵在胚盤的位置上顯示出相對(duì)于0天的卵的明顯改善(從0天的距中心9.71mm改善至7天的5.61mm，在0.0001水平上具有顯著意義)，并且將卵貯存10天沒有進(jìn)一步明顯改善胚盤位置。
白蛋白濃度被認(rèn)為是影響胚盤位置的變量之一；較濃的白蛋白限制了卵黃的轉(zhuǎn)動(dòng)。白蛋白以Haugh單位進(jìn)行測(cè)量。在一個(gè)分立實(shí)驗(yàn)中，對(duì)不同時(shí)間長(zhǎng)度進(jìn)行了白蛋白濃度的測(cè)量。對(duì)來自55周齡的禽群的Bovan卵進(jìn)行了稱重并且在平板上貯存0、3、6、10、13或17天后測(cè)定Haugh單位。隨著貯存時(shí)間的增加，白蛋白重量或者Haugh單位表現(xiàn)出明顯的降低。
進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)以測(cè)定貯存時(shí)間以及白蛋白濃度對(duì)于胚盤離中心位置的影響。對(duì)來自于37周齡禽群的Hyline卵進(jìn)行了稱重，并且在60F以及75％相對(duì)濕度下在固定器中貯存(鈍端朝上)2、6、9、12或15天。保存6天的組被稱為參照組。進(jìn)行了以胚盤位置為因變量，貯存時(shí)間(天數(shù))固定的協(xié)方差分析。另一獨(dú)立分析中，Haugh單位被作為因變量，貯存時(shí)間作為固定變量。隨后通過SNK分析對(duì)各個(gè)貯存時(shí)間的平均胚盤位置或平均Haugh單位進(jìn)行比較。如下文表5所示，胚盤距中心位置隨著貯存時(shí)間的增加而顯著地減少，12天和15天的平均位置明顯低于2天，6天和9天居中(6天的平均位置實(shí)際上低于9天，12天低于15天)。進(jìn)一步，Haugh單位也隨著貯存時(shí)間而降低，表現(xiàn)出比胚盤位置更為明顯的影響。
表5
總體上，使白蛋白稀薄表現(xiàn)得允許了卵黃更為自由的轉(zhuǎn)動(dòng)，并且由此而使胚盤的定位更為接近固定于鈍端朝上的豎直位置的卵的“上止點(diǎn)(top dead center)”。
實(shí)施例9還進(jìn)行了一些研究以測(cè)定在貯存期間調(diào)節(jié)卵的朝向?qū)ε弑P的影響。對(duì)側(cè)向擺放7天的卵進(jìn)行的初步實(shí)驗(yàn)并未改善胚盤定位。但是，這些實(shí)驗(yàn)的實(shí)施通過將這些卵置于平板表面并且允許它們?cè)趥?cè)向自由地朝向而進(jìn)行。
在本研究中，這些卵在不同的位置上根據(jù)實(shí)施例7中的描述貯存于固定器中以測(cè)定對(duì)胚盤定位的影響，該固定器限制了側(cè)向移動(dòng)和滾動(dòng)。該固定器將這些卵保持于固定的水平或者豎直位置。對(duì)這些卵進(jìn)行貯存的不同的朝向以及進(jìn)行胚盤位置測(cè)量時(shí)這些卵的朝向如下1.側(cè)置(Bovan和Hy-Line W-36)，并且側(cè)置測(cè)量。
2.倒置(即，鈍端朝下)3天(Hy-Line W-36)，隨后鈍端朝上3-4天，并且鈍端朝上測(cè)量。
3.倒置(即，鈍端朝下)6-7天并且鈍端朝上測(cè)量(Bovan)。
4.倒置(即，鈍端朝下)6-7天并且倒置測(cè)量(Hy-Line W-36)。
結(jié)果概括于表6之中。
表6
卵的側(cè)置貯存對(duì)于各個(gè)類型的卵并未產(chǎn)生顯著改善的結(jié)果；盡管胚盤距離有所降低，離中心太遠(yuǎn)的胚盤數(shù)量也有增加。將卵倒置貯存3天獲得了顯著意義，但實(shí)際上增加了胚盤距卵中心的距離(p≤.057)。對(duì)倒置貯存的卵進(jìn)行的合適一端朝上或者倒置測(cè)量均產(chǎn)生了顯著性差異，但較大提高了胚盤到卵中心的距離，對(duì)Bovan和Hy-Line W-36均是如此。
實(shí)施例10貯存溫度和相對(duì)濕度對(duì)胚盤位置的影響也受到了研究。溫度據(jù)信是影響白蛋白性質(zhì)(即，濃度)的重要因素，白蛋白性質(zhì)隨之可影響卵黃的移動(dòng)或者移動(dòng)性，并因此而影響胚盤的位置。初步實(shí)驗(yàn)表明，在較高溫度下對(duì)卵進(jìn)行貯存可能輔助將胚盤朝向卵黃表面中心進(jìn)行“定向”。
來自47周齡禽群的Hyline卵在60(商業(yè)孵化場(chǎng)所條件)或者70華氏度(15.5或者21.1攝氏度)進(jìn)行7天的貯存。胚盤距70度下貯存的卵中心的位置低于在60度下保存的卵(在p＝.063 approachedsignificance)。
在后續(xù)的研究中，探討了卵貯存期間的溫度和相對(duì)濕度條件的多種排列組合對(duì)胚盤位置的影響。對(duì)根據(jù)實(shí)施例7的描述貯存于固定器中6-7天的卵使用了溫度和相對(duì)濕度的不同組合，以60華氏度和70％相對(duì)濕度作為參照處理。對(duì)一些不同的處理?xiàng)l件進(jìn)行了評(píng)估1.正常溫度(60F)，而相對(duì)濕度(75％)被降至50％(Hy-Line W-36卵)。
2.最初5天為正常溫度(60F)和相對(duì)濕度(75％)，隨后在貯存的最后2天提高溫度至80度(75％RH)(Bovan)。
3.正常溫度(60F)，但相對(duì)濕度被設(shè)為90％(Hy-Line W-36)。
4.溫度被設(shè)為70F，相對(duì)濕度被設(shè)為50％(Hy-Line W-36)。
5.溫度被設(shè)為70F，相對(duì)濕度正常(Hy-Line W-36)。
6.溫度被設(shè)為70F，相對(duì)濕度被設(shè)為90％(Bovan和Hy-Line W-36)。
7.溫度被設(shè)為80F，相對(duì)濕度正常(Hy-Line W-36)。
結(jié)果概括于下文表7之中；
表7
簡(jiǎn)而言之，70F的溫度在所有的情況下表現(xiàn)出對(duì)胚盤定位的改善，并且對(duì)于除Hy-Line W-36卵在90％的相對(duì)濕度之外的所有情況，在p≤0.05之下具有顯著性。僅僅相對(duì)濕度的變化對(duì)于胚盤的位置鮮有影響(注意在所有的情況下，若不考慮顯著性，參照組具有較高的胚盤距中心距離)。Haugh單位的結(jié)果類似，同參照條件相比，該單位對(duì)于所有的處理組均有所降低(注意并未就正常溫度和90％相對(duì)濕度的研究進(jìn)行Haugh單位的收集)。Haugh數(shù)據(jù)顯示出比胚盤位置數(shù)據(jù)更高的顯著性意義，而僅僅正常溫度和50％相對(duì)濕度組并未顯示出顯著性效果。
實(shí)施例11對(duì)外部環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)是影響胚盤位置的一種方法。卵對(duì)氨氣的暴露已被證明使白蛋白變稀。Benton和Brake(2000)已經(jīng)證明，同參照相比(0mg/kg)，卵對(duì)高水平的NH3(2747和6052mg/kg)進(jìn)行一小時(shí)的暴露表現(xiàn)出白蛋白高度(height)的明顯降低，伴之以白蛋白pH的提高。由于白蛋白高度的降低同白蛋白流動(dòng)性的增加正相關(guān)，因此對(duì)NH3處理是否將胚盤定位到接近于卵中心的位置進(jìn)行估測(cè)。
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，來自38周齡的Hyline禽只的卵(卵類型W36；禽群標(biāo)識(shí)PL2506)被收取并且在60°F和75％RH下維持1天。18枚卵(三批共54枚卵)依其水平軸被置于玻璃干燥器(直徑250mm，具蓋)(Fisher Scientific)中的一個(gè)瓷平板之上。將一升NH4OH溶液(14.8M)(Sigma)或者雙蒸水(參照)倒入干燥器中。14.8M的NH4OH溶液據(jù)估計(jì)可釋放出6052mg/kg的NH3(Benton和Brake，2000)。將這些卵在各自水平的NH3中暴露1小時(shí)。隨后將卵取出，并且對(duì)胚盤位置、白蛋白高度和pH進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果見表8
表8
這些結(jié)果顯示，NH3處理導(dǎo)致了白蛋白pH同其各自的參照相比的明顯提高。在NH3處理組中白蛋白高度較低(即，較低的Haugh單位值)，這顯示了白蛋白的稀薄。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)氨氣進(jìn)行暴露之后對(duì)這些卵進(jìn)行了貯存。對(duì)這些卵(68周齡的Bovans)使用兩種濃度的NH3(2747和142mg/kg的NH3)。參照被暴露于0mg/kg的NH3?？傆?jì)50枚卵被用于NH3處理，48枚卵被用于參照。對(duì)一升NH4OH溶液(14.8M)(Sigma)進(jìn)行了一系列稀釋以產(chǎn)生2747和142mg/kg的NH3。對(duì)于參照，雙蒸水(1L)被倒入了干燥器。將這些卵在各自水平的NH3中暴露1小時(shí)。隨后將卵取出，置于固定器中且無轉(zhuǎn)動(dòng)或者側(cè)向移動(dòng)，并且在60F和75％RH下貯存6天。6天的貯存之后進(jìn)行測(cè)量以測(cè)定胚盤位置、白蛋白高度和pH。結(jié)果示于下文表9
表9
同參照相比，在以2747mg/kg的NH3進(jìn)行處理的卵中的胚盤距中心位置同卵鈍端上止點(diǎn)更為接近。有趣的是，這些卵的pH同參照相近。NH3處理和參照卵在Haugh單位上無差異。同參照相比，較低濃度的NH3(142mg/kg)在受測(cè)參數(shù)上無變化。
對(duì)以2747mg/kg的NH3處理組的胚所觀察到的變化之一是，這些卵具有“經(jīng)過烹制的”外觀并且看起來不似活體。因此，以高水平的氨氣進(jìn)行的處理可用作為使胚受損的方法。
實(shí)施例12對(duì)多種方法進(jìn)行了評(píng)估以測(cè)定是否胚盤可被主動(dòng)地“定向于”卵中心。
離心重力據(jù)信在胚定位于卵的最上部位置中起著重要的作用。離心是產(chǎn)生人工重力或者增加重力的質(zhì)量力的一種途徑。為測(cè)定離心導(dǎo)致的較大的力是否可改善胚的位置進(jìn)行了研究。
對(duì)來自于27周齡禽群的Hyline卵進(jìn)行了稱重，如實(shí)施例7所述將其置于固定器中，并且貯存共計(jì)7天。在貯存的第5天，將這些卵置于Sorval RC 5C離心筒中并且在50rpm下旋轉(zhuǎn)3分鐘，該過程中這些卵保持于固定器中，其長(zhǎng)軸同整個(gè)旋轉(zhuǎn)中的人工重力平行。隨后將這些卵再貯存2天，并且隨后對(duì)胚盤據(jù)亂中心的位置進(jìn)行測(cè)量。未注意到胚盤位置由于離心有明顯變化。
在進(jìn)一步的研究中，對(duì)卵(Hy-Line)進(jìn)行了稱重，在固定器中貯存5天，在300rpm(Beckman Allegra 6KR centrifuge)下旋轉(zhuǎn)30分鐘并且隨后在進(jìn)行胚盤位置測(cè)量之前貯存1天。使用以位置作為因變量，離心固定的協(xié)方差分析。如下文表10中所示，在胚盤位置上無顯著性差異，并且事實(shí)上經(jīng)離心的卵所表現(xiàn)出的胚盤位置距中心略遠(yuǎn)。
表10
轉(zhuǎn)動(dòng)在卵貯存期間進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)胚盤朝向卵頂部中心的定向的影響受到了評(píng)估。在60F，75％RH下將卵置于Hovabator轉(zhuǎn)動(dòng)器之中6-7天。該轉(zhuǎn)動(dòng)器使卵進(jìn)行與豎向呈正負(fù)45度的運(yùn)動(dòng)，一個(gè)從0至+45度到0至-45度并回到0度的完整循環(huán)耗時(shí)4小時(shí)。未處理卵在平板(紙板)上貯存用于比較(以同轉(zhuǎn)動(dòng)器中的卵相比)。結(jié)果示于下文表11
表11
協(xié)方差分析表明，對(duì)于Bovan或者Hy-Line卵，處理組之間的結(jié)果均無顯著性，盡管轉(zhuǎn)動(dòng)卵的平均離中心距離較低。
旋轉(zhuǎn)在貯存期間對(duì)卵進(jìn)行旋轉(zhuǎn)對(duì)于胚盤朝向卵頂部中心的定向的影響受到了評(píng)估。根據(jù)實(shí)施例7將卵貯存于固定器中并且同未經(jīng)旋轉(zhuǎn)但也在固定器中進(jìn)行貯存的卵進(jìn)行比較。對(duì)本試驗(yàn)，將這些卵貯存5天，在300rpm下旋轉(zhuǎn)30分鐘，并且隨后在進(jìn)行胚盤位置測(cè)量之前貯存一天。旋轉(zhuǎn)組所具有的胚盤距中心位置略有提高，盡管距中心太遠(yuǎn)以致難于觀察的的胚盤百分比略有改善。結(jié)果見下文表12
表12
協(xié)方差分析表明，處理組內(nèi)的結(jié)果無顯著性差異，盡管旋轉(zhuǎn)卵的平均離中心距離略低。
振蕩探索了在貯存期間對(duì)卵進(jìn)行振蕩對(duì)于胚盤朝向卵上止點(diǎn)的定向。根據(jù)實(shí)施例6將卵貯存于固定器中，并且同未經(jīng)振蕩但也在固定器中進(jìn)行貯存的卵進(jìn)行比較。
對(duì)于上述的不同處理，在進(jìn)行胚盤位置測(cè)量的同時(shí)還對(duì)胚盤的直徑進(jìn)行了測(cè)量。結(jié)果表明對(duì)于任何處理胚盤大小均無變化。
盡管通過以明確和理解為目的進(jìn)行說明和例示對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了較詳細(xì)的描述，很明顯特定的變化和改動(dòng)可在權(quán)利要求及其等效物的范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括的步驟有使含有胚盤的鳥卵朝向一個(gè)預(yù)定位置；向卵殼引入一個(gè)小開口；將一種裝置通過卵殼上的小開口伸入；以該裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入裝置之前基本完好；以及從卵中收回該裝置。
2.權(quán)利要求1的方法，其中裝置為一種遞送裝置，并且所述方法在所述刺穿步驟后進(jìn)一步包括通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并且將該物質(zhì)沉積在卵內(nèi)的步驟。
3.權(quán)利要求1的方法，其中裝置為一種取樣裝置，并且所述方法在所述刺穿步驟后進(jìn)一步包括從卵中取出樣本的步驟。
4.權(quán)利要求1的方法，其中裝置為一種檢測(cè)器裝置，并且所述方法在所述的刺穿步驟后進(jìn)一步包括以檢測(cè)器裝置檢測(cè)來自卵內(nèi)部的信息的步驟。
5.權(quán)利要求1的方法，其中裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個(gè)預(yù)定位置。
6.權(quán)利要求1的方法，其中裝置通過卵殼上的小開口伸入至胚盤位置或其緊鄰位置。
7.權(quán)利要求6的方法，其中裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個(gè)位置，該位置選自(a)胚下腔，(b)暗區(qū)與卵黃膜之間，(c)明區(qū)與卵黃膜之間，(d)暗區(qū)與明區(qū)之間(e)明區(qū)內(nèi)(f)暗區(qū)內(nèi)，以及(g)(a)到(f)的任何組合。
8.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括使胚盤受損的步驟。
9.權(quán)利要求1的方法，其中卵朝向大體上水平的位置，并且卵殼中的小開口被引入于卵的朝上一面。
10.權(quán)利要求1的方法，其中卵在處理之前被貯存。
11.權(quán)利要求1的方法，該方法在向卵殼中引入小開口的步驟之前進(jìn)一步包括對(duì)卵殼使用封閉劑的步驟，其中小開口被引入于卵殼上使用了封閉劑的位置。
12.權(quán)利要求1的方法，其中胚盤為XIII期(EG & K)或者更早期的胚盤。
13.權(quán)利要求12的方法，其中胚盤為VIII期到XIII期(EG & K)的胚盤。
14.權(quán)利要求12的方法，其中胚盤為X期(EG & K)的胚盤。
15.權(quán)利要求1的方法，其中卵選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、長(zhǎng)尾鸚鵡、鸚鵡、大冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋的卵。
16.權(quán)利要求15的方法，其中卵為雞卵。
17.權(quán)利要求15的方法，其中卵為火雞卵。
18.權(quán)利要求1的方法，其中胚盤含有異源核酸。
19.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括將胚盤定位于所需位置的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的定位步驟所包括的方法選自(a)振動(dòng)卵，(b)加熱卵，(c)將卵保持于固定位置，(d)對(duì)卵進(jìn)行化學(xué)處理，以及(e)(a)到(d)的任何組合。
21.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定胚盤或其區(qū)室的位置的步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的測(cè)定步驟包括對(duì)胚盤進(jìn)行可視化。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述的測(cè)定步驟包括使用一種檢測(cè)器裝置測(cè)定胚盤或其區(qū)室的位置。
24.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括對(duì)卵殼上的小開口進(jìn)行封緘的步驟。
25.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括在外殼膜上引入一個(gè)小開口的步驟，并且其中所述的伸入步驟包括將遞送裝置通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入。
26.權(quán)利要求1的方法，該方法進(jìn)一步包括將卵進(jìn)行溫育直至孵化的步驟。
27.權(quán)利要求2的方法，其中裝置為一種多注射遞送裝置。
28.權(quán)利要求2的方法，其中在卵中進(jìn)行沉積的物質(zhì)包括多肽。
29.權(quán)利要求28的方法，其中多肽選自抗體、激素、生長(zhǎng)因子、酶和細(xì)胞因子。
30.權(quán)利要求2的方法，其中在卵中進(jìn)行沉積的物質(zhì)包括核苷酸序列。
31.權(quán)利要求30的方法，其中核苷酸序列是使用一種方法引入胚盤的，該方法選自病毒載體、脂質(zhì)體和電穿孔。
32.權(quán)利要求30的方法，其中核苷酸序列編碼一種多肽或者一種反義核酸。
33.權(quán)利要求2的方法，其中在卵中進(jìn)行沉積的物質(zhì)包括抗生素。
34.權(quán)利要求2的方法，其中在卵中進(jìn)行沉積的物質(zhì)包括供體細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中供體細(xì)胞為鳥類細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的方法，其中供體細(xì)胞選自雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉、長(zhǎng)尾鸚鵡、鸚鵡、大冠鸚鵡、澳洲鸚鵡、鴕鳥、鴯鹋的細(xì)胞。
37.權(quán)利要求35的方法，其中供體細(xì)胞所來自的鳥類不同于胚盤的物種。
38.權(quán)利要求34的方法，其中供體細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
39.權(quán)利要求34的方法，其中供體細(xì)胞選自胚盤細(xì)胞、干細(xì)胞、培養(yǎng)的干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、胚生殖細(xì)胞以及上述細(xì)胞的任何組合。
40.權(quán)利要求34的方法，其中胚盤為雞胚盤并且供體細(xì)胞為雞細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的方法，其中胚盤和供體細(xì)胞來自雞的不同品種或者品系。
42.權(quán)利要求3的方法，其中從卵中取出的樣本含有胚下腔液。
43.權(quán)利要求3的方法，其中從卵中取出的樣本含有胚盤細(xì)胞。
44.權(quán)利要求4的方法，其中檢測(cè)器裝置為電子傳感器。
45.權(quán)利要求4的方法，其中檢測(cè)器裝置為光學(xué)傳感器。
46.權(quán)利要求4的方法，其中檢測(cè)器裝置為化學(xué)傳感器。
47.權(quán)利要求4的方法，其中檢測(cè)器裝置為溫度傳感器。
48.權(quán)利要求4的方法，其中檢測(cè)器裝置為聲傳感器。
49.權(quán)利要求4的方法，其中檢測(cè)器裝置為壓力傳感器。
50.一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括使鳥卵的鈍端朝向一個(gè)預(yù)定的位置，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在卵的鈍端氣室之上引入一個(gè)小開口；在卵殼上的小開口下的外殼膜中引入一個(gè)小開口；通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入一個(gè)遞送裝置；以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在遞送裝置通過其插入之前基本完好；通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并將物質(zhì)沉積在胚盤位置或其緊鄰位置；以及從卵中收回遞送裝置。
51.權(quán)利要求50的方法，其中定向步驟包括將卵的鈍端置于大體朝上的位置。
52.權(quán)利要求50的方法，其中在卵殼的鈍端的小開口被引入于一個(gè)預(yù)定的位置。
53.權(quán)利要求52的方法，其中預(yù)定位置基本上位于氣室的中央。
54.權(quán)利要求50的方法，其中在卵殼和外殼膜中引入小開口的步驟基本上同步進(jìn)行。
55.權(quán)利要求50的方法，該方法進(jìn)一步包括在所述的釋放步驟之前測(cè)定胚盤的位置的步驟。
56.權(quán)利要求50的方法，其中遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個(gè)位置，該位置選自(a)胚下腔，(b)暗區(qū)與卵黃膜之間，(c)明區(qū)與卵黃膜之間，(d)暗區(qū)與明區(qū)之間(e)明區(qū)內(nèi)(f)暗區(qū)內(nèi)，以及(g)(a)到(f)的任何組合。
57.一種對(duì)多個(gè)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法所包括的步驟有使多個(gè)鳥卵朝向預(yù)定位置，其中各卵均含有胚盤；將一個(gè)小開口引入各個(gè)卵的卵殼；將一種遞送裝置通過各個(gè)卵殼上的小開口伸入；以遞送裝置刺穿各個(gè)卵的內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放某種物質(zhì)并將物質(zhì)沉積在各個(gè)卵的胚盤位置或其緊鄰的位置；以及從各個(gè)卵中收回該裝置。
58.權(quán)利要求57的方法，該方法進(jìn)一步包括對(duì)多個(gè)卵進(jìn)行溫育直至孵化的步驟。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所產(chǎn)生的孵化率至少約為50％。
60.權(quán)利要求58的方法，其中所產(chǎn)生的孵化率至少約為65％。
61.一種產(chǎn)生嵌合鳥類的方法，該方法包括的步驟有使含有胚盤的鳥卵朝向一個(gè)預(yù)定位置；將一個(gè)小開口引入卵的卵殼；將一種遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入；以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放鳥類供體細(xì)胞并將供體細(xì)胞沉積在胚盤中或其緊鄰的位置，該步驟在足以產(chǎn)生嵌合胚的條件下進(jìn)行；以及從卵中收回遞送裝置，對(duì)嵌合胚進(jìn)行溫育以孵化產(chǎn)生嵌合鳥類。
62.權(quán)利要求61的方法，其中遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入至一個(gè)位置，該位置選自(a)胚下腔，(b)暗區(qū)與卵黃膜之間，(c)明區(qū)與卵黃膜之間，(d)暗區(qū)與明區(qū)之間(e)明區(qū)內(nèi)(f)暗區(qū)內(nèi)，以及(g)(a)到(f)的任何組合。
63.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥類的方法，該方法包括的步驟有使含有胚盤的鳥卵朝向一個(gè)預(yù)定位置；將一個(gè)小開口引入卵的卵殼；將一種遞送裝置通過卵殼上的小開口伸入；以遞送裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在通過其插入遞送裝置之前基本完好；通過遞送裝置釋放含有一種核苷酸序列的物質(zhì)并將該物質(zhì)沉積在胚盤中或其緊鄰的位置，該步驟在足以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚的條件下進(jìn)行；以及從卵中收回遞送裝置，對(duì)轉(zhuǎn)基因胚進(jìn)行溫育以孵化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鳥類。
64.一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括使鳥卵的鈍端朝向一個(gè)預(yù)定的位置，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在卵的鈍端氣室之上的卵殼引入一個(gè)小開口；在卵殼上的小開口下的外殼膜中引入一個(gè)小開口；通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入一個(gè)取樣裝置；以取樣裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在取樣裝置通過其插入之前基本完好；以取樣裝置從胚盤中收取樣本；以及從卵中收回取樣裝置。
65.一種對(duì)鳥卵進(jìn)行注射的方法，該方法包括使鳥卵的鈍端朝向一個(gè)預(yù)定的位置，該鳥卵含有(i)胚盤以及(ii)氣室；在卵的鈍端氣室之上的卵殼引入一個(gè)小開口；在卵殼上的小開口下的外殼膜中引入一個(gè)小開口；通過卵殼和外殼膜上的小開口伸入一個(gè)檢測(cè)器裝置；以檢測(cè)器裝置刺穿內(nèi)殼膜，其中內(nèi)殼膜在檢測(cè)器裝置通過其插入之前基本完好；以檢測(cè)器裝置檢測(cè)來自卵內(nèi)部的信息；以及從卵中收回檢測(cè)器裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供了改善的方法用于對(duì)含有胚的鳥卵進(jìn)行注射，優(yōu)選的情況下該卵含有早期胚(例如胚盤)。本發(fā)明的方法可被用于向卵中遞送物質(zhì)、從卵中取樣和/或向卵內(nèi)插入檢測(cè)器裝置以從中收集信息。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明被用于向胚進(jìn)行物質(zhì)的卵內(nèi)遞送。在其它的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明被用于在卵內(nèi)產(chǎn)生嵌合或者轉(zhuǎn)基因鳥胚。
文檔編號(hào)A01K45/00GK1568366SQ02820305
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2002年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月13日
發(fā)明者N·梅德杜, M·M·布蘭德, S·沃爾菲, J·H·赫蘭克, D·馬哈托 申請(qǐng)人:恩布里克斯公司