專利名稱：利用慢病毒載體產(chǎn)生基因修飾動(dòng)物的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供將感興趣的核苷酸序列整合入動(dòng)物基因組內(nèi)的方法和組合物。
背景技術(shù)：
廣泛利用在模型生物中操縱動(dòng)物基因組成的能力，可從功能上特征鑒定基因和剖析協(xié)作基因的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。已證明基因修飾的模型生物對(duì)于了解基因功能提供了頗具應(yīng)用前景的途徑。例如家畜的基因修飾使得能探索改進(jìn)的疾病抵抗力、生長(zhǎng)速度、飼養(yǎng)效率、畜體組成以及提高肉食品的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量和健康效益的方法。然而，目前產(chǎn)生這類基因修飾動(dòng)物的方法仍然成本高效率差。
一段時(shí)間以來(lái)偏愛原核顯微注射來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此法中，原核的顯微注射可導(dǎo)致輸送數(shù)百個(gè)基因拷貝。在轉(zhuǎn)移給受者母體的顯微注射胚胎中約有10~30％存活，其中1~10％是轉(zhuǎn)基因胚胎。另外，此種基因修飾品系中只有約一半動(dòng)物表達(dá)了轉(zhuǎn)基因。
或者可采用另一種方法進(jìn)行核轉(zhuǎn)移或克隆來(lái)產(chǎn)生基因修飾的動(dòng)物。這類方法中，將轉(zhuǎn)基因?qū)塍w細(xì)胞，培養(yǎng)這些體細(xì)胞，選擇那些摻入了新基因的細(xì)胞，然后將含這些基因的核轉(zhuǎn)移到去除核而無(wú)生殖力卵子的胞質(zhì)中。雖然核轉(zhuǎn)移可確保所有出生的動(dòng)物都是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但胚胎存活率很低，該技術(shù)本身存在問(wèn)題。
此外，通過(guò)攜帶有基因信息的作為RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)，是一種將基因轉(zhuǎn)移到胚胎內(nèi)的常用方法，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入細(xì)胞后，被逆轉(zhuǎn)錄為DNA。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒的融合酶和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組末端的特異性核苷酸序列的介導(dǎo)，該DNA原病毒被整合入宿主細(xì)胞基因組中(Goff等，Annu Rev Genit.26527-544，1992，和Brown等，Proc.Natl.Acad.Sci 862525-2529，1989)。大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒只能整合入分裂的細(xì)胞中(Kulkosly等，Parmacol Ther 61185-203，1994；Roe等，EMBO J122099-2108，1993；Miller等，Mol Cell Biol 104239-4242，1990)。逆轉(zhuǎn)錄病毒，除HIV和其它慢病毒外，整合的關(guān)鍵性要求是突破有絲分裂時(shí)的核包膜。反復(fù)嘗試了多年顯示用此法不能控制基因劑量和定時(shí)，導(dǎo)致幾乎所有的出生動(dòng)物都是以不同基因整合到不同組織部位為特征的基因鑲嵌體(Jaewsch等，Cell 19181-188，1980)。這迫使進(jìn)行遠(yuǎn)交以建立適合分析基因表達(dá)的純合子和雜合子品系。
需要新的方法和組合物來(lái)更有效地產(chǎn)生基因修飾的動(dòng)物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供將感興趣的核苷酸序列整合入動(dòng)物，具體是脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物的基因組內(nèi)的方法和組合物。本發(fā)明方法包括提供分離的具有胞質(zhì)膜的卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚；使胞質(zhì)膜與含有有效濃度的至少一種第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物(它們含有感興趣的核苷酸序列)的組合物接觸。本發(fā)明的其它方法還包括在得以形成植入前胚胎的條件下培養(yǎng)上述卵母細(xì)胞、早期胚胎或囊胚。進(jìn)一步方法包括將該植入前胚胎轉(zhuǎn)移入受者脊椎動(dòng)物并使該植入前胚胎發(fā)骨成至少一個(gè)基因修飾的脊椎動(dòng)物。
本發(fā)明具體方法中，所述早期胚胎包括受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞期胚、4細(xì)胞期胚、8細(xì)胞期胚或桑椹胚。
本發(fā)明其它方法包括使上述分離的卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚的胞質(zhì)膜與含有有效濃度的第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物和第二慢病毒載體組合物接觸，其中，該第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物含有感興趣的第一核苷酸序列，而第二慢病毒載體含有感興趣的第二核苷酸序列。
本發(fā)明其它方法中，上述卵母細(xì)胞或早期胚胎還含有透明帶，該透明帶和胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙。此實(shí)施例中，將含有有效濃度的至少一種第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物(它們含有感興趣的核苷酸序列)的組合物導(dǎo)入該卵黃周隙。具體實(shí)施例中，導(dǎo)入方法包括顯微注射。
本發(fā)明另外方法包括在分離的卵母細(xì)胞或早期胚胎的卵黃周隙中，導(dǎo)入含有有效濃度的第一慢病毒載體(含感興趣的第一核苷酸序列)和第二慢病毒載體(含感興趣的第二核苷酸序列)的組合物。
本發(fā)明其它方法包括利用選自以下病毒人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的慢病毒載體或其功能等價(jià)物。其它實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體是慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
本發(fā)明的組合物含有分離的卵母細(xì)胞，早期胚胎或桑椹胚，以及有效濃度的至少一種第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物(含感興趣的核苷酸序列)。其它組合物包括的卵母細(xì)胞或早期胚胎中還包含透明帶，其中，該透明帶和胞質(zhì)膜界定了一卵黃周隙，而慢病毒載體被導(dǎo)入該卵黃周隙。
本發(fā)明的其它組合物包括分離的卵母細(xì)胞、早期胚胎和桑椹胚，以及有效濃度的第一慢性病毒載體或其功能等價(jià)物(含有感興趣的第一核苷酸序列)和有效濃度的第二慢病毒載體或其功能等價(jià)物(含有感興趣的第二核苷酸序列)，其它組合物包括卵母細(xì)胞或早期胚胎，其卵黃周隙中導(dǎo)入了有效濃度的第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物(含感興趣的第一核苷酸序列)和有效濃度的第二慢病毒載體或其功能等價(jià)物(含感興趣的第二核酸序列)。
本發(fā)明其它實(shí)施例中，本發(fā)明組合物的慢病毒載體衍生自選自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。具體實(shí)施例中，該慢病毒載體是轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體，本發(fā)明其它實(shí)施例中該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體是慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
附圖簡(jiǎn)述


圖1說(shuō)明可用于本發(fā)明方法中的慢病毒載體的非限制性例子。具體說(shuō)，
圖1說(shuō)明了可用于本發(fā)明方法中設(shè)計(jì)用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)病毒顆粒含有4種不同DNA構(gòu)建物的“轉(zhuǎn)運(yùn)慢病毒”(框外為滅活的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶)。
圖2提供了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)的非限制性說(shuō)明。
圖3提供了本發(fā)明方法和組合物能從各基礎(chǔ)動(dòng)物產(chǎn)生多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系動(dòng)物的證據(jù)。圖3A顯示第一個(gè)eGFP基礎(chǔ)動(dòng)物之一后代的尾部剪切物制備的基因組DNA。圖3B顯示GFP的Southern印跡探測(cè)。圖3提供了共聚焦顯微攝影圖像。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了將感興趣的核苷酸序列整合入動(dòng)物基因組內(nèi)的方法和組合物。具體說(shuō)，本發(fā)明的方法包括使卵母細(xì)胞或早期胚胎或桑椹胚與含有感興趣的核苷酸序列的慢病毒載體接觸，所接觸的條件應(yīng)允許該病毒載體進(jìn)入并隨后將感興趣的核苷酸序列整合入胚細(xì)胞基因組中。此方法還包括在得以形成植入前胚胎的條件下，培養(yǎng)已與該慢病毒載體或其功能等價(jià)物接觸后的未受精的卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚。隨后可將該植入前胚胎轉(zhuǎn)移到受體動(dòng)物中，在該動(dòng)物中發(fā)育成為至少一個(gè)基因修飾的動(dòng)物。
本發(fā)明的方法和組合物因而能產(chǎn)生基因修飾的動(dòng)物。具體是脊椎動(dòng)物，更具體是哺乳動(dòng)物。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒載體其原病毒基因組整合入靶細(xì)胞染色體中時(shí)不需要細(xì)胞分裂(Naldini等，Science 2722637，1996納入本文作參考)。因?yàn)槁《镜脑《净蚪M能在第一次細(xì)胞分裂前整合入卵母細(xì)胞或受精卵母細(xì)胞的基因組中，因此，本發(fā)明方法的具體實(shí)施例能降低基因修飾動(dòng)物中存在的感興趣的核苷酸序列發(fā)生鑲嵌的頻率。
然而如本文所顯示，在本發(fā)明方法中采用慢病毒載體大大提高了產(chǎn)生基因修飾動(dòng)物的頻率。因?yàn)楸景l(fā)明的方法允許發(fā)生多個(gè)獨(dú)立的整合活動(dòng)，可使含有多個(gè)整合情況的一種F0動(dòng)物遠(yuǎn)交，以產(chǎn)生具有獨(dú)立基因座整合位點(diǎn)的多個(gè)基礎(chǔ)動(dòng)物品系。這樣可實(shí)現(xiàn)100％以上的轉(zhuǎn)化效率。具體說(shuō)本發(fā)明方法可產(chǎn)生約5~10％、10~20％、20~60％、60~80％、80~100％、100~125％、125~175％、175~200％、200~300％或更高的轉(zhuǎn)化效率。本文所用的“轉(zhuǎn)化效率”定義為產(chǎn)生的可單獨(dú)遺傳的基因修飾動(dòng)物數(shù)除以與上述慢病毒載體相接觸的卵母細(xì)胞或胚胎的總數(shù)。
本發(fā)明還提供將多個(gè)感興趣的核苷酸序列導(dǎo)入未受精的卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚的基因組中的方法和組合物。具體實(shí)施例中，由于本發(fā)明的方法和組合物提高了DNA整合效率及降低了鑲嵌動(dòng)物發(fā)生率，因而改進(jìn)了產(chǎn)生具有多個(gè)整合的感興趣的核苷酸序列的非鑲嵌動(dòng)物的效率。
I.將慢病毒載體導(dǎo)入胚胎發(fā)育不同階段的卵母細(xì)胞和胚中。
本發(fā)明提供產(chǎn)生基因修飾動(dòng)物的新方法和組合物。具體說(shuō)，該新方法包括使未受精的卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹期胚胎接觸含有有效濃度的至少一種慢病毒載體(含感興趣的第一核苷酸序列)的組合物。本發(fā)明方法提供了將感興趣的核苷酸序列整合入未受精卵母細(xì)胞、早期胚胎或囊胚的有效手段，從而提供了產(chǎn)生基因修飾動(dòng)物的有效方法。
雖然本發(fā)明方法可在任何動(dòng)物中實(shí)施，但具體動(dòng)物是脊椎動(dòng)物，更具體說(shuō)脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，具體實(shí)施例中脊椎動(dòng)物是人。其它實(shí)施例中，脊椎動(dòng)物是非人脊椎動(dòng)物。本發(fā)明的“非人脊椎動(dòng)物”包括能產(chǎn)生“基因修飾的非人脊椎動(dòng)物”的所有非人脊椎動(dòng)物。這類非人脊椎動(dòng)物包括但不限于噬齒動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、羊、牛、反芻動(dòng)物、兔、豬、羊、馬、小鼠、犬、貓、鳥等。優(yōu)選的非人脊椎動(dòng)物包括小鼠、大鼠、羊、牛、豬、鳥和兔。還要知道本發(fā)明方法和組合物包括的動(dòng)物還包括處于所有發(fā)育階段包含胚胎階段的動(dòng)物?！盎蛐揎椀膭?dòng)物”或“基因修飾的脊椎動(dòng)物”指含有因整合了感興趣核酸序列而基因組被改變的一種或多種細(xì)胞的動(dòng)物。可將感興趣的核苷酸序列整合入該基因修飾動(dòng)物的體細(xì)胞和/或生殖系細(xì)胞的基因組中。
“卵母細(xì)胞”本文用于指雌配子細(xì)胞，包括原代卵母細(xì)胞、次代卵母細(xì)胞和成熟的未受精卵。卵母細(xì)胞是含有大的細(xì)胞核(即生殖性運(yùn)載體)圍繞有卵漿的一種大黃周隙，此實(shí)施方法中，通過(guò)提供具有胞質(zhì)膜和透明帶的卵母細(xì)胞或早期胚胎(此透明帶和胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙)，并將含有有效濃度的至少一種第一慢病毒載體(含感興趣的第一核苷酸序列)的組合物在允許該病毒載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的條件下，導(dǎo)入該卵黃周隙從而將感興趣的第一核苷酸序列整合入脊椎動(dòng)物基因組中。
“導(dǎo)入”指用該領(lǐng)域已知方法穿透透明帶，從而使慢病毒載體得以進(jìn)入卵黃周隙。導(dǎo)入慢病毒載體的方法包括例如將病毒顯微注射入卵黃周隙(Chang等Science291309-12，2001；chan等，Proc Natl Acad Sci，9514028-33，1998和美國(guó)專利6,080,912，納入本文作參考)，并在允許該病毒載體進(jìn)入透明帶的條件下，培養(yǎng)含胞質(zhì)膜和透明帶的未受精卵母細(xì)胞或早期胚胎(即受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞胚或桑椹胚)。
當(dāng)采用顯微注射技術(shù)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得大多數(shù)脊椎動(dòng)物卵母細(xì)胞的卵黃周隙可容納至少約1-300皮升的注射液體，因此本發(fā)明方法優(yōu)選采用具有病毒高滴度的慢病毒載體，采用高滴度病毒貯液方得以將有效濃度的病毒顆粒導(dǎo)入卵黃周隙。
本發(fā)明的慢病毒載體宜具有每毫升約1×106、1×107、1×109、1×1010、1×1011或更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位貯液滴度?；蛘弑景l(fā)明的慢病毒載體具有的病毒滴度范圍每毫升約5×107-5×108、5×108-5×109、5×109-5×1010或更高的病毒粒子。具體實(shí)施例中，病毒滴度至少約每毫升2.9×109轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道產(chǎn)生所需濃度病毒貯液的方法。
本發(fā)明其它實(shí)施例中，可除去卵母細(xì)胞或早期胚胎(即受精卵母細(xì)胞)的透明帶。此實(shí)施例中，“接觸”可包括培育含有效濃度慢病毒載體的組合物和卵母細(xì)胞或早期胚胎(即受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞胚或桑椹胚)。去除透明帶的方法是本領(lǐng)域已知的。見例如Hogen等，Manipulating the Mouse EmbryoA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Press。此實(shí)施例中使卵母細(xì)胞或早期胚胎接觸的典型條件，包括含Quinus Adrantage Hepes緩沖液培養(yǎng)基(Sage Biofarm，定貨號(hào)1020)和4％牛血清白蛋白(BSA，因子V，實(shí)驗(yàn)胚胎，Sigma定貨號(hào)A-311)，以及Quinus Advantage Cleavage培養(yǎng)基(Sage Biofarm定貨號(hào)1026)和4％BSA的緩沖液中，培養(yǎng)卵母細(xì)胞或早期胚胎和慢病毒載體。具體實(shí)施例中，有效濃度包括每微升約1×103、1×104、1×105、1×106、1×107或1×108轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的病毒粒子?；蛘撸《玖Ｗ拥臐舛确秶梢约s5×103-5×104、5×104-5×105、5×105-5×106、5×106-5×107、5×107-5×108轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。
其它實(shí)施例中，與慢病毒接觸的胚胎處在發(fā)育的囊胚期，接觸方法包括將病毒粒細(xì)胞。卵漿包含無(wú)核胞質(zhì)成分，包括mRNA、核糖體、線粒體、卵黃蛋白質(zhì)等，卵母細(xì)胞的膜本文稱為“胞質(zhì)膜”。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞還圍繞一層胞外包膜，稱為透明帶。精子可結(jié)合透明帶并穿透該帶，然后與卵母細(xì)胞的胞質(zhì)接觸。術(shù)語(yǔ)“卵黃周隙”指位于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和受精卵母細(xì)胞的透明帶和胞質(zhì)膜之間的空隙，該間隙在早期胚胎發(fā)育階段保留著(即在植入前透明帶從胚泡上脫落)。
“早期胚胎”本文用于包括從卵母細(xì)胞受精開始(即受精卵母細(xì)胞)到2細(xì)胞期，4細(xì)胞期、8細(xì)胞期和桑椹胚(16-32細(xì)胞胚)的所有胚胎發(fā)育階段。本文所用早期胚胎不包括發(fā)育的桑椹胚階段?！澳遗摺北疚挠糜谥敢约?xì)胞發(fā)育成中空球圍繞著稱為囊胚腔的腔隙的特征的胚胎發(fā)育階段。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道囊胚的整個(gè)組織(結(jié)構(gòu))視生物而不同。例如“胚泡”指以細(xì)胞發(fā)育成由外層嗜母細(xì)胞和內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)塊組成的中空球?yàn)樘卣鞯姆至哑诓溉閯?dòng)物胚胎。
“受精卵母細(xì)胞”指處于“單個(gè)細(xì)胞”發(fā)育階段的胚胎。此發(fā)育期可通過(guò)受精而觸發(fā)，特征為繼發(fā)性減數(shù)分裂；次級(jí)極體突出，父代和母代原核形成和DNA復(fù)制。術(shù)語(yǔ)“受精卵母細(xì)胞”包括的發(fā)育階段開始于受精，結(jié)束受精的卵母細(xì)胞分裂成2細(xì)胞胚。
“分離的”卵母細(xì)胞，“分離的”早期胚胎(即受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期或桑椹胚)或“分離的”囊胚本文指從雌性供體天然體內(nèi)環(huán)境中取出的。
A使慢病毒載體與不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞和胚胎接觸的方法。
本發(fā)明將感興趣的核苷酸序列整合入脊椎動(dòng)物基因組中的方法，包括提供未受精的卵母細(xì)胞、早期胚胎(即受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞胚胎或桑椹胚)或囊胚，及使它們與含有有效濃度的至少一種第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物(含感興趣的核苷酸序列)的組合物相接觸?！跋嘟佑|”指慢病毒載體與卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚直接接觸。
更具體實(shí)施例中，本發(fā)明方法包括使卵母細(xì)胞、早期胚胎即受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞胚胎或桑椹胚)或囊胚的胞質(zhì)膜與含有有效濃度的至少一種第一慢病毒載體或其功能等價(jià)物(含感興趣的核苷酸序列)的組合物接觸?！芭c胞質(zhì)膜接觸”指慢病毒載體與卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚的胞質(zhì)膜直接接觸。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可采用各種方法使病毒載體和胞質(zhì)膜直接接觸。
例如當(dāng)卵母細(xì)胞或早期胚胎保留透明帶時(shí)，“接觸”可包括將慢病毒載體導(dǎo)入卵子注射入囊胚腔中。見例如，Wolfgang等，Proc Natl Acad Sci 9810728-32，2001納入本文作參考。
“有效量”或“有效濃度”指病毒載體粒子的足以使卵母細(xì)胞\早期胚胎或桑椹胚與至少一個(gè)病毒載體粒子接觸的濃度?；蛘撸行Я堪ㄊ孤涯讣?xì)胞、早期胚胎或桑椹胚與1-10個(gè)病毒粒子，約10-50、50-100、100-1000、1000-2000、2000-5000、5000-1×104、1×104-1×105、1×105-1×106個(gè)病毒粒子或更多接觸的濃度。
本發(fā)明一實(shí)施例中，先滴定慢病毒貯液并稀釋，然后顯微注射入卵黃周隙中，從而控制整合入所產(chǎn)生的基因修飾動(dòng)物中的原病毒基因組數(shù)目，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該整合數(shù)目所需的病毒粒子的合適濃度。
本發(fā)明其它實(shí)施例中，所述胞質(zhì)膜與含有有效濃度的至少二種慢病毒載體(含至少二種不同的感興趣的核苷酸序列)的組合物相接觸。由于本發(fā)明方法最大程度減少了鑲嵌動(dòng)物的產(chǎn)生，此種實(shí)施方式得以提高了具有至少二種感興趣的核苷酸序列整合的基因修飾動(dòng)物的產(chǎn)生效率。
“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”指該領(lǐng)域常規(guī)用于促進(jìn)病毒載體的貯存、給藥和/或生物活性的運(yùn)載體。合適的運(yùn)載體應(yīng)是穩(wěn)定的，即不會(huì)與制劑中的其它成分反應(yīng)，在所用濃度時(shí)對(duì)接受者無(wú)明顯不良作用。該領(lǐng)域通常知道這類運(yùn)載體。示范性的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體包括但不限于滅菌的無(wú)熱原質(zhì)水，和滅菌的無(wú)熱原質(zhì)生理鹽水溶液。本領(lǐng)域還知道藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體還可含其它化合物，如能促進(jìn)病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞的化合物，包括各種陽(yáng)離子化合物，如二價(jià)化合物聚凝胺(1，5二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化合物)和DEAE。
本領(lǐng)域知道獲得卵母細(xì)胞、早期胚胎或桑椹胚的方法，例如受精卵母細(xì)胞可獲自排卵期時(shí)的自然交配，并通過(guò)環(huán)境條件而不是給予促性腺素來(lái)控制受精?；蛘呖稍诮慌淝敖o予雌性促性腺素以提高排出的卵數(shù)目。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，感興趣動(dòng)物種類，此雌性供者的年齡和體重，給予促性腺素的劑量和時(shí)間、雄性新手的生殖行為將影響到獲得受精卵母細(xì)胞所用具體方法的效果；或者可體外受精卵母細(xì)胞。已知道卵母細(xì)胞分離、成熟和受精的這類方法。見例如美國(guó)專利5,741,957和6,080,912；Lonergan等，Acta Vet Scand 35307-320，1994，Nagai等，Theriogenology 551291-1301，2001(牛)；Moor等，J Reprod Fertil Suppl40197-210，1990；Nagai等，Theriogendogy 551291-1301，2001；Kikuchi等，Bio Reprod 60336-340，1999；Funahashi等，J Reprod Fertil Suppl 52271-283，1997(豬)；Wang等，Reproduction 122809-816，2001；和Hogen等，Manipulutingthe Mouse EnbryoA Laboratory Mannal第二版1994；Cold Spring Harbor Press(小鼠)，和Teotia等，Small Rumin Res，40165-177，2001(羊)。所有這些文獻(xiàn)納入本文作參考。還見Jackson等，Mouse Geuetics and TransgenicsA PracticalApproach，Oxford University Press and Pinkert，等，Trangenic Auimal TechnologyA Laboratory Hand book Academic Press San Diego二者也納入本文作參考；Chan等，Proc Natl Acad Sci 9514028-14033，1998；Parrish等，Theriogenology25591-600；和Leibfried等，J Ammal Science 4876-86，1979。
B.形成植入前胚胎和胚胎轉(zhuǎn)移的方法在未受精卵母細(xì)胞、早期胚胎(即受精的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞胚或桑椹胚)或囊胚與慢病毒載體接觸后，在允許形成“植入前胚胎”的體外條件下培養(yǎng)上述胚胎。這種植入前胚胎宜含約16-150個(gè)細(xì)胞或更多，特別是約16-64個(gè)細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道培養(yǎng)植入前胚胎所需方法，視與慢病毒載體接觸的卵母細(xì)胞或胚胎的發(fā)育階段而不同。例如當(dāng)接觸的是早期胚胎或桑椹胚時(shí)，本領(lǐng)域知道培養(yǎng)受精卵母細(xì)胞的方法，包括以下文獻(xiàn)中的描述Gordon等，Methods in Engymology101414.1984；Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo 1990.Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor N.Y(小鼠胚)；Hammer等，Nature315680，1985(兔和豬胚)；Gandolfi等，J Reprod Fert 8123-28，1987；Rexroad等，J Anim Sic 6947-953，1988(牛胚)和Eyestone等，J Reprod Fert85715-720，1989；Camous等，J reprod Fert 72779-785，1984；和Hey man等，Theriogenology 275986，1987(牛胚)。
在未受精卵母細(xì)胞與病毒載體接觸的實(shí)施方法中，形成植入前胚胎包括培育成熟卵母細(xì)胞和精子，本領(lǐng)域知道體外受精的這類方法，見例如美國(guó)專利6,080,912；Chan等，Science 291309-312，2001和Chan等，Proc Natl Acad Sci 9514028-14033，1998，所有納入本文作參考。
然后用標(biāo)準(zhǔn)方法將植入前胚胎轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)拇菩越邮苷唧w內(nèi)，使發(fā)育和生長(zhǎng)成基因修飾動(dòng)物。使基礎(chǔ)基因修飾動(dòng)物內(nèi)部交配可產(chǎn)生雜合子和純合子動(dòng)物，本領(lǐng)域知道這類方法。例如見Hogen等，Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Mannal第二版1994 Cold Spring Harbor Laboratory Press。
術(shù)語(yǔ)“后代”指某具體基因修飾動(dòng)物，即其基因組中整合了一個(gè)或多個(gè)感興趣的核苷酸序列的動(dòng)物產(chǎn)生的、或遺傳的任何和所有后代，不論此動(dòng)物是所述核苷酸序列的雜合子或純合子。任何含有該感興趣的核苷酸序列的后代都包括在內(nèi)，如F1、F2、F3，故此定義包括同樣含有感興趣的核苷酸序列的任何一代。
C.檢測(cè)整合的感興趣的核苷酸序列可用本領(lǐng)域已知技術(shù)先鑒定可能的F0代基礎(chǔ)基因修飾動(dòng)物(即卵母細(xì)胞或胚胎與慢病毒載體接觸后出生的動(dòng)物)，這些技術(shù)包括但不限于PCR分析和/或限制性酶消化和/或Southern印跡分析，見Hogen等，Manipulating the Mouse Embryo ALaboratory Mannal第二版1994 Cold Spring Harbor Laboratory Press，納入本文作參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可在發(fā)育的各個(gè)階段，包括胚胎轉(zhuǎn)移入雌性受體之前，子宮內(nèi)，分娩后或出生后進(jìn)行基礎(chǔ)基因修飾動(dòng)物的這種鑒定。
檢測(cè)基因組中感興趣的核苷酸序列的整合方法是該領(lǐng)域熟知的。例如，可測(cè)定植入前胚胎中整合的感興趣的核苷酸序列，或相連的可檢測(cè)標(biāo)志。發(fā)育此階段的檢測(cè)，得以鑒定出已發(fā)生基因修飾的胚胎，從而可將基因修飾的胚胎然后種植在雌性受體中。此方法中，從植入前胚胎取出一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。基本上所要求的不僅是分析一個(gè)胚胎細(xì)胞的感興趣的核苷酸序列的整合，而是要求足夠的細(xì)胞數(shù)目在子宮內(nèi)整個(gè)期間發(fā)育。分離植入前胚胎的單個(gè)細(xì)胞后，分析其基因DNA，檢測(cè)感興趣的核苷酸序列。見例如美國(guó)專利5,741,957，納入本文作參考。
另外，可在胚胎發(fā)育后期測(cè)定整合的感興趣的核苷酸序列。例如可分析子宮內(nèi)和分娩后的組織。在采用幾種技術(shù)，包括例如在回波鏡指導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺羊膜腔進(jìn)行子宮內(nèi)分析。見例如Bowgso等，Bet Res 96.124-127，1975和Rumsey等，J Anim Sci39386-91，1974，二者納入本文作參考。此類方法獲得的細(xì)胞含有的基因組DNA，可用于PCR分析基因組修飾?；蛘?，可經(jīng)絨毛膜穿刺回收胚胎細(xì)胞，此法也在回波鏡指導(dǎo)下經(jīng)陰道進(jìn)行，獲得的絨毛膜細(xì)胞可用于PCR分析，以確定是否發(fā)生了基因修飾。
也可在出生后檢測(cè)基因修飾，例如，可從估計(jì)已基因修飾的動(dòng)物耳朵或尾巴獲取組織活檢樣品，并分析是否存在基因修飾。此外，也可通過(guò)測(cè)定組織，分泌物(如唾液)，其它體液中的mRNA序列，感興趣的核苷酸序列編碼的多肽表達(dá)，或含有該感興趣的核苷酸序列的DNA構(gòu)建物中所含選擇性標(biāo)記產(chǎn)生的表型，來(lái)檢測(cè)基因修飾。
II.慢病毒和慢病毒載體本發(fā)明通過(guò)使受精卵母細(xì)胞的胞質(zhì)與含有感興趣的核苷酸序列的慢病毒載體接觸，提供將該感興趣的核苷酸序列整合入哺乳動(dòng)物基因組中的方法。
“慢病毒載體”本文用于指一種重組修飾的慢病毒，其修飾的原病毒RNA基因組中含有感興趣的核苷酸序列。本發(fā)明所定義的慢病毒載體至少一部分衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒慢病毒亞科，該亞科成員的特征是能感染非分裂性細(xì)胞，本領(lǐng)域知道，本發(fā)明方法中所用的慢病毒載體諸組分可衍生自任何病毒來(lái)源，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒，更特別是慢病毒來(lái)源，只要所得慢病毒載體保留了整合入非分裂性細(xì)胞的能力即可。
所述慢病毒載體衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒科和慢病毒亞科的病毒。慢病毒與影響免疫系統(tǒng)的慢性進(jìn)行性疾病有關(guān)(Coffin等，Retroviruses，Cold Spring HarborLaboratory Press納入本文作參考)，其特征是能整合入非分裂性細(xì)胞的基因組中。慢病毒包括各種靈長(zhǎng)類(如人免疫缺陷病毒HIV-1and 2)和猴免疫缺陷病毒(SIV)和非錄長(zhǎng)類病毒(如maedi-visna病毒MVV)、禽免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血癥病毒(EIAV)，羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)和牛免疫缺陷病毒(BW)。綜述見例如Romano等，Stem Cells 1819-39，2000。
可用于本發(fā)明方法中的許多慢病毒載體是本領(lǐng)域知道的包括但不限于以下文獻(xiàn)所述的HIV-1為基礎(chǔ)的載體Parolin等，J Virol 683888-3895，1994；Naldini等，Science 272263-267，1996；Zufferey等，Nat Biotech 15871-875，1997；Uchida等，Proc Natl Acad Sci USA 9511939-11944，1998；Kim等，J Virol 72811-816，1998；Poeschla等，Proc Natl Acad Sci 9311395-11399，1996；Mochizuki等，J Virol 728873-8883，1998；Gasmi等，J Virol 731828-1834，1994；Buchschacher等，J Virol 662731-2739，1992和Dropulic等，Proc Natl Acad SciUSA 9311103-11108，1996均納入本文作參考。此外，已開發(fā)了自身滅活(SIV)慢病毒載體并可用于本發(fā)明。見例如Zufferey等，J Virol 729873-9880，1998和Miyoshi等，J Virol 728150-8157，1998二者納入本文作參考。本領(lǐng)域也知道HIV-2病毒載體。見例如Poeschla等，Proc Natl Acad Sci USA 9311395-11399，1996。此外，知道FIV病毒載體，見例如Johnston等，J Virol 734991-5000，1999；Johuston等，J Virol 732991-2998，1999和Poeschla等，Nat Med 4354-357，1998。
另外，可用于本發(fā)明方法中的慢病毒載體也可含有RNA假型慢病毒Rizvi等，JVirol 672681-2688，1993和Embretson等，J Virol 612675-2683，1987，二者納入本文作參考。例如Corbean及其同事設(shè)計(jì)了HIV-1/HIV-2為基礎(chǔ)的載體(Corbean等，Gene Ther 599-104，1998)。此外，White等，J.Jirol 732832-2840，1999描述了HIV-1/SIV-衍生載體。以上各文納入本文作參考。
正在開發(fā)的其它慢病毒載體包括以羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal等，Arch.Virol，143681-695，1998；馬傳染性貧血癥病毒(Mitchell等，Lancet351346，1998；)和牛免疫缺陷性病毒為基礎(chǔ)的復(fù)制缺陷性載體。上述各納入本文作參考。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得本發(fā)明方法中用的慢病毒載體系統(tǒng)可以是“復(fù)制缺陷性”的?！皬?fù)制缺陷性”指該病毒載體顆粒不能在靶細(xì)胞中重建完整的病毒顆粒，因而不能繁殖和傳播給其它細(xì)胞。
具體實(shí)施例中，本發(fā)明方法中所用的慢病毒載體是“傳染性的”?！皞魅拘浴敝冈摬《绢w粒能進(jìn)入靶細(xì)胞。其它實(shí)施例中，本發(fā)明方法中所用的慢病毒載體能“轉(zhuǎn)導(dǎo)”靶細(xì)胞。“轉(zhuǎn)導(dǎo)”指該病毒載體能進(jìn)入靶細(xì)胞并將其基因轉(zhuǎn)移載體整合入靶細(xì)胞的基因組中。設(shè)計(jì)能將感興趣的核苷酸序列整合入基因組的重組慢病毒載體的方法，是本領(lǐng)域知道的。簡(jiǎn)言之，可通過(guò)含有至少三種基因元件基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建物、包裝構(gòu)建物和EnV表達(dá)構(gòu)建物的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)生該慢病毒載體(Naldini等，Science，272263-267，1996；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 908033-8037，1993和White等，J Virol.732832-2840，1999)。基因轉(zhuǎn)移構(gòu)建物含有逆轉(zhuǎn)錄病毒順式作用元件和感興的趣核苷酸序列。該轉(zhuǎn)移構(gòu)建物包含在插入靶細(xì)胞基因組中的修飾的原病毒基因組上。包裝構(gòu)建物能指導(dǎo)除包膜蛋白以外的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。包裝構(gòu)建物表達(dá)的蛋白質(zhì)(主要是Gag/Pol)可形成衣殼和聚合酶組分，能識(shí)別逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組中和其逆轉(zhuǎn)錄DNA產(chǎn)物中的特異性順式作用序列(Miller等，HumGeneTher 8803-815，1997)。此種識(shí)別導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄和整合。包膜構(gòu)建物一般含有異源性包膜(如水泡性口炎病毒糖蛋白G，VSV-G)。這三種表達(dá)構(gòu)建物以細(xì)菌質(zhì)粒形式維持，可轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生復(fù)制缺陷性病毒貯液(White等，J Virol 732832-2840，1999和Naldini等，Science 272263-267，1996)納入本文作參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以各種方法設(shè)計(jì)該慢病毒載體，仍能產(chǎn)生可用于本發(fā)明方法中的“功能等價(jià)物”。以下提供具體涉及轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)的“功能等價(jià)物”的更詳細(xì)說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這種說(shuō)明可將此概念同樣應(yīng)用于其它已知的慢病毒載體系統(tǒng)。
A.轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體本發(fā)明一實(shí)施例中所用的慢病毒載體包含“轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體”。本文中含“轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體”的“慢病毒載體”設(shè)計(jì)特點(diǎn)是，至少部分分離的編碼Gag和Pol聚合蛋白質(zhì)含有逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。再如HIV Gag聚合蛋白質(zhì)含有MA、CA、NC和P6。
在轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體設(shè)計(jì)中，編碼Gag-Poo-Pol聚合蛋白質(zhì)的核苷酸序列被劈裂成至少二個(gè)分開部分，第一DNA區(qū)段含有編碼Gag或Gag/Pro或其功能等價(jià)物的核苷酸序列，和至少第二DNA區(qū)段編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和/或整合酶或其功能等價(jià)物。“轉(zhuǎn)運(yùn)-慢”病毒載體設(shè)計(jì)的另一特征采用Vpr和/或Vpx多肽或其功能等價(jià)物，來(lái)使逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶靶向病毒顆粒。下面將概述用于轉(zhuǎn)運(yùn)慢病毒載體設(shè)計(jì)的Vpr/Vpx融合蛋白設(shè)計(jì)的詳細(xì)內(nèi)容。
另一實(shí)施例中，此轉(zhuǎn)運(yùn)-載體設(shè)計(jì)包括“轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體”設(shè)計(jì)。如以下詳述，“逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)”載體的特征為能在至少二部分中表達(dá)Gag-Poo-Pol聚合蛋白質(zhì)第一DNA區(qū)段表達(dá)Gag或Gag/Pro，至少第二DNA區(qū)段表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶和/或整合酶?！澳孓D(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)”載體設(shè)計(jì)的另一特征是采用能整合入病毒粒子中的至少一個(gè)Gag多肽片段或其功能等價(jià)物，使逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶靶向該病毒粒子。此設(shè)計(jì)中利用該Gag多肽片段作為運(yùn)載體將功能性逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶輸送入病毒粒子中。以下將概述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)的詳細(xì)內(nèi)容。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可在衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源的病毒載體中采用此逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)。因本發(fā)明具體實(shí)施例中，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒而非慢病毒。這類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可衍生自但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括但不限于莫洛尼白血病病毒(MLV)、Abelson小鼠白血病病毒，AKR(內(nèi)源性)小鼠白血病病毒、禽癌瘤Mill Hill病毒2、禽造白細(xì)胞增生病毒-RSA、禽成髓細(xì)胞瘤病毒、禽髓細(xì)胞瘤增生病毒29、牛合胞病毒、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒、雞合胞病毒、鳥傳染性貧血病毒、貓白血病病毒、貓合胞病毒、Finkel-Biskis-Jinkins小鼠肉瘤病毒、Friend小鼠白血病病毒、Fujinami肉瘤病毒、Gardner-Amstein貓肉瘤病毒、Gibbon猿白血病病毒、豚鼠C型致瘤病毒、Hardy-Zuckerman貓肉瘤病毒、Harvey小鼠肉瘤病毒、人泡沫病毒、人泡沫病毒、人嗜T細(xì)胞病毒1、人嗜T細(xì)胞病毒2、南非羊肺炎肺腺瘤病毒、Kirsten小鼠肉瘤病毒、Langur病毒、Mason-Pfiger猴病毒、莫洛尼小鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺瘤病毒、羊肺腺瘤病毒、豬C型致瘤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒、羅斯肉瘤病毒、猴泡沫病毒、猴肉瘤病毒、猴嗜T淋巴細(xì)胞病毒、猴D型病毒1、Snyder-Theilen貓肉瘤病毒、松鼠猴逆轉(zhuǎn)錄病毒、Trager鴨脾壞死病毒、UR2肉瘤病毒、蝰蛇逆轉(zhuǎn)錄病毒、綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎/肺腺瘤病病毒、羊毛猴肉瘤病毒和Y73肉瘤病病毒、人-、猴-、貓-和牛免疫缺陷病毒(HIV、SIV、FIV、BIV)。見美國(guó)專利申請(qǐng)09/578,548。
用于產(chǎn)生這些病毒粒子的“轉(zhuǎn)運(yùn)”病毒載體設(shè)計(jì)，“轉(zhuǎn)運(yùn)-慢”病毒載體設(shè)計(jì)和“轉(zhuǎn)運(yùn)-逆轉(zhuǎn)錄病毒”載體設(shè)計(jì)和病毒載體系統(tǒng)的完整說(shuō)明可詳見美國(guó)專利申請(qǐng)09/089,900；09/709,751；09/460,548；美國(guó)專利6,001,985；PCT專利申請(qǐng)PCT/US00/185975；Wu等，EMBO 165113-5122，1997，所有納入本文作參考。
圖1-2提供了對(duì)用于本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體系統(tǒng)的非限制性描述。這些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)包括以下組分；env構(gòu)建物、包裝構(gòu)建物、酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移載體。該轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒系統(tǒng)的“包裝構(gòu)建物”包含編碼Gag/Pro(
圖1-2中的框中結(jié)構(gòu)為代表)的核苷酸序列，而編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)的核苷酸序列已用某種方式從該構(gòu)建物中刪除了一個(gè)或被破壞，從而阻止了功能性多肽的表達(dá)。編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶多肽的核苷酸序列以反向提供給包裝構(gòu)建物上的DNA伸長(zhǎng)部分，本文稱為“酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物”。該病毒表達(dá)系統(tǒng)因此通過(guò)從編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的核苷酸序列上割裂下Gag-Pro而使Gag-Pro-Pol結(jié)構(gòu)失去功能。
該轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒系統(tǒng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體可在生理上可與采用三載體系統(tǒng)(其中Gag/Pol表達(dá)為聚合蛋白質(zhì))的病毒載體相區(qū)別。例如見Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997和Wu等，Mol Ther 147-55，2000，二文提供了鑒定轉(zhuǎn)運(yùn)-慢病毒顆粒中未切割Vpr/Vpx融合蛋白的試驗(yàn)和測(cè)定該轉(zhuǎn)運(yùn)-病毒載體中與三載體慢病毒載體相比基因重組水平降低的試驗(yàn)。
本文中“核酸序列”有時(shí)用作包括DNA和RNA片段的通用術(shù)語(yǔ)。因?yàn)楸景l(fā)明的材料包括修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組及其原病毒復(fù)本，所涉及的具體功能序列可以RNA和DNA二種形式存在，涉及的相應(yīng)基因座可以DNA和RNA二種形式互換存在。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組中的ψ包裝信號(hào)功能作為包裝信號(hào)；然而在原病毒DNA中存在有相應(yīng)的序列。相似地，在基因組RNA和原病毒DNA形式中存在啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子序列，雖然形式略有不同。在病毒生命周期不同時(shí)象中，這些功能序列的互換性該領(lǐng)域技術(shù)人員尚不了解。因此，關(guān)于DNA或RNA身份的相當(dāng)隨便說(shuō)說(shuō)的術(shù)語(yǔ)常用于指它們。具體說(shuō)，應(yīng)理解由堿基漸進(jìn)所確定的序列包括RNA和DNA二種形式的那些特定序列及其互補(bǔ)序列。
雖然該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體系統(tǒng)各種元件的描述包括以下提供的，例如該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體系統(tǒng)具有基因轉(zhuǎn)移載體、包裝構(gòu)建物、包膜構(gòu)建物和酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物組分，但應(yīng)知道本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不難地產(chǎn)生“功能等價(jià)”構(gòu)建物?！肮δ艿葍r(jià)”構(gòu)建物指具有基本上與本文所述特異性載體構(gòu)建物功能相同的各DNA構(gòu)建物(即基因轉(zhuǎn)移載體、包裝構(gòu)建物、包膜構(gòu)建物和酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物)。還應(yīng)知道該轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)的各載體中的基因元件可從任何病毒來(lái)源，具體是逆轉(zhuǎn)錄病毒，更具體是慢病毒來(lái)源制得。
以下更全面描述該轉(zhuǎn)運(yùn)-載體系統(tǒng)各組分功能等價(jià)物的例子和試驗(yàn)。雖然表1提供HIV-1基因組各基因元件的參考序列，是根據(jù)NCBI Genbank登錄號(hào)AF033819而定，但應(yīng)知道本領(lǐng)域已知其它逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或慢病毒的序列并可用于構(gòu)建針對(duì)某給定動(dòng)物種類的功能等價(jià)載體和載體系統(tǒng)。表1所示組分及其功能的更詳細(xì)說(shuō)明可參見Coffin等，Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，納入本文作參考本文作為參考。此外，技術(shù)人員會(huì)明白不同病毒分離物之間在各種基因元件中存在等位基因變體，這類變體可用于本發(fā)明的構(gòu)建物中。例如，這類變體的描述見Li等，J.Virol，666587，1992；Ghosh等，Virology.194858，1993和美國(guó)專利5,869,313；以上文獻(xiàn)均納入本文作參考。
表1人HIV-1分離物的基因元件和序列座標(biāo)基因元件 序列座標(biāo)R (1-96)U5 (97-181)PBS (182-199)Gag (336-1836)Pro (1637-2099)Pol (2102-4640)Vif (4587-5163)Vpr (5150-5339)Tat (5377-5591，7925-7968)rev (5516-5591，7925-8197)vpu (5608-5854)env (5771-8339)nef (8343-8710)PPT (8615-8630)U3 (8631-9085)R (9086-9181)
本發(fā)明的功能等價(jià)序列也包括基本上保留了與各天然序列功能相同的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的各種片段。這類片段包含所述感興趣特異性基因元件的至少約10、15個(gè)毗連核苷酸，至少約20個(gè)毗連核苷酸，至少約24、50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、340、360、380個(gè)或高達(dá)全部的毗連核苷酸?？捎孟拗菩悦盖懈钐烊徊《净蚪M；合成該病毒基因組的天然核苷酸序列獲得這類片段，或可通過(guò)利用PCR技術(shù)獲得。具體見Mullis等，MethodsEnzymol.155335-350，1987和Erlich編PCR Technology(Stockton Press，NewYork)。另外，各種載體組分的變體，如由定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的變體也包括在本發(fā)明的方法中。如以下更詳細(xì)所述，本領(lǐng)域可獲得測(cè)定功能等價(jià)物的方法。
“變體”指基本上相同的序列。因此，對(duì)核苷酸序列或氨基酸序列而言，變體包括與該慢病毒載體系統(tǒng)各組分功能等價(jià)的序列。變體核苷酸序列也包括通過(guò)定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的但仍保留了天然序列功能的的合成核苷酸序列。通常本發(fā)明的核苷酸序列變體或氨基酸變體具有與其各自天然核苷酸序列至少70％，通常80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。
由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，核苷酸序列的變體可編碼保守性不同的氨基酸序列。這些天然產(chǎn)生的等位基因變體可用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)來(lái)鑒定。變體核苷酸序列也包括用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的但仍保留了天然序列功能的的合成核苷酸序列。
關(guān)于本發(fā)明慢病毒載體系統(tǒng)中用的各種全長(zhǎng)或成熟多肽的氨基酸序列，所述變體包括通過(guò)在天然多肽的N-末端和/或C-末端缺失(所謂截短)或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在天然多肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或在天然多肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而從天然多肽產(chǎn)生這些多肽。這類變體可產(chǎn)生自基因多態(tài)性或人的操縱。這類操縱方法通常為本領(lǐng)域所知。
例如，可通過(guò)編碼感興趣特定載體元件的克隆DNA序列中的突變，制備某多肽的氨基酸序列變體。誘變和核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的，見例如，Walker和Gaastra編，Techniques in Molecular Biology，1983，(MacMillan PublishingCompany，New York)；Kunkel，Proc，Natl，Acad，Sci，USA 82488-492，1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154367-382，1987；Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)；美國(guó)專利4,873,192和本文引用的參考文獻(xiàn)，均納入本文作參考。關(guān)于不影響各種載體多肽生物學(xué)活性的適當(dāng)氨基酸置換的指南，可參見納入本文作參考的Dayhoff等，Atlas of Polypeptide Sequence和Structure(Natl Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。保守性置換，如優(yōu)選一個(gè)氨基酸與另一個(gè)具有相同性能的氨基酸互換。保守性置換的例子包括但不限于GlyAla，Val Ile Leu，Asp Glu，Lys Arg，Asn Gln和PheTrp Tyr。
天然核苷酸序列或天然多肽的變體具有與天然序列或天然多肽基本的相同性。變體可有幾個(gè)，例如1-10個(gè)氨基酸殘基，如少至6-10個(gè)，少至5個(gè)，少至4、3、2個(gè)或甚至1個(gè)氨基酸殘基不同。核苷酸序列的變體可有少至1-30個(gè)核苷酸，如6-20個(gè)，少至5個(gè)，少至4、3、2個(gè)或甚至1個(gè)核苷酸殘基不同。
“序列相同性”指當(dāng)將變體的核苷酸序列或氨基酸序列的一特定連續(xù)區(qū)段，與參比序列的核苷酸序列或氨基酸序列作排列對(duì)比比較時(shí)，該變體序列和參比序列中的相同核苷酸或氨基酸殘基。序列排列對(duì)比和鑒定序列間相同性的方法是本領(lǐng)域熟知的。就二核苷酸序列最佳排列對(duì)比而言，變體核苷酸的連續(xù)區(qū)段可按參比核苷酸序列加入核苷酸或缺失核苷酸。同樣，為最佳排列對(duì)比二氨基酸序列，變體氨基酸序列的連續(xù)區(qū)段可按參比氨基酸序列加入氨基酸殘基或缺失氨基酸殘基。。用于與參比核苷酸序列或參比氨基酸序列作比較的連續(xù)區(qū)段，將含有至少20個(gè)毗連核苷酸或氨基酸殘基，可以是30、40、50、100個(gè)或更多的核苷酸或氨基酸殘基?？赏ㄟ^(guò)設(shè)定空格罰分，在變體核苷酸序列或氨基酸序列中加入空格，糾正相關(guān)的序列相同性的增加。序列排列對(duì)比的方法是本領(lǐng)域熟知的?？衫脭?shù)學(xué)算法來(lái)確定二序列之間的相同性百分率。例如，可用Smith-Waterman的同源性檢索算法來(lái)確定核苷酸序列的相同性百分率，采用的空格開放罰分為25，空格延伸罰分為5。例如，可用TimeLogicVersion G的DeCypher的硬件加速器來(lái)進(jìn)行序列相同性的測(cè)定。Smith-Waterman的同源性檢索算法見Smith和Waterman，Adv.Appl.Math，2482-89，1981(納入本文作參考)中所述?；蛘呖刹捎媚J(rèn)參數(shù)的排列對(duì)比程序GCG Gap(Wisconsin GeneticComputing Group，Suite Version 10.1)。此GCG Gap程序采用Needleman和Wunch的算法排列對(duì)比核苷酸序列，所用的開放空格罰分為3，延伸空格罰分為1。比較二序列所用數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul，Proc，Natl，Acad，Sci.USA 872264，1990的算法，Karlin和Altschul，Proc，Natl，Acad，Sci.USA905873-5877，1993作了改進(jìn)?？蓪⑦@類算法加入到Altschul等，J.Mol.Biol.215403，1990的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程序進(jìn)行，評(píng)分＝100，詞長(zhǎng)＝12，以獲得具有充分序列相同性的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可用XBLAST程序進(jìn)行，評(píng)分＝50，詞長(zhǎng)＝3，以獲得具有充分序列相同性的氨基酸序列。為比較目的獲得加空格的排列對(duì)比，可采用Altschul等，Nucleic Acids Res.253389，1997所述的加空格BLAST?；蛘呖捎肞SI-Blast進(jìn)行重復(fù)檢索，測(cè)定分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系。見Altschul等，1997，同上。當(dāng)采用加空格的BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可采用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見http∥www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一優(yōu)選非限制性例子是Myers和Miller，CABIOS 411-17，1988的算法?？蓪⒁凰惴尤氲紾CG序列排列對(duì)比軟件包一部分的ALIGN程序(2.0版)中。當(dāng)采用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可采用PAM120權(quán)數(shù)殘基表，空格長(zhǎng)度罰分12和空格罰分4。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，載體或質(zhì)粒上含有下述DNA構(gòu)建物。該質(zhì)?？珊屑?xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種可選擇標(biāo)記、使該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)成為單鏈(即M13復(fù)制起點(diǎn))的信號(hào)肽、多個(gè)克隆位點(diǎn)和“哺乳動(dòng)物”的復(fù)制起點(diǎn)(即SV49或腺病毒復(fù)制起點(diǎn))。這類載體是本領(lǐng)域知道的。
1.基因轉(zhuǎn)移載體如上所述，此轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體系統(tǒng)提供了與包裝構(gòu)建物、env構(gòu)建物和酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物組合的基因轉(zhuǎn)移載體，其能構(gòu)成能預(yù)防復(fù)制活性病毒形成的轉(zhuǎn)移病毒包裝細(xì)胞系。
“基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體”本文用于指具有必須的“順式作用”組分的核苷酸序列，該順式作用組分可轉(zhuǎn)錄該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體；將該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA(即修飾的原病毒基因組)衣殼包裹入病毒粒子中；逆轉(zhuǎn)錄該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA；和將該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA整合入靶細(xì)胞的基因組中。
攜帶上述功能的順式作用核酸序列是本領(lǐng)域熟知的。例如，基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可含有以下組分5’LTR；包裝信號(hào)肽；Rev反應(yīng)元件(RRE)；和3’LTR或這些元件之一的功能性變體或衍生物。該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體還可含有至少一個(gè)操作性連接于在所需靶細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子的感興趣的核苷酸序列。這些組分的每一個(gè)將在下面更詳細(xì)說(shuō)明。
5’和3’LTR序列側(cè)接該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的其它元件。該LTR序列含有多個(gè)元件，包括啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件和對(duì)于原病毒基因組整合入靶細(xì)胞基因組有重要作用的其它順式作用序列。該LTR的各種順式作用元件包括，例如U5區(qū)(GeneBank登錄號(hào)AF033819的nt 97-181)和U3區(qū)(GeneBank登錄號(hào)AF033819的nt8631-9085)，它們含有指導(dǎo)該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)為單一前體mRNA的病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列。其它LTR組分包括含有RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所需序列的R區(qū)(即反式激活區(qū)TAR)，聚腺苷酸信號(hào)(Genebank登錄號(hào)AF033819的nt 1-96)。HIV-1病毒的LTR序列和功能性變體的更完全說(shuō)明見Pereira等，Nucleic Acid Research.28663-8，2000，納入本文作參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的各種組分可以任何順序排列，只要它們位于5’和3’LTR元件的內(nèi)部。該轉(zhuǎn)運(yùn)載體還可含有tRNA引物結(jié)合位點(diǎn)序列(GeneBank登錄號(hào)AF033819的nt182-199)，其功能是啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這類改變。還應(yīng)知道可對(duì)該LTR進(jìn)行修飾，如可自身滅活(SIN)的載體的那些修飾演。這類改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。
本文“包裝信號(hào)”或“ψ信號(hào)”用于指衣殼化包裹病毒RNA到病毒粒子中所需的核酸序列。用于本發(fā)明方法中的包裝信號(hào)序列可以是衣殼化包裹病毒RNA到病毒粒子中所需的最小包裝信號(hào)序列。優(yōu)選的本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的最小包裝序列，將足以指導(dǎo)該修飾的原病毒基因組(即基因轉(zhuǎn)移載體)摻入到該病毒粒子中。
應(yīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明方法中可采用已知的包裝信號(hào)的變體和片段，只要該變體能指導(dǎo)衣殼化包裹病毒RNA到病毒粒子中。例如，含有圍繞該最小包裝序列的序列的延伸包裝信號(hào)，可提高衣殼化包裹該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體到病毒粒子中的效率。納入本文作參考的Mcbirde等，J.Virol.714544-4554，1997中特征鑒定了HIV包裝信號(hào)。
該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體也可含有Rev反應(yīng)元件(RRE)。該元件的存在使Rev得以指導(dǎo)核輸出含RRE的mRNA。RRE序列及其功能性變體是本領(lǐng)域知道的，見例如，Berchtold等，Ciology.21285-289，1995；Dillon等，J.Virol.644428-4437，1990；Le等，Nucleic Acid Res.181613-1623，1990；此三論文納入本文作參考。還應(yīng)知道Rev/RRE可用其它元件取代，包括例如，Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)的順式作用219-核苷酸組成型轉(zhuǎn)運(yùn)元件(CTE)，其顯示能使Rev-獨(dú)立的HIV-1復(fù)制。見例如，Bray等，PROCNATL ACAD SCI USA 911256-1260，1994。
該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體還含有攜帶感興趣的核苷酸序列的DNA結(jié)構(gòu)。因此，該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中所含感興趣的核苷酸序列當(dāng)經(jīng)由病毒粒子導(dǎo)入靶細(xì)胞時(shí)能夠表達(dá)。該感興趣的核苷酸序列和含此序列的DNA構(gòu)建物下面將全面描述。還應(yīng)知道該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可含有至少一個(gè)其它的感興趣的核苷酸序列。
該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體也可包含至少一個(gè)含可選擇標(biāo)記(操作性連接于一啟動(dòng)子)的DNA構(gòu)建物。關(guān)于可選擇標(biāo)記的用途以下將更全面全說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得存在著許多可能性。也知道選擇用于表達(dá)可選擇標(biāo)記的啟動(dòng)子，將取決于該標(biāo)記用于鑒測(cè)所述基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體摻入包裝細(xì)胞系還是摻入靶細(xì)胞基因組而不同。
圖1-2說(shuō)明該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的非限制性實(shí)例。所述構(gòu)建物含HIV-1的LTR序列，側(cè)接有以下組分包裝信號(hào)肽；RRE；中央聚嘌呤序列(PPT)和操作性連接于CMV啟動(dòng)子的感興趣的核苷酸序列。
2.酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物含有與其天然構(gòu)象分開的編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的核苷酸序列。具體說(shuō)，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼含操作性連接于功能性逆轉(zhuǎn)錄酶和/或整合酶的多肽(其特征是能靶向病毒粒子)的一融合蛋白。例如，HIV毒粒相關(guān)輔助性蛋白(Vpr或Vpx)或其變體或片段，可用作運(yùn)載體來(lái)輸送具有整合酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽到該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體顆粒中。這種“轉(zhuǎn)運(yùn)-慢”病毒載體的設(shè)計(jì)見
圖1。具體說(shuō)，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物可包含編碼一融合蛋白(其含有Vpr或Vpx多肽或其功能性變體或片段)的核酸序列，而此融合蛋白框內(nèi)融合于至少一個(gè)含整合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶或其功能性變體或片段的一異源性多肽。此種酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物是本領(lǐng)域已知的，見例如，Liu等，J.Virol.717704-7710，1997；Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997；美國(guó)專利6,001,985；1998年6月3日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/089,900；和1999年12月14日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/460,548；以上文件均納入本文作參考。
“融合蛋白”本文用于指一種多肽，其含有連接在一起可框內(nèi)表達(dá)的至少二種異源多肽序列。即編碼這些異源多肽的核苷酸序列將翻譯成一個(gè)翻譯產(chǎn)物。一實(shí)施例中，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼的融合蛋白含有Vpr或Vpx多肽或其功能性片段或變體，而第二個(gè)多肽含具有整合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。本發(fā)明其它實(shí)施例中，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼的融合蛋白含編碼所有這三種多肽(即Vpr/Vpx、或逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶)的核苷酸序列。
編碼Vpr和Vpx多肽的序列是該領(lǐng)域知道的，見例如，美國(guó)專利5,861,161，納入本文作參考?？刹捎肰pr或Vpx多肽的片段或變體并保留其摻入病毒粒子的能力。Vpr/Vpx多肽保留此活性的片段和變體的例子是知道的，見例如，Paxton等，J.Virol.677229-7237和美國(guó)專利6,043,081，二者納入本文作參考。此外，測(cè)定Vpr或Vpx多肽是否摻入病毒粒子的試驗(yàn)是本領(lǐng)域的常規(guī)。簡(jiǎn)而言之，融合于一標(biāo)記多肽的Vpr/Vpx片段或變體在細(xì)胞系中表達(dá)能產(chǎn)生病毒顆粒。培養(yǎng)該細(xì)胞系并產(chǎn)生病毒顆粒。分離病毒顆粒并檢測(cè)該標(biāo)記蛋白的存在。見例如，Paxton等，J.Virol.677229-7237，1993。
圖2說(shuō)明該轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)的另一實(shí)施例。此具體非限制性實(shí)施例中的設(shè)計(jì)本文稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)，其利用了Gag多肽的片段，該片段保留了靶向病毒顆粒輸送具有整合酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性多肽到該病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體顆粒中的能力。
具體說(shuō)此實(shí)施例中，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物可含編碼一融合蛋白的核酸序列，該融合蛋白含有保留了靶向病毒顆粒能力的Gag多肽的片段，該片段框內(nèi)融合于至少一個(gè)含整合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶或其功能性變體或片段的的異源性多肽。這類酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物是本領(lǐng)域知道的，見例如，1999，12月工資4日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)09/578548。
一實(shí)施例中，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼的融合蛋白含有保留了靶向病毒顆粒能力的Gag片段，同時(shí)第二個(gè)多肽含具有整合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。本發(fā)明其它實(shí)施例中，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼的融合蛋白含編碼所有三種多肽(即Gag；逆轉(zhuǎn)錄酶；整合酶)的核苷酸序列。
編碼Gag多肽的核苷酸序列是本領(lǐng)域知道的。Gag多肽的片段和變體保留了摻入病毒顆粒的能力。保留了此活性的Gag多肽的片段和變體的例子是知道的。
也知道編碼整合酶多肽的核苷酸序列(見表1)。整合酶參與病毒生命周期的許多方面。例如，已知整合酶參與病毒粒子裝配和成熟過(guò)程的各種步驟，并參與病毒基因組在宿主細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄和整合(Lie等，J.Virol.738831-36，1999和Craigie等，J.Biol.Chem.Manuscript R100027200)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于本發(fā)明方法的整合酶多肽可得自任何病毒來(lái)源，具體是逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是慢病毒來(lái)源。
整合酶多肽或其變體或片段將具有整合酶活性。整合酶活性指該多肽保留了支持產(chǎn)生病毒顆粒(即支持病毒裝配、成熟和/或整合)的充分活性。整合酶多肽影響到病毒裝配、成熟和/或整合的區(qū)域是本領(lǐng)域知道的。例如，整合酶催化中心內(nèi)的突變會(huì)降低病毒顆粒的感染力。見例如，Liu等，J.Virol.717704-7710，1997；Wu等，Mol.Therapy 247-55，2000和Craigie等，J Bio.Chem.Manuscript R100027200和Liu等，J.Virol.238831-8836，1999，這些文件均納入本文作參考。
編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列是本領(lǐng)域知道的(見表1)。逆轉(zhuǎn)錄酶參與利用細(xì)胞tRNA作引物從單鏈RNA模板合成雙鏈線性DNA。本發(fā)明所用逆轉(zhuǎn)錄酶可得自任何逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)源，具體是包括HIV-1、HIV-2和SIV等的慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄酶多肽或其變體或片段將具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
“逆轉(zhuǎn)錄酶活性”指該多肽保留了支持產(chǎn)生病毒顆粒(即催化該基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體復(fù)制)的充分活性。測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的試驗(yàn)是本領(lǐng)域知道的。例如，測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性可在體外用人造模板/引物構(gòu)建物和氚化三磷酸脫氧核苷酸進(jìn)行。該試驗(yàn)是依據(jù)對(duì)摻入RNA/DNA雜交物(可用三氯醋酸TCA沉淀)中的放射活性的檢測(cè)。測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性的其它方法可見例如，美國(guó)專利6,132,995，XMW TY。
制備含有編碼能翻譯成一種翻譯產(chǎn)物(即框內(nèi)融合)的至少二個(gè)異源多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體，是本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可在編碼該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物異源多肽的核苷酸序列之間安置接頭，只要該接頭序列充許諸肽的編碼區(qū)留在框內(nèi)。這類接頭序列包括例如，蛋白酶切割位點(diǎn)，此位點(diǎn)可被包裝構(gòu)建物中編碼的蛋白酶所識(shí)別。這類序列是本領(lǐng)域知道的，包括例如，HIV-1基因組中逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列5’端的33個(gè)核苷酸，或位于GenBank登錄號(hào)L02317的整合酶編碼序列5’端的18個(gè)核苷酸。見例如，Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道怎樣利用這類序列將逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶從Vpr或Vpx多肽上有效切割下來(lái)。
為了產(chǎn)生復(fù)制缺陷性轉(zhuǎn)運(yùn)病毒顆粒，可在包裝細(xì)胞系中以與編碼Gag或Gag/Pro多肽的包裝構(gòu)建物相反方向表達(dá)整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明一實(shí)施例中，包裝細(xì)胞系內(nèi)在二個(gè)分開的酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物上表達(dá)含逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的融合蛋白。此實(shí)施例中，包裝細(xì)胞系含有至少二個(gè)酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物。采用慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)作為例子，第一融合蛋白含Vpr或Vpx和逆轉(zhuǎn)錄酶；而第二該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼含Vpr或Vpx和整合酶的融合蛋白。應(yīng)知道這些構(gòu)建物中的多肽順序可以改變。然而，還應(yīng)知道，可以相似方式采用該逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體設(shè)計(jì)。
該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物的另一實(shí)施例中，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶或其變體或片段的多肽表達(dá)為一個(gè)翻譯產(chǎn)物。此實(shí)施例中，該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物編碼含有框內(nèi)融合的以下多肽或其功能性變體或片段的一個(gè)融合蛋白Vpr或Vpx、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。見例如，美國(guó)專利申請(qǐng)09/089900和Wu等，EMBO.J.165113-5122，1997。
編碼該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物融合蛋白的核苷酸序列可操作性連接于在包裝細(xì)胞系中有活性的啟動(dòng)子。包含該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物的DNA結(jié)構(gòu)也可含有在該包裝細(xì)胞系中能發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。感興趣的啟動(dòng)子包括例如，雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、CMV、HIV-2LTR、SHVTK啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。
圖1說(shuō)明該轉(zhuǎn)運(yùn)慢病毒載體系統(tǒng)的酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物的非限制性例子。該構(gòu)建物包括以下操作性相連的組分CMV啟動(dòng)子、編碼Vpr多肽的核苷酸序列、編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列、編碼整合酶的核苷酸序列、HIV-2的RRE、和SV40聚腺苷酸信號(hào)。
圖1說(shuō)明了該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物，其保存了逆轉(zhuǎn)錄酶的N-端蛋白酶切割位點(diǎn)，和逆轉(zhuǎn)錄酶與整合酶多肽之間的蛋白酶切割信點(diǎn)。
3.包裝構(gòu)建物如上所述，本發(fā)明方法中用的轉(zhuǎn)運(yùn)病毒顆粒還提供了一種包裝構(gòu)建物，其與基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體、env構(gòu)建物和酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物組合在一起，因而能構(gòu)建成預(yù)計(jì)可形成復(fù)制活性病毒的包裝細(xì)胞系。
該包裝構(gòu)建物的特征是，其核酸序列含有至少一個(gè)核苷酸序列，此核苷酸序列編碼截短的Gag/Pro序列(即Gag/Pro)，不編碼功能性整合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶多肽。編碼Gag/Pro多肽的核苷酸序列含有組成核基質(zhì)和核衣殼多肽的各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。該序列還編碼功能性蛋白酶。Gag/Pro序列可衍生自本文所述任何逆轉(zhuǎn)錄病毒。這類Gag/Pro序列是本領(lǐng)域知道的，包括例如，Genebank登錄號(hào)AF033819的核苷酸336-2099。
該包裝構(gòu)建物也可含病毒基因組(具體是逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組)中產(chǎn)生復(fù)制缺陷性病毒顆粒所必須的核苷酸序列?？砂谠摪b構(gòu)建物中的基因元件的例子包括但不限于編碼Vif、Tat和Rev的核苷酸序列。然而，該包裝構(gòu)建物不含有編碼功能性包膜多肽、功能性逆轉(zhuǎn)錄酶多肽和功能性整合酶多肽的核苷酸序列。這些序列已全部或部分缺失或改變以防止功能性多肽的翻譯。此外，該包裝構(gòu)建物缺乏功能性包裝信號(hào)(ψ信號(hào))，從而防止了該構(gòu)建物摻入病毒顆粒時(shí)產(chǎn)生RNA。
美國(guó)專利申請(qǐng)09/089900更詳細(xì)說(shuō)明了該包裝構(gòu)建物中可能影響到病毒顆粒感染力的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶突變方式。已認(rèn)識(shí)到可對(duì)該包裝構(gòu)建物中的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或整合酶序列作某些改變，以破壞酶多肽的功能，使得當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶以反式在該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物中表達(dá)時(shí)，仍能產(chǎn)生感染性復(fù)制缺陷性轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體。例如，一實(shí)施例中，改變逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶序列，使該蛋白酶序列的3’端含一終止密碼子。也知道可將多個(gè)突變導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶序列中。例如，除了在逆轉(zhuǎn)錄酶編碼序列中導(dǎo)入早期翻譯終止密碼子外，可在逆轉(zhuǎn)錄酶和/或整合酶編碼序列中至少定位加入一個(gè)“死亡”突變。這個(gè)加入的突變將減少該包裝構(gòu)建物和該酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物之間基因重組重建完整Gag-Pol編碼區(qū)的可能性。
可將該包裝構(gòu)建物的核苷酸序列包含在還含有在包裝細(xì)胞系中有活性的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建物中。該DNA構(gòu)建物還可含有在包裝細(xì)胞系中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。感興趣的啟動(dòng)子包括例如，CMV、HIV-2LTR、HCMV-IE(Naldini等，Science 272263-267，1996)、SHVYK啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。該包裝構(gòu)建物還可含有一操作性連接于活性啟動(dòng)子的可選擇標(biāo)記。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可展望該包裝構(gòu)建物的各種功能性變體。
圖12說(shuō)明了用于本發(fā)明方法中的包裝構(gòu)建物的非限制性例子。該包裝構(gòu)建物含有操作性連接于編碼Gag/Pro、Vif、Tat、Rev(GeneBank登錄號(hào)L02317的nt258-8384)的核苷酸序列的CMV啟動(dòng)子。
圖1的該包裝構(gòu)建物在逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶編碼序列的第一個(gè)氨基酸位置處還含翻譯終止密碼子(TAA)；缺少ψ信號(hào)；在Vpr編碼區(qū)中有框偏移突變；nef基因完全缺失；可導(dǎo)致無(wú)活性Vpu多肽的內(nèi)部缺失；及編碼Env多肽核苷酸的缺失。該包裝構(gòu)建物結(jié)構(gòu)的更詳細(xì)描述可見美國(guó)專利申請(qǐng)09/089900。
4.Env構(gòu)建物本發(fā)明還提供預(yù)計(jì)能形成復(fù)制完全的轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體顆粒，與上述包裝構(gòu)建物、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體和酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物組合在一起的env構(gòu)建物。該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒系統(tǒng)的env構(gòu)建物含有編碼操作性連接于活性啟動(dòng)子的包膜蛋白或其功能性變體或片段的核苷酸序列。各種包膜多肽是本領(lǐng)域知道的。已知本發(fā)明的病毒顆粒可感染的宿主細(xì)胞范圍視所用包膜編碼序列而不同。用于本發(fā)明的病毒包膜蛋白，包括HIV包膜多肽(見表1)、MLV包膜糖蛋白(Page等，J.Virol.645270-5276，1990)、水泡性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)(Yee等，PROC NATL ACAD SCI。919564-9568，1994和Burns等，Proc Natl Acad Sci.USA 908033-8037)、或埃博拉和馬可拉病毒的包膜多肽(Kobinger等，Nature Biotech.19225-230，2001)。本發(fā)明一優(yōu)選項(xiàng)實(shí)施例中，所選env編碼序列使得病毒顆粒能進(jìn)入受精卵母細(xì)胞中。本發(fā)明的方法中，在env構(gòu)建物中采用水泡性口炎病毒的G-蛋白(VSV-G)或其片段或變體。測(cè)定本發(fā)明方法中所用的其它包膜多肽的假型試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。還知道可構(gòu)建缺少env構(gòu)建物的轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體顆粒。
包膜多肽的片段或變體將保留支持產(chǎn)生復(fù)制缺陷性病毒顆粒的充分活性(即能摻入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的包膜中并能結(jié)合靶細(xì)胞使病毒顆粒進(jìn)入靶細(xì)胞)。測(cè)定Env多肽或其片段或變體功能的試驗(yàn)是本領(lǐng)域知道的。例如，本發(fā)明Env多肽片段或變體的表達(dá)可使包裝細(xì)胞系產(chǎn)生載體顆粒，將可選擇標(biāo)記傳遞給原初敏感細(xì)胞使其對(duì)該標(biāo)記藥物選擇產(chǎn)生抗性。
該env構(gòu)建物中可采用任何啟動(dòng)子序列，只要其在包裝細(xì)胞系中有活性。本文中已描述了這類啟動(dòng)子序列。適合的聚腺苷酸信號(hào)的代表性例子包括SV40晚期聚腺苷酸信號(hào)、牛生長(zhǎng)激素終止/聚腺苷酸序列、和胰島素聚腺苷酸信號(hào)。
該env構(gòu)建物也可含編碼一可選擇標(biāo)記的核苷酸序列。這類可選擇標(biāo)記的例子包括能賦予宿主對(duì)抗菌素(如嘌呤霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等)抗性，或賦予氨基酸類似物抗性等的核苷酸序列。其它可選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的，包括例如，βgal、GFP和熒光素酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多可能的選擇。
圖1顯示對(duì)本發(fā)明env構(gòu)建物的說(shuō)明性和非限制性例子。該env構(gòu)建物含有操作性連接于VSV-G編碼區(qū)的VMV立即早期啟動(dòng)子，而VSV-G編碼區(qū)操作性連接于SV40聚腺苷酸信號(hào)。
5.包裝細(xì)胞系可用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)病毒顆粒。見納入本文作參考的美國(guó)專利4,650,764和美國(guó)專利申請(qǐng)09/089,900。方法包括在包裝細(xì)胞系中摻入酶轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物、基因轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)建物、env構(gòu)建物和包裝構(gòu)建物；在適合于病毒顆粒形成的條件下培養(yǎng)該包裝細(xì)胞系；和分離該轉(zhuǎn)運(yùn)病毒顆粒。各種各樣的細(xì)胞可用于制備本發(fā)明的包裝細(xì)胞，包括例如，獲自脊椎動(dòng)物，或哺乳動(dòng)物如人、貓、山羊、牛、綿羊和小鼠的細(xì)胞。合適的包裝細(xì)胞系包括但不限于Hela(ATCC No；CCL2)；HT1080(ATCCNoCCL121)；293(ATCC No1573)和293T細(xì)胞系。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法將各種載體構(gòu)建物導(dǎo)入該包裝細(xì)胞。這類方法包括但不限于電穿孔、采用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀。見例如，Ausabel等，Current Protocols inMolecular Biology；John Wileg和Sons，Inc.和美國(guó)專利5,739,081，二者均納入本文作參考。還知道慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的各種構(gòu)建物可在該包裝細(xì)胞系中短期內(nèi)表達(dá)，或者，或?qū)⑦@些構(gòu)建物穩(wěn)定性摻入該包裝細(xì)胞的基因組中。
在能產(chǎn)生該轉(zhuǎn)運(yùn)性慢病毒顆粒的條件下培養(yǎng)包裝細(xì)胞系，然后分離逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒的方法也是本領(lǐng)域知道的。例如，可用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)，包括各種單層培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝細(xì)胞系。可將這些包裝細(xì)胞系培養(yǎng)在T-瓶、滾瓶、或生物反應(yīng)器中?？刹捎靡雅鷾?zhǔn)的培養(yǎng)液，如含5％胎牛血清的AIM-V培養(yǎng)液(GibcoBRL，Gr和Isl和，N.Y)或含高濃度葡萄糖(4.5g/l)及10％熱滅活胎牛血清的Dulbecco’smodified Eagle(DMEM)培養(yǎng)液。
分離逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒的方法是本領(lǐng)域已知的，見例如，美國(guó)專利5,661,022和6,013,517，XMW TY?！凹兓霓D(zhuǎn)運(yùn)病毒載體顆粒”本文用于指，含該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒重量至少50％、60％、70％、80％；優(yōu)選至少85％；更優(yōu)選至少90％、93％、95％、98％、99％的轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體顆粒的制品。
III.感興趣的核苷酸序列本發(fā)明的方法和組合物中，慢病毒載體的修飾的原病毒基因組含有至少一個(gè)感興趣的核苷酸序列。感興趣的核酸序列與基因修飾動(dòng)物可以是異源性或同源性。異源性指該動(dòng)物基因組中天然不存在的核苷酸序列。同源性指該動(dòng)物中存在的核苷酸序列并整合入不同于天然序列存在的部位處。
本發(fā)明方法中可采用任何感興趣的核苷酸序列。特別感興趣的是其表達(dá)能導(dǎo)致一可檢測(cè)表型的核苷酸序列。通過(guò)指導(dǎo)動(dòng)物中異源產(chǎn)物的表達(dá)或提高內(nèi)源產(chǎn)物的表達(dá)可獲得這些結(jié)果?；蛘撸赏ㄟ^(guò)降低一種或多種內(nèi)源性產(chǎn)物，如該動(dòng)物中的各種酶或協(xié)同因子的表達(dá)獲得此結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這類感興趣的核苷酸序列可編碼多肽、核糖酶或反義序列。
感興趣的基因反映了商品市場(chǎng)的需要，市場(chǎng)感興趣的是開發(fā)基因修飾的動(dòng)物。感興趣的核苷酸序列的總分類目錄包括例如，涉及在雌性哺乳動(dòng)物的奶中產(chǎn)生重組多肽；產(chǎn)生疾病研究用動(dòng)物模型；產(chǎn)生對(duì)疾病(如乳腺疾病乳腺炎)有高抵抗力動(dòng)物；能在動(dòng)物的血、尿、或其它適當(dāng)體液或組織中產(chǎn)生重組多肽的那些序列。此外，可選擇感興趣的核苷酸序列作為工具，進(jìn)一步研究發(fā)育、突變發(fā)生、畸形發(fā)展、動(dòng)物生長(zhǎng)、生殖和設(shè)計(jì)用于研究促進(jìn)肉類/奶制品生產(chǎn)或影響特定農(nóng)作物性狀的基因修飾的效果。
感興趣的核苷酸序列的非限制性例子包括編碼奶蛋白質(zhì)(即乳鐵蛋白、溶菌酶、分沁性免疫球蛋白、乳白蛋白、膽鹽激發(fā)的脂酶等)；血清蛋白質(zhì)(即白蛋白、免疫球蛋白、因了VIII、因子IX、蛋白C等)和工業(yè)用酶(即蛋白酶、脂酶、殼多糖酶、和原核與真核來(lái)源的liginases)。重組DNA序列包括基因組和編碼重組多肽的cDNA序列。此外，可選擇能在各種生理過(guò)程中起作用的感興趣的核苷酸序列，然后可用于產(chǎn)生藥物開發(fā)所用的動(dòng)物模型系統(tǒng)，以評(píng)價(jià)化合物的效果和毒性(liggitt等，Xenobiotica.22(9-10)1043-1054，1992)。
具體實(shí)施例中，該核苷酸序列含有核糖酶。核糖酶是由執(zhí)行各種涉及RNA反應(yīng)，包括切割和連接多核苷酸鏈的核糖核酸(RNA)組成的酶。核糖酶的靶結(jié)合區(qū)域與底物RNA之間的堿基配對(duì)(氫鍵)決定了該酶的特異性。改變靶結(jié)合區(qū)域的核苷酸序列可改變這種特異性。也可以改變核糖酶的催化功能域以提高此酶的活性和穩(wěn)定性。核糖酶的設(shè)計(jì)方法是該領(lǐng)域知道的，見例如，美國(guó)專利5,646,031；5,646,020和5,639,655；均納入本文作參考本文作為參考。
另外，此核苷酸序列可含反義核苷酸序列。此實(shí)施例中，感興趣的核苷酸序列含有與基因修飾動(dòng)物的靶序列互補(bǔ)的核苷酸序列。反義序列的靶核酸可以是DNA或RNA。該靶核苷酸序列含有其表達(dá)與感興趣表型相關(guān)的細(xì)胞基因。靶基因中存在與反義序列相互反應(yīng)的位點(diǎn)，因而可調(diào)節(jié)該靶序列所編碼多肽的表達(dá)(在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平)，從而改變所得基因修飾動(dòng)物的表型。反義寡核苷酸靶向的優(yōu)選位點(diǎn)包括含靶基因開放讀框的翻譯起始或終止密碼子的區(qū)域。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，或“5’加帽點(diǎn)”和5’加帽區(qū)(其含有加帽mRNA 5’最終端的約25-50個(gè)毗連核苷酸)也可能是反義核苷酸序列的有效靶子。
另一實(shí)施例中，基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中所含的感興趣的核苷酸序含有一多核苷酸序列，當(dāng)其表達(dá)時(shí)，所含RNA分子能介導(dǎo)RNA干擾?！癛NA干擾”指存在與靶基因相同或充分序列相同性的RNA時(shí)，將導(dǎo)致該靶基因轉(zhuǎn)錄的信信使RNA降解的現(xiàn)象(Sharp，Gene和Dev.15485-490，2001，納入本文作參考本文作為參考)。此實(shí)施例中，使該病毒載體與靶細(xì)胞接觸，并將靶細(xì)胞(或生物)維持在能表達(dá)干擾性RNA的情況下，結(jié)果導(dǎo)致該靶mRNA降解。
能介導(dǎo)RNA干擾的RNA可含RNA分子、RNA區(qū)段或RNA片段。這些術(shù)語(yǔ)包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA(部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA或重組產(chǎn)生的RNA)以及由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變而不同于天然存在的RNA的改變的RNA。
此實(shí)施例中所用感興趣的核苷酸序列表達(dá)的干擾性RNA，每條鏈含有2個(gè)或多個(gè)核酸多聚體的核苷酸。具體實(shí)施例中，含干擾性RNA的感興趣的核苷酸序列是雙鏈的，每條鏈含有約50-40個(gè)核苷酸堿基；每條鏈含有約40-30個(gè)核苷酸堿基；每條鏈含有約15-50個(gè)核苷酸堿基。“siRNA”指短的干擾性RNA，其特征是從鏈RNA，每條鏈長(zhǎng)度不到30個(gè)核苷酸堿基?；蜊锩織l鏈約10-30個(gè)、約15-30個(gè)、或約21-25個(gè)核苷酸堿基。已知該干擾性RNA序列和靶序列的偏愛對(duì)應(yīng)是不需要的，但這種對(duì)應(yīng)必須充分才能使該RNA指導(dǎo)對(duì)靶mRNA的RNA干擾性切割。測(cè)定RNA干擾的方法是該領(lǐng)域知道的，包括例如，Norther分析或檢測(cè)表型的試驗(yàn)。見美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0132788和美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0162126，二者均納入本文作參考。
表達(dá)和設(shè)計(jì)能介導(dǎo)RNA干擾的RNA的方法是該領(lǐng)域知道的。見例如，Paul等，Nature Biotech.20505-08，2002，納入本文作參考。例如，一實(shí)施例中，該siRNA表達(dá)為返折的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞間加工后成為siRNA。這些siRNA在靶細(xì)胞中經(jīng)胞內(nèi)加工成為siRNA樣分子。另一實(shí)施例中，該siRNA的有義和反義鏈在靶細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)錄。此實(shí)施例中，含靶基因有義鏈的第一siRNA被表達(dá)，并且含靶因反義鏈的第二siRNA被表達(dá)。還知道該第一和第二siRNA可包含在同一或不同的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體中。也見美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0132788；美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0162126和美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0086356；均納入本文作參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可采用各種啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)干擾性RNA。例如，Pol III啟動(dòng)子的第III型；已證明成功的U6或H1啟動(dòng)子。見例如Tuschl，Nature Biotech.20446-448，2002；Miyagishi和Taira，Nature Biotech.19497-500，2002；Paule和White.Nucleic Acid Res.281283-1298，2000，均納入本文作參考?？刹捎闷渌鼏?dòng)子，如Pol II啟動(dòng)子，包括例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。見例如，Xia等，Nature Biotech 201006-1010，2002，納入本文作參考。技術(shù)人員還懂得也可加入聚腺苷酸信號(hào)來(lái)促進(jìn)該干擾性RNA的表達(dá)。
還知道該干擾性RNA可用作降低靶基因表達(dá)(部分或全部)的方法。降低基因表達(dá)的所述方法可用于治療或研究(如產(chǎn)生疾病狀態(tài)模型以檢測(cè)某基因的功能，評(píng)估藥物對(duì)該基因是否有作用，驗(yàn)證藥物發(fā)現(xiàn)的靶子等)。這些情況時(shí)基因功能被消除，所得到的細(xì)胞或生物也或稱為“敲除”或“敲掉”。此外，許多疾病是由于某特定基因或基因組的的異常表達(dá)而致，可利用RNA干擾來(lái)抑制這些基因的表達(dá)，從而緩解疾病的癥狀或治愈。
可將感興趣的核苷酸序列包含在DNA結(jié)構(gòu)中。具體實(shí)施例中，該DNA構(gòu)建物含有在靶細(xì)胞中表達(dá)感興趣的核苷酸序列所需的所有元件。這樣，感興趣的核苷酸序列包含在該慢病毒載體修飾的原病毒基因組中，當(dāng)其經(jīng)該病毒顆粒被導(dǎo)入靶細(xì)胞時(shí)可被表達(dá)。
“操作性連接于”指各核苷酸序列連接在一起，在5’和3’調(diào)控序列的調(diào)控下表達(dá)該感興趣的核苷酸序列。當(dāng)該感興趣的核苷酸序列編碼一多肽時(shí)，“操作性連接”還包括連接諸核苷酸序列，以表達(dá)在適當(dāng)讀碼框中的編碼序列。基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體可含有至少一個(gè)操作性連接于一啟動(dòng)子的感興趣的核苷酸序列。
如本文所用，含感興趣的核苷酸序列的DNA構(gòu)建物可以5’-3’方向轉(zhuǎn)錄，包含在靶宿主細(xì)胞(即基因修飾演的動(dòng)物的細(xì)胞)中能發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)，感興趣的核苷酸序列和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，啟動(dòng)子對(duì)該靶細(xì)胞可以是天然的或外源的。此外，此啟動(dòng)子可以是天然序列或或合成序列?！巴庠吹摹敝冈撀《据d體所導(dǎo)入的靶細(xì)膩中不存在的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。雖然采用外源啟動(dòng)子表達(dá)該序列是優(yōu)選的，但也可用天然啟動(dòng)子序列。終止區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是天然的，可以與操作性相連的感興趣DNA序列是天然的，或可以衍生自另外來(lái)源。
任何啟動(dòng)子可操作性連接于感興趣的核苷酸序列，只要該啟動(dòng)子在靶細(xì)胞中有活性。這類啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子(Balling等，Cell 58337-347，1989和Beddington等，Development 105733-737，1989)，金屬硫蛋白啟動(dòng)子(Palmiter等，Science 222809-814，1983和Iwamoto等，EMBO.J.103167-3175，1991)，HMGCR啟動(dòng)子(Mehtali等，Gene 91179-184，1990和Tam等，Development 115703-715，1992)和組蛋白H4啟動(dòng)子(Choi等，Mol.Cell.Biol.113070-3074，1991)。其它啟動(dòng)子或增強(qiáng)子元件可在真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)中和美國(guó)專利6,271,436(納入本文作參考)中找到。
或者，該啟動(dòng)子可以是條件性活化的啟動(dòng)子?！皸l件性”啟動(dòng)子指該啟動(dòng)子是沉默的(表現(xiàn)為降低表達(dá))直到被特異性激活。該啟動(dòng)子可被實(shí)驗(yàn)操作，如給予某種藥物或其它活化劑而激活，或該啟動(dòng)子可在特定發(fā)育階段或在特定組織中被激活。
發(fā)育中受到調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包括例如，在末分化細(xì)胞中才有活性的啟動(dòng)子，如磷酸甘油激酶(Pgk)啟動(dòng)子和八聚體(octomer)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(Oct-4)啟動(dòng)子。
“組織偏愛啟動(dòng)子”基本上只在所選組織中或細(xì)胞類型中表達(dá)，如果在基因修飾動(dòng)物的這類組織或細(xì)胞中該核苷酸序列的表達(dá)不傷害動(dòng)物，它們?cè)谄渌M織和/或細(xì)胞類型中的繼發(fā)性表達(dá)可以接受。組織偏愛啟動(dòng)子包括能指導(dǎo)在奶中表達(dá)的啟動(dòng)子，包括但不限于指導(dǎo)乳腺組織表達(dá)的乳清酸蛋白啟動(dòng)子(歐洲專利0264,166和PCTWO88/00239)，α-乳白蛋白啟動(dòng)子(PCT WO88/01648)，大鼠β-酪蛋白啟動(dòng)子(歐洲專利法0279582)和牛酪蛋白啟動(dòng)子(PCT WO88/10118)。見例如美國(guó)專利5,741,957。各自內(nèi)容納入本文作參考。
還知道含感興趣的核苷酸序列的DNA構(gòu)建物可含各種能促進(jìn)感興趣的核苷酸序列表達(dá)、穩(wěn)定化、和/或定位，和/或所得基因產(chǎn)生定位的序列。這些序列包括增強(qiáng)子、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄后元件，如鴨肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后區(qū)(WPRE)或PPT-CTS或其功能性變體。見例如，Zufferey等，J.Virol.732886-2892和2000年11月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)專利09/709,751，二者納入本文作參考。其它實(shí)施例中，含感興趣的核苷酸序列的DNA構(gòu)建物還含有親和性尾，用于純化或標(biāo)記(如用抗體)。
或者，可將感興趣的核苷酸序列包含在缺少啟動(dòng)子序列的DNA構(gòu)建物中。此實(shí)施例中，該感興趣的核苷酸序列在其序列5’端整合到靶細(xì)胞內(nèi)源啟動(dòng)子后才表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地篩選出含該感興趣的核苷酸序列的基礎(chǔ)動(dòng)物，鑒定以所需方式(即在所需發(fā)育階段、組織中或以所需水平表達(dá))表達(dá)該感興趣的核苷酸序列的動(dòng)物。
慢病毒的原病毒基因組也可含至少一種DNA結(jié)構(gòu)，此DNA結(jié)構(gòu)含操作性連接于啟動(dòng)子的一選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記包括但不限于熒光素酶(Lira等，Proc Natl AcadSci.877215-7219，1990和Lee等，J.Biol.Chem.26715875-15885，1992)，β-gal(Goring等，Science 235456-458，1987)，GFP，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)(Overbeek等，Proc Natl Acad Sci.877815-7819，1985)和人生長(zhǎng)激素(hGH)(Pinkert等，GeneDev.1268-276，1987)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道存在許多可能的選擇。
技術(shù)人員知道可用的適合可選擇標(biāo)記。例如，1acZ具體用于研究動(dòng)物中的組織或定位可被染色的全胚胎中特定基因的表達(dá)。CTA和熒光素酶敏感和能定量，然而這些標(biāo)記不能觀察檢測(cè)表達(dá)的立體模式。人生長(zhǎng)激素不難檢測(cè)，可用于立體定位和定量。
在制備該DNA構(gòu)建物時(shí)，可操縱各種DNA片段，以提供正確取向的DNA序列，和適當(dāng)?shù)卦谡_的讀碼框中。為體外誘變，可能涉及引物、修復(fù)、限制、退火、重取代，如堿基轉(zhuǎn)換和顛換。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)使慢病毒載體接觸胞質(zhì)膜產(chǎn)生基因修飾的小鼠A.慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體質(zhì)粒為構(gòu)建pPCW-eGFP基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將含有EGFP cDNA(衍生自pEGFP-C1，Clontech)的PCR擴(kuò)增的DNA片段連接入pHR-CMV-LacZ質(zhì)粒的BamHI/XhoI位點(diǎn)(Naldini等，Science 272263-7，1996)，產(chǎn)生pHR-CMV-eGFP；然后PCR擴(kuò)增HIV-1 pSG3分子克隆的含中心聚嘌呤序列(PPT)和中心終止位點(diǎn)(CTS)的150bpDNA序列(4327-4483)(Ghosh等，Virology 194858-864，1993)，并連入pHR-CMV-eGFP的獨(dú)特ClaI位點(diǎn)。為減少eGFP表達(dá)(Zufferey等，J.Virol.72886，1999)，將衍生自鴨肝炎病毒(WPRE)的后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入eGFP的下游，產(chǎn)生pPCW-eGFP基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。表2的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中采用了此構(gòu)建物，但Fisher334(a)和Fisher344(b)大鼠除外。
用pgk-eGFPF基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體產(chǎn)生表2的轉(zhuǎn)基因參比動(dòng)物，如Fisher334(a)。此構(gòu)建物與上述pPCM-eGFP基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體相同，除了用磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子替代CMV啟動(dòng)子。
用EF1-α-APP-eGFP基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體產(chǎn)生表2的轉(zhuǎn)基因參比動(dòng)物，如Fisher344(b)。此構(gòu)建物代表通過(guò)IRES連接于GFP的早老性癡呆淀粉樣前體蛋白(APP)的突變體。
制備載體貯液先前已報(bào)道過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體代表了有獨(dú)特安全性的基于HIV的載體(Wu等，Mol.Therapy 247-55)。簡(jiǎn)而言之，為減少產(chǎn)生復(fù)制活性逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)的危險(xiǎn)，采用TranzVectorTM(Tranzyme，Inc.Birmingham AL)慢病毒包裝系統(tǒng)(該系統(tǒng)的RT和IN與Gag-Pol分開，以反式輸送作為與HIV-1毒粒相關(guān)蛋白Vpr的融合蛋白)產(chǎn)生該載體貯液。因此，用磷酸鈣DNA沉淀法將3微克pCMV-gag-pro包裝質(zhì)粒、1微克pCMV-vpr-RT-IN酶轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒、1.5微克pMD.G(VSVG)表達(dá)質(zhì)粒和3微克基因轉(zhuǎn)運(yùn)(pPCW-eGFP)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染亞鋪滿的單項(xiàng)式層培養(yǎng)293T細(xì)胞。60小時(shí)后收集上清液，低速離心(1000g，10分鐘)澄清，0.45μm孔徑濾膜過(guò)濾。超離心(Beckman SW28轉(zhuǎn)頭，23,000rpm，2小時(shí))濃縮載體顆粒。為測(cè)定載體滴度，用0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032、和0.000064微升的上清液貯液感染培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，2天后用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)GFP-陽(yáng)性(綠色)細(xì)胞集落。衡量每個(gè)GFP-陽(yáng)性細(xì)胞集落為一轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)。所用純化病毒的滴度為2,0×109TU/ml。等分病毒-80℃保存待用。
B.小鼠受精卵母細(xì)胞的分離和顯微注射及植入前胚胎的轉(zhuǎn)移每只小鼠腹腔內(nèi)(i.p)注射50IU的PMS(含F(xiàn)SH卵泡刺激素的妊娠雌鼠血清)使雌鼠超排卵。46-48小時(shí)后每只鼠i.p注射3.75IU的晚期HCG(人絨毛膜促性腺激素)并交配。次日從輸卵管收集受精卵母細(xì)胞，用含1％透明質(zhì)酸酶的Hepes緩沖胚胎培養(yǎng)液洗滌除去圍繞收獲卵母細(xì)胞的堆積細(xì)胞。除去堆積細(xì)胞后，用Hepes緩沖胚胎培養(yǎng)液洗卵母細(xì)胞除去殘留的透明質(zhì)酸。將受精卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到用石臘油覆蓋的“裂解培養(yǎng)基”中。在潮濕的培養(yǎng)箱中37℃，7％CO2中靜止培養(yǎng)卵母細(xì)胞。0.5-4小時(shí)后用Hepes緩沖胚胎培養(yǎng)液洗卵母細(xì)胞，然后滴種在載玻片上石臘油封蓋。在玻璃注射針筒中裝入含CMV-eGFP轉(zhuǎn)基因的病毒顆粒(109/ml)，顯微注射入卵母細(xì)胞的卵黃周隙(PVS)。在400倍放大下注射。每只卵母細(xì)胞注射約100微微升(pl)。與原核注射(導(dǎo)致卵母細(xì)胞溶解率高達(dá)33％)相比，PVS注射的卵母細(xì)胞溶解率約5％或不到。
在用石臘油覆蓋的“裂解培養(yǎng)基”中37℃，7％CO2培養(yǎng)成功注射的卵母細(xì)胞過(guò)夜。次日卵母細(xì)胞發(fā)育成2細(xì)胞胚。將此胚轉(zhuǎn)移到假孕雌鼠的輸卵管中。19天后子代出生。觀察到的妊娠率為100％，而相比較原核注射為75％。
用eGFP和CMV診斷探針作Souther印跡分析來(lái)篩檢檢注射3周時(shí)產(chǎn)生的后代。與用原核注射≤1％-20％的產(chǎn)率相比，此法獲得的基因修飾后代比率為65％。表2小結(jié)了本發(fā)明的結(jié)果。
圖3證明本發(fā)明的方法和組合物能產(chǎn)生各基礎(chǔ)動(dòng)物的個(gè)體品系。圖3A顯示第一批eGFP轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)動(dòng)物117_040(其與野生型小鼠(BALB/cJ)交配)之一的后代(A一代)的尾尖制備的基因組DNA。用BamHI限制性2性消化該基因組DNA，要0.8％瓊脂糖凝膠上跑電泳(上圖)并標(biāo)準(zhǔn)方法作Southern印跡轉(zhuǎn)移。該凝膠上的陽(yáng)性對(duì)照是用AsnI，StuI和Alw44I限制性酶消化并作雙凝膠純真化的PeGFP-C2(Clontech)。
圖3B提供32P標(biāo)記分離自用Eco47III和EcoRI消化的PeGFP-C2(Clontech)的eGFP(∽750bp)探測(cè)，并雙凝膠純化后的Southern印跡結(jié)果。該southern圖象中所見子代的眾多分離模式有效證明，此技術(shù)能產(chǎn)生各基礎(chǔ)動(dòng)物的個(gè)體品系。此種情況約有12種不同的獨(dú)立整合模式。
Southern印跡自顯影上的剪箭頭(圖3B)顯示小鼠尾活檢中表達(dá)eGFP的共同條帶模式和轉(zhuǎn)基因的整合。圖3B的星號(hào)代表尾部作活檢小鼠用共聚焦顯微鏡(BioRadViewscan DVD250低激光強(qiáng)度，488nm激光線，4倍目鏡)分析eGFP熒光。圖3C提供的圖象是共聚焦圖象，顯示清晰的熒光。共聚焦圖的陰性對(duì)照是陰性同窩交配基因型A一代小鼠。
表2轉(zhuǎn)運(yùn)載體要小鼠和大鼠品系中轉(zhuǎn)基因的效率 用作胚胎供者的小鼠或大鼠品系。[2]卵黃周隙注射轉(zhuǎn)運(yùn)載體顆粒的受精卵數(shù)。[3]轉(zhuǎn)移到假孕代孕母小鼠或大鼠有胚胎數(shù)。[4]代孕鼠妊娠結(jié)束時(shí)出生的幼鼠數(shù)。[5]每次基因轉(zhuǎn)移胚胎操作出生的幼鼠百分率。[6]隨后用Southern印跡分析基因型出生幼鼠的數(shù)目。[7]鑒定到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物數(shù)。[8]每種基因型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的百分率。[9]小鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)小結(jié)。[10]大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)小結(jié)。[11]大鼠和小鼠綜合的總效率。
本說(shuō)明書提到的所有出版物和專利申請(qǐng)表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平。所有出版物和專利申請(qǐng)以同等程度納入本文作參考，如同各出版物或?qū)＠暾?qǐng)具體和單獨(dú)納入本文作參考那樣。
雖然以上通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例在某種詳細(xì)程度上說(shuō)明了本發(fā)明，但顯然或在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些修改和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種將感興趣的核苷酸序列整合入脊椎動(dòng)物基因組中的方法，基特征在于，所述方法包括a)提供具有胞質(zhì)膜的早期胚胎；和b)使所述胞質(zhì)膜與含有至少一種含感興趣的核苷酸序列的第一慢病毒載體的組合物接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中a)所述早期胚胎還含有透明帶，所述透明帶和所述胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙；和b)與所述胞質(zhì)膜接觸，將所述組合物導(dǎo)入所述卵黃周隙。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述早期胚胎是受精卵母細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述早期胚胎選自2細(xì)胞胚、4細(xì)胞胚、8細(xì)胞胚和囊胚。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中含第一慢病毒的所述組合物通過(guò)顯微注射被導(dǎo)入卵黃周隙。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述感興趣的第一核苷酸序列被整合入受精卵母細(xì)胞的基因組中。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述感興趣的第一核苷酸序列編碼一多肽。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一慢病毒載體衍生自選自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一慢病毒載體是一種轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體是慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脊椎動(dòng)物選自小鼠、兔、綿羊、牛、鳥類和大鼠。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物還含有第二慢病毒載體，該載體含有感興趣的第二核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中第一和第二慢病毒載體衍生自選自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中第一和第二慢病毒載體是病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體是慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括在充許形成植入前胚胎的條件下培養(yǎng)該早期胚胎。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，所述方法還包括將所述植入前胚胎轉(zhuǎn)移到受者脊椎動(dòng)物中并使所述植入前胚胎發(fā)育成為至少一個(gè)脊椎動(dòng)物。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中a)所述早期胚胎還含有透明帶，所述透明帶和胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙，和b)與所述胞質(zhì)膜接觸包括將至少含有所述含感興趣的第一核苷酸序列的第一慢病毒載體的組合物導(dǎo)入所述卵黃周隙。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述早期胚胎是受精卵母細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述早期胚胎是2細(xì)胞胚、4細(xì)胞胚、8細(xì)胞胚和囊胚。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，所述方法還包括將所述植入前胚胎轉(zhuǎn)移到受者脊椎動(dòng)物中并使所述植入前胚胎發(fā)育成為至少一個(gè)基因修飾的脊椎動(dòng)物。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述含第一慢病毒載體的組合物通過(guò)顯微注射被導(dǎo)入卵黃周隙。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述感興趣的第一核苷酸序列被整合入受精卵母細(xì)胞的基因組中。
24.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述組合物還含有第二慢病毒載體，該載體含感興趣的第二核苷酸序列。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，所述方法還包括將所述植入前胚胎轉(zhuǎn)移到受者脊椎動(dòng)物中并使所述植入前胚胎發(fā)育成為至少一個(gè)基因修飾的脊椎動(dòng)物。
26.一種組合物，所述組合物含有分離的早期胚胎和有效濃度的至少一種含感興趣的核苷酸序列的第一慢病毒載體，其特征在于，所述早期胚胎來(lái)自非人脊椎動(dòng)物。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述早期胚胎是受精卵母細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述早期胚胎是2細(xì)胞胚、4細(xì)胞胚、8細(xì)胞胚和囊胚。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中a)所述分離的早期胚胎還含有透明帶，所述透明帶和所述胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙；和b)所述慢病毒載體在所述卵黃周隙中。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述感興趣的第一核苷酸序列編碼一多肽。
31.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述慢病毒載體衍生自選自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
32.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述慢病毒載體是轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體是慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
34.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述非人脊椎動(dòng)物選自小鼠、兔、綿羊、牛、鳥類和大鼠。
35.如權(quán)利要求26所述的方法，該組合物還含有有效濃度的第二慢病毒載體，所述載體含有感興趣的第二核苷酸序列。
36.一種將感興趣的核苷酸序列整合入脊椎動(dòng)物基因組中的方法，其特征在于，所述方法包括a)提供分離的含胞質(zhì)膜的卵母細(xì)胞，和b)使所述胞質(zhì)膜與含至少一種含感興趣的核苷酸序列的第一慢病毒載體相接觸。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中a)所述分離卵母細(xì)胞還含有透明帶，所述透明帶和所述胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙；和b)與所述胞質(zhì)膜接觸，將所述組合物導(dǎo)入所述卵黃周隙。
38.一種組合物，所述組合物含有分離的早期胚胎和有效濃度的至少一種含感興趣的核苷酸序列的第一慢病毒載體，其特征在于，所述卵母細(xì)胞來(lái)自脊椎動(dòng)物。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其中a)所述分離的卵母細(xì)胞還含有透明帶，所述透明帶和所述胞質(zhì)膜界定了卵黃周隙；和b)所述慢病毒載體在所述卵黃周隙中。
40.一種將感興趣的核苷酸序列整合入脊椎動(dòng)物基因組中的方法，其特征在于，所述方法包括a)提供分離的含胞質(zhì)膜的囊胚，和b)使所述胞質(zhì)膜與含至少一種含感興趣的核苷酸序列的慢病毒載體相接觸。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述慢病毒載體衍生自選自人免疫缺陷病毒和猴免疫缺陷病毒的病毒。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述慢病毒載體是轉(zhuǎn)運(yùn)病毒載體。
43.一種組合物，所述組合物含有分離的囊胚和有效濃度的至少一種含感興趣的核苷酸序列的第一慢病毒載體，其特征在于，所述桑椹胚來(lái)自非人脊椎動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供將興趣核苷酸序列整合入基因組中的方法和組合物。具體說(shuō)，本發(fā)明的方法包括使慢病毒載體在允許該病毒載體進(jìn)入并隨后讓感興趣的核苷酸序列整合入基因組的條件下，與卵母細(xì)胞、早期胚胎或囊胚接觸。本方法還包括在允許形成植入前胚胎的條件下，培養(yǎng)與該慢病毒載體接觸過(guò)的卵母細(xì)胞或胚胎。可將該植入前胚胎思想性移到受者脊椎動(dòng)物中，讓其發(fā)育成至少一個(gè)基因修飾的動(dòng)物。本發(fā)明的方法和組合物因而能產(chǎn)生基因修飾的動(dòng)物，具體是脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1633495SQ02828246
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者R·拉馬哈德蘭, F·科恩特金, J·維基菲爾德 申請(qǐng)人:奧茲基因控股有限公司