專利名稱：天麻高效組織培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)方法，特指一種天麻高效組織培養(yǎng)方法。
天麻自身缺乏同化外界元素和獲得礦質(zhì)營養(yǎng)的能力。外界礦質(zhì)營養(yǎng)大部分靠蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)獲得。蜜環(huán)菌可以提供天麻全生育期的生長發(fā)育的營養(yǎng)。通過同位素示蹤及放射自顯影，可以看出，天麻自身能夠吸收葡萄糖、氮、磷、鉀等營養(yǎng)。常規(guī)天麻的栽培需要接上蜜環(huán)菌的菌材；沒有菌材，天麻不可能生長，甚至腐爛。天麻與菌材伴生可使天麻正常地生長發(fā)育。天麻吸收礦質(zhì)營養(yǎng)的關鍵就是蜜環(huán)菌的“泵”作用。大部分金屬元素的獲得主要靠蜜環(huán)菌的“泵”作用，只有少數(shù)金屬元素可被天麻細胞直接吸收。因而天麻的工廠化生產(chǎn)存在很多困難。
植物生理學通訊，1996，32(3)，劉能俊“天麻的離體培養(yǎng)”；中草藥，2001，32(5)，蔡永萍等“天麻的組織培養(yǎng)及快速繁殖”，雖然也成功地實現(xiàn)了試管天麻的增殖，但是她們培養(yǎng)出的天麻僅是數(shù)量的增加，天麻的重量和體積增大的效果有限，個體重量一般不超過10g，不能算完整意義上的天麻組織培養(yǎng)。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的方法為從田間取回正在生長的天麻，用自來水沖洗，去除泥土，用70％醫(yī)用酒精棉球擦一遍。其特征在于用飽和的漂白粉消毒15分鐘，再用0.1％的HgCl2消毒10分鐘，再用無菌水沖洗4～6次，在超凈工作臺上用解剖刀將莖尖切成長0.5～1.0cm左右的小塊，接種到含有天冬氨酸及谷氨酸或谷氨酸鈉二者之一的培養(yǎng)基中，置于25±2℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。
其中較佳的技術方案為培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 10～1000mg/L+Asp 5～200mg/L，含3％蔗糖，0.8％瓊脂，pH值為5.5～6.0。其中NAA為奈乙酸；6-BA為6-芐基腺嘌呤；Glu為谷氨酸，Asp為天冬氨酸；或培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu-Na 10～1000mg/L+Asp 5～200mg/L。其中Glu-Na為谷氨酸鈉。
從田間取回正在生長的天麻為小白麻。
小白麻培養(yǎng)20-30天左右形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，20-30天后小米麻開始生長，50-60天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻，實現(xiàn)了天麻的完全組織培養(yǎng)。
上述MS培養(yǎng)基的成分按常規(guī)為硝酸銨1650mg/L，硝酸鉀1900mg/L，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4)170mg/L，氯化鈣(CaCl2·2H2O)440mg/L，硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L，硼酸(H3BO3)6.2mg/L，碘化鉀(KI)0.83mg/L，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L，硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg/L，氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025mg/L，硫酸鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg/L，Na2EDTA37.3mg/L，甘氨酸0.025mg/L，鹽酸硫胺素0.4mg/L，鹽酸吡哆素0.5mg/L，煙酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
本發(fā)明利用蜜環(huán)菌起“泵”作用的物質(zhì)是帶負電荷的氨基酸，且主要是天冬氨酸和谷氨酸的原理，通過提供含這些成分的培養(yǎng)液，使天麻自身可從外界環(huán)境獲得營養(yǎng)，促進其生長增殖，實現(xiàn)天麻的完全組織培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點目前還沒有人成功地培養(yǎng)出“大天麻”。它根據(jù)天麻的營養(yǎng)原理，尤其是使用了谷氨酸或味精以及天冬氨酸，代償了蜜環(huán)菌的功能，從而使試管培養(yǎng)“大天麻”得以實現(xiàn)。本發(fā)明具有設備簡單，成本低和易操作等優(yōu)點。
實施例1 培養(yǎng)基1為1/2MS+6-BA2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 10mg/L+Asp 5mg/L。
白麻培養(yǎng)28天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基1中，27天后小米麻開始生長，55天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-15g的大白麻。
實施例2 培養(yǎng)基2為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 100mg/L+Asp 5mg/L。
白麻培養(yǎng)23天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基2中，22天后小米麻開始生長，51天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻。
實施例3 培養(yǎng)基3為1/2MS+6 BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 1000mg/L+Asp 5mg/L。
白麻培養(yǎng)22天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基3中，22天后小米麻開始生長，53天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-18g的大白麻。
實施例4 培養(yǎng)基4為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 100mg/L+Asp 20mg/L。
白麻培養(yǎng)21天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基4中，21天后小米麻開始生長，51天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻。
實施例5 培養(yǎng)基5為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 100mg/L+Asp 500mg/L。
白麻培養(yǎng)21天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基5中，21天后小米麻開始生長，51天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻。
實施例6 培養(yǎng)基6為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 1000mg/L+Asp 20mg/L。
白麻培養(yǎng)26天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基6中，25天后小米麻開始生長，56天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻。
實施例7 培養(yǎng)基7為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu-Na 150mg/L+Asp 20mg/L。
白麻培養(yǎng)23天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基7中，23天后小米麻開始生長，49天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻。
實施例8 培養(yǎng)基8為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu-Na 1000mg/L+Asp20mg/L。
白麻培養(yǎng)22天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基9中，22天后小米麻開始生長，50天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-20g的大白麻。
實施例9 培養(yǎng)基9為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu-Na 10mg/L+Asp 20mg/L。
白麻培養(yǎng)26天形成新米麻。分離小米麻無菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基9中，29天后小米麻開始生長，59天后可長成3-5cm的小白麻，150天后可長成10-12g的大白麻。
權利要求
1.天麻高效組織培養(yǎng)方法，從田間取回正在生長的天麻，用自來水沖洗，去除泥土，用70％醫(yī)用酒精棉球擦一遍，其特征在于用飽和的漂白粉消毒15分鐘，再用0.1％的HgCl2消毒10分鐘，再用無菌水沖洗4～6次，在超凈工作臺上用解剖刀將莖尖切成長0.5～1.0cm左右的小塊，接種到含有天冬氨酸及谷氨酸或谷氨酸鈉二者之一的培養(yǎng)基中，置于25±2□培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的天麻高效組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu 10～1000mg/L+Asp 5～200mg/L，含3％蔗糖，0.8％瓊脂，pH值為5.5～6.0。
3.根據(jù)權利要求1所述的天麻高效組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L+Glu-Na 10～1000mg/L+Asp 5～200mg/L。
4.根據(jù)權利要求1所述的天麻高效組織培養(yǎng)方法，其特征在于從田間取回正在生長的天麻為小白麻。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)方法，特指一種天麻高效組織培養(yǎng)方法。從田間取回正在生長的天麻，用自來水沖洗，去除泥土，用70％醫(yī)用酒精棉球擦一遍。其特征在于用飽和的漂白粉消毒15分鐘，再用0.1％的HgCl
文檔編號A01H4/00GK1430879SQ0311273
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月23日 優(yōu)先權日2003年1月23日
發(fā)明者吳沿友, 劉能俊, 李萍萍 申請人:江蘇大學