專利名稱：小麥赤霉病抗性主效qtl連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小麥育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是選擇利用小麥抗赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，以提高小麥抗赤霉病育種的效率。
背景技術(shù)：
由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum，Schw)引起的小麥赤霉病是一個(gè)世界范圍內(nèi)的病害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量及小麥地籽粒品質(zhì)。它也是困擾我國(guó)小生產(chǎn)的重要因素之一。在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、華南冬麥區(qū)和東北麥區(qū)，受害面積超過1億畝，占全國(guó)小麥總面積的四分之一，隨著全球變暖，耕作制度及方式的變化，小麥赤霉病發(fā)病范圍逐漸擴(kuò)展。在中國(guó)正向淮海和黃河流域擴(kuò)展。在美國(guó)的中部、北部和加拿大的南部等地區(qū)，近年來(lái)小麥赤霉病擴(kuò)展迅猛。在歐洲、南美洲也呈擴(kuò)展趨勢(shì)，因此小麥赤霉病已成為全世界關(guān)注的世界病害。
幾十年來(lái)，中外科學(xué)家一直努力致力于赤霉病的遺傳分析和抗病育種研究，但收效甚微，主要是由于多基因控制及環(huán)境的影響給應(yīng)用常規(guī)方法篩選抗病種質(zhì)選育抗病品種帶來(lái)了很大的困難。分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗病分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，給小麥赤霉病育種家?guī)?lái)了一線光明。近年來(lái)，對(duì)蘇麥3號(hào)及其衍生品種(系)的抗赤QTL分析，研究得比較多。Waldron和Anderson等采用RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism)和SSR(Simple Sequence Repeat)等分子標(biāo)記技術(shù)在赤霉病抗源蘇麥3號(hào)及其衍生品種(系)的3B短臂上發(fā)現(xiàn)一抗赤性主效QTL(Quantitative Trait Loci)，該位點(diǎn)最高可解釋41.6％表型變異。Bai和Zhou等以及Buerstmayr等也對(duì)不同蘇麥3號(hào)衍生系的遺傳分離群體進(jìn)行分析，證實(shí)了3B染色體主效抗赤QTL的存在。本課題組通過已有的不同赤霉病抗源的重組自交系群體，構(gòu)建蘇麥3號(hào)、望水白、894037 3B染色體遺傳連鎖圖并進(jìn)行QTL分析，發(fā)現(xiàn)不同抗源3B染色體短臂都存在一個(gè)主效抗赤QTL位點(diǎn)以及與該主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。使用與某一特定抗源抗赤性主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以不受環(huán)境條件的影響，對(duì)該特定抗源的后代及其衍品種(系)在早代苗期進(jìn)行篩選，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率。
小麥品系寧894037(江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，p129-134)是本實(shí)驗(yàn)室用揚(yáng)麥3號(hào)經(jīng)幼穗培養(yǎng)獲得的體細(xì)胞無(wú)性系突變體，其抗赤性已接近或達(dá)到抗源蘇麥3號(hào)的水平，而農(nóng)藝性狀明顯好于蘇麥3號(hào)，已被育種家所用；目前尚未有與其主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供小麥抗赤霉病抗性主效QTL的分子標(biāo)記及其在小麥抗赤霉病育種中的應(yīng)用方法，用以界定與894037的赤霉病抗性主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記，通過檢測(cè)這些分子標(biāo)記可以預(yù)測(cè)小麥植株的赤霉病抗性，加快抗赤霉病小麥的選擇進(jìn)度，在生產(chǎn)上用于檢測(cè)小麥品種的赤霉病抗性水平。
本發(fā)明提供了與赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的
a)小麥赤霉病抗病品種寧894037(♀)與小麥赤霉病感病品種(♂)雜交，得到雜種F1；
b)由雜種F1自花授粉獲得F2多個(gè)子代，通過單粒傳(SSD)方法獲得F8代重組自交系；
c)對(duì)重組自交系每個(gè)株系進(jìn)行分子標(biāo)記分析，并對(duì)重組自交系每個(gè)株系的基因型進(jìn)行描述；具體方法分離重組自交系每個(gè)株系的基因組DNA，采用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染后，獲得每個(gè)株系基因型；
d)基于孟德爾和摩爾根遺傳連鎖和分離規(guī)律，用獲得的分子標(biāo)記資料構(gòu)建小麥遺傳連鎖e)測(cè)定重組自交系每個(gè)株系的赤霉病抗性；
f)將重組自交系每個(gè)株系的赤霉病抗性與小麥遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，QTL分析采用MapQTL4.0進(jìn)行，先進(jìn)行Kruskal-Wallis(K-W)測(cè)驗(yàn)，P＜0.005表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖，可能存在QTL，然后對(duì)可能存在QTL的區(qū)間進(jìn)行區(qū)間作圖(Interval Mapping)和多QTL作圖(MQM Mapping)分析，以2.5為L(zhǎng)OD閾值，大于2.5說(shuō)明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，從而確定與抗源寧894037赤霉病抗性主效QTL連鎖的SSR分子標(biāo)記Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110。
上述小麥赤霉病抗性QTL連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用，包括將分子標(biāo)記Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110用于小麥品種或品系的基因型檢測(cè)，以判斷某品種或品系是否具有赤霉病抗性
a)通過以寧894037及其衍生品種(系)為父本或母本與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上；
b)分離單個(gè)小麥植株的基因組DNA，檢測(cè)每個(gè)小麥植株是否存在與赤霉病主效抗性QTL相連鎖的分子標(biāo)記；如有2個(gè)以上分子標(biāo)記同時(shí)出現(xiàn)，則預(yù)測(cè)該小麥品種的赤霉病性達(dá)到抗的水平。
本發(fā)明小麥抗赤霉病主效QTL的分子標(biāo)記及其在小麥抗赤霉病育種中的應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)在于克服常規(guī)抗赤霉病育種周期長(zhǎng)、效率低的不足，發(fā)揮分子標(biāo)記輔助選擇的特長(zhǎng)，發(fā)展一種高效、快速的育種新技術(shù)。例如利用常規(guī)抗赤霉病育種方法選育一個(gè)新品種或新品系，往往需要6-8年，甚至更長(zhǎng)時(shí)間，同時(shí)每代都需要對(duì)群體進(jìn)行抗性鑒定，工作量很大。此外，抗赤霉病鑒定又往往受環(huán)境條件的影響，而分子標(biāo)記輔助選擇不受環(huán)境條件的影響，在低世代就可以對(duì)赤霉病抗性進(jìn)行選擇，將大大減少育種家的工作量，提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。


圖1是寧894037 3B染色體及QTL分析LOD值分布圖；左邊為3B染色體遺傳連鎖圖，標(biāo)記間的圖距已用數(shù)據(jù)標(biāo)出；右邊的曲線圖為QTL的LOD分布圖，虛線為2.5閾值。
具體實(shí)施例方式材料和方法1.寧894037/Alondra重組自交系群體構(gòu)建及接種抗赤鑒定
采用寧894037與小麥感赤霉病品種阿龍達(dá)(Alondra)雜交產(chǎn)生F1雜種，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2后代，F(xiàn)2的219個(gè)單株隨機(jī)選取一粒種子種植，采用單粒傳的方法，繁殖到F8代，產(chǎn)生219個(gè)家系。
赤霉病抗性鑒定均采用單花滴注方法，禾谷鐮刀菌分生孢子懸浮液濃度為50000個(gè)/ml，選取剛開花的穗子，于中部小花滴加10ul孢子懸浮液，溫室彌霧保濕3天，田間則采用套袋或人工彌霧保濕方法，每個(gè)系接種10～12穗，于接種后21天，調(diào)查病小穗率。病小穗率＝(發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù))×100％
寧894037/Alondra重組自交系群體于2000年和2001年分別在美國(guó)普度大學(xué)試驗(yàn)地和溫室進(jìn)行赤霉病抗性鑒定。2.寧894037 3B染色體的遺傳圖構(gòu)建及QTL分析
在寧894037 3B染色體上有9個(gè)SSR標(biāo)記，覆蓋87.1cM。K-W測(cè)驗(yàn)分析顯示，位于3B短臂的SSR標(biāo)記Xgwm389、BAC075、Xgwm533、BAC133、Xgwm493以及BARC102在試驗(yàn)田和溫室的赤霉病抗性鑒定中均與抗性緊密連鎖，在此連鎖群上可能存在赤霉病抗性QTL。采用區(qū)間作圖分析，在BARC075和BARC102的之間確實(shí)發(fā)現(xiàn)一QTL位點(diǎn)，該QTL的LOD值在12.35～20.11之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過LOD2.5閾值，可以解釋28.3％～42.8％的抗赤性變異；復(fù)合區(qū)間作圖表明，該QTL確切位置在BARC133與Xgwm493之間，該區(qū)間只有5個(gè)cM，最高可以解釋37.9％的赤霉病抗性。實(shí)施例1
小麥赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的
a)小麥赤霉病抗病品種寧894037(♀)與小麥赤霉病感病品種阿龍達(dá)(Alondra)(♂)雜交，得到雜種F1。
b)由雜種F1自花授粉獲得F2多個(gè)子代，通過單粒傳(SSD)方法獲得F8代重組自交系。
c)對(duì)重組自交系每個(gè)株系進(jìn)行分子標(biāo)記分析，并對(duì)重組自交系每個(gè)株系的基因型進(jìn)行描述；具體方法分離重組自交系每個(gè)株系的基因組DNA，采用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染后，獲得每個(gè)株系基因型。
d)基于孟德爾和摩爾根遺傳連鎖和分離規(guī)律，用獲得的分子標(biāo)記資料構(gòu)建小麥遺傳連鎖圖。
e)測(cè)定重組自交系每個(gè)株系的赤霉病抗性。
f)將重組自交系每個(gè)株系的赤霉病抗性與小麥遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，QTL分析采用MapQTL4.0進(jìn)行，先進(jìn)行Kruskal-Wallis(K-W)測(cè)驗(yàn)，P＜0.005表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖，可能存在QTL，然后對(duì)可能存在QTL的區(qū)間進(jìn)行區(qū)間作圖(Interval Mapping)和多QTL作圖(MQM Mapping)分析，以2.5為L(zhǎng)OD閾值，大于2.5說(shuō)明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，從而確定與抗源寧894037赤霉病抗性主效QTL連鎖的SSR分子標(biāo)記Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110。
用小麥基因組DNA，采用SSR引物BARC075F5’-AGGGTTACAGTTTGCTCTTTTAC-3’，BARC075R5’-CCCGACGACCTATCTATACTTCTCTA-3’、Xgwm533F5’-AAGGCGAATCAAACGGAATA-3’，Xgwm533R5’-GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC-3’及BA RC133F5’-AGCGCTCGAAAAGTCAG-3’，BARC 133R5’-GGCAGGTCCAACTC CAG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得三個(gè)分子標(biāo)記，大小分別為110bp、130bp、115bp。
實(shí)施例2
利用篩選到的與寧894037赤霉病抗性主效QTL相連鎖的分子標(biāo)記對(duì)育種高代材料進(jìn)行初步檢測(cè)，以檢測(cè)該方法在小麥赤霉病抗性分子標(biāo)記輔助選擇中的實(shí)用價(jià)值。選取6個(gè)以寧894037及其衍生品種(系)為父本或母本的高代育種材料或小麥品種，分離其基因組DNA，然后用SSR引物Xgwm533、BARC075和BARC133對(duì)這些DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳后根據(jù)DNA帶的大小或有無(wú)來(lái)確定是否存在相應(yīng)的標(biāo)記，如同時(shí)存在2-3個(gè)標(biāo)記，說(shuō)明該品種或品系赤霉病抗性達(dá)到“抗”的水平，不存在則是感病的，同時(shí)用赤霉病抗性接種鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
附表3給出的是高代品系或品種的DNA測(cè)試的預(yù)測(cè)結(jié)果以及赤霉病接種鑒定結(jié)果，從表中我們可以發(fā)現(xiàn)，SSR標(biāo)記Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110與抗赤鑒定結(jié)果吻合度很好，以上結(jié)果說(shuō)明分子標(biāo)記輔助選擇是完全可行的。實(shí)施例3
獲得的與寧894037赤霉病抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，也在寧894037與阿龍達(dá)(Alondra)雜交的F10后代的部分植株進(jìn)行了赤霉病抗性預(yù)測(cè)，結(jié)果見附表4，預(yù)測(cè)非常準(zhǔn)確。
現(xiàn)將以上各實(shí)施例涉及的分析測(cè)試結(jié)果在下面集中列出
附表1Kruskal-Wallis測(cè)驗(yàn)結(jié)果；
附表2894037/Alondra群體赤霉病抗性QTL分析結(jié)果；
附表3用與寧894037主QTL緊密連鎖分子標(biāo)記檢測(cè)以寧894037及其衍生品種
(系)為抗源的小麥品系的赤霉病抗性；
附表4用與寧894037主效QTL緊密連鎖分子標(biāo)記預(yù)測(cè)寧894037/Alondra的雜
交后代(F10)的赤霉病抗性。附表1
K值Kruskal-Wallis測(cè)驗(yàn)分析值，值越大表明與赤霉病抗性越相關(guān)。
P值表示與赤霉病抗性相關(guān)的顯著程度，P＜0.005表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖。
附表2
分析方法 標(biāo)記區(qū)間 大田 溫室 大田/溫室
LODVE LOD VE LOD VE
區(qū)間作圖 BARC075
18.43 4012.3528.320.1142.8
-BARC102
復(fù)合區(qū)間作圖 BARC133
17.77 35.8 12.3625.319.5837.9
-Xgwm493LOD＝對(duì)數(shù)幾率值(反映QTL的幾率)VE＝％由QTL所造成的表型變化
附表3
+表示有SSR標(biāo)記(Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110)的條帶，
-表示沒有SSR標(biāo)記(Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110)的條帶附表4
+表示有SSR標(biāo)記(Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110)的條帶，
-表示沒有SSR標(biāo)記(Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110)的條帶。
權(quán)利要求
1、一種小麥赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，是通過下列步驟獲得
a)得到小麥赤霉病抗病品系寧894037(♀)和小麥赤霉病感病品種(♂)的雜種F1；
b)由雜種F1自花授粉獲得F2多個(gè)子代，通過單粒傳(SSD)方法獲得F8代重組自交系；
c)對(duì)重組自交系每個(gè)株系進(jìn)行分子標(biāo)記分析，并對(duì)重組自交系每個(gè)株系的基因型進(jìn)行描述；具體方法分離重組自交系每個(gè)株系的基因組DNA，采用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，經(jīng)銀染后，獲得每個(gè)株系基因型；
d)基于孟德爾和摩爾根遺傳連鎖和分離規(guī)律，用獲得的分子標(biāo)記資料構(gòu)建遺傳連鎖e)測(cè)定重組自交系每個(gè)株系的赤霉病抗性；
f)將重組自交系每個(gè)株系的赤霉病抗性與小麥遺傳連鎖圖中的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖和QTL分析，QTL分析采用MapQTL4.0進(jìn)行，先進(jìn)行Kruskal-Wallis(K-W)測(cè)驗(yàn)，P＜0.005表明該標(biāo)記與赤霉病抗性緊密連鎖，可能存在QTL，然后對(duì)可能存在QTL的區(qū)間進(jìn)行區(qū)間作圖(Interval Mapping)和多QTL作圖(MQM Mapping)分析，以2.5為L(zhǎng)OD閾值，大于2.5說(shuō)明存在一個(gè)QTL位點(diǎn)，從而確定與抗源寧894037赤霉病抗性主效QTL連鎖的SSR分子標(biāo)記Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的所述小麥赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于所述的小麥赤霉病抗病品系寧894037是用揚(yáng)麥3號(hào)經(jīng)幼穗培養(yǎng)獲得的體細(xì)胞無(wú)性系突變體。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述小麥赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于用小麥基因組DNA，采用SSR引物BARC075F5’-AGGGTTACAGTTTGCTCTTT TAC-3’，BARC075R5-CCCGACGACCTATCTATACTTCTCTA-3’、Xgwm533F5’-AA GGCGAATCAAACGGAATA-3’，Xgwm533R5’-GTTGCTTTAGGGGAAAAGCC-3’及BARC133F5’-AGCGCTCGAAAAGTCAG-3’，BARC 133R5’-GGCAGG TCCAACTCC AG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在6％(100ml聚丙烯酰胺膠溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉雙丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得三個(gè)分子標(biāo)記，大小分別為110bp、130bp、115bp。
4、一種如權(quán)利要求1-3之一所述分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于
a)將通過以寧894037及其衍生品種(系)為父本或母本與其他小麥雜交并繁衍至F2代以上；
b)分離單個(gè)小麥植株的基因組DNA，檢測(cè)每個(gè)小麥植株是否存在與赤霉病主效抗性QTL相連鎖的分子標(biāo)記；如有2個(gè)以上分子標(biāo)記同時(shí)出現(xiàn)，則預(yù)測(cè)該小麥品種的赤霉病性達(dá)到抗的水平。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所上所述分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于將分子標(biāo)記Xgwm533-130、BARC133-115、BARC075-110作為輔助選擇標(biāo)記在以寧894037及其衍生品種(系)為抗源的小麥赤霉病育種中進(jìn)行應(yīng)用，通過其基因型來(lái)判斷其衍生品種或品系是否具有赤霉病抗性。
6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所用寧894037衍生品種或品系，是指以寧894037為親本，通過常規(guī)雜交、或采用組織培養(yǎng)、或采用花藥培養(yǎng)、或采用玉米與小麥雜交誘導(dǎo)單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種或品系。
全文摘要
本發(fā)明涉及小麥赤霉病抗性主效QTL連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。該技術(shù)利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)894037/AlondraF8重組自交系群體進(jìn)行分析，結(jié)合赤霉病抗性鑒定資料，采用區(qū)間作圖和復(fù)合區(qū)間作圖方法對(duì)此群體進(jìn)行分析，在寧894037的3B染色體上檢測(cè)到主效QTL的存在，可解釋42.8％的赤霉病抗性。寧894037主效QTL分子標(biāo)記Xgwm533－130、BARC133－115、BARC075－110的獲得將加快我們的抗病育種進(jìn)程，提高抗病育種選擇效率。對(duì)以寧894037及其衍生品種(系)為父本或母本通過常規(guī)的雜交、回交，或采用生物技術(shù)等手段獲得的小麥品種或品系進(jìn)行分子標(biāo)記的檢測(cè)，選育出抗赤霉病的小麥品種(系)。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1459226SQ03112779
公開日2003年12月3日 申請(qǐng)日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者任麗娟, 陸維忠, 沈曉蓉, 周淼平, 張旭, 馬鴻翔 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院