專利名稱：澳洲青蘋快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生，以及未分化的人類、動(dòng)物或植物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到澳洲青蘋的快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
澳洲青蘋(Granny Smith Shoots)是我國(guó)70年代由阿爾巴尼亞引進(jìn)的品種，果實(shí)色澤翠綠、汁液多、耐貯藏，是加工、鮮食兼用的優(yōu)良品種，曾在許多果區(qū)推廣，但由于果味太酸在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)出售困難而被放棄。近年隨著我國(guó)加入WTO以及國(guó)際市場(chǎng)高酸蘋果和高酸果汁的流行，澳洲青蘋鮮果外貿(mào)出口前景好，以其為原料的加工果汁不需人工調(diào)酸，酸度即可達(dá)4.5以上，不但價(jià)格高而且深受外商歡迎，澳洲青蘋的需求量也正在迅速擴(kuò)大，呈供不應(yīng)求趨勢(shì)。
采用植物組織培養(yǎng)方法可以在短期內(nèi)快速繁殖多種植物，不僅繁殖速率極高，且因?yàn)槠涫菬o(wú)性繁殖，可以保持原繁殖母株的優(yōu)良性狀，近年來(lái)在生產(chǎn)上應(yīng)用越來(lái)越廣。植物組織培養(yǎng)方法是利用植物細(xì)胞的全能性，即組成植物體的每一個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育成為一個(gè)完整植株的潛在能力，采取植物體上的單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、分生組織或器官的一部分，通過(guò)人工配制不同營(yíng)養(yǎng)成分和激素的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)并調(diào)控其發(fā)育，使這些細(xì)胞、組織等形成成千上萬(wàn)個(gè)小植株并且保持了母本植株的全部的優(yōu)良性狀，這種方法可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的組培苗，并能在人工控制條件的車間內(nèi)一年四季進(jìn)行，因而可以實(shí)現(xiàn)種苗繁殖的工廠化生產(chǎn)，在較小的面積內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，無(wú)需占用大量土地。
上述的植物組織培養(yǎng)方法，先培養(yǎng)成無(wú)根苗，再將無(wú)根苗在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，長(zhǎng)苗和生根在兩種不同培養(yǎng)基中進(jìn)行，在繁殖生根培養(yǎng)和煉苗階段，通常先在室內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間，然后移到自然光下進(jìn)行長(zhǎng)苗和煉苗。增加了繁殖生根培養(yǎng)和煉苗時(shí)間。
澳洲青蘋組培苗生根困難，移栽成活率低使其一直無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，至今國(guó)內(nèi)外尚未見到利用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)澳洲青蘋苗的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題以及解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是它包括如下步驟(1)組培苗的制備剪取大田栽培的盛果期優(yōu)良單株的無(wú)病蟲害的健壯營(yíng)養(yǎng)枝為母本，在光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為75％～90％的溫室保濕沙培，利用新生長(zhǎng)的幼嫩枝條作為外植體，然后取澳洲青蘋的幼嫩莖段，流水沖洗干凈，濾紙吸干。在超凈工作臺(tái)上將取下的莖尖或側(cè)芽在75％酒精中浸泡10～30秒，無(wú)菌水沖洗3次，每次5分鐘，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌5～15分鐘，用無(wú)菌水沖洗3～5次，每次5分鐘，用無(wú)菌濾紙吸干，切成帶1～2個(gè)芽的莖段，作為外植體扦插入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，該增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10～35g瓊脂粉 4～8g6-(芐胺基)嘌呤 0.1～0.5mg萘乙酸 0.08～0.12mg配制好的培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶裝25～35毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘，將培養(yǎng)瓶置于光照強(qiáng)度為3500～4500lx、溫度為20℃～30℃、濕度為70％～90％的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。選取繁殖8～30代的4～6cm高健壯組培苗為材料，切成長(zhǎng)1.4～1.6cm左右?guī)ы斞炕?～2個(gè)側(cè)芽的上部莖段和中部莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)。
(2)組培苗生根培養(yǎng)將(1)中切好的莖段放入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，所用的生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10～35g瓊脂粉 4～8g吲哚-3-丁酸 0.4～1mg萘乙酸 0.08～0.14mg或所用的生根培養(yǎng)基為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10～35g瓊脂粉 4～8g吲哚-3-丁酸 0.4～1mg萘乙酸 0.08～0.14mg多效唑 0.8～1.5mg將配制好的生根培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶25～35毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘，培養(yǎng)瓶移入溫度為18℃～22℃、濕度為70％～90％的暗室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)3～7天。
(3)長(zhǎng)苗煉苗培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶直接移入光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為75％～90％的溫室內(nèi)，每天光照9～11小時(shí)，馴化20～25天，打開瓶蓋，煉苗5～10天，開蓋煉苗時(shí)培養(yǎng)瓶加0.5～1.0厘米高的自來(lái)水防污保濕，當(dāng)苗高5～8厘米，根長(zhǎng)1～2.5厘米時(shí)進(jìn)行移栽。
(4)移栽取出(3)中經(jīng)過(guò)煉苗的幼苗，洗凈根上殘留的生根培養(yǎng)基，將根在含50ppm的萘乙酸泥漿中浸泡處理2小時(shí)，移入裝有營(yíng)養(yǎng)土的移栽容器中，移栽前澆足1/10MS基本培養(yǎng)基，上覆蓋塑料薄膜，保持濕度在70％～100％，7天后逐漸通風(fēng)，15天后揭膜，在此期間噴灑1/10MS基本培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)在光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為70％～90％的溫室內(nèi)，培養(yǎng)20～50天，在苗高15～20厘米，有8～15片葉時(shí)移栽入大田。
本發(fā)明的優(yōu)選增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 15～30g瓊脂粉 4～6g6-(芐胺基)嘌呤 0.2～0.4mg萘乙酸 0.09～0.11mg本發(fā)明的優(yōu)選生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 15～30g瓊脂粉 4～6g吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg萘乙酸 0.08～0.13mg本發(fā)明的優(yōu)選生根培養(yǎng)基也可以為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 15～30g瓊脂粉 4～6g吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg萘乙酸 0.08～0.13mg多效唑 0.8～1.2mg本發(fā)明的最佳增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g6-(芐胺基)嘌呤 0.3mg萘乙酸 0.1mg
本發(fā)明的最佳生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g吲哚-3-丁酸 0.7mg萘乙酸 0.1mg本發(fā)明的最佳生根培養(yǎng)基也可以為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g吲哚-3-丁酸 0.7mg萘乙酸 0.1mg多效唑 1mg本發(fā)明采用暗培養(yǎng)進(jìn)行組培苗的制備和組培苗生根培養(yǎng)促進(jìn)生根和培育壯苗，并在自然光下長(zhǎng)苗、長(zhǎng)根、煉苗同步進(jìn)行的組織培養(yǎng)方法，組培步驟采用了適合于澳洲青蘋快速繁殖的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，增殖和生根效果好，使澳洲青蘋生根率達(dá)79％以上，而且根系粗壯整齊，同時(shí)組培苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠，有效地節(jié)約了人力和物力，移栽成活率可達(dá)85.07％，為工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明組培方法具有簡(jiǎn)便易行、簡(jiǎn)化了程序、提高了工效、降低了成本等優(yōu)點(diǎn)，可用于澳洲青蘋的快速繁殖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)組培苗的制備原材料的預(yù)處理剪取大田栽培的盛果期優(yōu)良單株的無(wú)病蟲害的健壯營(yíng)養(yǎng)枝為母本，在溫室保濕沙培，利用新生長(zhǎng)的幼嫩枝條作為外植體，溫室條件為光照強(qiáng)度為800-8000lx，溫度20～25℃，濕度為75％～90％；取材取澳洲青蘋的幼嫩莖段，流水沖洗干凈，濾紙吸干；材料消毒在超凈工作臺(tái)上將取下的莖尖或側(cè)芽在75％酒精中浸泡10～30秒，無(wú)菌水沖洗3次，每次5分鐘，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌5～15分鐘，用無(wú)菌水沖洗3～5次，每次5分鐘，用無(wú)菌濾紙吸干，切成帶1～2個(gè)芽的莖段，作為外植體扦插入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
組培苗長(zhǎng)至4～6厘米時(shí)，可在超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌條件下，將苗取出，再切成帶1～2個(gè)芽的莖段，插入新配制的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖，如此反復(fù)，可實(shí)現(xiàn)苗木的快速繁殖，在短期內(nèi)獲得大量的無(wú)菌苗。組培苗的增殖培養(yǎng)在放有增殖培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。本實(shí)施例所用的增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g6-(芐胺基)嘌呤 0.3mg萘乙酸 0.1mg配制好的增殖培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶裝25～35毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘。將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)室內(nèi)的光照強(qiáng)度為3500～4500lx，溫度為20℃～30℃，濕度為70％～90％，每一次繼代培養(yǎng)使用新鮮配置的增殖培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)條件與第一代培養(yǎng)條件相同。選取繁殖8～30代的4～6cm高健壯組培苗為材料，切成長(zhǎng)1.4～1.6cm帶頂芽或1～2個(gè)側(cè)芽的上部莖段和中部莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)，下部莖段用于繁殖。實(shí)驗(yàn)表明上部莖段和中部莖段的生根率分別為78.85％和73.68％，是組培苗生根的最佳部位，而基部莖段生根率較低，作繁殖之用較好。
(2)組培苗生根培養(yǎng)將(1)中切好的莖段放入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，本實(shí)施例的生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g
瓊脂粉 4.5g吲哚-3-丁酸 0.7mg萘乙酸 0.1mg將配制好的生根培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶25～35毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘。培養(yǎng)瓶移入暗室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗室中溫度為18℃～22℃，濕度為70％～90％，暗培養(yǎng)可明顯促使組培苗生根，3～7天的暗培養(yǎng)促進(jìn)組培苗生根，平均生根率為79％～90％，平均根數(shù)為3～5條，且根系整齊健壯，并且在一定程度上可以解除多效唑?qū)M培苗生長(zhǎng)的抑制作用，在生根的同時(shí)保證組培苗生長(zhǎng)健壯。
上述配比中的吲哚-3-丁酸和萘乙酸可使生根率達(dá)81.82％，且根潔白、粗壯、整齊；當(dāng)吲哚-3-丁酸濃度提高到1.3mg/L時(shí)雖然生根率有所提高，但是根色發(fā)黃，且根的發(fā)育呈現(xiàn)畸形。
(3)長(zhǎng)苗煉苗培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶直接移入光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為75％～90％的溫室內(nèi)，每天光照9～11小時(shí)，馴化20～25天，打開瓶蓋，煉苗5～10天，開蓋煉苗時(shí)培養(yǎng)瓶加0.5～1.0厘米高自來(lái)水防污保濕。當(dāng)苗高5～8厘米，根長(zhǎng)1～2.5厘米時(shí)進(jìn)行移栽。
(4)移栽取出(3)中經(jīng)過(guò)煉苗的幼苗，洗凈根上殘留的生根培養(yǎng)基，將根在含50ppm的萘乙酸泥漿中浸泡處理2小時(shí)，可使移栽成活率提高到85.07％，將苗移入裝有營(yíng)養(yǎng)土(蛭石∶腐殖土∶田園土＝2∶1∶2)的移栽容器中，移栽容器可采用塑料缽或育苗盤或苗床，移栽前澆足1/10MS基本培養(yǎng)基溶液，上覆蓋塑料薄膜，保持濕度在70％～100％，7天后逐漸通風(fēng)，15天后揭膜，在此期間噴灑1/10MS基本培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)在光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為70％～90％的溫室內(nèi)，培養(yǎng)20～50天，在苗高6～15厘米，有8～15片葉時(shí)移栽入大田。經(jīng)移栽實(shí)驗(yàn)，蛭石和營(yíng)養(yǎng)土為移栽基質(zhì)組培苗成活率在77％以上，而且苗生長(zhǎng)整齊一致，以田園土作基質(zhì)組培苗成活率最低，適宜組培苗移栽的基質(zhì)應(yīng)當(dāng)保水性強(qiáng)通氣性好，為了使組培苗更好的生長(zhǎng)，移栽基質(zhì)還應(yīng)當(dāng)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，雖然以蛭石為基質(zhì)移栽成活率高，但蛭石缺乏營(yíng)養(yǎng)、疏松易散，移栽成活后還要再次移栽，增加了工序、降低了成苗率，故以營(yíng)養(yǎng)土為移栽基質(zhì)最為適宜，成活率為77.78％，而且苗生長(zhǎng)健壯整齊。
實(shí)施例2在本實(shí)施例組培苗的培養(yǎng)步驟中，所用的增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10g瓊脂粉 4g6-(芐胺基)嘌呤 0.1mg萘乙酸 0.08mg在組培苗生根培養(yǎng)步驟中，所用的生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10g瓊脂粉 4g吲哚-3-丁酸 0.4mg萘乙酸 0.08mg在本實(shí)施例中其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3在本實(shí)施例組培苗的培養(yǎng)步驟中，所用的增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 35g瓊脂粉 8g6-(芐胺基)嘌呤 0.5mg萘乙酸 0.12mg
在組培苗生根培養(yǎng)步驟中，所用的生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 35g瓊脂粉 8g吲哚-3-丁酸 1mg萘乙酸 0.14mg在本實(shí)施例中其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4在以上實(shí)施例1～3組培苗生根培養(yǎng)步驟中，所用的生根培養(yǎng)基也可以為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g吲哚-3-丁酸 0.7mg萘乙酸 0.1mg多效唑 1mg在本實(shí)施例中所用的增殖培養(yǎng)基與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本實(shí)施例的生根培養(yǎng)基在1/2MS基本培養(yǎng)基中加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L、多效唑1mg/L能同時(shí)完成生根和長(zhǎng)苗，生根率達(dá)80％，同時(shí)幼苗生長(zhǎng)健壯整齊，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)程序、贏得了時(shí)間、提高了工效、降低了成本，為工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
實(shí)施例5在以上實(shí)施例1～3組培苗生根培養(yǎng)步驟中，所用的生根培養(yǎng)基也可以為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10g瓊脂粉 4g吲哚-3-丁酸 0.4mg
萘乙酸 0.08mg多效唑 0.8mg在本實(shí)施例中所用的增殖培養(yǎng)基與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例6在以上實(shí)施例1～3組培苗生根培養(yǎng)步驟中，所用的生根培養(yǎng)基也可以為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 35g瓊脂粉 8g吲哚-3-丁酸 1mg萘乙酸 0.14mg多效唑 1.5mg在本實(shí)施例中所用的增殖培養(yǎng)基與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其它培養(yǎng)步驟與實(shí)施例1相同。
為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用了本發(fā)明第一個(gè)實(shí)施例1方法以及培養(yǎng)過(guò)程中所用的增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)情況如下實(shí)驗(yàn)材料澳洲青蘋枝條、MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、萘乙酸、吲哚-3-丁酸、多效唑、6-(芐胺基)嘌呤、瓊脂粉、白砂糖。
材料提供單位澳洲青蘋枝條由陜西恒興飲料有限公司提供，MS基本培養(yǎng)基和1/2MS基本培養(yǎng)基按照《植物組織培養(yǎng)》一書MS基本培養(yǎng)基配方由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)院中藥材組培快繁實(shí)驗(yàn)室配制，萘乙酸由北京市雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)，吲哚-3-丁酸、多效唑和6-(芐胺基)嘌呤由中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)，瓊脂粉由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)，白砂糖市售。
實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)瓶。
實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、組培苗不同莖段生根的比較本試驗(yàn)是在增殖生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，選取生長(zhǎng)整齊一致的組培苗分別切成上中下三段接種在1/2MS加入吲哚-3-丁酸0.5mg/L培養(yǎng)基上在自然光下生根并長(zhǎng)苗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1不同莖段生根效果表莖段接種株數(shù)生根株數(shù)生根率(％)平均根數(shù)上 52 41 78.85 3.29中 38 28 73.68 3.04下 46 32 69.56 2.97實(shí)驗(yàn)結(jié)論上部莖段和中部莖段是組培苗生根的最佳部位，而基部莖段作繁殖之用較好。
2、激素對(duì)生根的影響(1)萘乙酸和不同濃度的吲哚-3-丁酸對(duì)生根的影響在1/2MS中加入萘乙酸0.1mg/L和吲哚-3-丁酸進(jìn)行生根培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2萘乙酸與吲哚-3-丁酸不同濃度對(duì)生根的影響表培養(yǎng) 吲哚-3-丁酸 萘乙酸濃度 接種株數(shù) 生根株數(shù) 生根率基號(hào) 濃度(mg/L) (mg/L) (％)1 0.4 0.1 564275.002 0.7 0.1 544379.633 1.0 0.1 554581.824 1.3 0.1 574782.46實(shí)驗(yàn)結(jié)論吲哚-3-丁酸濃度為1.0和萘乙酸濃度為0.1時(shí)生根率達(dá)81.82％，且根潔白、粗壯、整齊；當(dāng)吲哚-3-丁酸濃度提高到1.3mg/L時(shí)雖然生根率有所提高，但是根色發(fā)黃，且根的發(fā)育呈現(xiàn)畸形。
(2)多效唑濃度對(duì)生根的影響在1/2MS基本培養(yǎng)基中加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L作為進(jìn)行多效唑試驗(yàn)的基本配比，加入多效唑0.0～5.0mg/L，進(jìn)行生根培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3多效唑不同濃度對(duì)生根的影響表多效唑濃度接種株數(shù) 生根株數(shù)生根率(％)平均苗高(cm) 長(zhǎng)勢(shì)(mg/L)0 7054 77.29 4.54 ++++1 7257 79.17 4.25 +++3 7963 79.75 3.87 +++5 7762 80.52 3.55 ++實(shí)驗(yàn)結(jié)論在1/2MS基本培養(yǎng)基中加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L、多效唑1mg/L能同時(shí)完成生根和長(zhǎng)苗，簡(jiǎn)化了培養(yǎng)程序、贏得了時(shí)間、提高了工效、降低了成本，為工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
3、暗培養(yǎng)對(duì)生根的促進(jìn)作用將澳洲青蘋組培苗接種于1/2MS基本培養(yǎng)基加入吲哚-3-丁酸0.7mg/L、萘乙酸0.1mg/L、多效唑1mg/L的培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行0、3、7、12天暗培養(yǎng)后即進(jìn)行自然光長(zhǎng)苗和煉苗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
表4不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生根的影響表暗培養(yǎng)時(shí)間 接種株數(shù) 生根株數(shù) 生根率 平均根數(shù)平均苗高(cm)(天)05947 79.66 3.34 4.2236251 82.26 3.86 4.2875951 86.44 4.39 4.6112 5246 88.46 4.58 5.32實(shí)驗(yàn)結(jié)論3～7天的暗培養(yǎng)不僅有效促進(jìn)組培苗生根且經(jīng)光培養(yǎng)煉苗生長(zhǎng)健壯，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)能夠解除多效唑?qū)γ缟L(zhǎng)的擬制作用。
4移栽(1)移栽基質(zhì)實(shí)驗(yàn)分別試驗(yàn)了蛭石、營(yíng)養(yǎng)土(蛭石∶腐殖土∶田園土＝2∶1∶2)、田園土對(duì)組培苗移栽成活率的影響情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽成活率的影響表基質(zhì)處理株數(shù) 成活株數(shù) 成活率(％)蛭石 130 102 78.46營(yíng)養(yǎng)土135 105 77.78田園土122 76 62.29實(shí)驗(yàn)結(jié)論以蛭石和營(yíng)養(yǎng)土為移栽基質(zhì)組培苗成活率高、生長(zhǎng)整齊一致，而以田園土作基質(zhì)組培苗成活率最低，適宜組培苗移栽的基質(zhì)應(yīng)當(dāng)保水性強(qiáng)通氣性好，為了使組培苗更好的生長(zhǎng)，移栽基質(zhì)還應(yīng)當(dāng)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，雖然以蛭石為基質(zhì)移栽成活率高，但蛭石缺乏營(yíng)養(yǎng)、疏松易散，移栽成活后還要再次移栽，增加了工序、降低了成苗率，故以營(yíng)養(yǎng)土為移栽基質(zhì)最為適宜。
(2)萘乙酸對(duì)組培苗移栽成活率的影響以清水為對(duì)照進(jìn)行了萘乙酸不同濃度及處理方法對(duì)組培苗移栽成活率影響的試驗(yàn)，將處理過(guò)的小苗直接移栽在營(yíng)養(yǎng)土中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。
表6不同濃度萘乙酸及處理方法對(duì)組培苗移栽成活率的影響表萘乙酸濃度(mg/L) 處理株數(shù) 成活株數(shù) 成活率(％)0(清水) 203 164 80.7950(清水) 220 185 84.0950(泥漿) 221 188 85.07100(清水) 214 179 83.64實(shí)驗(yàn)結(jié)論含50ppm的萘乙酸泥漿浸泡處理幼苗根2小時(shí)可有效提高組培苗移栽成活率。
權(quán)利要求
1.一種澳洲青蘋快速繁殖方法，其特征在于它包括如下步驟(1)組培苗的制備剪取大田栽培的盛果期優(yōu)良單株的無(wú)病蟲害的健壯營(yíng)養(yǎng)枝為母本，在光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為75％～90％的溫室保濕沙培，利用新生長(zhǎng)的幼嫩枝條作為外植體，然后取澳洲青蘋的幼嫩莖段，流水沖洗干凈，濾紙吸干；在超凈工作臺(tái)上將取下的莖尖或側(cè)芽在75％酒精中浸泡10～30秒，無(wú)菌水沖洗3次，每次5分鐘，置入0.1％HgCl2溶液中滅菌5～15分鐘，用無(wú)菌水沖洗3～5次，每次5分鐘，用無(wú)菌濾紙吸干，切成帶1～2個(gè)芽的莖段，作為外植體扦插入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，該增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10～35g瓊脂粉 4～8g6-(芐胺基)嘌呤 0.1～0.5mg萘乙酸 0.08～0.12mg配制好的培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶裝25～35毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘，將培養(yǎng)瓶置于光照強(qiáng)度為3500～4500lx、溫度為20℃～30℃、濕度為70％～90％的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，選取繁殖8～30代的4～6cm高健壯組培苗為材料，切成長(zhǎng)1.4～1.6cm左右?guī)ы斞炕?～2個(gè)側(cè)芽的上部莖段和中部莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)；(2)組培苗生根培養(yǎng)將(1)中切好的莖段放入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，所用的生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10～35g瓊脂粉 4～8g吲哚-3-丁酸 0.4～1mg萘乙酸 0.08～0.14mg或所用的生根培養(yǎng)基為在1升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 10～35g瓊脂粉 4～8g吲哚-3-丁酸 0.4～1mg萘乙酸 0.08～0.14mg多效唑 0.8～1.5mg將配制好的生根培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶25～35毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘，培養(yǎng)瓶移入溫度為18℃～22℃、濕度為70％～90％的暗室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)3～7天；(3)長(zhǎng)苗煉苗培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶直接移入光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為75％～90％的溫室內(nèi)，每天光照9～11小時(shí)，馴化20～25天，打開瓶蓋，煉苗5～10天，開蓋煉苗時(shí)培養(yǎng)瓶加0.5～1.0厘米高的自來(lái)水防污保濕，當(dāng)苗高5～8厘米，根長(zhǎng)1～2.5厘米時(shí)進(jìn)行移栽；(4)移栽取出(3)中經(jīng)過(guò)煉苗的幼苗，洗凈根上殘留的生根培養(yǎng)基，將根在含50ppm的萘乙酸泥漿中浸泡處理2小時(shí)，移入裝有營(yíng)養(yǎng)土的移栽容器中，移栽前澆足1/10MS基本培養(yǎng)基，上覆蓋塑料薄膜，保持濕度在70％～100％，7天后逐漸通風(fēng)，15天后揭膜，在此期間噴灑1/10MS基本培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)在光照強(qiáng)度為800～8000lx、溫度20～25℃、濕度為70％～90％的溫室內(nèi)，培養(yǎng)20～50天，在苗高15～20厘米，有8～15片葉時(shí)移栽入大田。
2.按照權(quán)利要求1所述的澳洲青蘋快速繁殖方法，其中增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 15～30g瓊脂粉 4～6g6-(芐胺基)嘌呤 0.2～0.4mg萘乙酸 0.09～0.11mg其中生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 15～30g瓊脂粉 4～6g吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg萘乙酸 0.08～0.13mg其中生根培養(yǎng)基或?yàn)樵?升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 15～30g瓊脂粉 4～6g吲哚-3-丁酸 0.6～0.8mg萘乙酸 0.08～0.13mg多效唑 0.8～1.2mg
3.按照權(quán)利要求1所述的澳洲青蘋快速繁殖方法，其中增殖培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g6-(芐胺基)嘌呤 0.3mg萘乙酸 0.1mg其中生根培養(yǎng)基為在1升MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g吲哚-3-丁酸 0.7mg萘乙酸 0.1mg其中生根培養(yǎng)基或?yàn)樵?升1/2MS基本培養(yǎng)基中加入下述的原料及其配比制成白砂糖 20g瓊脂粉 4.5g吲哚-3-丁酸 0.7mg萘乙酸 0.1mg多效唑 1mg
全文摘要
一種澳洲青蘋快速繁殖方法，采用了組培苗的制備、組培苗生根培養(yǎng)、長(zhǎng)苗煉苗培養(yǎng)、移栽組培方法，在暗室進(jìn)行組培苗的制備和組培苗生根培養(yǎng)，并在自然光下長(zhǎng)苗、長(zhǎng)根、煉苗同步進(jìn)行，組培步驟采用了適合于澳洲青蘋快速繁殖的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，增殖和生根效果好，使澳洲青蘋生根率達(dá)79％以上，而且根系粗壯整齊，同時(shí)組培苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠，有效地節(jié)約了人力和物力，移栽成活率可達(dá)85.07％，為工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明組培方法具有簡(jiǎn)便易行、簡(jiǎn)化了程序、提高了工效、降低了成本等優(yōu)點(diǎn)，可用于澳洲青蘋的快速繁殖。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1443444SQ03114690
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2003年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月28日
發(fā)明者肖婭萍, 王喆之, 張錚, 黃馨慧 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)