專(zhuān)利名稱(chēng)：番茄耐鹽性狀篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種番茄耐鹽性狀篩選方法，可用于所有果菜類(lèi)，如番茄、茄子、辣椒、黃瓜、甜瓜等耐鹽新品種培育，側(cè)枝扦插部分內(nèi)容可用于所有性狀的培育，屬于農(nóng)作物育種技術(shù)領(lǐng)域。
番茄為嚴(yán)格的自花授粉植物，長(zhǎng)期的人工馴化和有性雜交，使其基因背景越來(lái)越窄，一些耐逆境基因，如耐鹽基因已很難在其栽培種中找到，故近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家都試圖通過(guò)基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)來(lái)培育番茄耐鹽新品種，但大都只有獲得耐鹽植株的報(bào)道，育成品種的報(bào)道甚少。就其原因，一則因?yàn)槟望}性的表達(dá)大多受多基因控制；二則研究證明番茄不同的生育時(shí)期耐鹽性的表達(dá)不盡相同，這給耐鹽性狀的篩選帶來(lái)不便，從而延長(zhǎng)了篩選時(shí)間，且降低了篩選的有效性，最終阻礙了耐鹽育種的進(jìn)程。(陳火英等，番茄耐鹽性狀的離體篩選(英文)，上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2002，20(1)，1-6)，(M.Ashraf.Breedingfor salinity tolerance in plants，Critical Reviews in Plant Sciences，1994，13(1)17-42)。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明利用在氯化鈉NaCl脅迫下番茄芽體的生根情況、子葉愈傷組織的增殖情況、幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)、成株期的側(cè)枝扦插的生根情況以及下一世代種子的發(fā)芽勢(shì)，綜合評(píng)判番茄植株的耐鹽性，同時(shí)加快番茄耐鹽育種的進(jìn)程。
本發(fā)明的技術(shù)方案中，各個(gè)時(shí)期的技術(shù)關(guān)鍵包括
①芽體的生根情況將要鑒定材料的種子浸種24小時(shí)，飽和漂白粉液消毒20分鐘，再在無(wú)菌條件下催芽，接著將處于萌動(dòng)狀態(tài)的種子播種于1/2的MS(Murashige and Skoog的基本培養(yǎng)基)大量元素培養(yǎng)基中；出苗后10天，將其芽體切下，接種于附加有75mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，10天后觀察和統(tǒng)計(jì)生根情況。
②子葉愈傷組織的增殖量取上述生根快的植株的子葉作為外植體，接種于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，每15天繼代1次，將繼代2次的愈傷組織接種于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的增殖情況，并測(cè)定其干重，以重復(fù)進(jìn)行耐鹽性的鑒定。
③幼苗生長(zhǎng)勢(shì)將芽體生根快的植株移栽于大棚苗床或育苗缽中。緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進(jìn)行耐鹽性的脅迫篩選。
④成株期側(cè)枝扦插的生根情況將上述在鹽脅灌溉下生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的、葉片鹽害癥狀輕的植株移栽于大棚中，觀察農(nóng)藝性狀；取第一花穗下的具4-5片葉子的側(cè)枝，側(cè)枝的基部用100mmol/L的NAA(萘乙酸)處理10分鐘，爾后扦插于基質(zhì)槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計(jì)側(cè)枝的生根情況。
⑤下一世代種子的發(fā)芽勢(shì)將上述由生根快的側(cè)枝形成的植株定植于大棚或大田中進(jìn)一步觀察該材料的其它農(nóng)藝性狀，并將其相對(duì)應(yīng)植株留一穗果打頂以加快種子的成熟，加快世代進(jìn)程。將種子在無(wú)菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)。將發(fā)芽勢(shì)大于50％的材料，進(jìn)入下一世代的篩選。
與傳統(tǒng)篩選技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，一般常規(guī)育種工作者易于掌握；整個(gè)系統(tǒng)的耐鹽性篩選都在可控條件下，使得篩選結(jié)果更加可靠；利用組培室有限的空間進(jìn)行大量材料的初步篩選；利用側(cè)枝在基質(zhì)槽進(jìn)行鹽池鑒定，即可以減少工作量，又可做到育種材料的不間斷；耐鹽植株留一穗果打頂，可使番茄在長(zhǎng)江中下游地區(qū)的氣候條件下繁殖4個(gè)世代，大大縮短了育種時(shí)間。
本發(fā)明選用試驗(yàn)材料為上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院耐鹽番茄育種課題組的育種材料，可分為兩組①以擬改良品種“鮮豐”為受體，通過(guò)花粉管通道技術(shù)分別將野生耐鹽的奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716的Total DNA及帶有耐鹽目的基因HVA1的pBY520質(zhì)粒作為供體導(dǎo)入到受體的后代材料；②以擬改良品種“鮮豐”為對(duì)象，進(jìn)行體細(xì)胞突變體篩選的后代。
研究表明，利用本發(fā)明可在1年到1年半的時(shí)間內(nèi)完成番茄變異體的穩(wěn)定性篩選，而傳統(tǒng)的篩選技術(shù)則需要2-3年的時(shí)間；耐鹽性鑒定覆蓋了整個(gè)種子到種子的過(guò)程，避免了鹽脅過(guò)程中生理適應(yīng)性的干擾，從而大大提高了選擇的有效性；利用本發(fā)明在不到3年的時(shí)間內(nèi)已成功獲得了7個(gè)耐鹽的、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的系統(tǒng)。其中，2個(gè)系統(tǒng)耐鹽且農(nóng)藝性狀優(yōu)良，在上海崇明東旺沙新圍墾的，鹽度達(dá)到0.7％-0.8％的大棚中，且用鹽度達(dá)0.8％海水灌溉(由于崇明島的海水鹽度不穩(wěn)定，故根據(jù)每次取水的實(shí)際濃度加上一定量的NaCl復(fù)配而成)條件下正常生長(zhǎng)，成品率達(dá)到80％-100％；而對(duì)照“鮮豐”葉片有嚴(yán)重的鹽害癥狀，所結(jié)果實(shí)臍腐病的發(fā)病率達(dá)到80％以上，成品率最高達(dá)20％。
將24個(gè)果實(shí)的種子浸種24小時(shí)，飽和漂白粉液消毒20分鐘，再在無(wú)菌條件下催芽，接著將處于萌動(dòng)狀態(tài)的種子播種于1/2的MS大量元素培養(yǎng)基中；出苗后10天，將其芽體切下，接種于附加有75mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，10天后統(tǒng)計(jì)生根情況，并初步斷定耐鹽植株15株。
取上述15株植株的子葉作為外植體，接種于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，每15天繼代1次，將繼代2次的愈傷組織接種于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的增殖情況，并測(cè)定其相對(duì)干重，以進(jìn)一步鑒定材料的耐鹽性。
將上述15株植株移栽于大棚苗床中。緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進(jìn)行耐鹽性的脅迫篩選。
將上述在鹽脅灌溉下生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的、葉片鹽害癥狀輕的植株移栽于大棚中，觀察農(nóng)藝性狀；取第一花穗下的具4-5片葉子的側(cè)枝，側(cè)枝的基部用100mmol/L的NAA處理10分鐘，爾后扦插于基質(zhì)槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計(jì)側(cè)枝的生根情況。
將由生根快的9個(gè)側(cè)枝形成的植株定植于大棚中進(jìn)一步觀察其它農(nóng)藝性狀，并將其相對(duì)應(yīng)植株(取側(cè)枝的母株)留一穗果打頂以加快種子的成熟，加快世代進(jìn)程；9個(gè)植株單株留種，將9個(gè)株系的種子在無(wú)菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)有5個(gè)株系的發(fā)芽勢(shì)達(dá)到50％以上。從第3世代開(kāi)始將材料種植于上海崇明東旺沙新圍墾的，鹽度達(dá)到0.7％-0.8％的大棚中，且用鹽度達(dá)0.8％海水灌溉進(jìn)行篩選。
利用本發(fā)明，將上述材料連續(xù)篩選1.5年(6個(gè)世代)獲得了一個(gè)耐鹽、且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的有限生長(zhǎng)型番茄新品種。
實(shí)施例2將利用體細(xì)胞突變體篩選獲得的10株耐鹽植株移栽于育苗缽中。緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進(jìn)行耐鹽性的脅迫篩選。10株均表現(xiàn)耐鹽。接著將其移栽于大棚中，只有2株生長(zhǎng)正常，并能開(kāi)花結(jié)實(shí)。取第一花穗下具4-5片葉子的側(cè)枝，側(cè)枝的基部用100mmol/L的NAA處理10分鐘，爾后扦插于基質(zhì)槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計(jì)側(cè)枝的生根情況。
將2個(gè)側(cè)枝形成的植株定植于大棚中進(jìn)一步觀察該材料的其它農(nóng)藝性狀，并將其相對(duì)應(yīng)植株(取側(cè)枝的母株)留一穗果打頂以加快種子的成熟，加快世代進(jìn)程；2個(gè)植株單株留種，將2個(gè)株系的種子在無(wú)菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)。從第3世代開(kāi)始將材料種植于上海崇明東旺沙新圍墾的，鹽度達(dá)到0.7％-0.8％的大棚中，且用鹽度達(dá)0.8％海水灌溉進(jìn)行篩選。
利用本發(fā)明，將上述材料連續(xù)篩選1.5年(6個(gè)世代)獲得了一個(gè)耐鹽、且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的有限生長(zhǎng)型番茄新品種。
權(quán)利要求
1.一種番茄耐鹽性狀篩選方法，其特征在于包括①芽體的生根情況將要鑒定材料的種子浸種24小時(shí)，消毒后在無(wú)菌條件下催芽，接著將處于萌動(dòng)狀態(tài)的種子播種于1/2的MS大量元素培養(yǎng)基中，出苗后10天，將其芽體切下，接種于附加有75mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，10天后觀察和統(tǒng)計(jì)生根情況；②子葉愈傷組織的增殖量取上述生根快的植株的子葉作為外植體，接種于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，每15天繼代1次，將繼代2次的愈傷組織接種于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的增殖情況，并測(cè)定其干重，以重復(fù)進(jìn)行耐鹽性的鑒定；③幼苗生長(zhǎng)勢(shì)將芽體生根快的植株移栽于大棚苗床或育苗缽中，緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進(jìn)行耐鹽性的脅迫篩選；④成株期側(cè)枝扦插的生根情況將上述在鹽脅灌溉下生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的、葉片鹽害癥狀輕的植株移栽于大棚中，觀察農(nóng)藝性狀；取第一花穗下的具4-5片葉子的側(cè)枝，側(cè)枝的基部用100mmol/L的萘乙酸NAA處理10分鐘，爾后扦插于基質(zhì)槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營(yíng)養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計(jì)側(cè)枝的生根情況；⑤下一世代種子的發(fā)芽勢(shì)將上述由生根快的側(cè)枝形成的植株定植于大棚或大田中，并將其相對(duì)應(yīng)植株留一穗果打頂，將種子在無(wú)菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，7天后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，將發(fā)芽勢(shì)大于50％的材料，進(jìn)入下一世代的篩選。
全文摘要
一種番茄耐鹽性狀篩選方法，利用在氯化鈉NaCl脅迫下番茄芽體的生根情況、子葉愈傷組織的增殖情況、幼苗的生長(zhǎng)勢(shì)、成株期的側(cè)枝扦插的生根情況以及下一世代種子的發(fā)芽勢(shì)，綜合評(píng)判番茄植株的耐鹽性，同時(shí)加快番茄耐鹽育種的進(jìn)程。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，易于掌握，整個(gè)系統(tǒng)的耐鹽性篩選都在可控條件下，使得篩選結(jié)果更加可靠；利用組培室有限的空間進(jìn)行大量材料的初步篩選；利用側(cè)枝在基質(zhì)槽進(jìn)行鹽池鑒定，即可以減少工作量，又可做到育種材料的不間斷；耐鹽植株留一穗果打頂，可大大縮短育種時(shí)間。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1433680SQ03115379
公開(kāi)日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2003年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月13日
發(fā)明者陳火英, 莊天明, 劉風(fēng)榮 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)