專利名稱：一種水稻耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是來源于水稻的耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冷害和凍害等非生物逆境脅迫因素，不僅對植物的生長發(fā)育具有重要影響，嚴(yán)重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，并且影響作物優(yōu)良品種的推廣，因此培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。由于植物本身耐逆性的限制和遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，利用傳統(tǒng)的育種方法提高作物的耐逆性受到一定的限制。植物耐逆性分子機(jī)制的研究進(jìn)展和植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的日臻完善使應(yīng)用轉(zhuǎn)基因手段提高植物耐逆性成為可能。轉(zhuǎn)錄因子在植物對逆境的應(yīng)答中起著“承上啟下”的作用。逆境下，植物細(xì)胞將環(huán)境中物理參數(shù)的變化變?yōu)榘麅?nèi)信號，經(jīng)過一系列磷酸化級聯(lián)反應(yīng)將信號傳遞到轉(zhuǎn)錄因子，再經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)的功能基因，啟動或者抑制它們的表達(dá)，使細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境達(dá)到平衡，從而提高植物的耐逆性。因此耐逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的高表達(dá)與植物的耐逆性是息息相關(guān)的。
水稻作為最重要的糧食作物之一，闡明其應(yīng)答低溫的轉(zhuǎn)錄因子及其功能，對應(yīng)用基因工程技術(shù)培育耐低溫植物品種具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供與植物耐低溫特性相關(guān)的一種轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的耐低溫轉(zhuǎn)錄因子來源于水稻，名稱為OsbHLH1，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2蛋白質(zhì)序列由265個氨基酸殘基組成，在氨基端有一個富含堿性氨基酸如賴氨酸的短基元LysLysCysAspLysLysAlaProLysArg，如圖1A所示，為序列2中自氨基端到羧基端的第28-37位氨基酸殘基；其可能是定位于細(xì)胞核的信號。此外含有保守的bHLH結(jié)構(gòu)域序列，包括54個氨基酸殘基，構(gòu)成了典型的單環(huán)—可變環(huán)—單環(huán)結(jié)構(gòu)(bHLH)，在bHLH結(jié)構(gòu)域序列右側(cè)是富亮氨酸的拉鏈結(jié)構(gòu)(ZIP)，于是構(gòu)成了bHLH-ZIP結(jié)構(gòu)域。其中，bHLH結(jié)構(gòu)域序列為序列2中自氨基端到羧基端的第32-85位氨基酸殘基，即圖1A中劃細(xì)線部分的氨基酸殘基；富亮氨酸的拉鏈結(jié)構(gòu)(ZIP)序列為序列2中自氨基端到羧基端的第86-127位氨基酸殘基，即圖1A中劃粗線部分的氨基酸殘基；bHLH-ZIP結(jié)構(gòu)域序列為序列2中自氨基端到羧基端的第32-127位氨基酸殘基，即圖1A中劃細(xì)線和劃粗線部分的氨基酸殘基。
耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1的編碼基因OsbHLH1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1137個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第121到第918位堿基，其表達(dá)主要受低溫的誘導(dǎo)。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼耐低溫的轉(zhuǎn)錄因子的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對低溫逆境脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時也可不攜帶有任何標(biāo)記基因，直接用低溫篩選。本發(fā)明OsbHLH1基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤沟蜏刂参锲贩N，擴(kuò)大作物種植范圍，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1A為OsbHLH1的核苷酸及氨基酸序列圖1B為OsbHLH1與其它bHLH類因子蛋白保守區(qū)的相似性比較圖2為OsbHLH1基因在染色體中的拷貝數(shù)圖3為OsbHLH1蛋白在細(xì)胞核中的定位圖4為酵母系統(tǒng)實驗說明OsbHLH1是一個轉(zhuǎn)錄因子圖5A顯示不同處理對OsbHLH1表達(dá)的影響圖5B顯示低溫處理對秈稻和粳稻根和葉中OsbHLH1基因表達(dá)的影響
具體實施例方式
實施例1、水稻耐低溫轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1的篩選及其cDNA的克隆水稻(Oryza sativa var.Lansheng)種子種在培養(yǎng)皿中在培養(yǎng)室中生長至兩葉一心期時進(jìn)行低溫脅迫處理后取樣。收集新鮮葉片1g在液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，之后，溶于水。應(yīng)用常規(guī)方法構(gòu)建cDNA文庫。
從水稻cDNA文庫中根據(jù)CBF/DREB1的序列按照AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域和載體的序列設(shè)計了一對引物5’-引物為5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’；3’-引物為5’-(ATGC)GT(CT)TG(AG)AA(ATGC)GT(ATGC)CC(ATGC)AGCCA-3’(括號中的堿基表示此位堿基可是其中的任一個)用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增了一段DNA序列。將這一DNA片段進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)其為一個全長的cDNA，如圖1A所示，它含有1137bp，包括一個798bp的閱讀框、120bp5’-非翻譯區(qū)和219bp 3’-非翻譯區(qū)，推定的蛋白質(zhì)含265個氨基酸，為42kD。
根據(jù)該cDNA的核苷酸序列推斷的氨基酸序列畫出其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，再與NCBI數(shù)據(jù)庫比較，結(jié)果如圖1B所示，表明該蛋白含有典型的單環(huán)—可變環(huán)—單環(huán)結(jié)構(gòu)(bHLH)，在HLH結(jié)構(gòu)右側(cè)是富亮氨酸的拉鏈結(jié)構(gòu)(ZIP)，于是構(gòu)成了bHLH-ZIP結(jié)構(gòu)域，但在該蛋白中未發(fā)現(xiàn)有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)，因此獲得的cDNA片段是一個bHLH類的蛋白，命名為OsbHLH1。
實施例2、OsbHLH1基因在染色體中的拷貝數(shù)將水稻總DNA分別用限制性內(nèi)切酶BamH I，Xho I，EcoR I，Xba I完全水解后，以O(shè)sbHLH1為探針進(jìn)行Southern分析(常規(guī)方法)。Southern雜交結(jié)果如圖2所示，表明EcoR I酶切時可見3條雜交帶而其它3個酶切時僅顯示1條雜交帶。在OsbHLH1cDNA中沒有此3個酶的酶切位點(diǎn)，而僅有一個EcoR I的酶切位點(diǎn)。當(dāng)將OsbHLH1序列與已公布的水稻全基因組序列比較時發(fā)現(xiàn)OsbHLH1基因含有5個外顯子，分別為108bp，81bp，119bp，130bp，699bp，4個內(nèi)含子，分別為……。在第2個內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)存在1個EcoR I切點(diǎn)。因此當(dāng)水稻總DNA用EcoR I酶切時的雜交帶為3條。至此，可以判明OsbHLH1基因在水稻基因組中僅含1個拷貝，對水稻9311基因組全序列的檢索也證實了上述結(jié)果。
實施例3、OsbHLH1蛋白在細(xì)胞核中的定位由于OsbHLH1蛋白含有LysLysCysAspLysLysAlaProLysArg基元，富含亮氨酸(K)和精氨酸(R)，推斷這一結(jié)構(gòu)可能是位于細(xì)胞核的信號(NLS)。因此進(jìn)行了OsbHLH1蛋白的核定位實驗。
OsbHLH基因的編碼序列用引物
5’-引物5’-TAGGGATCCGAGGTCGAGATGGTGCCCAG-3’3’-引物3’-GTGGTCGACAGATCTACCTATACGGTCTTC-3’以水稻總DNA為模板經(jīng)常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到。該序列與pUC18質(zhì)粒中的綠色熒光蛋白(GFP)基因融合并經(jīng)測序驗證。以僅含GFP基因的載體為對照，所用啟動子均為35S啟動子。然后導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在MS培養(yǎng)基中于28℃下培養(yǎng)2天，然后在Confocal顯微鏡(Olympus FV500)下觀察。如圖3所示，結(jié)果表明OsbHLH1位于細(xì)胞核中。
實施例4、酵母雙雜交系統(tǒng)實驗證明OsbHLH1是一個轉(zhuǎn)錄因子含有HIS3和LacZ報告基因的酵母YRG-2作為本實驗系統(tǒng)。用與實施例3相同的引物經(jīng)常規(guī)PCR方法擴(kuò)增得到OsHLH1基因的編碼序列，分別與GAL4 DNA結(jié)合域載體和GAL4活化域載體連接產(chǎn)生2個載體pBD-OsbHLH1和pAD-OsbHLH1。根據(jù)Stratagene的操作程序?qū)GAL4(正對照)，pBD(負(fù)對照)，pBD-OsbHLH1和pAD-WT加pBD-WT(WT是內(nèi)對照，表示λcI阻抑蛋白中的C片段)分別轉(zhuǎn)化酵母YRG-2，轉(zhuǎn)化子分別在含YAPD或SD-His平板上生長。酵母YRG-2含有上游活化序列(UAS)，能調(diào)控報告基因HIS3的表達(dá)。如果含有pBD-OsbHLH1的酵母轉(zhuǎn)化子能夠在無組氨酸(SD-His)的培養(yǎng)基上生長，說明報告基因HIS3被激活了證明在OsbHLH1基因中存在轉(zhuǎn)錄活化域。圖4顯示所有含有pGAL4(正對照)，pBD(負(fù)對照)，pBD-OsHLH1和pAD-WT加pBD-WT的轉(zhuǎn)化子均能在YAPD培養(yǎng)基中正常生長，但在SD-His培養(yǎng)基中含pGAL4(正對照)，pBD-OsbHLH1和pAD-WT加pBD-WT的轉(zhuǎn)化子仍正常生長而含pBD(負(fù)對照)的轉(zhuǎn)化子不能生長。證明在OsbHLH1蛋白中含有轉(zhuǎn)錄因子活性的片段。
實施例5、水稻OsbHLH1基因轉(zhuǎn)錄活性與低溫脅迫的關(guān)系及其組織表達(dá)特異性水稻(Oryza sativa var.)秈稻9311和粳稻JX17的種子種在水中，37℃2天，然后在培養(yǎng)皿的水和營養(yǎng)液中，25℃生長10天后進(jìn)行下述各種脅迫處理鹽處理將水稻苗移入250mM NaCl溶液中。
旱處理將水稻苗移入25％PEG 6000溶液中。
冷處理將水稻苗移入4°下。
ABA處理將水稻苗移入100μM ABA溶液中。
分別在各種處理后0、0.5、1、3、5、8、10、24小時收集9311全株各1克，組織特異性實驗中低溫處理后分別于0、1、3、5、12小時收集9311和JX17的新鮮葉片和根各1g在液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，之后，溶于水，得到總RNA。以O(shè)sbHLH1 DNA為探針，常規(guī)方法進(jìn)行Northern雜交分析。
結(jié)果如圖5A所示，表明在各種處理中只有低溫處理誘導(dǎo)OsbHLH1基因的表達(dá)，并在脅迫0.5-1小時即達(dá)到高峰，之后逐漸下降，而ABA，NaCl和PEG的處理均不誘導(dǎo)OsbHLH1基因的表達(dá)；圖5B表明無論是9311還是JX17，在常規(guī)條件下，其葉中均沒有檢測到OsbHLH1的轉(zhuǎn)錄，而在根中卻有較強(qiáng)的表達(dá)。當(dāng)用4℃處理時在9311和JX17中OsbHLH1基因的轉(zhuǎn)錄均受低溫誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的水平在2個品種中未見區(qū)別。
序列表<160>2<210>1<211>1137<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>
tgcagccagc cacgagccga ggaagccgag gccgaggagg aagacgacga agacaagtag 60cgcaaggaac cctcgaaccg ggaggccgcc gcggctccga tctgggaggg ggaggtcgag120atggtgccca gggacagggt gaatgccgct gccgctggtg gcggcggcga ggggaggctg180gtccagagcg gtatagtgaa caagaagtgt gataagaagg ctccaaagag aatccataaa240tcagagaggg agaaacttaa gcgggacaag cagaatgacc tctttaatga gctgggaaac300ttgctagaac ctgacaggca gaacaatggg aaggcatgtg tactgggtga aactacacga360atactaaaag atttactttc acaagtggaa tctctccgga aggagaatag ttcactgaag420aatgaatctc attatgttgc attggagaga aatgaactgc acgacgatta cagcatgctt480cgtactgaaa tcttggagct tcaaaacgag cttaggacgc ggatggaagg caatcctgtt540tggagtcatg taaacaccag accagctctc agggtacctt atccgacaac cggagtgttc600ccagtacagc acctgccaca tttaccagtc accacgacgg cagcatttcc tcagaagcta660ccggttatca tcgagcagca ctatgccgcc acgccaagag aacttcagct cttccctgag720tctgcgacca gcgaagacag cgaaccgtca caagaacacg ggatttctga ccatgtaaca780cggcctcagc caaggtaccc aacaccaacg gccactttgc cagtaaacct gtttccagtg840tttccaggaa gacaagatca acaatgtagc agtggtactt ctggcactaa cgaggaagac900cgtataggta gatcttaggt acactacata acgagaggtc cacacaatga tttgagaatt960cctttagttt caacgtttaa ctttgcaagt ttagcaaatg tgaaacagag atctgcgact 1020gtgctcatgg gtagcaccta atctgtatat ctgaatctca gttttaagtg gtcaaatagg 1080tgacattcag aaaagtttga aatgctttga ttattctgta aaaaaaaaaa aaaaaaa 1137<210>2<211>265<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa var.Lansheng)
<400>2Met Val Pro Arg Asp Arg Val Asn Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Glu Gly Arg Leu Val Gln Ser Gly Ile Val Asn Lys Lys Cys20 25 30Asp Lys Lys Ala Pro Lys Arg Ile His Lys Ser Glu Arg Glu Lys35 40 45Leu Lys Arg Asp Lys Gln Asn Asp Leu Phe Asn Glu Leu Gly Asn50 55 60Leu Leu Glu Pro Asp Arg Gln Asn Asn Gly Lys Ala Cys Val Leu65 70 75Gly Glu Thr Thr Arg Ile Leu Lys Asp Leu Leu Ser Gln Val Glu80 85 90Ser Leu Arg Lys Glu Asn Ser Ser Leu Lys Asn Glu Ser His Tyr95 100 105Val Ala Leu Glu Arg Asn Glu Leu His Asp Asp Tyr Ser Met Leu110 115 120Arg Thr Glu Ile Leu Glu Leu Gln Asn Glu Leu Arg Thr Arg Met125 130 135Glu Gly Asn Pro Val Trp Ser His Val Asn Thr Arg Pro Ala Leu140 145 150Arg Val Pro Tyr Pro Thr Thr Gly Val Phe Pro Val Gln His Leu155 160 165Pro His Leu Pro Val Thr Thr Thr Ala Ala Phe Pro Gln Lys Leu170 175 180Pro Val Ile Ile Glu Gln His Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Glu Leu185 190 195Gln Leu Phe Pro Glu Ser Ala Thr Ser Glu Asp Ser Glu Pro Ser200 205 210Gln Glu His Gly Ile Ser Asp His Val Thr Arg Pro Gln Pro Arg215 220 225Tyr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Leu Pro Val Asn Leu Phe Pro Val
230 235 240Phe Pro Gly Arg Gln Asp Gln Gln Cys Ser Ser Gly Thr Ser Gly245 250 255Thr Asn Glu Glu Asp Arg Ile Gly Arg Ser260 26權(quán)利要求
1.耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述序列2中自氨基端到羧基端的第32-127位氨基酸殘基是bHLH-ZIP結(jié)構(gòu)域。
4.耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1的編碼基因是序列表中SEQ ID №1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的編碼基因，其特征在于該基因的讀碼框為序列1中自5’端第121到第918位堿基。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
8.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求4所述基因在培育耐低溫植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了來源于水稻的耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，目的是提供具有較強(qiáng)耐低溫特性的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明所提供的耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子名稱為OsbHLH1，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID№2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。耐低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤偷蜏孛{迫植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，擴(kuò)大種植面積具有重要意義。
文檔編號A01H1/00GK1548453SQ0312391
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月20日
發(fā)明者陳受宜, 張勁松, 王玉軍, 張志剛, 何新建, 周華林 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所