專利名稱：鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法及在水稻中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法，本發(fā)明還涉及一種鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在植物發(fā)育過程中，Ca2+通過同其靶蛋白相互作用起著非常重要的作用，首先鈣信號(hào)通過鈣靶蛋白進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，鈣靶蛋白又通過和其靶蛋白分子結(jié)合而啟動(dòng)基因表達(dá)和細(xì)胞生命活動(dòng)，從而構(gòu)成鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜體系。植物中深入研究過的Ca2+靶蛋白主要有兩種即鈣結(jié)合型蛋白激酶(CDPKs)及鈣調(diào)素(CaM)。目前已對(duì)多種CDPKs進(jìn)行了生化和分子生物學(xué)分析，并已探討出它在植物生理和發(fā)育過程中的多種功能。同樣對(duì)CaM的研究亦顯示它參與植物發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)，然而有關(guān)植物中CaM結(jié)合蛋白激酶功能的研究起步較晚，已經(jīng)分離到的基因有三種從蘋果中分離的鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II的同源物(Watillon，B.，Kettmenn，R.，Roxus，P.and Burny，A.A calcium/calmodulin bindingserine/threonine protein kinase homologous to mammalian type IIcalcium/calmodulin-dependent protein kinase is expressed in plant cells.PlantPhysiol.(1993)101，1381-1384)；從玉米中分離到的鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II的同源物，MCKI和MCK II(Lu YT，Hidaka H，F(xiàn)eldman LJ..Characterization of a calcium/calmodulin-dependent protein kinasehomolog from maize roots showing light-regulated gravitropism.Planta(1996)199，18-24.；Lu YT，F(xiàn)eldman LJ..Light-regulated rootgravitropisma role for，and characterization of，acalcium/calmodulin-dependent protein kinase homolog.Planta(1997)203，S91-S97；嵌合型的鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶(CCaMKs)(Patil S，Takezawa D，Poovaiah BW..Chimeric plant calcium/calmodulin-dependent proteinkinase gene with a neural visinin-like calcium-binding domain.Proceedings of National Academy of Sciences.USA(1995)92，4897-4901；Ramachandiran S，Takezawa D，Wang W，Poovaiah BW..Function domains ofplant chimeric calcium/calmodulin-dependent protein kinaseregulationby autoinhibitory and visinin-like domains.Journal of BiologicalChemistry(1997)121，984-990；Liu ZH，Xia M，Poovaiah BW..Chimericcalcium/calmodulin-dependent protein kinase in tobaccodifferentialregulation by calmodulin isoforms.Plant Molecular Biology(1998)38，889-897；Poovaiah BW，Xia M，Liu ZH，Wang WY，Yang TB，SathyanarayananPV，F(xiàn)ranceschi VR.Developmental regulation of the gene for chimericcalcium/calmodulin-dependent protein kinase in anthers.Planta(1999).209，161-171)。許多這方面的研究表明其參與介導(dǎo)許多細(xì)胞活動(dòng)過程，包括基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞周期，神經(jīng)記憶，碳水化合物代謝，細(xì)胞骨架功能等。利用MCK1為探針，從水稻的cDNA文庫中篩選得到了一種同MCK1同源性很高的蛋白激酶基因(Lei ZHang，Bi-Feng Liu，Shuping Liang，Russell L.Jones andYing-Tang Lu..Molecular and biochemical characterization of acalcium/calmodulin-binding protein kinas from rice.Biochem J.(2002)368，145-157)該基因具有蛋白激酶的12個(gè)保守區(qū)和一個(gè)鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)，以此命名為OsCBK(Oryza sativa calcium/calmodulin-binding protein)。并且對(duì)該基因進(jìn)行了生化分析(Zhang，et al.，2002)。
另外在植物的組織培養(yǎng)中通常按照常規(guī)條件如陳正華主編，高等教育出版社，1986，木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用；(聯(lián)邦德國(guó))賴納特(REINERT，J.)，(英)約曼(YEOMAN，M.M.)著；尤瑞麟，王模善譯，北京大學(xué)出版社，1988，植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)；以及德)巴爾茨(W.Barz)等主編；夏鎮(zhèn)澳等譯，科學(xué)出版社，1983，植物組織培養(yǎng)及其在生物技術(shù)上的應(yīng)用等書中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
在中國(guó)專利02138701(申請(qǐng)中)中，發(fā)明人公開了一種煙草基因序列，該基因在煙草中的表達(dá)導(dǎo)致煙草表現(xiàn)出晚開花性狀。在雜交水稻研究領(lǐng)域，人們一直想通過親本性狀的優(yōu)勢(shì)組合來提高作物的產(chǎn)量，或通過縮短作物的生長(zhǎng)周期實(shí)現(xiàn)二季稻等方式來提高單位面積產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)畝產(chǎn)過于斤的增產(chǎn)目標(biāo)。但是這增加了農(nóng)民的勞動(dòng)強(qiáng)度，并增加了農(nóng)民負(fù)擔(dān)。同時(shí)這些研究都忽視了通過延長(zhǎng)作物特別是水稻的生長(zhǎng)周期，增加千粒重達(dá)到增產(chǎn)目的的方式。更重要的是，將鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因轉(zhuǎn)入類似水稻這種單子葉植物并高效表達(dá)且顯示優(yōu)良性狀是困難的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法，并提供一種能高效表達(dá)鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的植株。該轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)晚開花性狀，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，千粒重增加。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因在水稻中的應(yīng)用。
在本發(fā)明中，為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案，該方法包括下列步驟A.用BamHI酶切已克隆到的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因；B.將A步獲得的基因連接到中間載體pAHC17上，形成pAHC17-R19(+)；C.用HindIII，EcoRI于37℃雙酶切pAHC17-R19(+)，并連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上，使得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因置于泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；D.將制備的載體通過制備的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌EHA105，再導(dǎo)入成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織中；E.篩選陽性植株.將愈傷轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基26℃黑暗培養(yǎng)兩周，轉(zhuǎn)入新的選擇培養(yǎng)基再培養(yǎng)兩周，將抗性愈傷轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中26℃黑暗培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中于4000Lux下，26℃培養(yǎng)至誘導(dǎo)的綠芽3-4cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出根系后，將再生植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)缽中蔭處培養(yǎng)4-5天，最后轉(zhuǎn)入大田中培養(yǎng)至成熟。
在本發(fā)明中，鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因OsCBK序列如序列表所示。該基因用兩種引物RF5(5’-cgggatccatgggtctctgccatggcaag-3’)和RF3(5’cgggatcctcaggtttttgggatggtacgc-3’)。以克隆有鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因的pET32a+載體作為模板DNA，通過PCR方式合成并獲得全長(zhǎng)的水稻鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因OsCBK(Oryza sativa calcium/calmodulin-binding protein)。用BamHI37℃消化PCR獲得的全長(zhǎng)的OsCBK基因并克隆到中間載體質(zhì)粒pAHC17中，形成pAHC17-R19(+)，其插入片段經(jīng)DNA測(cè)序鑒定.pAHC17-R19(+)含有編碼OsCBK全長(zhǎng)597氨基酸的序列。將連有OsCBK全長(zhǎng)及啟動(dòng)子的片段一起切下，連入pCAMBIA1300或pCAMBIA1301，其插入片段經(jīng)DNA測(cè)序鑒定.然后將含有鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因的載體轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌EHA105，培養(yǎng)農(nóng)桿菌于YM液體培養(yǎng)基，并將成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織在菌液中浸泡。在加潮霉素的選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，愈傷組織選自水稻，通過選擇培養(yǎng)基最后篩選到鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶高表達(dá)的植株。
本發(fā)明還公開了鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因在水稻中的應(yīng)用，以及含有鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因高表達(dá)的水稻。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出晚開花性狀，開花時(shí)間比野生型對(duì)照大約推遲了15-20天，相應(yīng)的生育期也延長(zhǎng)。同時(shí)千粒重有約15％的增加，只種一季水稻就有可能提高農(nóng)作物單位面積產(chǎn)量，每畝增產(chǎn)約10-15％。


圖1植物表達(dá)載體示意圖Hygromycin為潮霉素抗性，promoter為泛素啟動(dòng)子，NOS尾巴為轉(zhuǎn)錄終止子。+號(hào)表示基因?yàn)檎虿迦搿D2植物表達(dá)載體構(gòu)建示意3轉(zhuǎn)化植株的核酸分析-PCR鑒定結(jié)果1-8樣為轉(zhuǎn)基因植株，9為對(duì)照野生植株，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株1，2，3，5，6，8成功導(dǎo)入基因于野生植株。圖4轉(zhuǎn)化植株的Southern結(jié)果1-5樣為轉(zhuǎn)基因植株，6為對(duì)照野生植株，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株基因?qū)胛稽c(diǎn)不同。圖5轉(zhuǎn)基因水稻與野生水稻對(duì)比 圖中左為轉(zhuǎn)基因水稻，右為野生水稻。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例。進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1含有鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)圖1和圖2所示，本實(shí)驗(yàn)使用兩種引物，其核酸序列分別為RF5(5’-cgggatccatgggtctctgccatggcaag-3’)和RF3(5’cgggatcctcaggtttttgggatggtacgc-3’)。以RF5/RF3作為引物組合，以克隆有鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因的pET32a+載體作為模板DNA，通過PCR(94攝氏度53min，94攝氏度1min，65攝氏度50s，72攝氏度1min30s，30 cycles，72攝氏度10min)方式合成并獲得全長(zhǎng)的水稻鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因的全長(zhǎng)OsCBK(Oryza sativa calcium/calmodulin-bindingprotein)。將中間載體質(zhì)粒pAHC17用限制性內(nèi)切酶BamHI37攝氏度消化，得到pAHC17/c，同時(shí)將用限制性內(nèi)切酶BamHI37攝氏度消化的DNA片段克隆到pAHC17/c中，得到pAHC17-R19(+)，用HindIII，EcoRI37攝氏度雙酶切pAHC17-R19(+)，得到連有啟動(dòng)子的全長(zhǎng)OsCBK，并連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上(用雙酶切的pCAMBIA1300或pCAMBIA1301載體稱為pCAMBIA1300/c或pCAMBIA1301/c)，使得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因置于泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體，即1300(A4)-R19正向。其插入片段經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后.最終用來轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
實(shí)施例2含有鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的植株的轉(zhuǎn)化與篩選1.農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備將農(nóng)桿菌EHA105劃YM平板，26-28℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落接種到40ml YM液體培養(yǎng)基中，250rpm懸浮培養(yǎng)約12-16小時(shí)，然后在超凈臺(tái)上將菌液轉(zhuǎn)入滅過菌的50ml離心管中，4℃，8000rpm，離心8分鐘，棄上清，用100mMNaCl(4℃預(yù)冷)重懸農(nóng)桿菌，4℃，8000rpm，離心8分鐘，棄上清，加入原始菌液1/50體積(800μl)的20mM CaCl2重懸菌體，并分裝成100μl/管。(此時(shí)的感受態(tài)農(nóng)桿菌可以直接用于轉(zhuǎn)化)，或置液氮中10秒鐘，放入-20℃或-80℃冰廂中保存?zhèn)溆谩?br> 2.農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化將感受態(tài)農(nóng)桿菌置于冰上，加入1μg質(zhì)粒DNA(體積不宜超過10μl)，充分混勻，置冰上30分鐘，置液氮中1分鐘(時(shí)間不能過長(zhǎng))，然后迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中，待其融化后加入1ml YM液體培養(yǎng)基于28℃，230rpm培養(yǎng)2-4小時(shí)，3000rpm離心2分鐘，將上清吸去500μl，留500μl于管中，振蕩重懸菌體，并涂布到含有適當(dāng)抗生素的YM平板上，吹干，28℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取單菌落接種到液體YM培養(yǎng)基中，28℃，250rpm培養(yǎng)48小時(shí)，菌液用于保存或轉(zhuǎn)化。
3.水稻的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將成熟的水稻種子去殼，所用品系為粳稻品種中花11，臺(tái)北309。在超凈臺(tái)上將去殼的種子在70％乙醇中消毒1分鐘后滅菌水清洗種子三次；再用0.15％氯化汞消毒種子20分鐘，滅菌水清洗種子三次，將種子接種在2N6培養(yǎng)基中，于26℃黑暗培養(yǎng)大約五周。將由盾片誘導(dǎo)的愈傷轉(zhuǎn)入新的2N6培養(yǎng)基，26℃黑暗培養(yǎng)大約三周。將愈傷轉(zhuǎn)入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中26℃黑暗預(yù)培養(yǎng)4天。在預(yù)培養(yǎng)的第三天，將含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種于YM/kan液體培養(yǎng)基中26℃250rpm懸浮培養(yǎng)兩天。也可接種到相應(yīng)的平板上培養(yǎng)兩天，收集農(nóng)桿菌重懸于懸浮介質(zhì)中并懸浮培養(yǎng)1小時(shí)后，將細(xì)菌懸液的濃度調(diào)到OD600值為1.0，將預(yù)培養(yǎng)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)入其中浸泡30分鐘，并不時(shí)輕輕晃動(dòng)容器，將愈傷組織轉(zhuǎn)入滅過菌的濾紙上，吸干菌液。將愈傷組織轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基上于19-20℃黑暗培養(yǎng)3天后將愈傷組織轉(zhuǎn)入滅菌水中洗3次再用400ppm的羧芐青霉素溶液浸泡愈傷組織20分鐘，轉(zhuǎn)入滅菌的濾紙上吸去剩余的水分，將愈傷轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基26℃黑暗培養(yǎng)兩周，轉(zhuǎn)入新的選擇培養(yǎng)基再培養(yǎng)兩周，將抗性愈傷轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中26℃黑暗培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中于4000Lux下，26℃培養(yǎng)至誘導(dǎo)的綠芽3-4cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出根系后，將再生植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)缽中蔭處培養(yǎng)4-5天，最后轉(zhuǎn)入大用中培養(yǎng)至成熟。
實(shí)施例3含有鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因轉(zhuǎn)化植株的核酸分析1.用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取根據(jù)圖3所示，70％7醇擦洗葉片，稱取100mg，加入600μl抽提緩沖液(0.2MNaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)，室溫快速研磨，在1.5ml Eppendorf管中渦旋混勻5-20秒于室溫，12000rpm，離心25分鐘。取上清加等體積異丙醇，上下顛倒混勻。-20℃沉淀過夜，室溫條件下，12000rpm，15分鐘。棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入200μl 70％的乙醇泡洗DNA沉淀，室溫，12000rpm，10分鐘。棄乙醇，倒置于紙巾上待其干燥后加100μl TE(pH7.5)溶解沉淀。分光光度計(jì)測(cè)定或電泳估測(cè)DNA濃度，最后以總DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)和電泳檢測(cè)。
2.PCR程序
PCR反應(yīng)混合液的配比同質(zhì)粒PCR鑒定，反應(yīng)的時(shí)間和溫度作如下94攝氏度53min94攝氏度1min，55攝氏度1min，72攝氏度1min30s，30 cycles72攝氏度10min實(shí)施例4含有鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因轉(zhuǎn)化植株的核酸分析Southern雜交1.DNA抽提(CTAB法)根據(jù)圖4所示，稱取水稻樣本新鮮葉片約5克，剪碎放入預(yù)冷的研缽中，用液氮磨成粉末。轉(zhuǎn)移粉末到預(yù)冷的玻璃瓶中，暫存于-20℃冰箱(不超過24小時(shí))加入適量預(yù)熱至100℃的1.5×CTAB抽提液，迅速攪勻后置于56℃水浴中溫浴20分鐘，取出玻璃瓶，冷卻至室溫(切忌低于15℃，以免CTAB發(fā)生沉淀)，將瓶中混合液倒入一支50ml離心管中，加入一倍體積氯仿/異戊醇(24∶1)。反復(fù)顛倒充分混勻，室溫下4000rpm離心20分鐘。將上層液移入一新的50ml離心管，加入1/10體積的10％CTAB(預(yù)熱至56℃)及等體積的氯仿/異戊醇，充分混勻，4000rpm室溫離心20分鐘。吸取上清液至另一新的50ml離心管中，加入等量的1％CTAB沉淀液，輕輕搖晃直至形成DNA絮狀沉淀。3000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底。加入5ml 1M NaCl及5ul RNaseA，置于56℃水浴中過夜。待DNA完全溶解后，加10ml 95％冰乙醇使DNA沉淀。挑出DNA用76％7醇洗30分鐘，再用95％乙醇浸泡5分鐘。將風(fēng)干的DNA溶于適量TE溶液中，存于4備用。
2.DNA的限制性消化，電泳與Southern轉(zhuǎn)移電泳檢測(cè)總DNA質(zhì)量。調(diào)節(jié)所有樣品DNA濃度至200-400ng/ul(最好是250-300ng/ul)每樣品取2.5-3ug總DNA，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，反應(yīng)體積為15ul。置于37℃恒溫箱中6小時(shí)后，加入1.5ul溴酚藍(lán)終止酶切反應(yīng)，取2ul用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切質(zhì)量。酶切反應(yīng)液配方如下DNA 2.5ug10*buffer 1.5ulEnzyme5u
加水至15ul通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，電泳緩沖液為1×TAE，電壓40V，過夜。將凝膠切成19.5×9.5cm大小，右下方切角作標(biāo)記，放在0.2N HCl中變性8分鐘，用雙蒸水漂洗，迅速用0.4N NaOH溶液作為轉(zhuǎn)移液通過毛細(xì)作用原理使膠上DNA片段轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。轉(zhuǎn)移24小時(shí)后取出膜，用2×SSC漂洗兩次(各5分鐘)，晾干放入100-120℃真空烘箱中烘烤3小時(shí)，使DNA固定于膜上。
3.探針標(biāo)記計(jì)算探針混合液中各成分的體積DNA 100ngDNTPs(dATP，dGTP)2.0μl引物 2.0μlklenow Fragment(IU/μl) 1.0μlα-dCTP* 1.0μl加水至 17.0μl取適量待標(biāo)記的探針DNA，加水至規(guī)定體積，于100℃變性10分鐘，冰浴5分鐘。預(yù)先配制dNTP、引物和klenow酶混合液，分裝到各裝有探針DNA的Eppendorf管。最后往各管中加入適量體積的α-32P-dCTP，用槍頭攪勻，25℃溫浴2小時(shí)以上。
4.Southern雜交將新雜交膜用2×SSC打濕，裝入雜交爐中。加入適量體積(10-20ml)預(yù)熱至65℃的預(yù)雜交液，于65℃預(yù)雜交2小時(shí)以上。取出標(biāo)記好的探針，加入500μl雜交液，于100℃變性5分鐘，冰浴5分鐘。將已變性的探針加入雜交爐中，置于65℃恒溫雜交8-10小時(shí)。
5.洗膜、壓片雜交完成后，用含2×SSC，0.2％SDS的洗液在室溫下冷漂洗一次，再用預(yù)熱至65℃的洗液(1×SSC或0.5×SSC，0.1％SDS)于65℃熱洗兩次，各15分鐘。晾半干，迅速用保鮮膜包裹，放入暗夾。在暗室里裝入X-光片，把暗夾放在-80℃冰箱中放射自顯影4-7天，沖洗X-光片。
實(shí)施例5含有鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因轉(zhuǎn)基因水稻與野生水稻的性狀對(duì)比根據(jù)圖5所示，經(jīng)篩選的抗性植株的水稻和同時(shí)種植的對(duì)照植株均種植于武漢大學(xué)室外溫室，于正常季節(jié)栽培，同樣的管理?xiàng)l件，進(jìn)行開花時(shí)間的嚴(yán)格記錄。開花時(shí)間與千粒重等數(shù)值均為株系平均值(見下表)。結(jié)果顯示植株開花時(shí)間生育期都有相應(yīng)延遲，表現(xiàn)出晚開花性狀，開花時(shí)間比野生型對(duì)照大約推遲了15-20天，相應(yīng)的生育期也延長(zhǎng)。同時(shí)千粒重有約15％的增加，只種一季水稻就有可能提高農(nóng)作物單位面積產(chǎn)量，每畝增產(chǎn)10-15％。
生育期(天)穗長(zhǎng)(cm)千粒重(g)理論產(chǎn)量(kg/畝)比對(duì)照晚開花(天)比對(duì)照增產(chǎn)(％)轉(zhuǎn)基因中花11 143.8 17.525.59 624.91 17.5113.7轉(zhuǎn)基因臺(tái)北309 141.6 17.125.95 678.36 15.3115.3對(duì)照(野生) 126.3 16.822.51 553.16
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法及在水稻中的應(yīng)用<130>鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法及在水稻中的應(yīng)用<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2800<212>DNA<213>水稻<400>1cctcctcctc ctcctctctc tctccttcct ccgattcaca cacacacaca ctcctcgccg60tcttgtttct tcttcgtctg ggtggttgat ccatccatcc agagattgcc tgtgcgagga120agggagcggg cgagtggcgg atttgttttt ggtttgtttt tgagtttgtt tttattggtg180gtatcctctc ctcctcctgt gcgaggagca gctggtggat tgttcgttcc agctccgttt240cttgtcttga tttggaatcc gggacatttt tccgcgcccc gtttctggat ttccggtacc300cccccttcct tggtggaagt gggaagggga gggggaagga ttttttggtg gggaattcga360gggggcgagg tgatgaactc ttgcctcttt gaccagcctt gattttcctg gtgattttgc420ttggaatttc tcggattttg tggggggttc tttgatccgg gctccatggg tctctgccat480ggcaagtcgg cggcggtgct ggagccaacg gtggaggagg aggaggaggg ggcgacgcgc540gtagccgagg ccgcggcggc gccggcgaag ccagcgtcgc ctgcgccttc ggcggcggcg600gcggcggcga agcccgggac gccgaagcag cacaagttcc cgttctacct gccgagcccg660ctcccggcgt cgagctacaa gggctcgccg gcgaactcga gcgtggcgtc gacgcccgcg720cgcggcgggt tcaagcggcc gttcccgccg ccgtcgccgg cgaagcacat ccgcgcgctc780ctggcgcggc gccacggctc ggtgaagccg aacgaggcgt ccatcccgga gtccggcgag840cccggcgtgg cgctggacaa gggcttcggc ttctccaggc acttcgccgc caagtacgag900ctcggccgcg aggttggccg cggccacttc ggctacacct gcgccgccac ctgcaagaag960ggcgagctca agggcgacga cgtcgcggtc aaggtcatcc ccaaggccaa gatgactact 1020gctattgcca ttgaagatgt caggagagaa gtcagaatat tgagttcttt ggcagggcac 1080agcaacttag tgcagtttta tgatgcttat gaggatgaag aaaatgtata tatagttatg 1140gagttatgca aaggaggtga actgctggac aggattttgg ctagaggtgg aaaatattct 1200gaggaagatg caaaggttgt tatgcgccaa atcctaagtg ttgcttcatt ttgtcatctt 1260cagggtgttg ttcatcggga tctgaaacca gagaatttcc ttttctcgtc aaaggatgag 1320aactctgcca tgaaggtcat agacttcggt ttgtctgact ttgtaaagcc agatgagagg 1380cttaatgaca ttgtcggaag tgcatattat gttgctcctg aagtgctcca tcgatcttat 1440ggcactgagg cagatatgtg gagcattgga gtaatagtgt atattttgct ttgtggcagc 1500cgtcctttct gggcacgtac tgagtcagga atattccgag ctgtgctgaa agcagaccct 1560agttttgagg aagccccatg gccaaccctc tctgctgaag caaaagactt tgtaaggagg 1620ctgctcaata aagattaccg caagaggatg actgctgcac aagccctctg tcatccatgg 1680attcgtggta ctgaagaagt gaagcttcct ttggacatga taatttatag gcttatgagg 1740gcttacataa gttcatcttc tttacggaga gctgcattga gggcccttgc caagacattg 1800acaacagatc aaatctatta cctaagagaa cagtttgaat tgataggccc aaacaagagc 1860gatcttatta ctttgcaaaa tttgaagacg gccttgatga agaactccac aaatgcaatg 1920aaggattcta gggtggttga ctttgttaac acaatatcca atattcagta cagaaagttg 1980gattttgagg agttttctgc tgctgccatc agtgtttacc agatggaagg tttggaaacc 2040tgggaacaac atgcccggca agcgtacgag ttctttgata aggagggtaa ccgaccaatt 2100gtgatcgacg agctcgcatc gggacttgga ttgggtcctt cggttcccct acatgttgtt 2160ctccaagatt ggatcagaca tcctgatgga aaactcagct tccttgggtt catgaaacta 2220ttgcatggag tttcttcgcg taccatccca aaaacctgag ataataactt attttcttac 2280atcaaccaac aaaagtgtga tgactaaact aatctctggc tgtctggaga agcggcatgg 2340aaccagtaca aagattaaca aagctgtcct agtgtaacaa gtgaaaaagc tctcctgtca 2400ggcccgcgaa tttcgccttc tctttaccag atgattgatg ttgcgtttga tatcaggttt 2460gtttagaggt ggaatgtaca gatgagttta ggaaacagca aaaatgaggt gctaagaagt 2520gaaacatggt ttaatttcga ttggtgtaac tgtgtgcgtt tgatcttcgc cgatctgtga 2580atgtcgtgat tggactgaaa ttgagaagtg aggtggtatc agtaccatat tcgtagatat 2640ttcttgagtt tttttttctt attgaaattt actcgtgttt atttgcaata gtttggctca 2700ttggctgtac atcgatgtga tgaaaacgat atcaattttt ttttgcataa acaatatcag 2760tatggttagg aattttttat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2800
權(quán)利要求
1.一種鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法，包括下列步驟A.用BamHI酶切已克隆到的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因；B.將A步獲得的基因連接到中間載體pAHC17上，形成pAHC17-R19(+)；C.用HindIII，EcoRI于37℃雙酶切pAHC17-R19(+)，并連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上，使得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因置于泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；D.將制備的載體通過制備的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌EHA105，再導(dǎo)入成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織中；E.篩選陽性植株.將愈傷轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基26℃黑暗培養(yǎng)兩周，轉(zhuǎn)入新的選擇培養(yǎng)基再培養(yǎng)兩周，將抗性愈傷轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中26℃黑暗培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中于4000Lux下，26℃培養(yǎng)至誘導(dǎo)的綠芽3-4cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，長(zhǎng)出根系后，將再生植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)缽中蔭處培養(yǎng)4-5天，最后轉(zhuǎn)入大田中培養(yǎng)至成熟。
2.權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因在水稻中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鈣調(diào)素結(jié)合型蛋白激酶基因的制備方法和它在水稻中的應(yīng)用。其步驟為A.用BamHI酶切已克隆到的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因；B.將A步獲得的基因連接到中間載體pAHC17上，形成pAHC17－R19(+)；C.用HindIII，EcoRI雙酶切pAHC17－R19(+)，并連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pCAMBIA1300或pCAMBIA1301上，使得鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因置于泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；D.將制備的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，再導(dǎo)入成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織中；E.篩選陽性植株。本發(fā)明的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白激酶基因在水稻中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)晚開花狀，生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，千粒重增加，可以提高單位面積產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1462802SQ0312814
公開日2003年12月24日 申請(qǐng)日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者呂應(yīng)堂, 梁述平, 王盈, 張蕾, 楊萬年 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)