專利名稱：一種使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種領(lǐng)域，更特別的，本發(fā)明是一種使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，單倍體育種技術(shù)主要是以小孢子處于單核期的花藥為材料接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，使小孢子細(xì)胞分化后分裂形成愈傷組織或胚狀體，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)成苗，然后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，形成完整植株，再移栽到田間育種。移栽前后可進(jìn)行加倍處理，以獲得純合二倍體植株后代。
然而，由于現(xiàn)有的單倍體育種技術(shù)要將植株移栽到田間才能結(jié)出種子，這就在一定程度上造成以下的缺陷(1)所需時(shí)間較長；(2)需要相當(dāng)面積的試驗(yàn)田來移栽植株；(3)在試驗(yàn)田培育將會(huì)受到自然條件的影響，如果移栽到溫室則育種成本非常的高。
因此，如果可以使植物在培養(yǎng)瓶內(nèi)直接結(jié)出種子，這樣就不必再移栽到田間去育種了，從而不僅不需要試驗(yàn)田用地、節(jié)省了人力物力，還使植株的培育不受到不可預(yù)測(cè)環(huán)境因素的影響，并且很大程度降低了育種所需成本。
小繁縷屬于石竹科，繁縷屬，為二年生草本，苗期10-11月，花期3-4月，果期4-5月。二歧聚傘狀花序，無花瓣，果實(shí)成熟后開裂，種子散落土壤，種子細(xì)小，徑約0.55mm，紅褐色，圓腎形。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，在本發(fā)明的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法包括(1)配制適合小繁縷生長的培養(yǎng)基；
(2)將小繁縷植株組織栽種在含有(1)所述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中；(3)將(2)所述的包含植株組織和培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶置于一定的溫度和光照條件下，使植株生長；(4)觀察生長情況，直至植株結(jié)籽。
本發(fā)明使用的小繁縷無菌苗可以通過外植體滅菌培養(yǎng)而成，將小繁縷無菌苗分割成一段莖帶一片葉子的小段。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)基可以選擇適合所培養(yǎng)植物生長的成分作為配制原料，培養(yǎng)基內(nèi)還可以加入諸如生長素(如IBA、NAA、6-BA)、細(xì)胞分裂素等有利于植物生長發(fā)育的成分。經(jīng)過發(fā)明人多種條件多次試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)小繁縷時(shí)，培養(yǎng)基可以選用MS培養(yǎng)基(配方參照《植物組織培養(yǎng)技術(shù)》32頁，其中蔗糖和瓊脂另加，上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1995)，在所述的培養(yǎng)基還添加IBA、NAA、6-BA、蔗糖和瓊脂。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)小繁縷的光照條件可以為210-4500LX，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，培養(yǎng)小繁縷的光照條件選擇2400LX-2600LX。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)小繁縷較適宜的溫度為16-28℃，作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，培養(yǎng)小繁縷的溫度條件選擇20-24℃(即22±2℃)。
本發(fā)明所述的方法使小繁縷植物在培養(yǎng)瓶內(nèi)直接結(jié)出種子，這樣就不必再移栽到田間去育種。使用本發(fā)明的方法，不僅不需要試驗(yàn)田用地、節(jié)省了人力，還使植株的培育不受到不可預(yù)測(cè)環(huán)境因素的影響，并且很大程度降低了育種所需成本。


圖1顯示了實(shí)施例1中培養(yǎng)架1小繁縷的平均每瓶結(jié)籽數(shù)；圖2顯示了實(shí)施例1中培養(yǎng)架1小繁縷的結(jié)籽比率；圖3顯示了實(shí)施例2中小繁縷的平均每瓶結(jié)籽數(shù)；圖4顯示了實(shí)施例2中小繁縷的結(jié)籽比率。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明
實(shí)施例1 不同條件下小繁縷植株的培育試驗(yàn)1.設(shè)計(jì)并配制F系列培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基各分裝20瓶備用。培養(yǎng)基的配方如下表(表1)表1F1 MS+IBA(1.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F2 MS+IBA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F3 MS+IBA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F4 MS+IBA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F5 MS+NAA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F6 MS+NAA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F7 MS+NAA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F8 MS+6-BA(2.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F9 MS+6-BA(1.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F10 MS+6-BA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)F11 MS+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)2.將小繁縷無菌苗分成一段莖帶一片葉子的小段，每瓶培養(yǎng)基中接3段，分別放在4個(gè)區(qū)域培養(yǎng)(表2)，光照時(shí)間都為12個(gè)小時(shí)。
表2區(qū)域每一種培總瓶數(shù)光照強(qiáng)度(LX) 溫度(℃)養(yǎng)基瓶數(shù)培養(yǎng)架1555 250022±2培養(yǎng)架2555 210 22±2培養(yǎng)箱1555 450022±2培養(yǎng)箱2555 450016±2根據(jù)表2，培養(yǎng)架1、培養(yǎng)架2和培養(yǎng)箱1可以比較相同溫度不同光照強(qiáng)度的生長情況，培養(yǎng)箱1和培養(yǎng)箱2可以比較相同光照強(qiáng)度不同溫度的生長情況，而相同的光照和溫度下就可以比較不同培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況。每隔7天對(duì)每一瓶小繁縷做一次觀察記錄。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)架1中的F2(1瓶)有一透明桃形囊，內(nèi)有籽數(shù)粒；F4(3瓶)其中一瓶有桃形囊2個(gè)，內(nèi)有籽數(shù)粒，另有籽6粒在培養(yǎng)瓶內(nèi)，紅褐色，一瓶有籽1粒在培養(yǎng)基上，一瓶，有桃形囊1個(gè)，內(nèi)有籽數(shù)粒，有1粒籽落在培養(yǎng)基上；F7(1瓶)有籽一粒在培養(yǎng)基上；F11(2瓶)其中一瓶有籽3粒落在培養(yǎng)基上，另一瓶有籽6粒落在培養(yǎng)基上；在F1，F(xiàn)5，F(xiàn)6，F(xiàn)8，F(xiàn)9，F(xiàn)10內(nèi)培養(yǎng)的小繁縷，無論是在培養(yǎng)架還是培養(yǎng)箱處的，不但沒有結(jié)籽，而且都表現(xiàn)為植株矮小，葉片也很小，甚至有的植株發(fā)黃，瀕臨死亡。
清點(diǎn)各瓶內(nèi)籽的數(shù)目見下表(表3)表3培養(yǎng)架 培養(yǎng)架 培養(yǎng)架 培養(yǎng)架 培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱 培養(yǎng)箱1平均 1結(jié)籽 2平均 2結(jié)籽 1平均 1結(jié)籽 2平均 2結(jié)籽每瓶結(jié) 比 率 每瓶結(jié) 比 率 每瓶結(jié) 比 率 每瓶結(jié) 比 率籽 數(shù) (％) 籽 數(shù) (％) 籽 數(shù) (％) 籽 數(shù) (％)(粒) (粒) (粒) (粒)F1 0 0 0 0 0 0 0 0F2 26/5 20 0 0 0 0 0 0F3 0 0 0 0 0 0 0 0F4 21/5 60 0 0 0 0 0 0F5 0 0 0 0 0 0 0 0F6 0 0 0 0 0 0 0 0F7 1/520 0 0 0 0 0 0F8 0 0 0 0 0 0 0 0F9 0 0 0 0 0 0 0 0F10 0 0 0 0 0 0 0 0F11 9/540 0 0 0 0 0 0培養(yǎng)架1上各培養(yǎng)基的結(jié)籽情況圖見圖1和圖2。很明顯，培養(yǎng)架1的培養(yǎng)條件(2500LX，22±2℃)是較適合小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的。可以看出太低的光照強(qiáng)度(210LX)和太高的光照強(qiáng)度(4500LX)都不利于小繁縷的結(jié)籽，而對(duì)于溫度來講，由于培養(yǎng)箱1和培養(yǎng)箱2的結(jié)籽情況都不好所以不能比較，但根據(jù)培養(yǎng)架1的情況，22±2℃適合于小繁縷的結(jié)籽。所以在下述的實(shí)施例2中使用了(2500LX，22±2℃)的培養(yǎng)條件。
可見，在2500LX，22±2℃的培養(yǎng)條件下，F(xiàn)2，F(xiàn)4，F(xiàn)11培養(yǎng)基較適合小繁縷的結(jié)籽，其中F11是MS培養(yǎng)基，說明不加任何植物生長素和細(xì)胞分裂素也能使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽。另外F2、F4的結(jié)籽情況都較好，但F3所含的IBA濃度(0.1mg/L)是界于F2(0.5mg/L)和F4(0.02mg/L)之間的，而F3沒有一瓶結(jié)籽，這可能是由實(shí)驗(yàn)失誤造成。
在F7內(nèi)培養(yǎng)的小繁縷有一瓶結(jié)了一粒籽，說明NAA濃度較低(0.02mg/L)時(shí)，小繁縷是可以正常生長并結(jié)籽的。在F1，F(xiàn)5，F(xiàn)6，F(xiàn)8，F(xiàn)9，F(xiàn)10內(nèi)培養(yǎng)的小繁縷，不但沒有結(jié)籽，而且都表現(xiàn)為植株矮小，葉片也很小，甚至有的植株發(fā)黃，瀕臨死亡，這說明生長素的濃度太高(NAA0.1mg/L以上，IBA1.0mg/L以上)會(huì)抑制小繁縷的生長，使之不能結(jié)籽，甚至使其死亡；同樣的細(xì)胞分裂素的濃度太高(6-BA0.5mg/L以上)也會(huì)抑制小繁縷的生長使之不能結(jié)籽，甚至使其死亡。
實(shí)施例2 小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的驗(yàn)證試驗(yàn)為了確證實(shí)施例1的初步結(jié)果不是純屬偶然的，發(fā)明人又進(jìn)一步做了以下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
1.配制R系列培養(yǎng)基，配方如下(表4)表4R1 MS+IBA(1.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)R2 MS+IBA(0.75mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)R3 MS+IBA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)R4 MS+IBA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)R5 MS+IBA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)R6 MS+NAA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)R7 MS+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)2.將小繁縷無菌苗分成一段莖帶一片葉子的小段，每瓶培養(yǎng)基中接3段，每一種培養(yǎng)基接5瓶，并標(biāo)上序號(hào)，放在2500LX，22±2℃條件下培養(yǎng)。每隔7天對(duì)每一瓶小繁縷做一次觀察記錄。
91天后，結(jié)籽情況如下(表5、表6)表5第一瓶結(jié) 第二瓶結(jié) 第三瓶結(jié) 第四瓶 第五瓶結(jié)籽數(shù)(粒) 籽數(shù)(粒) 籽數(shù)(粒) 結(jié)籽數(shù) 籽數(shù)(粒)(粒)R1 000 0 0R2 000 0 0R3 090 13 0R4 709 1 21R5 8017 2 0R6 020 0 0R7 11 60 0 9表6平均每瓶結(jié)籽數(shù)＝ 結(jié)籽比率＝總粒數(shù)/總瓶數(shù) 結(jié)籽瓶數(shù)/總瓶數(shù)(％)R100R200R3 22/5 40R4 38/5 80R5 27/5 60R6 2/5 20R7 26/5 60結(jié)籽情況圖見圖3和圖4?？梢奟3(原來的F2)、R5(原來的F4)、R7(原來的F11)結(jié)籽情況較好，這與我們的第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，說明我們第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不是偶然現(xiàn)象；其中R4(原來的F3)結(jié)籽情況也較好說明第一次實(shí)驗(yàn)F3沒有結(jié)籽可能是實(shí)驗(yàn)失誤造成的；R6(原來的F7)雖然也有結(jié)籽但只有一瓶結(jié)了2粒。R1(原來的F1)不但沒有結(jié)籽，而且都表現(xiàn)為植株矮小，葉片也很小，甚至有的植株發(fā)黃，瀕臨死亡，這與我們的第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也是一致的。
R2也不但沒有結(jié)籽，而且都表現(xiàn)為植株矮小，葉片也很小說明生長素IBA0.75mg/L的濃度會(huì)抑制小繁縷的生長。
綜合實(shí)施例1以及實(shí)施例2的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)1.小繁縷在MS或者M(jìn)S加生長素(IBA0.5mg/L)以下的培養(yǎng)基里，在光照2500LX，溫度22±2℃的培養(yǎng)條件下是可以結(jié)籽的。
2.生長素的濃度太高(NAA0.1mg/L以上，IBA0.75mg/L以上)會(huì)抑制小繁縷的生長，使之不能結(jié)籽，甚至使其死亡；同樣的細(xì)胞分裂素的濃度太高(6-BA0.5mg/L以上)也會(huì)抑制小繁縷的生長使之不能結(jié)籽，甚至使其死亡。
3.在MS+NAA(0.02mg/L)+蔗糖(30g/L)+瓊脂(4g/L)培養(yǎng)基內(nèi)，小繁縷兩次都結(jié)籽了，但結(jié)籽數(shù)分別只有1粒和2粒，即可能NAA(0.02mg/L)的濃度適合小繁縷的生長，但不太適合小繁縷的結(jié)籽。
4.本實(shí)施例中，把實(shí)施例1中結(jié)的籽移入MS培養(yǎng)基，在光照2500LX，溫度22±2℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些籽能在培養(yǎng)瓶內(nèi)發(fā)芽，并長大，并且同樣能在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽。這說明單倍體育種是可以完全在培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行的，如果在培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行單倍體育種，就不用將植物移栽到大田里受自然條件的影響，同時(shí)可以大大的縮短單倍體育種的時(shí)間。
權(quán)利要求
1. 一種使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于所述的方法包括(1)配制適合小繁縷生長的培養(yǎng)基；(2)將小繁縷植株組織栽種在含有(1)所述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中；(3)將(2)所述的包含植株組織和培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶置于16～28℃的溫度和210～4500LX的光照條件下，使植株生長；(4)觀察生長情況，直至植株結(jié)籽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于所述的小繁縷植株組織是將小繁縷無菌苗分割形成的一段莖帶一片葉子的小段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于在所述的培養(yǎng)基中添加有IBA、NAA、6-BA、蔗糖和瓊脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于所述的IBA占所述的培養(yǎng)基的重量百分比在0.01-0.70mg/L之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于所述的光照條件為2400LX～2600LX。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，其特征在于所述的溫度條件為20～24℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使小繁縷在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽的方法，采用本發(fā)明的方法，不用將小繁縷移栽到大田里，而讓小繁縷直接在培養(yǎng)瓶內(nèi)結(jié)籽，這樣不必將植株移栽到大田里，這樣可以大大縮短單倍體育種的時(shí)間，節(jié)省人力物力，降低成本。
文檔編號(hào)A01G9/02GK1552197SQ03129078
公開日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月5日
發(fā)明者周偉明, 李晨, 朱偉, 沈?qū)W峰 申請(qǐng)人:周偉明, 上海南匯中學(xué)