專利名稱：殺線蟲生防菌代謝物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水溶性新型殺線蟲生物制劑及其制備和應用，特別涉及總狀共頭霉代謝物及其制備方法。
背景技術：
植物寄生線蟲是植物病害的重要病原物之一，由于其寄生范圍廣，環(huán)境適應性強，幾乎每種作物都受到線蟲侵害，由于線蟲的危害日趨嚴重，對農(nóng)作物生產(chǎn)構成嚴重威脅，每年由于植物寄生線蟲危害造成全球農(nóng)作物方面的損失高達1000億美元(Sasser&Freckman，1987)，占整個病蟲害引起損失的2/3。
我國地處溫帶和亞熱帶，氣候適宜于線蟲的活動和繁殖，世界性重要植物線蟲病害在我國均有發(fā)生。尤其是隨著耕作制度的改革和復種指數(shù)的提高，大豆、蔬菜、小麥、水稻、花生、果樹等植物的線蟲病害發(fā)生危害越來越嚴重，損失也日益嚴重。目前，甘薯莖線蟲在我國的甘薯基地盧龍泛濫成災，減產(chǎn)60-70％，嚴重時造成絕產(chǎn)，當?shù)剞r(nóng)民深受其害；大豆孢囊線蟲在我國的發(fā)生面積常年在2000萬畝以上，造成產(chǎn)量損失15-20％，嚴重的達50-80％以上；蔬菜根結線蟲在保護地中造成的損失達20-30％，嚴重地可達70％，甚至絕產(chǎn)，如番茄及黃瓜根結線蟲病在華北、西北等保護地和華南露地泛濫成災；花生根結線蟲病在山東發(fā)生有40多年歷史，對花生產(chǎn)量影響極大，嚴重的減產(chǎn)70-80％；目前被稱為“松樹癌癥”的松材線蟲病在我國的發(fā)生呈蔓延擴散的趨勢，松材線蟲肆虐，在距著名風景區(qū)黃山70公里的地方已有松材線蟲危害而引起我國政府的高度關注；特別是植物線蟲與細菌、真菌、病毒等多種病原物共同作用造成對植物的復合侵染，其危害更嚴重、損失更大。植物線蟲病害使我國各種作物年平均產(chǎn)量損失達10-15％。
所以植物寄生線蟲，已成為全世界農(nóng)作物產(chǎn)量的一個不容忽視的限制性重要因素，引起了世界各國的高度重視。要提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，治理土壤及植物寄生線蟲在近幾年已成為一個全球性的、新的、迫切需要解決的重要問題。
目前化學農(nóng)藥仍然是控制植物線蟲病重要的措施之一，但殺線蟲劑的品種甚少。全世界約30種，常用的不過10余種。有的殺線蟲劑被發(fā)現(xiàn)有致畸、致癌、導致不育等劇毒作用，被撤消注冊商標、禁止停用，有的在被重新審查。由于缺乏有效和安全的殺線蟲劑，現(xiàn)有化學殺線蟲劑多為劇毒農(nóng)藥。其用量高、花費大、且?guī)砣诵笾卸?、污染地下水源及食品等嚴重問題。恰恰相反，生物防治克服了上述問題。因此線蟲的生物防治日益受到世界各國的普遍重視(RobinN.Heuttel，1996)，成為線蟲病害防治研究的重點和熱門；目前線蟲病害的生物防治發(fā)展趨勢是利用真菌、細菌等微生物資源開發(fā)生物農(nóng)藥來代替化學農(nóng)藥。但是當前線蟲生防存在以下的主要問題
1.目前，線蟲生防中研究最多的生防因子有捕食線蟲真菌、內寄生真菌和寄生性細菌，這些為第一代線蟲生防因子。此類線蟲生防制劑系屬活菌劑，所以存在著以下缺點1)受環(huán)境因素影響大，如溫度、各地土壤條件不同并存在不同程度的抑菌作用等而導致其穩(wěn)定性較差、效果不一致等；2)為保證菌體存活率，在保存上有較嚴格的條件限制、由于活菌劑不好保存，使得貨架期較短；3)活菌一般行專性寄生，即專一性強，因此殺蟲譜較窄。上述問題的存在使第一代線蟲生防制劑(活菌劑)的應用受到限制，尚未廣泛及大規(guī)模生產(chǎn)和應用。
2.為克服活菌劑使用上的缺點，目前人們更加重視線蟲生防第二代產(chǎn)品，即對微生物菌株的次生代謝產(chǎn)物的研究。這是當前國內外研究的熱門領域。特別是從真菌代謝物中尋找殺線蟲活性物質已成為新的研究熱點，國內也已開始重視對殺線蟲真菌代謝物的開發(fā)研究，但已發(fā)現(xiàn)的真菌殺線蟲代謝物大多為脂溶性，水中溶解度較差，需加增效劑來助溶，這給真菌代謝物的實際應用造成了困難。另外，大多數(shù)的微生物代謝物中的目標化合物濃度較低，需要進行濃縮后才可使用；再有，有些代謝物對腐生線蟲(土壤中的自由生活線蟲)有較強活性，而對使農(nóng)作物和林木受到嚴重危害的根結線蟲和松材線蟲活性小，甚至沒有活性；因此，實驗應以造成嚴重危害的松材線蟲和根結線蟲來衡量代謝物生防潛力的高低，而且也應以此作為篩選菌株的基本依據(jù)(董錦艷等2001)。
3.絲狀真菌在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及基礎生物學研究中具有重要作用。關于利用絲狀真菌代謝物防治線蟲的報道涉及較少(報道最多的是淡紫擬青霉，其次是長臂木霉)，而有關利用絲狀真菌總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)代謝產(chǎn)物殺線蟲及產(chǎn)業(yè)化方面的研究尚未見報道。
綜上所述，現(xiàn)在對防治線蟲病害生物農(nóng)藥的市場需求量很大，但卻缺少合適的生防制劑，市場存在很大空白。因此，目前急需篩選高效、廣譜殺線蟲活性物質產(chǎn)生菌及水溶性代謝物，以便開發(fā)新型實用制劑，這是當務之急。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題針對上述問題，本發(fā)明提供了一種成本低、殺線蟲活性高、殺蟲譜廣、熱穩(wěn)定性強、水溶性的新型殺線蟲生物農(nóng)藥。它不僅克服了化學農(nóng)藥毒性的危害，而且克服了第一代線蟲生防活菌劑，受環(huán)境因素影響大的種種弊病，同時還解決了多數(shù)第二代線蟲生防因子屬于脂溶性、水中溶解度較差，給使用帶來的困難。從而為生物防治植物寄生線蟲病害、開發(fā)新型微生物殺線劑，實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。
技術方案本發(fā)明的殺線蟲生防菌代謝物，它是活性菌株總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)的代謝產(chǎn)物；其殺線蟲活性組分的基本組成為帶兩個結晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物、含氨基化合物和其它有機酸；在該代謝物中活性組分含量之和為100％。其中帶兩個結晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物和其它有機酸含量之和不小于80％，且其之間的含量比為(2.5-3.5)∶(1.8-2.5)∶(1.5-2.5)。其它有機酸包括酒石酸、蘋果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有機酸含量的90-95％。此外還含丙二酸等。
該代謝物的活性成分8配位鉀的乙二酸配合物，為一種新型結構物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，結構如圖1所示； 兩個結晶水的乙二酸分子式為(H2C2O4)(H2O)2；該生防菌代謝物的特性溶解性為水溶性，并能以任意比溶于水；熱穩(wěn)定性121℃處理15-20min，活性不低于原活性的95％；生物活性取1ml發(fā)酵原液作用1500條松材線蟲，線蟲死亡率為100％；將發(fā)酵原液稀釋一倍后，取1ml作用1500條松材線蟲，線蟲死亡率為70-95％；殺線蟲譜；它可廣泛用于松材線蟲、根結線蟲、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲重要植物寄生線蟲病害的生物防治。
殺線蟲生防菌代謝物的制備方法，是以總狀共頭霉(Syncephalastrumracemosum)為菌種，通過液體通氣培養(yǎng)菌株而產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，然后進行劑型加工制得；具體步驟如下●菌種的培養(yǎng)菌株斜面保存使用馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基即PSM培養(yǎng)基；斜面菌種26℃靜置培養(yǎng)6-7天，然后放入4℃冰箱保存；●活性代謝物的制備將上述斜面菌種，進行液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)選擇PSM培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖PS培養(yǎng)基、普通蛋白胨蔗糖培養(yǎng)基、馬鈴薯甘油培養(yǎng)基中的一種；初始pH可調范圍3.5-8；再經(jīng)真空抽濾，獲得含活性代謝物的發(fā)酵原液；液體培養(yǎng)從下述兩種方法中任選一種1)、搖瓶培養(yǎng)用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，在500毫升三角瓶中，以每75-125毫升液體培養(yǎng)基中加入104-107孢子，轉速120-220rpm，培養(yǎng)4-6天；2)、發(fā)酵罐發(fā)酵首先進行一級種子的制備，即用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入106孢子，26℃，pH4-6，靜置或者170rpm振蕩培養(yǎng)21-30小時；然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3-5％的一級種子，26℃，通氣攪拌，發(fā)酵36-68h，發(fā)酵罐發(fā)酵時間也可以是45-60h；通氣量為1∶0.5-1∶0.75，轉速為300-350rpm；●劑型加工將上述獲得的含活性代謝物的發(fā)酵原液，按照下述一種方法進行處理A.發(fā)酵原液可直接作為殺線蟲生防制劑使用；B.濃縮液發(fā)酵原液經(jīng)過薄膜蒸發(fā)，制備成濃縮水劑；C.粗制粉劑發(fā)酵原液經(jīng)真空冷凍干燥制得。
需要說明的是，液體培養(yǎng)基是馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基(PSM培養(yǎng)基)即300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖，麥芽精2g/L；或馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS培養(yǎng)基)即200-300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖；初始pH為4-6。
搖瓶培養(yǎng)也可以是以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入104-106孢子，轉速120-170rpm，培養(yǎng)4-6天；
搖瓶培養(yǎng)時采用下述三種方法中的任意一種培養(yǎng)方式A.26℃靜置培養(yǎng)6-7天；B.溫度為26℃，用120-220rpm搖床培養(yǎng)4--6天，以104-106孢子數(shù)接種于20020的PS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的初始pH為4-6；C.從28-18℃，170rpm搖床變溫培養(yǎng)4-7天。
該代謝物具有殺線蟲的廣譜性，可用于松材線蟲、根結線蟲、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲、重要植物寄生線蟲病害的生物防治。此外還可用于黃瓜、芹菜等蔬菜寄生線蟲的生物防治。
熱穩(wěn)定性檢測試驗將獲得的活性菌株發(fā)酵液，放在高壓滅菌鍋中，在121℃、滅菌20min，然后測定其生物活性，與未滅菌發(fā)酵液生物活性相比，僅降低2％左右，證明該活性代謝物具有熱穩(wěn)定性。
發(fā)酵濾液生物活性檢測方法用松材線蟲作為供試線蟲，在96孔細胞培養(yǎng)板中依次加入0.2ml1/2濃度的發(fā)酵原液和0.02ml線蟲懸液(含線蟲300條)，26℃培養(yǎng)一定時間用解剖鏡觀察統(tǒng)計線蟲死亡率，發(fā)酵液活性以殺線率％表示，殺線率％＝{1-游動線蟲數(shù)/線蟲總數(shù)}*100％-空白對照死亡率。
有益效果本發(fā)明利用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術，可快速、簡便地獲得成本低、生物活性強、廣譜性的殺線蟲生物制劑，即總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)的代謝產(chǎn)物。這種新型線蟲生防制劑為水溶性，能以任意比溶于水，施用方便；而且，其熱穩(wěn)定性強利于制劑加工。該代謝產(chǎn)物中含一種新型結構物的8配位鉀的乙二酸配合物，為今后對其進行設計改造、調控，開發(fā)一類新型殺線蟲活性物質，打下良好的基礎；這對線蟲的生物防治以及微生物農(nóng)藥的研制開發(fā)具有重要的理論意義和廣闊的開發(fā)前景。本發(fā)明產(chǎn)品不僅可以制成濃縮液，而且還可加工成粉劑，便于運輸和保存。這種殺線蟲生防菌代謝物，生物活性強；發(fā)酵原液，不用濃縮，即可直接使用，而且藥效高，1ml發(fā)酵原液作用1500條松材線蟲，線蟲死亡率為100％。其發(fā)酵原液不經(jīng)濃縮，甚至在稀釋一倍后，殺蟲率仍在75％-95％。該菌代謝物，除對松材線蟲有極高的活性外，作為一種植物寄生線蟲的生防制劑，在實驗室、溫室及大田小區(qū)試驗的防治根結線蟲、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲等的應用實驗都取得了很好效果。結果表明，該活性菌株的代謝物對上述重要的植物寄生線蟲有很強的抑制作用；如大田小區(qū)防治甘薯莖線蟲試驗的防效達到71.5％；保護地大棚的防治蕃茄根結線蟲實驗，代謝物施用量6.7L/畝，防治效果達到57.3％；番茄增產(chǎn)60％以上，增產(chǎn)率高于施用化學農(nóng)藥溴甲烷(增產(chǎn)39％)的結果；另外溫室實驗證實其50倍稀釋液對大豆孢囊線蟲仍有抑制作用，孢囊減少率為60.7％，相當于同期使用的化學農(nóng)藥的水平。以上實驗證實，該代謝物具有一定的殺線蟲的廣譜性，可廣泛用于松材線蟲、根結線蟲、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲重要植物寄生線蟲病害的生物防治。此外，還可用于黃瓜、芹菜等蔬菜寄生線蟲的生物防治。它不僅克服了化學農(nóng)藥毒性的危害；而且克服了第一代線蟲生防活菌劑，受環(huán)境因素影響大的種種弊病；同時還解決了多數(shù)第二代線蟲生防因子屬于脂溶性、給使用帶來的困難。從而為生物防治植物寄生線蟲病害、開發(fā)新型微生物殺線蟲制劑，實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。實驗證明，該菌代謝物在生物防治植物寄生線蟲病害、生產(chǎn)綠色無污染農(nóng)作物蔬菜等方面將有廣闊的開發(fā)潛力和應用前景。總之，以上特性，使其在今后開發(fā)應用上占有很大的優(yōu)勢，因此，該發(fā)明將對植物寄生線蟲的生物防治以及微生物農(nóng)藥的研制開發(fā)、實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，具有重要的理論意義和應用價值。


圖1為8配位鉀的乙二酸配合物的結構圖具體實施方式
實施例1利用液體通氣培養(yǎng)發(fā)酵制備抗線蟲活性物質的方法，包括以下步驟以總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)為菌種，具體的制備工藝如下(1)菌種的培養(yǎng)菌株斜面保存使用PSM培養(yǎng)基(馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖，麥芽精2g/L)，所有的斜面菌種于26℃靜置培養(yǎng)6天，放入4℃冰箱保存。
(2)活性代謝物的制備采用搖瓶培養(yǎng)即用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以106孢子接種于PSM液體培養(yǎng)基(500ml三角瓶裝液量100ml)中，初始pH6.5，26℃，搖床轉速170rpm培養(yǎng)4天。
(3)劑型加工將上述液體培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物進行真空抽濾，獲得原發(fā)酵濾液。
本實施例所獲的代謝物中殺線蟲活性組分的基本組成為帶兩個結晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物、氨基化合物和其它有機酸；活性組分含量之和為100％。其中帶兩個結晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物和其它有機酸含量之和不小于80％，且其之間的含量比為2.5∶1.8∶1.5；其它有機酸包括酒石酸、蘋果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有機酸含量的95％。該代謝物的活性成分8配位鉀的乙二酸配合物，為一種新型結構物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，結構如圖1所示；兩個結晶水的乙二酸分子式為(H2C2O4)(H2O)2；熱穩(wěn)定性檢測試驗將獲得的活性菌株發(fā)酵液，放在高壓滅菌鍋中，在121℃、滅菌20min，然后測定其生物活性，與未滅菌發(fā)酵液生物活性相比，活性為原活性的98％；證明該活性代謝物具有熱穩(wěn)定性。
發(fā)酵濾液生物活性檢測用松材線蟲作為供試線蟲，在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入0.2ml1/2濃度的發(fā)酵原液和0.02ml線蟲懸液(含線蟲300條)，26℃培養(yǎng)一定時間用解剖鏡觀察統(tǒng)計線蟲死亡率，發(fā)酵液活性以殺線率％表示，殺線率％＝{1-游動線蟲數(shù)/線蟲總數(shù)}*100％-空白對照死亡率。采用生物活性檢測方法測得，發(fā)酵原液稀釋一倍后的殺線率為85％。
實施例2
改變液體培養(yǎng)基配方，只接種于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS培養(yǎng)基300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖)中，其它同實施例1，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性達85％。
實施例3液體培養(yǎng)基改變C/N比，200g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖，初始pH6.7，其它同實施例2，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為88％.
實施例4三角瓶通氣培養(yǎng)發(fā)酵5d，其它同實施例3，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為83％。
實施例5活性菌株發(fā)酵和活性物質的制備同實施例3，需要說明的是，發(fā)酵6天，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為80％。
實施例6活性菌株三角瓶通氣培養(yǎng)發(fā)酵和活性物質的制備同實施例3。需要說明的是，調節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH3.5，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為85％。
實施例7活性菌株三角瓶通氣培養(yǎng)發(fā)酵和活性物質的制備同實施例3需要說明的是，調節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH4，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為85％。
實施例8活性菌株三角瓶通氣培養(yǎng)發(fā)酵和活性物質的制備同實施例3需要說明的是，調節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH8，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為75％。
實施例9改變活性菌株三角瓶液體培養(yǎng)的接種量，將孢子懸液以104孢子數(shù)接種于液體培養(yǎng)基(500ml三角瓶裝液量100ml)中，其它培養(yǎng)條件同實施例3，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為85％。
實施例10改變活性菌株三角瓶液體培養(yǎng)的接種量，將孢子懸液以107孢子數(shù)接于液體培養(yǎng)基(500ml三角瓶裝液量100ml)中，其它培養(yǎng)條件同實施例3，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為78％。
實施例11改變活性菌株三角瓶液體培養(yǎng)的溶氧條件制備活性代謝產(chǎn)物，變化搖床的轉速為120rpm，三角瓶的裝液量75ml/500ml，其它培養(yǎng)條件同實施例3。發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為72％。
實施例12改變活性菌株三角瓶液體培養(yǎng)的溶氧條件制備活性代謝產(chǎn)物，變化搖床的轉速為220rpm，三角瓶的裝液量100ml/500ml，其它培養(yǎng)條件同實施例3。發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為74％。
實施例13
改變活性菌株三角瓶液體培養(yǎng)的溶氧條件制備活性代謝產(chǎn)物，變化搖床的轉速為170rpm，三角瓶的裝液量125ml/500ml，其它培養(yǎng)條件同實施例3。發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為77％。
實施例14用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以106孢子數(shù)接種于PS液體培養(yǎng)基(500ml三角瓶裝液量100ml)中，26℃，靜置培養(yǎng)6天，其他同實施例1。發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為90％。
實施例15采用變溫方式，將活性菌株接種于液體培養(yǎng)基中，從26℃至21℃逐步降溫培養(yǎng)，其它培養(yǎng)條件同實施例3。
4天后對發(fā)酵濾液進行活性測定，與26℃恒溫培養(yǎng)作為對照，活性提高一倍以上。將發(fā)酵濾液稀釋4倍，其殺線蟲結果達90％以上，說明變溫培養(yǎng)有利于殺線蟲代謝物的積累。
實施例16菌株的培養(yǎng)同實施例1，但需要說明的是，活性物質的制備采用發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐發(fā)酵采用PS培養(yǎng)基，300g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖。首先進行一級種子的制備，即用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入106孢子，26℃，pH6.5，靜置培養(yǎng)26小時；然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種4％的一級種子，26℃，通氣攪拌，通氣量為1∶0.5-1∶0.75，轉速300-350rpm；發(fā)酵36h，劑型加工是將真空抽濾后獲得的發(fā)酵原濾液，經(jīng)真空冷凍干燥制得粗制粉劑，用蒸餾水稀釋為1/2發(fā)酵原液的濃度，生物活性達到95％以上。
實施例17活性菌株5L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)和活性物質的制備同實施例16，需要說明的是，發(fā)酵罐發(fā)酵PS培養(yǎng)基，300g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖發(fā)酵68h，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為95％以上。該代謝產(chǎn)物主要活性成分含帶兩個結晶水的乙二酸和8配位鉀的乙二酸配合物，此外還含其它有機酸；上述各物質之間的含量比為3.5∶2.5∶2.0。
實施例18活性菌株5L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)和活性物質的制備及劑型加工同實施例16需要說明的是，發(fā)酵罐發(fā)酵PS培養(yǎng)基改變C/N比，200g/L的土豆汁和20g/L的蔗糖，發(fā)酵60h后獲得發(fā)酵液，發(fā)酵原液稀釋一倍后的生物活性為95％以上。
實施例19在實驗室以松材線蟲為供試線蟲進行殺蟲實驗，1ml原發(fā)酵液作用1500條線蟲，線蟲死亡率達100％。其他同實施例1。
應用實驗1將20倍的濃縮液用無菌水稀釋一倍，按照實施例1的生物活性檢測方法加入供試線蟲，26℃培養(yǎng)，定時用解剖鏡觀察統(tǒng)計線蟲死亡率，結果為濃縮液作用線蟲3小時，線蟲死亡率達100％；
應用實驗2取20倍濃縮液按照實施例1的生物活性檢測方法加入供試線蟲，26℃培養(yǎng)，定時用解剖鏡觀察統(tǒng)計線蟲死亡率，結果為濃縮液作用線蟲1小時，線蟲死亡率達100％；證明經(jīng)濃縮后，菌發(fā)酵液的殺蟲活性顯著提高。
應用實驗3取20倍濃縮液用水稀釋32倍后作用線蟲5天，線蟲死亡率達80.9％，證明加熱濃縮對代謝物殺蟲活性影響不大。
應用實驗41998年5-10月，在河北省盧龍縣進行大田小區(qū)防治甘薯莖線蟲試驗，取得一定成效，將總狀共頭霉的代謝產(chǎn)物制得的粗制粉劑，用水稀釋成水溶液(劑量以75g干粉/畝)進行澆埯，防效為71.5％。
應用實驗51999年7-12月在北京郊區(qū)保護地大棚進行的防治蕃茄根結線蟲實驗，代謝物的發(fā)酵原液施用量6.7L/畝，栽苗前一周用水稀釋進行土壤處理，防治效果達到57.3％，番茄增產(chǎn)60％以上，增產(chǎn)率高于施用化學農(nóng)藥溴甲烷(增產(chǎn)39％)的結果。
應用實驗61998年5月在中國農(nóng)科院植保所溫室進行的實驗，將發(fā)酵原液稀釋50倍后，進行大豆孢囊線蟲的防治試驗，試驗結果孢囊減少率為60.7％，相當于同期施用的化學農(nóng)藥的水平。
以上應用實驗結果表明，該活性菌株的代謝物對松樹、甘薯、番茄、大豆等重要植物的寄生線蟲表現(xiàn)了其殺線蟲的廣譜性。
權利要求
1.殺線蟲生防菌代謝物，其特征在于，它是活性菌株總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)的代謝產(chǎn)物；其殺線蟲活性組分的基本組成為帶兩個結晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物、氨基化合物和其它有機酸；活性組分含量之和為100％；其中帶兩個結晶水的乙二酸、8配位鉀的乙二酸配合物和其它有機酸含量之和不小于80％，且其之間的含量比為(2.5-3.5)∶(1.8-2.5)∶(1.5-2.5)；該代謝物的活性成分8配位鉀的乙二酸配合物，為一種新型結構物，其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2，結構如圖1所示，兩個結晶水的乙二酸分子式為(H2C2O4)(H2O)2；該生防菌代謝物的特性溶解性為水溶性，并能以任意比溶于水；熱穩(wěn)定性121℃處理15-20min，活性不低于原活性的95％；生物活性取1ml發(fā)酵原液作用于1500條松材線蟲，線蟲死亡率為100％；將發(fā)酵原液稀釋一倍后，取1ml作用于1500條松材線蟲，線蟲死亡率為70-95％；殺線蟲譜；它可廣泛用于松材線蟲、根結線蟲、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲重要植物寄生線蟲病害的生物防治。
2.按照權利要求1所述殺線蟲生防菌代謝物，其特征是，其它有機酸包括酒石酸、蘋果酸、乳酸，其三者含量之和，占其它有機酸含量的75-85％。
3.權利要求1所述的殺線蟲生防菌代謝物的制備方法，其特征在于，以總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)為菌種，通過液體通氣培養(yǎng)菌株而產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，然后進行劑型加工制得；具體步驟如下●菌種的培養(yǎng)菌株斜面保存使用馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基即PSM培養(yǎng)基；斜面菌種26℃靜置培養(yǎng)6-7天，然后放入4℃冰箱保存；●活性代謝物的制備將上述斜面菌種，進行液體培養(yǎng)，液體培養(yǎng)選擇PSM培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖PS培養(yǎng)基、普通蛋白胨蔗糖培養(yǎng)基、馬鈴薯甘油培養(yǎng)基中的一種；初始pH可調范圍3.5-8；再經(jīng)真空抽濾，獲得含活性代謝物的發(fā)酵原液；液體培養(yǎng)從下述兩種方法中任選一種1)、搖瓶培養(yǎng)用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，在500毫升三角瓶中，以每75-125毫升液體培養(yǎng)基中加入104-107孢子，轉速120-220rpm，培養(yǎng)4-6天；2)、發(fā)酵罐發(fā)酵首先進行一級種子的制備，即用無菌水洗下斜面孢子，制成孢子懸液，以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入106孢子，26℃，pH4-6，靜置或者170rpm振蕩培養(yǎng)21-30小時；然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種3-5％的一級種子，26℃，通氣攪拌，發(fā)酵36-68h，通氣量為1∶0.5-1∶0.75，轉速為300-350rpm；●劑型加工將上述獲得的含活性代謝物的發(fā)酵原液，按照下述一種方法進行處理A.發(fā)酵原液可直接作為殺線蟲生防制劑使用；B.濃縮液發(fā)酵原液經(jīng)過薄膜蒸發(fā)，制備成濃縮水劑；C.粗制粉劑發(fā)酵原液經(jīng)真空冷凍干燥制得。
4.按照權利要求2所述殺線蟲生防菌代謝物的制備方法，其特征是，液體培養(yǎng)基是馬鈴薯蔗糖麥芽精培養(yǎng)基(PSM培養(yǎng)基)即300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖，麥芽精2g/L；或馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PS培養(yǎng)基)即200-300g/L的土豆汁，20g/L的蔗糖；初始pH為4-6。
5.按照權利要求2所述殺線蟲生防菌代謝物的制備方法，其特征是，搖瓶培養(yǎng)是以每100毫升液體培養(yǎng)基中加入104-106孢子，轉速120-170rpm，培養(yǎng)4-6天；
6.按照權利要求2所述殺線蟲生防菌代謝物的制備方法，其特征是，搖瓶培養(yǎng)時采用下述三種方法中的任意一種培養(yǎng)方式A.26℃靜置培養(yǎng)6-7天；B.溫度為26℃，用120-220rpm搖床培養(yǎng)4-6天，以104-106孢子數(shù)接種子20020的PS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的初始pH為4-6；C.從28-18℃，170rpm搖床變溫培養(yǎng)4-7天。
7.按照權利要求2所述殺線蟲生防菌代謝物的制備方法，其特征是，發(fā)酵罐發(fā)酵時間是45-60h。
8.權利要求1所述的殺線蟲生防菌代謝物的應用，其特征是，該代謝物具有殺線蟲的廣譜性，可用于松材線蟲、根結線蟲、大豆孢囊線蟲、甘薯莖線蟲、重要植物寄生線蟲病害的生物防治。
全文摘要
殺線蟲生防菌代謝物及其制備方法，涉及總狀共頭霉代謝物及制備。它解決了線蟲生防制劑缺乏、活菌劑及脂溶性制劑使用上的問題。本發(fā)明為總狀共頭霉的代謝產(chǎn)物，是一種新型線蟲生防制劑。其主要活性成分含帶兩個結晶水的乙二酸和8配位鉀的乙二酸配合物，此外還含酒石酸、蘋果酸、乳酸。其制備方法是利用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術，以總狀共頭霉(Syncephalastrum racemosum)為菌種，主要利用液體通氣培養(yǎng)制備出活性代謝產(chǎn)物。該生防菌代謝物具有水溶性、利于制劑加工、熱穩(wěn)定性強、成本低、殺蟲譜廣、易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、施用方便等特性。本發(fā)明對線蟲的生物防治及微生物農(nóng)藥的研制開發(fā)，具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。
文檔編號A01N37/00GK1484954SQ0313052
公開日2004年3月31日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權日2003年7月31日
發(fā)明者孫建華, 杜連祥, 宇克莉, 王建玲, 張穎, 彭德良, 孟慶恒, 路福平, 婁威 申請人:天津師范大學