專利名稱：使用生長(zhǎng)素前體有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用基因工程技術(shù)有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，以及用于此方法的載體。
(2)技術(shù)背景當(dāng)通過將所需基因引入感興趣的植物來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，通常需要以下三個(gè)步驟(1)將所需基因引入植物細(xì)胞；(2)選擇植物組織(已引入所需基因的組織)，所述組織含有已引入所需基因的細(xì)胞，以及(3)使植物由所選植物組織再分化。這些步驟中，在選擇已引入所需基因的組織時(shí)，僅僅將所需基因的表達(dá)作為細(xì)胞培養(yǎng)階段的指標(biāo)不容易選擇這種組織，因此將所需基因和可選標(biāo)記基因一起引入植物細(xì)胞，這種可選標(biāo)記基因的表達(dá)容易檢測(cè)，并可根據(jù)存在或不存在可選標(biāo)記基因的表達(dá)選擇所述已引入所需基因的組織。所用可選標(biāo)記基因?qū)嶋H上且通常包括與藥物抗性有關(guān)的基因，如卡那霉素抗性基因(NPTII新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)和潮霉素抗性基因(HPT潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，它們可提供對(duì)抗生素的抗性，以及磺酰脲抗性基因(ALS乙酰乳酸合酶基因)，它可提供對(duì)農(nóng)藥的抗性，等等。
當(dāng)將與藥物抗性有關(guān)的基因用作可選標(biāo)記基因時(shí)，在引入基因后用含有此類藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，這種藥物可評(píng)定所述可選標(biāo)記基因存在或不存在(即藥物抗性)，并將評(píng)定結(jié)果作為指標(biāo)進(jìn)行選擇。由于這種藥物對(duì)植物細(xì)胞通常是有毒的，當(dāng)用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，未引入可選標(biāo)記基因(故而也未引入所需基因)的植物細(xì)胞會(huì)死亡。然而，即便在這種情況下存在抗性，即即使植物細(xì)胞在這種藥物存在時(shí)可以生長(zhǎng)，這也是程度的問題，因此在這種藥物存在時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)對(duì)植物細(xì)胞有不可避免的壞影響，這實(shí)際上造成了諸如生長(zhǎng)率減少和伴隨植物細(xì)胞活性降低產(chǎn)生的已引入所需基因的組織再分化率減少之類的問題。
為解決這些問題，在JP-A-9-154580中介紹了一種將基因引入植物的新型載體和用所述載體將基因引入植物的方法。當(dāng)用上述載體和方法引入基因時(shí)，僅將基因引入后植物組織的形態(tài)學(xué)變化作為指標(biāo)就可選出已引入所需基因的組織，而無需使用會(huì)降低植物細(xì)胞活性的藥物。
在上述JP-A-9-154580揭示的載體和方法中，誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)異常的基因，如植物激素合成基因被用作可選標(biāo)記基因，在基因引入后，可以不定芽或不定根的形式由組織獲得已引入所需基因的組織。然而，在用這種方式獲得的不定芽或不定根中，存在相當(dāng)大量的未引入所需基因的組織(以后也稱為“逃逸組織(escape)”)。似乎細(xì)胞(已和所需基因一起引入了誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)異常的基因)產(chǎn)生的植物激素等被轉(zhuǎn)移到其周圍的細(xì)胞中，因此造成了上述影響，同時(shí)，由受到影響的未引入基因的細(xì)胞分化和增殖的組織也顯示出形態(tài)學(xué)異常。通常認(rèn)為將基因引入植物是困難的，且不定芽最初在植物中有很低的再分化率。此外，由于存在這種逃逸組織，對(duì)已引入所需基因的組織的選擇效率非常低，因此特別需要改進(jìn)再分化率和選擇效率。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，它可選擇已引入所需基因的組織而無需使用會(huì)降低植物細(xì)胞活性的藥物，此外，它還有改進(jìn)的選擇效率。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于此方法的載體。
本發(fā)明的這些目的和其它目的是通過產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法實(shí)現(xiàn)的，所述方法包括(A)將載體引入植物細(xì)胞，其中所述載體是用來將基因引入植物的，它包含所需基因，以及含有編碼酶的基因的可選標(biāo)記基因，這種酶可由生長(zhǎng)素前體合成生長(zhǎng)素；(B)在生長(zhǎng)素前體和/或其類似物存在時(shí)培養(yǎng)已通過上述載體引入所述基因的植物細(xì)胞，由此可制得再分化組織，檢測(cè)并選擇該再分化組織；以及(C)將上述在(B)中選出的再分化組織培養(yǎng)成再分化的植物個(gè)體。
同時(shí)，本發(fā)明的這些目的和其它目的也可通過用來將基因引入植物的載體實(shí)現(xiàn)，所述載體包含所需基因，以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因，但沒有色氨酸單加氧酶(iaaM)基因的可選標(biāo)記基因。
(4)


圖1是顯示pIAH6載體中將被整合到植物染色體的T-DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖2是顯示pIPT10載體中將被整合到植物染色體的T-DNA區(qū)域的結(jié)構(gòu)的示意圖。
(5)具體實(shí)施方式
作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過人工控制在已引入所需基因的細(xì)胞中合成生長(zhǎng)素的量可實(shí)現(xiàn)上述目的，因此完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明所述的方法(以后也可稱為“本發(fā)明的方法”)中，生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因被用作可選標(biāo)記基因。生長(zhǎng)素是一種植物激素，已知它促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)、增殖和分裂。例如，就植物病原體根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens，此后稱為“A.tumefaciens”)而言，通過色氨酸單加氧酶的氧化，色氨酸被轉(zhuǎn)化成生長(zhǎng)素前體吲哚乙酰胺(IAM)，然后IAM被吲哚乙酰胺水解酶水解，由此轉(zhuǎn)變成天然的生長(zhǎng)素吲哚乙酸(IAA)。在這種情況中，編碼色氨酸單加氧酶的基因是iaaM基因，編碼吲哚乙酰胺水解的基因是iaaH基因(D.Inze，M.VanMontagu，Mol.Gen.Genet.，194265(1984))。當(dāng)iaaH基因單獨(dú)存在時(shí)不能合成生長(zhǎng)素(Harry Klee，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42529-51(1991))。通過分析iaaH基因清楚得知，它在此過程中是作為生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因的，因此，那些精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易得到這種基因，且它是優(yōu)選用于本發(fā)明的基因。
同樣，除了生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因，其它植物激素合成基因(如上述iaaM基因)和作為植物激素的細(xì)胞因子合成基因(它可促進(jìn)側(cè)芽增殖和細(xì)胞分裂)也可用作可選標(biāo)記基因。特別地，當(dāng)使用細(xì)胞因子合成基因時(shí)，僅通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素前體和/或其類似物的濃度就有可能控制植物細(xì)胞(已通過本發(fā)明的方法引入所需基因)產(chǎn)生再分化組織。最典型的作為細(xì)胞因子合成基因的基因是ipt基因(A.C.Smigocki，L.D.Owens，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855131(1988))。由于也已經(jīng)清楚分析了ipt基因，那些精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易得到這種基因，且它是優(yōu)選用于本發(fā)明的基因。
根據(jù)本發(fā)明的方法，含有這些作為植物激素基因的可選標(biāo)記基因和所需基因一起被插入載體(已知是作為將基因引入植物的載體)并被引入植物細(xì)胞。可間接通過病毒或感染植物的細(xì)菌，或者直接通過物理和化學(xué)技術(shù)將所述載體引入植物細(xì)胞(I.Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42205(1991))。
當(dāng)通過病毒或感染植物的細(xì)菌引入載體時(shí)，例如，可以使用花椰菜花葉病毒、雙粒病毒組、煙草花葉病毒和雀麥花葉病毒等病毒和根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(Agrobaterium rhizogenes)等細(xì)菌。此外，通過物理和化學(xué)技術(shù)引入所述載體的方法包括微注射法、電穿孔法、聚乙二醇法、融合法、高速?gòu)椀来┩阜ǖ取?br> 引入基因后，在生長(zhǎng)素前體和/或其類似物存在的情況下培養(yǎng)該植物細(xì)胞，以產(chǎn)生不定芽之類的再分化組織。在這種情況下，生長(zhǎng)素前體或其類似物是可通過表達(dá)作為可選標(biāo)記基因引入的生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因轉(zhuǎn)變成生長(zhǎng)素的物質(zhì)，或是可通過表達(dá)作為可選標(biāo)記基因引入的生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因而具有類似于生長(zhǎng)素的生理活性的物質(zhì)(以后也可稱為“生長(zhǎng)素樣物質(zhì)”)。例如，當(dāng)上述iaaH基因被表達(dá)時(shí)，吲哚乙酰胺水解酶被合成，除其原始底物IAM外，這種酶還可水解萘乙酸酰胺(NAM)，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣傻纳L(zhǎng)素萘乙酸(NAA)。因此，當(dāng)iaaH基因在本發(fā)明中被用作生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因時(shí)，NAM也可被用作生長(zhǎng)素前體的類似物，這與生長(zhǎng)素前體IAM的情況類似。
同樣，已知再分化組織如不定芽的產(chǎn)生主要是由細(xì)胞因子和生長(zhǎng)素控制的。這就是說，當(dāng)細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例高時(shí)，芽的分化被誘導(dǎo)，而當(dāng)細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例低時(shí)，誘導(dǎo)根的分化(John D.HaMill，Aust.J.Plant Physiol.，20405(1993))。
另一方面，生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因也可被作為可選標(biāo)記基因引入本發(fā)明已引入所需基因的細(xì)胞。因此，通過補(bǔ)充有合適量生長(zhǎng)素前體和/或其類似物(以后也可稱為“生長(zhǎng)素前體等”)和細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)已引入基因的植物細(xì)胞，可產(chǎn)生已引入所需基因的不定芽之類的再分化組織。由于通過生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因響應(yīng)其所加量的作用，生長(zhǎng)素前體等在已引入所需基因的植物細(xì)胞中被轉(zhuǎn)變成生長(zhǎng)素樣物質(zhì)，因此當(dāng)用補(bǔ)充有合適量生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，最終在已引入所需基因的植物細(xì)胞中提供了合適量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞因子，因此它們有最佳的細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素比例以再分化不定芽等。另一方面，未引入所需基因的細(xì)胞采取了不同于已引入所需基因的細(xì)胞的行動(dòng)。這就是說，由于未將生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因引入細(xì)胞，此細(xì)胞將生長(zhǎng)素前體等用作生長(zhǎng)素的能力非常低，這樣，在添加到培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子之中，它主要可單獨(dú)使用細(xì)胞因子。
此外，如上所述，當(dāng)將細(xì)胞因子合成基因和生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因一起用作本發(fā)明的可選標(biāo)記基因時(shí)，使用培養(yǎng)基(其中，生長(zhǎng)素前體和/或其類似物的濃度被適當(dāng)設(shè)定)簡(jiǎn)單培養(yǎng)經(jīng)引入基因處理的植物細(xì)胞就可使已引入所需基因的不定芽等再分化。這就是說，這種情況下，在已引入所需基因的細(xì)胞中，根據(jù)所添加的量，生長(zhǎng)素前體等被轉(zhuǎn)變?yōu)樯L(zhǎng)素樣物質(zhì)，且無需在培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子，細(xì)胞因子合成基因即可主動(dòng)合成細(xì)胞因子，這樣，當(dāng)用已加入合適量的生長(zhǎng)素前體等的培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細(xì)胞時(shí)，所述已引入所需基因的細(xì)胞中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例就會(huì)變成最適合不定芽等再分化的值。另一方面，未引入所需基因的細(xì)胞采取了明顯不同于已引入所需基因的細(xì)胞的行動(dòng)。這就是說，由于未將生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因和細(xì)胞因子合成基因引入細(xì)胞，故很難產(chǎn)生這種植物激素。
通過上面的描述顯見，根據(jù)本發(fā)明的方法，通過控制加到培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素前體和/或其類似物和細(xì)胞因子的量可使所述已引入所需基因的不定芽等較好地再分化，由此可降低逃逸頻率。特別地，當(dāng)將細(xì)胞因子合成基因和生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因一起用作可選標(biāo)記基因時(shí)，可得到較大的效果。
根據(jù)植物激素的種類和采用本發(fā)明的方法用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的植物種類可任選地確定實(shí)際加到培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子的特定量。在確定這一量時(shí)，例如可用載體對(duì)用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的植物采用基因引入處理，所述載體含有用于本發(fā)明的可選標(biāo)記基因和和報(bào)道基因(如GUS(β-D-葡糖醛酸酶)基因)。在基因引入后，通過在幾個(gè)步驟中改變培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子的種類和數(shù)量以培養(yǎng)所述組織，這樣可使不定芽等再分化以檢測(cè)報(bào)道基因的表達(dá)。由于使表達(dá)報(bào)道基因的不定芽等再分化率最高的條件是最適合由已引入所需基因的植物細(xì)胞產(chǎn)生再分化組織的條件，因此，可通過用本發(fā)明的方法將所需基因引入植物，以根據(jù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體時(shí)生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子的種類和數(shù)量采用這種條件。
同樣，除生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子外，可在上述培養(yǎng)基中加入植物細(xì)胞增殖和分化所必需的成分和/或植物細(xì)胞增殖和分化不必需的其它成分以產(chǎn)生再分化的組織，這些成分的加入量應(yīng)不會(huì)破壞本發(fā)明的目的。所述培養(yǎng)基包括固體培養(yǎng)基，它是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或經(jīng)輕微修飾以適合所述植物產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)素前體等和細(xì)胞因子、1-3w/v％蔗糖作為碳源和0.5-1.0w/v％瓊脂或0.1-0.4w/v％吉蘭糖膠作為凝固劑而制備的，上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MS(Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15473-497(1962))或WPM(Loyd和McCown，Prop.Int.PlantProp.Soc.，30421-427(1980))。
根據(jù)本發(fā)明的方法，由此獲得的再分化組織(如不定芽)被檢測(cè)和選擇，因此可用再分化的植物個(gè)體來產(chǎn)生其中已引入所需基因的轉(zhuǎn)基因植物。因?yàn)楸贿x擇的組織是再分化組織如不定芽，所用可用肉眼進(jìn)行檢測(cè)和選擇，而無需借助特殊的試劑和工具。此外，由于作為可選標(biāo)記基因被引入的生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因和加到培養(yǎng)基中用于產(chǎn)生再分化組織的生長(zhǎng)素前體和/或其類似物的協(xié)同作用，用這種方法選擇的已引入所需基因的再分化組織的頻率要高于通常情況中的頻率。此外，由于對(duì)已引入所需基因的組織的選擇效率非常出色，通過使由此得到的再分化組織再分化成植物個(gè)體，可有效產(chǎn)生其中已引入所需基因的轉(zhuǎn)基因植物。
例如，當(dāng)由此得到的再分化組織是不定芽時(shí)，可照其原樣切開不定芽或待其長(zhǎng)至一定程度后再將其切開，然后把它放在生根培養(yǎng)基中使其生根，這樣可使它再分化成植物個(gè)體。在這種情況下，優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為15-30℃，光照強(qiáng)度小于50μmol/m2/s。生根培養(yǎng)基包括通過在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一種或多種生長(zhǎng)素(如作為植物激素的NAA和吲哚丁酸)而制得的液體培養(yǎng)基或其稀釋液，并進(jìn)一步補(bǔ)充5-30g/l蔗糖作為碳源，或是通過用瓊脂等固化而制得的固體培養(yǎng)基。
此外，如本發(fā)明所述的載體(以后稱為“本發(fā)明的載體”)是將基因引入植物的載體，它在進(jìn)入植物染色體的基因引入?yún)^(qū)包含所需基因以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因但沒有色氨酸單加氧酶(iaaM)基因的可選標(biāo)記基因。通過使用這種結(jié)構(gòu)的載體可在較高水平實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
除迄今所述基因外，用于本發(fā)明方法的載體和上述本發(fā)明的載體還含有其它基因和因子(具有特定功能的DNA序列)，只要這些基因和因子不會(huì)破壞本發(fā)明的目的。例如，如JP-A-9-154580中建議的，當(dāng)將生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因和細(xì)胞因子合成基因與可除去的DNA元件結(jié)合使用時(shí)，在選擇再分化組織后可將用作可選標(biāo)記基因的基因除去，這樣就有可能得到可選標(biāo)記基因的影響被完全排除的轉(zhuǎn)基因植物?？捎赊D(zhuǎn)座子或位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)獲得可除去的DNA元件。
對(duì)可施用本發(fā)明方法和載體的植物種類沒有特殊的限制。然而，對(duì)被認(rèn)為是難以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的植物如木本植物施用本發(fā)明的方法和載體會(huì)有特別大的效果。
此外，對(duì)用本發(fā)明的方法和載體引入的所需基因的種類也沒有限制。可根據(jù)不同的目的自由選擇，如可提供優(yōu)良農(nóng)業(yè)特性的基因和無法一直提供優(yōu)良農(nóng)業(yè)特性但是研究基因表達(dá)機(jī)制所必需的基因。
在植物組織培養(yǎng)中，植物激素生長(zhǎng)素和細(xì)胞因子在將培養(yǎng)的組織再分化成植物個(gè)體的方法的各個(gè)步驟中有很大關(guān)系。再分化組織如不定芽等的產(chǎn)生也不例外。如上所述，不定芽等的產(chǎn)生是由細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例控制的，當(dāng)細(xì)胞中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例變?yōu)楹线m值時(shí)細(xì)胞可首次產(chǎn)生不定芽等。
所以，當(dāng)僅用細(xì)胞因子合成基因和/或生長(zhǎng)素合成基因作為可選標(biāo)記基因時(shí)，得到已引入所需基因的再分化組織的頻率低。這種情況下，通過可選標(biāo)記基因的作用可在已引入所需基因的細(xì)胞中主動(dòng)產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長(zhǎng)素，但這種生產(chǎn)率不能人工控制，因此已引入植物激素基因的細(xì)胞(即已引入所需基因的細(xì)胞)中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例不會(huì)一直是合適的值。因此，所述細(xì)胞不會(huì)一直較好地再分化其中未引入所需基因的細(xì)胞。
因此，根據(jù)本發(fā)明，生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因被用作可選標(biāo)記基因，且已引入所需基因的細(xì)胞中合成的生長(zhǎng)素的量受生長(zhǎng)素前體等的協(xié)同作用人工控制。這就是說，將生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因和所需基因一起作為可選標(biāo)記基因?qū)χ参锝M織引入基因，并用補(bǔ)充有生長(zhǎng)素前體和/或其類似物的培養(yǎng)基培養(yǎng)植物組織。其結(jié)果是，在已引入所需基因的細(xì)胞中，作為對(duì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素前體等濃度的響應(yīng)產(chǎn)生了生長(zhǎng)素，這樣也就可以通過控制添加到培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素前體等的量控制細(xì)胞中生長(zhǎng)素的量。這種情況下，當(dāng)通過將預(yù)定量的細(xì)胞因子作為其它植物激素和生長(zhǎng)素前體等一起添加到培養(yǎng)基中，或者通過將細(xì)胞因子合成基因和生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因一起引入細(xì)胞，以便用這種方法對(duì)已引入所需基因的細(xì)胞施加這種預(yù)定量的細(xì)胞因子時(shí)，同樣可以控制細(xì)胞中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例。
根據(jù)本發(fā)明，已引入所需基因的細(xì)胞中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例被控制在最佳水平以使不定芽等再分化，從而加快從所述細(xì)胞中產(chǎn)生再分化組織，同時(shí)在引入基因后已引入所需基因的不定芽等可較好地從植物組織中再分化，從而降低逃逸組織的頻率。據(jù)認(rèn)為，當(dāng)將細(xì)胞因子合成基因和生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因一起用作可選標(biāo)記基因時(shí)可得到特別大的效果。這種情況下，與將生長(zhǎng)素前體-生長(zhǎng)素合成基因單獨(dú)用作可選標(biāo)記基因時(shí)的情況相比，已引入所需基因的細(xì)胞和未引入所需基因的細(xì)胞之間在與植物激素有關(guān)的胞內(nèi)生理環(huán)境上存在很大差異。因此，據(jù)認(rèn)為當(dāng)通過在培養(yǎng)基中添加合適量的生長(zhǎng)素前體等進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，已引入所需基因的細(xì)胞顯示了較好的分化不定芽的能力。
根據(jù)本發(fā)明，已引入所需基因的植物細(xì)胞中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例是可人工控制的。因此，已引入所需基因的植物細(xì)胞中細(xì)胞因子/生長(zhǎng)素的比例可被控制在最適合產(chǎn)生不定芽等再分化組織、可加快細(xì)胞再分化同時(shí)可使細(xì)胞較好地再分化出不定芽等的水平。
因此，本發(fā)明降低了所謂逃逸的頻率，從而改善了已引入所需基因的組織的選擇效率并改進(jìn)了轉(zhuǎn)化體的獲得比例。對(duì)被認(rèn)為是難以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的植物施用時(shí)會(huì)有特別大的效果。因此，根據(jù)本發(fā)明，可有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
此外，根據(jù)本發(fā)明，作為將可選標(biāo)記基因和可除去的DNA元件一起使用的結(jié)果，有可能產(chǎn)生出所用可選標(biāo)記基因的影響被完全排除的轉(zhuǎn)基因植物。
這就是說，即使在不便于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的植物中，也可有效產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體，此外根據(jù)本發(fā)明還可以產(chǎn)生出可選標(biāo)記基因的影響被完全排除和僅引入所需基因的轉(zhuǎn)基因植物。
下面根據(jù)實(shí)施例描述了本發(fā)明；然而，本發(fā)明不限于此。實(shí)施例1使用質(zhì)粒pIAH6作為載體，將GUS基因作為所需基因的模型，并將ipt基因和iaaH基因作為可選標(biāo)記基因，通過用本發(fā)明的方法將基因引入藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus，以后稱為“E.globulus”)進(jìn)行基因引入，由此可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。
圖1顯示在pIAH6的結(jié)構(gòu)中，將被整合進(jìn)植物染色體的區(qū)域(T-DNA區(qū)域)。在此圖中，被圈起來的P和T分別代表ipt基因和iaaH基因的啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)，NOS-P代表胭脂氨酸合酶基因的啟動(dòng)子，T代表胭脂氨酸合酶基因的聚腺苷酸化信號(hào)，35S-P代表花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。同樣，圖中兩末端上的黑色箭頭代表劃分T-DNA區(qū)域的RB位點(diǎn)和LB位點(diǎn)。此質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域以外的其它部分與市售的植物基因引入載體pBI121(TOYOBO制造)的相對(duì)應(yīng)部分有同樣的結(jié)構(gòu)。
質(zhì)粒pIAH6已經(jīng)被引入大腸桿菌JM109，所述大腸桿菌已于2003年7月16日被國(guó)際專利生物保藏所，國(guó)立先進(jìn)工業(yè)科學(xué)和技術(shù)國(guó)立學(xué)院(InternationalPatent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial andTechnology)(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)作為FERM BP-8429保藏，保藏物稱為大腸桿菌JM109(pIAH6)。I.將質(zhì)粒pIAH6引入土壤桿菌將根瘤土壤桿菌EHA105接種在10ml YEB液體培養(yǎng)基中(5g/l牛肉提取物、1g/l酵母提取物、1g/l蛋白胨、5g/l蔗糖、2mM MgSO4、pH7.2，溫度為22℃)并在28℃培養(yǎng)直至OD630值達(dá)到0.4-0.6。以6,900×g，4℃將培養(yǎng)液離心10分鐘以收集細(xì)胞，將由此收集的細(xì)胞懸浮于20ml的10mM HEPES(pH8.0)，并再以6,900×g，4℃離心10分鐘以收集細(xì)胞，然后將由此收集的細(xì)胞懸浮于200μl YEB液體培養(yǎng)基，并將此細(xì)胞懸液用于引入質(zhì)粒。
在0.5ml的容量試管(Assist制造)中將50μl由此制備的用于引入質(zhì)粒的細(xì)胞懸液和3μl上述pIAH6混合，然后進(jìn)行電穿孔(Gene Pulser II系統(tǒng)(BIORAD制造))，這樣可將質(zhì)粒pIAH6引入土壤桿菌。電穿孔后，在混合物中加入200μl YEB液體培養(yǎng)基，然后在25℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，并將由此獲得的細(xì)胞接種在補(bǔ)充有50mg/l卡那霉素的YEB瓊脂培養(yǎng)基(1.5w/v％瓊脂、其它成分如上所述)中28℃培養(yǎng)2天以得到根瘤土壤桿菌的細(xì)胞集落。用堿法從此集落的細(xì)胞中提取質(zhì)粒，用限制性酶HindIII、SmaI和EcoRI消化此質(zhì)粒，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析消化液，確定pIAH6引入根瘤土壤桿菌EHA105。II.將pIAH6引入桉樹將來自智利的藍(lán)桉的種子在70％的乙醇中浸泡約1分鐘消毒，然后在2％的次氯酸鈉水溶液中浸泡并攪拌約4小時(shí)，用無菌水充分洗滌，接種在已加入0.5mg/l玉米素的MS瓊脂培養(yǎng)基中，并在4℃冰箱中儲(chǔ)存兩天以促進(jìn)萌發(fā)，然后在25℃用光強(qiáng)度約10μmol/m2/s的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)以使其萌發(fā)。種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2周后，切除萌發(fā)的幼苗的頂芽、子葉和根以收集下胚軸，并將下胚軸切成約5mm的切片以作為基因引入的樣品并進(jìn)行以下試驗(yàn)。
將在上述項(xiàng)目中已引入質(zhì)粒pIAH6的根瘤土壤桿菌EHA105在YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后用EG基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至OD630＝0.5，并將上面準(zhǔn)備的下胚軸切片浸泡在所述細(xì)胞懸液中。然后在除去多余的細(xì)胞懸液后，將各個(gè)切片和土壤桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上(瓊脂8.5g/l)于25℃在黑暗中共培養(yǎng)3天，所述瓊脂培養(yǎng)基是通過在EG基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1.0mg/l玉米素、0.05mg/l NAA和40mg/l乙酰丁香酮(acetosyringone)制得的，這樣可使已引入pIAH6的土壤桿菌感染各個(gè)切片。這時(shí)，經(jīng)過改良的含有濃度比為1∶3的氨態(tài)氮/硝態(tài)氮(5mM NH4，15mM NO3)并補(bǔ)充有20g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基被用作EG基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
感染培養(yǎng)后，將切片放在補(bǔ)充有500mg/l羧噻吩青霉素(ticarcillin)和1μM或10μM生長(zhǎng)素前體類似物NAM的EG基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂8.5g/l中，并于25℃在光強(qiáng)度約30-40μmol/m2/s的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)每隔2周用同樣的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。在這些切片中，較快的切片在土壤桿菌感染約2個(gè)月后即再分化出不定芽。
土壤桿菌感染3個(gè)月后，為檢測(cè)用作所需基因模型的GUS基因的表達(dá)，按照J(rèn)efferson等的方法對(duì)再分化的不定芽進(jìn)行GUS染色試驗(yàn)(Plant Mol.Biol.Rep.，5387-405(1987))，然后通過檢測(cè)被染色的不定芽的數(shù)目(表達(dá)所需基因的不定芽的數(shù)目)來判斷已引入所需基因的不定芽形成的程度。結(jié)果顯示在表1中。
表1iaaH基因和添加NAM對(duì)產(chǎn)生藍(lán)桉轉(zhuǎn)化體的影響
*1分化成不定芽的切片數(shù)目*2分化成被GUS染色的不定芽的切片數(shù)目如表1顯見，當(dāng)不定芽的再分化率、選擇效率(所需基因引入再分化的不定芽的頻率)和基因引入率(得到已引入所需基因的不定芽的比例)是基于作為基因引入樣品的切片計(jì)算時(shí)，在NAM濃度為1μM時(shí)它們分別為35.0％、38.1％和13.3％，而在NAM濃度為10μM時(shí)它們分別為4.2％、50.0％和2.1％。
比較實(shí)施例1以實(shí)施例1的相同方式進(jìn)行藍(lán)桉基因引入試驗(yàn)，不同之處是，在土壤桿菌感染后用補(bǔ)充有500mg/l羧噻吩青霉素和0μM、10μM NAA作為生長(zhǎng)素的EG基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂8.5g/l)培養(yǎng)下胚軸切片。結(jié)果顯示在表2中。
表2iaaH基因和添加NAM對(duì)產(chǎn)生藍(lán)桉轉(zhuǎn)化體的影響
*1分化成不定芽的切片數(shù)目*2分化成被GUS染色的不定芽的切片數(shù)目由表2顯見，在所有情況下選擇效率是低的，即使在添加1μM NAA時(shí)也只有22.2％，而這已經(jīng)是最高值。
比較實(shí)施例2以實(shí)施例1或比較實(shí)施例1的相同方式進(jìn)行藍(lán)桉基因引入試驗(yàn)，不同之處是，作為可選標(biāo)記基因的只有ipt基因的質(zhì)粒pIPT10被用作載體。同樣，所述載體也含有作為所需基因模型的GUS基因。
這里所用的pIPT10的T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)顯示在圖2中，將基因引入試驗(yàn)的結(jié)果顯示在表3中。
表3ipt基因?qū)Ξa(chǎn)生藍(lán)桉轉(zhuǎn)化體的影響
*1分化成不定芽的切片數(shù)目*2分化成被GUS染色的不定芽的切片數(shù)目由表3顯見，在此情況下選擇效率也是低的，即使添加1μM NAA時(shí)也只有11.1％，而這已經(jīng)是最高值。
將Y-63楊雜交株(來自Akita Jujo Chemicals Co.，Ltd.的實(shí)驗(yàn)樹林)無菌幼苗的莖切成長(zhǎng)5mm的切片，使其不含有節(jié)點(diǎn)，然后沿縱向?qū)⑵淝谐蓛砂耄⒂靡岩雙IAH6的根瘤土壤桿菌LBA4404(購(gòu)自CLONTECH)進(jìn)行感染，從而將pIAH6引入Y-63楊雜交株。這就是說，將如實(shí)施例1同樣方式得到的已引入pIAH6的根瘤土壤桿菌LBA4404在YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后用Y基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至OD630＝0.5，并將上面制備的下胚軸切片浸泡在此細(xì)胞懸液中。然后在除去多余的細(xì)胞懸液后，將各個(gè)切片和土壤桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上(瓊脂8g/l)于25℃在黑暗中共培養(yǎng)3天，所述瓊脂培養(yǎng)基是通過在Y基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入40mg/l乙酰丁香酮制得的，這樣可使已引入pIAH6的土壤桿菌感染各個(gè)切片。這時(shí)，補(bǔ)充有20g/l蔗糖的改良MS培養(yǎng)基(10mM NH4，30mM NO3)被用作Y基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
感染培養(yǎng)后，將切片放在補(bǔ)充有500mg/l羧噻吩青霉素和1μM、5μM或30μM生長(zhǎng)素前體類似物NAM的Y基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂8g/l)中，并于25℃在光強(qiáng)度約30-40μmol/m2/s的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，2周后，選擇并分離再分化的不定芽，在同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)此不定芽，然后，在2個(gè)月后(加入NAM開始培養(yǎng)4個(gè)月后)觀察到培養(yǎng)組織的形態(tài)以判斷所需基因是否被引入所選不定芽。這時(shí)，當(dāng)所需基因被引入所選不定芽時(shí)，由于同時(shí)引入的可選標(biāo)記基因(ipt基因)的作用在培養(yǎng)組織上有多個(gè)芽形成，但當(dāng)所選基因未被引入時(shí)，即當(dāng)所選不定芽是逃逸組織時(shí)，則培養(yǎng)組織沒有多個(gè)芽形成。這就是說，由于ipt基因未被引入逃逸組織，不定芽?jī)H僅是因?yàn)槭艿狡涓浇嬖诘囊岩胨杌虻募?xì)胞的影響而再分化的。
結(jié)果顯示表4中。
表4iaaH基因和添加NAM對(duì)產(chǎn)生雜交楊轉(zhuǎn)化體的影響
*1分化成不定芽的切片數(shù)目*2分化成在培養(yǎng)4個(gè)月后觀察到有多個(gè)芽而被判斷為不定芽的切片數(shù)目如表4顯見，在NAM濃度為1μM和5μM時(shí)得到了已引入所需基因的不定芽，且以切片為基礎(chǔ)計(jì)算的選擇效率在NAM濃度為1μM時(shí)為50.0％，在NAM濃度為5μM時(shí)為40.0％。就此而言，盡管未在表中顯示，當(dāng)NAM濃度為1μM時(shí)再分化的不定芽的總數(shù)為67，且所需基因已被引入其中的6個(gè)。同樣，當(dāng)NAM濃度為5μM時(shí)再分化的不定芽的總數(shù)為34，且所需基因已被引入其中的5個(gè)。比較實(shí)施例3以實(shí)施例2的相同方式進(jìn)行雜交楊的基因引入試驗(yàn)，不同之處是，在土壤桿菌感染后用僅補(bǔ)充有500mg/l羧噻吩青霉素的Y基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂8g/l)培養(yǎng)莖切片。結(jié)果顯示在表4中。
如表4所述，這時(shí)沒有再分化出不定芽，也沒有得到其中已引入所需基因的再分化的個(gè)體。
感染培養(yǎng)后，將切片放在補(bǔ)充有500mg/l羧噻吩青霉素和1μM生長(zhǎng)素前體類似物NAM的EG基礎(chǔ)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂8.5g/l)中，并于25℃在光強(qiáng)度約30-40μmol/m2/s的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)每隔2周用同樣的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
土壤桿菌感染4個(gè)月后，按照上述Jefferson等的方法對(duì)再分化的不定芽進(jìn)行GUS染色試驗(yàn)，并判斷已引入所需基因的不定芽形成的程度。
其結(jié)果是，40個(gè)莖切片中有5個(gè)切片分化出不定芽，并確定所需基因已被引入其中3個(gè)切片的芽中。這就是說，基于作為基因引入樣品的切片，不定芽的再分化率、選擇效率和基因引入率分別為12.5％、60.0％和7.5％。當(dāng)將克隆的藍(lán)桉幼苗用作基因引入材料時(shí)，一個(gè)驚人的事實(shí)是，以已引入基因的樣品為基礎(chǔ)，以7.5％的頻率得到已引入基因的不定芽。比較實(shí)施例4以質(zhì)粒pIPT10作為載體，以實(shí)施例3同樣的方式進(jìn)行藍(lán)桉高生根克隆的基因引入試驗(yàn)。然而，不定芽在這種情況下沒有再分化，且沒有得到已引入所需基因的再分化的個(gè)體。
雖然詳細(xì)并參考具體實(shí)施例描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可對(duì)其進(jìn)行各種改變和修改，而不違背其精神和范圍。本文引用的全部文獻(xiàn)完整引入以供參考。
本申請(qǐng)基于2002年7月26日提交的日本專利申請(qǐng)?zhí)?002-218978，在此完整引用以供參考。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括(A)將載體引入植物細(xì)胞，其中所述載體是用來將基因引入植物的，它包含所需基因，以及含有編碼酶的基因的可選標(biāo)記基因，這種酶可由生長(zhǎng)素前體合成生長(zhǎng)素；(B)在生長(zhǎng)素前體和/或其類似物存在時(shí)培養(yǎng)已通過上述載體引入所述基因的植物細(xì)胞，由此可制得再分化組織，檢測(cè)并選擇該再分化組織；以及(C)培養(yǎng)上述在(B)中選出的再分化組織以再分化一種植物個(gè)體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生長(zhǎng)素前體和/或其類似物是吲哚乙酰胺和/或萘乙酸酰胺，以及其中所述用來從生長(zhǎng)素前體合成生長(zhǎng)素的基因是吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述可選標(biāo)記基因包含編碼由生長(zhǎng)素前體合成生長(zhǎng)素的酶的基因，還包含細(xì)胞因子合成基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述細(xì)胞因子合成基因是異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因。
5.一種將基因引入植物的載體，其特征在于，所述載體包括所需基因，以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因，但沒有色氨酸單加氧酶(iaaM)基因的可選標(biāo)記基因。
全文摘要
一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，它包括(A)將載體引入植物細(xì)胞，其中所述載體是用來將基因引入植物的，它包含所需基因、含有編碼酶的基因的可選標(biāo)記基因，這種酶可由生長(zhǎng)素前體合成生長(zhǎng)素；(B)在生長(zhǎng)素前體和/或其類似物存在時(shí)培養(yǎng)已通過上述載體引入所述基因的植物細(xì)胞，由此可制得再分化組織，檢測(cè)并選擇該再分化組織；以及(C)培養(yǎng)將上述在(B)中選出的再分化組織以成再分化一種植物個(gè)體，和一種將基因引入植物的載體，所述載體包含所需基因以及含有吲哚乙酰胺水解酶(iaaH)基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因，但沒有色氨酸單加氧酶(iaaM)基因的可選標(biāo)記基因。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1473936SQ0313319
公開日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者松永悅子, 杉田耕一, 海老沼宏安, 一, 宏安 申請(qǐng)人:日本制紙株式會(huì)社