專利名稱：一種防治植物寄生線蟲的生防制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治植物寄生線蟲的生防制劑，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
自然界中，線蟲的天敵是很多的，主要有真菌、細菌、螨、捕食性線蟲等。其中最多的是真菌，目前研究最多且成為產(chǎn)品上市的也主要是真菌。根據(jù)其侵染線蟲的特性主要分為1、捕食菌物通過營養(yǎng)菌絲特化形成的捕食器捕捉線蟲；2、寄生菌物通過寄生線蟲的卵、雌蟲、胞囊等的菌物；3、產(chǎn)毒菌物能夠產(chǎn)生毒素毒殺線蟲的菌物。
目前成為產(chǎn)品進入市場的主要是捕食菌物和寄生菌物。
本發(fā)明采用的真菌是中華輪枝菌(Verticillium sinense)GAUZ 412，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2003年5月26日；保藏登記入冊的編號CGMCC NO.0933。
中華輪枝菌GAUZ 412，系本發(fā)明人于1996年發(fā)現(xiàn)的一個輪枝菌新種。主要形態(tài)特征為營養(yǎng)菌絲分隔，分枝，常膨大；分子孢子梗直立，無色，長50-300μm，產(chǎn)生1個瓶?；?-6個瓶梗輪生；瓶梗下部膨大，膨大的基部長4.8-12.2μm，寬1.5-2.0μm。自基向頂逐漸變細，頂端寬0.5-0.7μm；10-50個分生孢子聚集成頭狀或呈鏈狀；分子孢子不分隔，無色，橡果形，大小為0.8-1×0.8-1.2μm。缺磚格厚垣孢子。
中華輪枝菌(Verticillium sinense)容易變異，原始菌株生長緩慢。我們從線蟲及土壤中分離到不同菌株，其中大部份不具備我們所需的“明顯穩(wěn)定的防治效果，綜合性狀好，易于規(guī)模化生產(chǎn)”的特性。通過對菌株進行篩選和改良后，獲得了中華輪枝菌的一株獨特菌株，命名為GAUZ 412。它不但對根結(jié)線蟲(Meloidogyne)、胞囊線蟲(Heterodera)具良好的防治效果，同時具備了工業(yè)化生產(chǎn)的基本性狀。
鑒于該菌株可能由于(自發(fā)的、物理的或化學(xué)的)突變、原生質(zhì)體融合，轉(zhuǎn)化或其他通過生物技術(shù)而發(fā)生變化或被改造，本菌種任何菌株的突變株、變種和衍生物均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
本發(fā)明按常規(guī)方法制備。即將中華輪枝菌GAUZ 412，通過固體或液體培養(yǎng)，獲得包括菌絲、分子孢子、厚垣孢子的菌體培養(yǎng)物，與蟹殼粉、蝦殼粉、幾丁質(zhì)、活性炭和草碳、農(nóng)作物秸桿糠等輔料和吸附載體按一定比例混合后，經(jīng)固體發(fā)酵生產(chǎn)和液體發(fā)酵生產(chǎn)，制成粉劑或微粒劑。
1、固體發(fā)酵生產(chǎn)(1)試管種培養(yǎng)將GAUZ 412的菌絲體或孢子接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為1000毫升PDA培養(yǎng)基中添加5-10克蔗糖和5-10毫升甘油，22-26℃下培養(yǎng)6-10天，獲得試管種。
(2)菌種搖床擴大培養(yǎng)(以下均為重量百分比)將斜面種子接種到三角瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為1000毫升PDA中添加10-20克糖蜜、2-5克硫酸銨，2-4克氯化鈉，1-3克硫酸二氫鉀，2-4克檸檬酸三鈉，5-10克蔗糖，5-10毫升甘油。25-30℃下?lián)u床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200-300rpm)，8-15天。
(3)固體發(fā)酵制備生防制劑將培養(yǎng)好的液體種子接入固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的配方為40％-60％農(nóng)作物秸桿糠、10-20％豆餅粉、20-30％麩皮、10％-20％蟹殼粉或蝦殼粉或幾丁質(zhì)，22-26℃培養(yǎng)20-30天后，40-45℃溫度條件下烘干后制成粉劑或微粒劑。
2、液體發(fā)酵生產(chǎn)(1)試管種培養(yǎng)與前述固體發(fā)酵生產(chǎn)中(1)相同(2)菌種搖床擴大培養(yǎng)與前述固體發(fā)酵生產(chǎn)中(2)相同(3)液體發(fā)酵制備生物制劑將逐級擴大的菌種按10％比例接種于不同容量的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基配方為前述固體發(fā)酵(2)培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)溫度28-32℃，培養(yǎng)時間為144-240小時，獲生產(chǎn)所需的菌絲體和孢子。將菌體培養(yǎng)物與5％-10％蟹殼粉或蝦殼粉或幾丁質(zhì)，1％-2％活性炭混合后，用草碳和農(nóng)作物秸桿糠吸附并混勻，制成粉劑或微粒劑。
本生防制劑可以與其他的殺線蟲農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用，但必須保證所混藥劑對本發(fā)明采用的中華輪枝菌無副作用。
本發(fā)明的線蟲生防制劑一般在作物播種或移栽時施用。方法是播種時與種子共同施入土壤中，移栽時將本制劑施入作物根際周圍。對線蟲發(fā)生嚴重地區(qū)可在作物生長過程中追施一次，方法是將本制劑施入作物根際周圍，每畝每次施用量為2-3公斤。
本發(fā)明具有明顯穩(wěn)定的防治效果，綜合性狀好，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
實例一生防制劑對線蟲卵寄生1、制備試驗用制劑將GAUZ 412菌株接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為1000毫升PDA培養(yǎng)基中添加6克蔗糖和6毫升甘油，25℃下培養(yǎng)8天后，用無菌水將孢子洗下，用血球計數(shù)板進行計數(shù)，制成孢子含量為1×108/毫升的孢子懸浮液。
2、試驗方法以吸管取5毫升孢子懸浮液置于直徑5厘米的無菌培養(yǎng)皿中，然后接入根結(jié)線蟲卵(Meloidogyne)懸浮液，每皿接種1000頭卵。
卵的制備將帶有大量根結(jié)線蟲的根系剪碎與土壤混合，然后移栽4周齡的番茄苗，5個月左右轉(zhuǎn)繁一次。使用時從缽栽番茄苗中取出已接種上根結(jié)線蟲的根系，水洗，切碎后放入廣口瓶中，加入1％次氯酸鈉，振蕩3分鐘后倒入雙層篩中(上篩孔徑250微米，下篩孔徑38微米)，反復(fù)沖洗直到所有卵都沖洗到下篩中，收集后制成線蟲卵懸浮液，用線蟲計數(shù)板計數(shù)。
試驗重復(fù)3次。對照加入5毫升無菌水。25℃下培養(yǎng)，將各處理培養(yǎng)皿用封口膜封嚴，以減少污染以及菌液蒸發(fā)。15天后觀察線蟲孵化情況，孵化了即說明未被抑制，未孵化即說明其卵已被抑制而未能萌發(fā)，然后計算卵抑制率。
3、試驗結(jié)果表1 生防制劑對根線蟲卵孵化的抑制率


結(jié)果表明菌劑對根結(jié)線蟲的卵孵化具有較好的抑制作用，抑制率達62.2％。本發(fā)明菌劑通過抑制卵孵化而達到防治線蟲的目的。
實例二深層發(fā)酵制備生防制劑及對根結(jié)線蟲的藥效試驗1、深層發(fā)酵制備生防制劑(1)將GAUZ 412的菌絲或孢子接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為1000毫升PDA培養(yǎng)基中添加6克蔗糖和6甘油，25℃下培養(yǎng)8天獲得試管種。
(2)將斜面種子接種到三角瓶(500毫升)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為1000毫升PDA中添加12克糖蜜、3克硫酸銨，4克氯化鈉，1克硫酸二氫鉀，2克檸檬酸三鈉，8克蔗糖，8毫升甘油。26℃下，搖床(轉(zhuǎn)速250rpm)培養(yǎng)10天。
(3)將發(fā)酵好的三角瓶液體菌種接入1噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基配方與前述(2)相同，30℃，培養(yǎng)48小時后接入10噸發(fā)酵罐中發(fā)酵190小時后，放出與5％蟹殼粉或蝦殼粉或幾丁質(zhì)，1％活性炭混合后，用草碳和農(nóng)作物秸桿糠吸附并混勻，42℃烘干后制成微粒劑。
2、試驗方法(1)試驗用藥劑及處理A、生防制劑2公斤/畝，在烤煙移栽時一次性施于苗根際；B、阿巴丁，稀釋1000倍液，在烤煙移栽時一次性施于苗根部；C、空白對照，施入清水。
(2)試驗方法供試作物為感病煙草品種紅花大金元，試驗地點為云南省昆明市宜良縣馬街鄉(xiāng)龔家營村，歷年發(fā)生根結(jié)線蟲(Meloidogyne)很嚴重的地塊，土壤為紅壤，肥力中等。
小區(qū)為單行區(qū)，面積33平方米，種煙50株，每處理設(shè)3個重復(fù)，隨機排列，共9個小區(qū)，四周設(shè)保護行，按優(yōu)質(zhì)煙栽培管理措施規(guī)范化管理。
(3)調(diào)查方法在烤煙采收最后一片煙葉后立即進行發(fā)病情況調(diào)查，每小區(qū)隨機取10株進行挖根調(diào)查，根翻挖出來后，用水輕洗去泥沙，用放大鏡檢查根結(jié)并注意觀察卵塊情況，按煙草系統(tǒng)根結(jié)線蟲病分級標(biāo)準(Y/cT40-1996)分級記載，分別計算病株率、根結(jié)百分率、根壞死百分率、病情指數(shù)、防治效果。
各個小區(qū)掛牌采收和烘烤，不同處理分別分級，稱重計算產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價、上等煙和中上等煙比例。
4、實驗結(jié)果表2 生防制劑對根結(jié)線蟲的防治率

表3 不同藥劑處理煙株的經(jīng)濟性狀指標(biāo)

結(jié)果表明生防制劑的病株率/％、根結(jié)百分率/％、根壞死百分率/％、病情指數(shù)分別比阿巴丁低24.8％、15％、8％、23.3，比空白對照低41.5％、30％、13％、40，平均防效比化學(xué)農(nóng)藥阿巴丁高41％，顯示了生防制劑很好的防效，具備了生產(chǎn)上大量推廣的基本條件。
經(jīng)濟性狀指標(biāo)分析表明，生防制劑的各個經(jīng)濟性狀指標(biāo)都較化學(xué)農(nóng)藥和對照高，其產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價、上等煙比例和中上等煙比例分別比化學(xué)農(nóng)藥阿巴丁高3.9kg、32.7元、0.06元、10.3％、7％，比對照分別提高了4.4kg、50元、1.41元、12.8％、11.2％。
田間藥效試驗表明，本發(fā)明生產(chǎn)的生防制劑對根結(jié)線蟲有良好的防治效果，其防效超過化學(xué)農(nóng)藥阿巴丁，可以在生產(chǎn)上推廣使用。
實例三固體發(fā)酵制備生防制劑采用前述實例二(1)制備固體試管斜面菌種，實例二(2)制備三角瓶液體菌種，將培養(yǎng)好的三角瓶液體菌種接入固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基的配方為15％豆餅粉、20％麩皮、55％農(nóng)作物秸桿糠、10％蟹殼粉或蝦殼粉或幾丁質(zhì)，25℃培養(yǎng)20天后，42℃溫度條件下烘干后制成粉劑或微粒劑。
權(quán)利要求
1.一種防治植物寄生線蟲的生防制劑，由生產(chǎn)菌株和輔料按常規(guī)方法制備，其特征在于該生防制劑的生產(chǎn)菌株為中華輪枝菌Verticillium sinense GAUZ 412，該菌株已于2003年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0933。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治植物寄生線蟲的生防制劑，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的生防制劑按常規(guī)方法制備，其中，生產(chǎn)菌株采用中華輪枝菌Verticillium sinense GAUZ 412，該菌株已于2003年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0933。本發(fā)明將該菌株，通過固體或液體培養(yǎng)，獲得包括菌絲、分子孢子、厚垣孢子的菌體培養(yǎng)物，與蟹殼粉、蝦殼粉、幾丁質(zhì)、活性炭和草碳、農(nóng)作物秸桿糠等輔料和吸附載體按一定比例混合后，制成粉劑或微粒劑的線蟲生物制劑。本發(fā)明具有明顯穩(wěn)定的防治效果，綜合性狀好，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A01N63/00GK1476762SQ0313513
公開日2004年2月25日 申請日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者周薇, 張克勤, 莫明和, 周 薇 申請人:云南大學(xué)