專利名稱：壇紫菜良種選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用人工誘變、體細(xì)胞克隆和單性生殖等技術(shù)選育壇紫菜良種，屬于海藻的栽培。
背景技術(shù)：
紫菜是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的海藻食品，作為海洋健康食品，深受中國(guó)、日本、朝鮮以及東南亞各國(guó)人民的喜愛。紫菜養(yǎng)殖的成本低、周期短、產(chǎn)值高，是我國(guó)沿海一項(xiàng)很重要的海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。在我國(guó)被大規(guī)模養(yǎng)殖的紫菜有南方的壇紫菜和北方的條斑紫菜。我國(guó)紫菜產(chǎn)量的80％為壇紫菜，條斑紫菜約占20％。近十多年來，我國(guó)的條斑紫菜養(yǎng)殖由于引進(jìn)了日本的優(yōu)良養(yǎng)殖品種和先進(jìn)加工技術(shù)，產(chǎn)量和產(chǎn)值取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，大部份產(chǎn)品被銷往國(guó)外市場(chǎng)。壇紫菜的年產(chǎn)量雖占全國(guó)紫菜產(chǎn)量的八成左右，但它的產(chǎn)值卻不及條斑紫菜。所以，培育出適合栽培的良種對(duì)提高我國(guó)壇紫菜養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和擴(kuò)大養(yǎng)殖規(guī)模已十分迫切。
紫菜育種主要在日本和中國(guó)開展。日本對(duì)主要養(yǎng)殖種條斑紫菜進(jìn)行了大量的良種選育工作。上世紀(jì)六十年代，日本開展了條斑紫菜的大田(海區(qū))良種選育工作，并成功得選出細(xì)長(zhǎng)型晚成熟的優(yōu)良品種；七十年代，新品種在全國(guó)推廣，使年產(chǎn)量大飛躍；同時(shí)，他們又從紫菜養(yǎng)殖群體中分離出自然色素突變體。到八十年代中期，通過不同自然色素突變體相互雜交獲得了良種。八十年代初，我國(guó)初步開展了條斑紫菜的大田品種選育；另一方面，我國(guó)的條斑紫菜生產(chǎn)，開始引進(jìn)日本的資金、優(yōu)良品系和先進(jìn)加工技術(shù)，使產(chǎn)量和產(chǎn)值十年上了一個(gè)新臺(tái)階。壇紫菜是我國(guó)的特有品種，具有個(gè)體大，生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高等特點(diǎn)。雖然，對(duì)壇紫菜的基本生物學(xué)、生活史、全人工采苗、自由絲狀體采苗和養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)行了大量的研究工作(福建省水產(chǎn)局，壇紫菜人工養(yǎng)殖)，1979，福建人民出版社)；但壇紫菜的品種選育工作幾乎沒有開展過，目前生產(chǎn)上使用的養(yǎng)殖品種仍為野生種。
壇紫菜的生活史可劃分為微型的絲狀體和大型的葉狀體二個(gè)階段，其葉狀體被大規(guī)模養(yǎng)殖并被制成商品供食用。絲狀體的核相為二倍體世代(2n)，經(jīng)過幾個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，最終成熟放出殼孢子(2n)，殼孢子萌發(fā)后發(fā)育成單倍體的葉狀體(n)。絕大部份葉狀體為雌雄異體，長(zhǎng)大成熟后，雄性葉狀體產(chǎn)生精子囊器，放散的精子(n)隨水飄至并附著在雌性葉狀體上，與其成熟的果胞(n)受精。受精的果胞(2n)發(fā)育成果胞子囊，成熟放散出來的果胞子(2n)鉆入貝殼或在海水中發(fā)育成絲狀體(2n)。壇紫菜葉狀體不能放散單孢子進(jìn)行無性繁殖。(曾呈奎、王素娟、劉思儉等編，1985。海藻栽培學(xué)，上?？萍汲霭嫔?。由于壇紫菜葉狀體為雌雄異體，又沒有單孢子無性繁殖途徑。另外，它的細(xì)胞減數(shù)分裂到底是發(fā)生在殼孢子放散前還是放散后的萌發(fā)階段沒有搞清楚，遺傳育種工作很困難。我們對(duì)壇紫菜葉狀體的單離細(xì)胞分離和培養(yǎng)，葉狀體細(xì)胞分化，突變體分離和雜交等進(jìn)行了十多年的基礎(chǔ)遺傳研究(王素娟、張小平、徐云龍等?！皦喜藸I(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究”，海洋與湖沼.1986，17(3)217-221；Yan X H，Wang S J.Studies on the development and differentiationof the somatic cells from Porphyra spp.(Rhodophyta).Marine Sciences.1990.3(2)195-208；嚴(yán)興洪，2003.國(guó)家863重大專項(xiàng)研究項(xiàng)目“壇紫菜良種選育技術(shù)”中期成果報(bào)告)，闡明了壇紫菜與雌雄同體的條斑紫菜一樣，減數(shù)分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)后的第一和第二次細(xì)胞分裂；減數(shù)分裂后產(chǎn)生的4個(gè)細(xì)胞在遺傳上存在一定的差異，這四個(gè)細(xì)胞繼續(xù)分裂發(fā)育成大葉狀體。所以，一個(gè)由殼孢子發(fā)育而來的壇紫菜葉狀體在遺傳上屬嵌合體。
紫菜的體細(xì)胞分離工具酶，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞苗種生產(chǎn)應(yīng)用，紫菜純系培養(yǎng)等有不少研究報(bào)告請(qǐng)參見唐延林 紫菜營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)(山東海洋學(xué)院學(xué)報(bào)，1982，12(4)37-50)；方宗熙，戴繼勛，唐延林等紫菜細(xì)的酶法分離和在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用(海洋科學(xué)，1986，10(3)46-47；王素娟、張小平、徐云龍等壇紫菜營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究)(海洋與湖沼.1986，17(3)217-221)，以及相關(guān)專利報(bào)道，中國(guó)專利號(hào)分別為85104059，91107320，96116039和01132162。但國(guó)內(nèi)外對(duì)壇紫菜良種選育技術(shù)沒有專利報(bào)道。
本發(fā)明的目的利用現(xiàn)代生物技術(shù)，建立一套有效，快速，可靠的壇紫菜良種選育技術(shù)，以便選育出壇紫菜良種應(yīng)用于生產(chǎn)，提高我國(guó)紫菜養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
選育步驟為(1)用自然的野生壇紫菜葉狀體放散果孢子，使其萌發(fā)生長(zhǎng)，以獲取野生種自由絲狀體；(2)從野生種自由絲狀體放散出殼孢子，并將其培養(yǎng)成葉狀體，然后用人工誘變劑對(duì)它們進(jìn)行誘變處理，再培養(yǎng)；(3)用海洋細(xì)菌酶處理經(jīng)誘變后的葉狀體，分離出單離的細(xì)胞和原生質(zhì)體，并把它們培養(yǎng)成葉狀體；(4)依據(jù)良種選拔指標(biāo)選拔出優(yōu)良再生葉狀體，并進(jìn)行單株培養(yǎng)；(5)對(duì)被選拔出來的優(yōu)良葉狀體的主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進(jìn)行定量和定性測(cè)定，以判斷紫菜的生長(zhǎng)和品質(zhì)等性狀的優(yōu)劣和穩(wěn)定性；(6)再次酶解優(yōu)良葉狀體以獲得單離細(xì)胞和原生質(zhì)體，并把它們培養(yǎng)成再生植株，利用單性生殖技術(shù)，獲得二倍體的純系絲狀體；(7)當(dāng)純系絲狀體成熟后，使其放出殼孢子，培養(yǎng)成F1代葉狀體，并對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)分析和遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)；
(8)將優(yōu)良品系的自由絲狀體粉碎后移植于貝殼內(nèi)，培養(yǎng)成貝殼絲狀體，然后，從貝殼絲狀體采殼孢子于養(yǎng)殖網(wǎng)簾上，進(jìn)行葉狀體海區(qū)養(yǎng)殖生產(chǎn)性試驗(yàn)；(9)良種以自由絲狀體形式保持在室內(nèi)。
所述人工誘變劑為N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)；所述人工誘變劑也可是60Co-γ射線；所述海洋細(xì)菌酶的來源細(xì)菌為假單胞桿菌(Psuedomonas sp)；所述主要光合色素和色素蛋白為葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白。
與現(xiàn)有大田紫菜良種選育技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)品系選育面廣，可獲得的優(yōu)良品系量多。由于使用了人工誘變技術(shù)，使變異細(xì)胞在數(shù)量和類型上大幅度地增加，在它們的細(xì)胞再生體中，可獲得大量具不同優(yōu)良性狀的變異體，用于進(jìn)一步良種選拔。(2)選育良種速度快。由于利用了體細(xì)胞快繁技術(shù)，在室內(nèi)一年可進(jìn)行數(shù)次的葉狀體培養(yǎng)和優(yōu)良品系選拔，克服了大田紫菜良種選育中由于季節(jié)限制一年只能獲得一次葉狀體的不足之處，從而可在較短時(shí)間內(nèi)(2-3年)獲得可被生產(chǎn)使用的優(yōu)良品系，而傳統(tǒng)大田良種選育法效率低，周期長(zhǎng)(5年以上)。(3)獲得的良種為遺傳型純系，優(yōu)良性狀十分穩(wěn)定。鑒于壇紫菜的減數(shù)分裂發(fā)生在殼孢子萌發(fā)后的第一和第二次細(xì)胞分裂；減數(shù)分裂后產(chǎn)生的4個(gè)細(xì)胞在遺傳上存在一定的差異，這4個(gè)細(xì)胞繼續(xù)分裂發(fā)育成遺傳上屬嵌合的大葉狀體。本發(fā)明通過連續(xù)二次體細(xì)胞克隆繁殖來分離優(yōu)良品系，確保了獲得的品系為真正遺傳意義上的純系。分離到的良種純系因?yàn)榻z狀體(二倍體)其等位基因完全純合，所以在它們的葉狀體(單倍體)世代中，個(gè)體遺傳背景完全相同，在相同的生長(zhǎng)環(huán)境中，個(gè)體差異變得很小，不會(huì)出現(xiàn)優(yōu)良性狀的分離，確保了良種的產(chǎn)量和質(zhì)量。用傳統(tǒng)的大田良種選育技術(shù)獲得的條班紫菜良種，由于往往不是純系，在子代葉狀體世代中，經(jīng)常出現(xiàn)優(yōu)良性狀的分離和丟失，需要一面使用一面再選拔，否則，較難維持良種的優(yōu)良性狀。(4)本發(fā)明使用的海洋細(xì)菌酶其分離紫菜單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體的效果遠(yuǎn)比市場(chǎng)上使用的海螺酶好，并且酶對(duì)細(xì)胞毒性低，分離的細(xì)胞成活率高，確保了經(jīng)人工誘變獲得的變異細(xì)胞被有效地分離和培養(yǎng)成植株，加快了良種的篩選。
具體實(shí)施例方式
1.采集自然生長(zhǎng)的野生壇紫菜葉狀體，除雜藻后，清洗干凈，并涼干，脫水70％左右。重新把葉狀體浸泡于消毒海水，收集由葉狀體放散的果孢子，并將它們培養(yǎng)成自由絲狀體。
2.從野生種自由絲狀體放散殼孢子，并將其培養(yǎng)成葉狀體，然后對(duì)它們進(jìn)行人工誘變處理。誘變劑選用MNNG，處理濃度為10-25ppm，處理時(shí)間30min，也可使用60Co-γ射線處理，照射劑量為500-1500Gy。經(jīng)過處理的葉狀體沖氣培養(yǎng)2周后，用于酶解，分離細(xì)胞。
3.用于分離細(xì)胞的葉狀體，用消毒海水清洗3-5次后，切成碎片(2mm2左右)，投入酶液中酶解。酶液含0.5％海洋細(xì)菌酶，0.8M甘露醇，60％自然海水和40％蒸餾水。酶解條件26℃，1.5h，黑暗。然后，用200目的篩絹把單離的細(xì)胞和原生質(zhì)體過濾出來，用離心法(1000rpm，5min)先把酶液除去，再用比重為1.035的海水懸浮細(xì)胞并再次離心(1000rpm，5min)，依次連續(xù)離心洗滌3次后，把所得細(xì)胞置MES培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)。
4.單離細(xì)胞和原生質(zhì)體的培養(yǎng)和植株再生條件20℃，第1周的光強(qiáng)為1000lux(12L∶12D)，第2周以后，光強(qiáng)增至3000lux(12L∶12D)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)育成小葉狀體后，把它們從培養(yǎng)皿里移至培養(yǎng)瓶中沖氣培養(yǎng)，溫度不變，同時(shí)光強(qiáng)增至5000lux(12L∶12D)。當(dāng)再生葉狀體體長(zhǎng)達(dá)到1cm時(shí)，選出具優(yōu)良性狀的變異體，進(jìn)行單個(gè)培養(yǎng)。另外，對(duì)被選拔出來的優(yōu)良再生葉狀體進(jìn)行下列主要光合色素和色素蛋白----葉綠素a，藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白的含量測(cè)定，因?yàn)檫@三種色素和蛋白的含量高低以及它們之間的比決定了紫菜的品質(zhì)和生長(zhǎng)；同時(shí)，測(cè)定活體吸收光譜，測(cè)定游離氨基酸和總蛋白質(zhì)的含量，測(cè)定藻體的厚度和光澤。
5.當(dāng)被選拔出來的優(yōu)良再生葉狀體達(dá)到一定的大小，再次依照上述方法酶解出單離細(xì)胞，并把它們培養(yǎng)成再生葉狀體。當(dāng)從小單株培養(yǎng)的優(yōu)良葉狀體快成熟時(shí)，利用單性生殖，獲得二倍體的絲狀體純系。
6.當(dāng)純系絲狀體成熟后，使其放出殼孢子，培養(yǎng)成F1代葉狀體，并對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)分析和遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)。
7.將性狀穩(wěn)定的優(yōu)良品系的自由絲狀體粉碎，并移植于貝殼內(nèi)，培養(yǎng)成貝殼絲狀體；然后，用貝殼絲狀體采殼孢子于養(yǎng)殖網(wǎng)簾上，進(jìn)行海區(qū)葉狀體養(yǎng)殖生產(chǎn)性試驗(yàn)；對(duì)海上養(yǎng)殖的葉狀體再次進(jìn)行生長(zhǎng)，品質(zhì)，抗病性等綜合性分析，選拔出優(yōu)良品系。
8.把獲得的良種自由絲狀體培養(yǎng)在15℃，300lux(12L∶12D)條件下保存。
權(quán)利要求
1.壇紫菜良種選育方法，其特征在于選育步驟為(1)用自然的野生壇紫菜葉狀體放散果孢子，使其萌發(fā)生長(zhǎng)，以獲取野生種自由絲狀體；(2)從野生種自由絲狀體放散出殼孢子，并將其培養(yǎng)成葉狀體，然后用人工誘變劑對(duì)它們進(jìn)行誘變處理，再培養(yǎng)；(3)用海洋細(xì)菌酶處理經(jīng)誘變后的葉狀體，分離出單離的細(xì)胞和原生質(zhì)體，并把它們培養(yǎng)成葉狀體；(4)依據(jù)良種選拔指標(biāo)選拔出優(yōu)良再生葉狀體，并進(jìn)行單株培養(yǎng)；(5)對(duì)被選拔出來的優(yōu)良葉狀體的主要光合色素和色素蛋白以及活體吸收光譜進(jìn)行定量和定性測(cè)定，以判斷紫菜的生長(zhǎng)和品質(zhì)等性狀的優(yōu)劣和穩(wěn)定性；(6)再次酶解優(yōu)良葉狀體以獲得單離細(xì)胞和原生質(zhì)體，并把它們培養(yǎng)成再生植株，利用單性生殖技術(shù)，獲得二倍體的純系絲狀體；(7)當(dāng)純系絲狀體成熟后，使其放出殼孢子，培養(yǎng)成F1代葉狀體，并對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)分析和遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)；(8)將優(yōu)良品系的自由絲狀體粉碎后移植于貝殼內(nèi)，培養(yǎng)成貝殼絲狀體，然后，從貝殼絲狀體采殼孢子于養(yǎng)殖網(wǎng)簾上，進(jìn)行葉狀體海區(qū)養(yǎng)殖生產(chǎn)性試驗(yàn)；(9)良種以自由絲狀體形式保持在室內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壇紫菜良種選育方法，其特征在于所述人工誘變劑為N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壇紫菜良種選育方法，其特征在于所述人工誘變劑也可是60Co-γ射線；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壇紫菜良種選育方法，其特征在于所述海洋細(xì)菌酶的來源細(xì)菌為假單胞桿菌；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的壇紫菜良種選育方法，其特征在于所述主要光合色素和色素蛋白為葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)方法，其特征在于所述選拔優(yōu)良葉狀體的主要指標(biāo)葉狀體的體型，顏色，生長(zhǎng)速度和成熟早晚；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)方法，其特征在于所述品質(zhì)分析內(nèi)容為游離氨基酸和總蛋白質(zhì)的含量，藻體厚度，干品的色澤。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用人工誘變、體細(xì)胞克隆和單性生殖等選育壇紫菜良種，屬于海藻的栽培。通過化學(xué)或物理人工誘變法獲得壇紫菜的變異細(xì)胞，用生物工具酶將變異細(xì)胞單個(gè)分離并將其培養(yǎng)成完整葉狀體。依據(jù)葉狀體的主要光合色素和色素蛋白質(zhì)含量的高低和它們相互間的比值，游離氨基酸含量高低，生長(zhǎng)速度，藻體的厚薄和色澤等指標(biāo)，篩選出優(yōu)良突變體葉狀體，并將它們?cè)俅蚊附猥@得單離體細(xì)胞進(jìn)行再生培養(yǎng)。將獲得的幼小葉狀體單個(gè)分離，培養(yǎng)至大葉狀體，利用單性生殖獲得純系絲狀體。優(yōu)良品系的純系絲狀體的F1代葉狀體，其優(yōu)良性狀經(jīng)遺傳穩(wěn)定性分析和綜合品質(zhì)測(cè)定后，對(duì)優(yōu)良品系的純系自由絲狀體進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并移植于貝殼內(nèi)使之成為貝殼絲狀體，隨后，進(jìn)行用貝殼絲狀體進(jìn)行大田采苗和養(yǎng)殖試驗(yàn)。經(jīng)大田試驗(yàn)證明為性狀穩(wěn)定的優(yōu)良品系，以自由絲狀體的方式進(jìn)行長(zhǎng)期保存和推廣應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有紫菜大田良種選育技術(shù)相比，具良種選育速度快，選育面廣，獲得品系純，優(yōu)良性狀穩(wěn)定，良種保存和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01G33/00GK1565168SQ0314144
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者嚴(yán)興洪 申請(qǐng)人:上海水產(chǎn)大學(xué)