專利名稱：一種向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育抗病小麥的方法，特別是涉及一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法。
背景技術(shù)：
小麥白粉病(Erysiphe graminis f.sp.tritici)是一種世界性病害，過去主要發(fā)生在冰冷、潮濕、多雨地區(qū)。近些年來，由于生產(chǎn)水平提高所帶來的化肥投入增加、種植密度提高、灌溉條件改善等原因，小麥產(chǎn)量穩(wěn)步提高，同時也為白粉病流行提供了適合的田間環(huán)境，導(dǎo)致小麥白粉病危害地區(qū)和發(fā)生頻率逐年擴(kuò)大，白粉病已經(jīng)上升為我國小麥的首要病害，成為影響和限止小麥穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的最大障礙。隨著小麥白粉病發(fā)生面積和頻率的增加，白粉病病菌的生理小種變異頻繁。目前，我國已發(fā)現(xiàn)了74個生理小種，這些小種流行于不同的麥區(qū)和不同的年份，抗病品種的選育工作往往落后于優(yōu)勢小種的變更，加上抗源貧乏等諸多因素的影響，大多數(shù)小麥品種很難保持較好的白粉病抗性。
簇毛麥(Haynaldia villosa或Dasypyrum Villosum(L)Shur，2n＝14vv)屬小麥亞族簇毛麥屬，是一年生二倍體禾本草。它分蘗力強(qiáng)，小穗數(shù)多(每穗有28-43個小穗)，耐旱，籽粒蛋白質(zhì)含量高(22-24％)，高抗白粉病，對全蝕病(I.L.Laursen et al 1973年)、眼斑病(A.Yildirim et al，2000年)、Wheat Curl Mite和WSMV(Hongjie Li etal 2001年)均有較強(qiáng)的抗性。最早報道簇毛麥抗白粉病基因Pm-v對84個來自美國、德國、中國的小麥白粉病菌菌系均表現(xiàn)免疫和高抗，是目前已知抗性基因中抗性最強(qiáng)、抗譜最廣的，該基因在小麥遺傳背景下均能很好表達(dá)，呈顯性遺傳。因此，它被小麥遺傳育種工作者所青睞，成為小麥遺傳改良的重要種質(zhì)源。但是，據(jù)Sears(1995)報道，簇毛麥染色體組V與普通小麥的A.B.D組染色體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，常規(guī)的遠(yuǎn)緣雜交程序難以把簇毛麥的有益性狀導(dǎo)入到普通小麥中。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)，快速、有效地向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法。
本發(fā)明方法是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法，包括以下步驟1)硬粒小麥與簇毛麥遠(yuǎn)緣雜交，幼胚或幼穗離體培養(yǎng)，再生得到硬粒小麥-簇毛麥異源雙二倍體；2)硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體與普通小麥回交轉(zhuǎn)育后，對雜交種子再生植株的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，獲得加倍單倍體植株；自交和定向選擇，獲得具有簇毛麥抗白粉病基因的小麥。
所述遠(yuǎn)緣雜交過程中，對硬粒小麥-簇毛麥雜交種幼胚或幼穗離體培養(yǎng)獲得的具有綠芽點(diǎn)愈傷組織進(jìn)行秋水仙素處理，實(shí)現(xiàn)染色體加倍。所述秋水仙素濃度一般為100-200ppm，處理時間為6-10天。較優(yōu)選的秋水仙素濃度為150ppm，處理時間為8天。
為了使目的基因漸滲，所述硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體與普通小麥回交轉(zhuǎn)育后，對雜交種子再生植株的花藥進(jìn)行培養(yǎng)之前，對雜交種子的幼胚進(jìn)行繼代培養(yǎng)。所述繼代培養(yǎng)進(jìn)行2-3次。
再生植株進(jìn)行花藥培養(yǎng)的目的是快速純和基因，縮短選育年限?；ㄋ幣囵B(yǎng)過程中經(jīng)過自然加倍，產(chǎn)生再生植株。這些再生植株的基因純合，其自交后代不易發(fā)生顯隱性基因分離的現(xiàn)象，遺傳性狀比較穩(wěn)定。
對本發(fā)明方法獲得的抗白粉病小麥進(jìn)行目標(biāo)性狀跟蹤，同工酶、細(xì)胞遺傳學(xué)分析，原位雜交和分子標(biāo)記，確定已成功地將簇毛麥抗白粉病基因?qū)氲狡胀ㄐ←溨?，其遺傳組成正確。
本發(fā)明方法利用有性雜交和幼胚、幼穗、花藥培養(yǎng)技術(shù)，把簇毛麥的有益性狀導(dǎo)入普通小麥，有效解決了常規(guī)遠(yuǎn)緣雜交中，雜交不親和性、雜種后代瘋狂分離及選育年限久遠(yuǎn)的難題。創(chuàng)造的雙二倍體、異源代換系、易位系、端體系為小麥育種提供了可直接利用的種質(zhì)，對促進(jìn)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用價值。


圖1為硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體的構(gòu)建流程2為6D/6V異代換系RW14和RW15的構(gòu)建流程3為谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)電泳圖譜圖4-A及圖4-B為RAPD分子標(biāo)記電泳圖譜圖5為6DL/6VS易位系Pm97033的構(gòu)建流程6為RAPD分子標(biāo)記電泳圖譜圖7為6VS端體系的選育流程8為6VS端體系原位雜交9為醇溶蛋白電泳圖譜圖10為psr8/EcoR V RFLP圖譜圖11為psr546/Dra I RFLP圖譜
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、利用幼胚、幼穗培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)造硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體1、選育過程利用遠(yuǎn)緣雜交種幼胚和幼穗離體培養(yǎng)技術(shù)，加速擴(kuò)大雜種群體，由一個雜種胚繼代培養(yǎng)半年到一年的時間，獲得百余株或千余株再生植株。
用不同濃度的秋水仙素處理硬粒小麥/簇毛麥雜種具綠芽點(diǎn)的愈傷組織，再生出染色體加倍了的異源雙二倍體。平均加倍率(加倍成功株數(shù)/成活株數(shù))達(dá)到78.8％，是組培過程中自然加倍率的6.3倍。其中D311/H.V的加倍率最高，為96.9％，秋水仙素濃度150ppm處理8天的效果最好。
硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體的構(gòu)建過程如圖1所示。
2、白粉病抗性鑒定簇毛麥對現(xiàn)有白粉病菌系都表現(xiàn)全生育期免疫或高抗。這種抗性在硬-簇雙二倍體中也能很好地表達(dá)，盡管它們的母本硬粒小麥高度感染白粉病。硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體主要農(nóng)藝特征如表1所示。
3、生化標(biāo)記利用乙醇脫氫酶(ADH)生化標(biāo)志檢測雙二倍體，發(fā)現(xiàn)雙二倍體ADH酶譜除具有雙親譜帶外，還有一條雙親ADH酶結(jié)構(gòu)基因共同作用形成的譜帶。酯酶(EST)同工酶譜中發(fā)現(xiàn)在負(fù)極有二條重組四倍體81081A和墨75的特征帶，硬粒小麥D311沒有這二條酶帶，而且發(fā)現(xiàn)與穎殼上蠟粉相關(guān)的特異帶，有蠟粉的TH1W、TH2W和TH3W均缺失此帶。
4、染色體組成及農(nóng)藝性狀硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體TH1和TH1W(81086A/H.V)、TH2W(D311/H.V)、TH3和TH3W(墨75/H.V)體細(xì)胞染色體數(shù)2n＝42，染色體組為AABBVV。它們的株高、穗形都近似母本，而穎脊剛毛、葉鞘茸毛、穗軸易折等特性則為簇毛麥所特有。籽粒淺紅，蛋白質(zhì)含量19.3-22.6％，比相應(yīng)母本高15-33％，對白粉病免疫。
表1 硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體主要農(nóng)藝性狀

實(shí)施例2、以硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體TH3為橋梁，向普通小麥導(dǎo)入簇毛麥抗白粉病基因。
硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體TH3具有簇毛麥抗白粉病、高蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)，也攜帶有簇毛麥的不良性狀穗軸易斷，穎殼硬，不易脫粒，莖稈細(xì)軟等，所以不能直接應(yīng)用于生產(chǎn)或小麥育種計劃。
1、通過回交轉(zhuǎn)育和幼胚、花藥培養(yǎng)創(chuàng)造6D/6V異代換系RW14和RW151)選育過程用宛7107、陜7859(河南省大面積栽培品種)和冀麥30(河北省栽培品種)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，逐代選育2n＝42，抗病及結(jié)實(shí)率高(每穗粒數(shù)大于20粒)的單株進(jìn)行回交，在TH3/宛7107//2×冀麥30/3/陜7859組合中獲得雜交種子5粒(來自同一雜交穗)。
對5粒雜交種子進(jìn)行幼胚繼代培養(yǎng)2-3次，5個幼胚均生長出愈傷組織，但是僅兩個幼胚的愈傷組織(HV90940和HV90941)分化出綠苗，其中HV90940獲得29株再生植株，HV90941獲得19株再生植株，所有再生植株皆對白粉病表現(xiàn)免疫。
對HV90940的SC2代中農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好的HV90940-G1-N2進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得加倍單倍體8株。經(jīng)連續(xù)3年自交后代的抗性鑒定，對白粉病都表現(xiàn)免疫。在DH3代定名為RW14(包括94G22-1，94G25-1等)。
對HV90941的19株抗病株繼續(xù)進(jìn)行自交和定向選擇，從SC5代選育出94G32-1、94G33-1，定名為RW15。
6D/6V異代換系RW14和RW15的構(gòu)建過程如圖2所示。
2)白粉病抗性鑒定用北京地區(qū)的白粉病混合菌種進(jìn)行鑒定，RW14和RW15及與感病品種雜交F1均表現(xiàn)免疫，其F2代抗∶感比例為3∶1，說明它們的抗性是由一對顯性基因控制的。
用84個來自美國、德國、中國的小麥白粉病菌菌系進(jìn)行苗期接種鑒定，發(fā)現(xiàn)簇毛麥、TH3及RW14、RW15對所有參試的白粉病菌系表現(xiàn)免疫和高抗，其中表現(xiàn)免疫的有63個小種，占83％；表現(xiàn)高抗的有21個，占17％，是目前已知抗性基因中抗性最強(qiáng)、抗譜最廣的。該基因在硬粒小麥、普通小麥遺傳背景中均能很好表達(dá)，呈顯性遺傳。
3)細(xì)胞遺傳學(xué)和生化鑒定染色體數(shù)與染色體構(gòu)型RW14和RW15根尖細(xì)胞染色體數(shù)為42，花粉母細(xì)胞PMCMI的染色體構(gòu)型為21個二價體，與感病品種測交F1PMC MI的染色體構(gòu)型為20II+2I。
原位雜交用熒光標(biāo)記的簇毛麥基因組總DNA作探針，進(jìn)行根尖細(xì)胞染色體原位雜交，RW14和RW15均能顯現(xiàn)出2條簇毛麥染色體。染色體C-分帶結(jié)果表明，這2條染色體都是6V染色體，其特征是短臂有較強(qiáng)的端帶和著絲粒帶；長臂有較強(qiáng)的中間帶和次端帶，并有一條較弱的端帶。
重雙端體測交用中國春6A、6B、6D重雙端體對RW14進(jìn)行測交，雜種F1PMC MI染色體構(gòu)型的觀察結(jié)果表明，CS6ADDT/RW14和CS6BDDT/RW14為19II+1III+2I，而CS 6D DDT/RW14為20II+1I+2t，由此證明RW14為6D/6V異代換系。
谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)電泳分析Hart(1975)指出，GOT是由第6部份同源群染色體6A、6B和6D上的GOT結(jié)構(gòu)基因編碼形成的。本發(fā)明電泳圖表明，在COT-2區(qū)，簇毛麥有一條帶，RW14和RW15有三條帶其中一條與簇毛麥相同，一條與普通小麥相同，第三條帶遷移率居中，由普通小麥、簇毛麥GOT結(jié)構(gòu)基因共同編碼形成的。由此，進(jìn)一步證明RW14和RW15為6D/6V異代換系。谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)電泳結(jié)果如圖3所示，其中，1.蘇聯(lián)簇毛麥；2.TH3；3.RW15；4.6V附加系；5.Pm97033；6.Pm97034；7.Pm97035；8.C.S；9.Wan7107；10.RW15。
4)RAPD分子標(biāo)記對RW14等6D/6V異代換系的抗白粉病基因進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記檢測，發(fā)現(xiàn)OPAN031700、OPAI01700、OPAL03750等均可作為RW14的分子標(biāo)記。標(biāo)記結(jié)果如表2所示，標(biāo)記電泳結(jié)果如圖4-A及圖-4B所示。
表2 RW14及其親本的RAPD分子標(biāo)記NO.Wheat lineOPAN031700OPAI01700OPAL03750OPAD17480OPAG156001 H.villosumM+ M+ M+ M+ M+2 M75 - - - - -3 Wan7107 - - - - -4 Shan7859 - - - - -5 Jimai30 - - - - -6 TH3 M+ M+ M+ M+ M+7 RW14 M+ M+ M+ M+ M+5)農(nóng)藝性狀RW14和RW15是首例通過組織培養(yǎng)獲得的普通小麥-簇毛麥6D/6V異代換系，它們起源于同一雜交組合同一穗。前者早熟、稈較高、紡形穗、白粒；后者中熟、稈較矮、分蘗較多、方形穗、紅粒。它們的抗性和農(nóng)藝性狀均能穩(wěn)定遺傳。
2、通過回交轉(zhuǎn)育和幼胚、花藥培養(yǎng)創(chuàng)造6DL/6VS易位系Pm97033、P97034和Pm97035。
1)選育過程以河南省推廣品種宛7107為回交親本，對TH3/宛7107×4代的雜交種子進(jìn)行幼胚培養(yǎng)，在SC5代獲得抗性不再分離的株系Pm931069-2、Pm931069-3。然后進(jìn)行花藥培養(yǎng)，加速農(nóng)藝性狀純合。在DH3代獲得抗性和農(nóng)藝性狀不再分離的Pm97033、Pm97034和Pm97035。6DL/6VS易位系Pm97033的構(gòu)建過程如圖5所示。
2)抗白粉病性鑒定三個易位系白粉病菌15號小種和北京地區(qū)混合菌種均表現(xiàn)全生育期免疫，與感病品種測交F1也表現(xiàn)全生育期免疫，呈顯性遺傳。
3)細(xì)胞遺傳學(xué)分析上述三個系的體細(xì)胞染色體數(shù)為2n＝42，均能見到4個具有隨體的完整染色體，表明易位與1B、6B染色體無關(guān)?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂中期I，染色體基本構(gòu)型為21II。用中國春重雙端體進(jìn)行測交，發(fā)現(xiàn)CS 6A DDT/Pm97033、C.S 6BDDT/Pm97033的F1PMC MI染色體基本構(gòu)型為20II+tIt，而CS 6D DDT/Pm97033 F1PMCMI染色體基本構(gòu)型為20II+It+t，說明Pm97033是與6D有關(guān)的易位系。
4)原位雜交用生物素標(biāo)記的簇毛麥基因組DNA作探針與Pm97033、Pm97034和Pm97035染色體進(jìn)行原位雜交，表明它們均為羅伯遜式易位，易位斷點(diǎn)在著絲點(diǎn)附近。
5)同工酶分析谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)分析表明Pm97033、Pm97034和Pm97035均缺少由6VL染色體上GOT-2結(jié)構(gòu)基因所編碼的特征帶，而具有6AL、6BL和6DL染色體上GOT-2結(jié)構(gòu)基因所編碼的特征帶，說明這三個易位系含有6AL、6BL和6DL染色體臂，缺少6VL染色體臂。
籽粒醇溶蛋白(Gli-2)電泳圖譜表明，三個易位系均具有6VS上結(jié)構(gòu)基因編碼的特征帶，缺少6DS上結(jié)構(gòu)基因編碼的特征帶。說明它們均缺少6DS染色體臂，而含有6VS染色體臂。
6)RAPD標(biāo)記以O(shè)PAN03為引物進(jìn)行擴(kuò)增，簇毛麥和易位系均能擴(kuò)增出OPAN031700的特征帶。RAPD分析圖譜如圖6所示，自左向右，1)分子量標(biāo)樣，2)墨75，3)Wan7107，4)Pm97033，5)Pm97034，6)Pm97035，7)H.V.，8)TH3，9)抗病代換系，10)抗病附加系。特征帶為OPAN031700。
7)農(nóng)藝性狀易位系在株型、穗形和籽粒性狀上與輪回親本宛7107相近，不表現(xiàn)簇毛麥及雙二倍體的任何野生性狀，也沒有南京農(nóng)大選育的6AL/6VS易位系的黑芒性狀。株高73-78cm，每穗39-43粒，棒形穗，長芒、紅粒、千粒重42-44克，半角質(zhì)。
3.從普通小麥CA9211與6D/6V異代換系RW15雜種幼胚培養(yǎng)后代中選育6DL/6VS抗病易位系和端體系1)選育過程以普通小麥CA9211為母本與6D/6V異代換系RW15進(jìn)行雜交，28個雜種幼胚在SD2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，SD1培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)兩次，1/2MS培養(yǎng)基上分化綠苗。共獲得再生植株117株，平均每個幼胚產(chǎn)生4.2株。共移栽成活77株，經(jīng)抗病性鑒定，SC1代抗∶感株比例為32∶45；抗病株順序編碼為T240-1到T240-32，選育過程如圖7所示。
2)抗病性與生化鑒定在SC2代對21個株系579株進(jìn)行抗病性鑒定，抗∶感＝221∶358。然后對抗病單株進(jìn)行谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT-2)電泳分析。結(jié)果表明21個SC2代株系中有9個株系(42.9％)的35個單株(16.1％)發(fā)生GOT-V2的特征帶的缺失，即缺少6VL染色體臂。其中T240-6、T240-7及T240-25 3個株系的所有抗病單株均缺失GOT-V2特征帶，即說明它們是臂間易位系或6VS端體系。
表3、T240組合SC2代株系的抗病性及GOT-V2鑒定結(jié)果


3)細(xì)胞遺傳學(xué)和原位雜交分析T240-7抗病株的根尖細(xì)胞染色體數(shù)2n＝42。用生物素標(biāo)記的簇毛麥基因組DNA作探針，進(jìn)行原位雜交，發(fā)現(xiàn)T240-7的抗病株均是雜合的臂間易位系。
T240-6-1和T240-6-12根尖細(xì)胞染色體數(shù)為2n＝41+t，原位雜交證明“t”端體是6VS，它們是單端體異代換系。對T240-6-12自交后代SC4代進(jìn)行抗病性鑒定，抗∶感為118∶2。到SC5代鑒定出雙端體異代換系T240-6-12-2-6，其28株全部抗病，根尖細(xì)胞染色體數(shù)2n＝41+2t，如圖8所示，原位雜交圖中可以清晰看到兩個簇毛麥端體6VS。
T240-6-2根尖細(xì)胞染色體數(shù)為2n＝41+2t，原位雜交證明它是簇毛麥雙端體異代換系。
4)農(nóng)藝性狀端體系農(nóng)藝性狀良好，株高82.2±5.8cm，穗長9.5±1.0cm，每穗小穗數(shù)20.3±1.4，每株穗數(shù)4.7±1.6，每穗可育小穗數(shù)17±1.1，結(jié)實(shí)87％±2％，千粒重40.4克。對白粉病免疫。其抗病基因取名為Pm-v。
實(shí)施例3、以小麥-簇毛麥異源易位系Pm97034和6VS端體材料T240-6-12和T240-6-12-2-6為材料，進(jìn)行Pm-v抗白粉病相關(guān)基因的克隆1、采用玻璃針顯微切割、單管技術(shù)體系及LA-PCR，構(gòu)建了6VS DNA特異質(zhì)粒文庫。
1)文庫含有17000個重組克隆，插入片段長度為100-1500bp，平均600bp。其中63％的插入序列克隆為單/低拷貝，37％為多拷貝。
2)從文庫中篩選到5個簇毛麥?；嗫截惒迦胄蛄衟HVMK134、pHVMK137、pHVMK125、pHVMK130和pHVMK67。3個簇毛麥?；瘑慰截愋蛄衟HVMK22、pHVMK15和pHVMK129。其中pHVMK22可以作為探針，檢測小麥遺傳背景下的Pm-v抗白粉病基因，6VS特征帶的大小為2Kb。
3)pHVMK 22的序列為252bp，GenBank登錄號為AF358923，同源性比較結(jié)果說明基因庫中沒有較高同源性的序列或基因，為一新序列。
2、根據(jù)抗病基因的保守序列設(shè)計引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得Pm-v抗病基因類似序列，為Pm-v抗白粉病基因克隆提供切入點(diǎn)或直接的探針。
1)利用己克隆抗病基因的保守域合成了7對引物Kina-HD、NLP、Xa21、RLK、S-AS、Pto、Pk。
從6VS端體DNA中擴(kuò)增出10類抗病基因同源片段HvrgakI-Hvrgak10(GenBank登錄號為AF387113-AF387120，AY040671，AY040672)。
2)上述10類抗病基因同源片段與己知抗病基因之間的同源性為5-20％。在Intenet上進(jìn)行BLASTN分析，序列Hvrgakl與山羊草(Aegilopsv ventricosa)抗病類似基因Partial rae 7 gene及Partial rae 6 gene同源性分別為82％和81％。序列Hvrgak3與Avena strigosa抗病基因部分序列有90％同源性，與水稻NBS-LRR類蛋白NBA2 gene有86％的同源性。
3)利用獲得的10類抗病基因相似序列(RGA)為探針，對小麥-簇毛麥易位系、代換系及其雙親的DNA，進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)Hvrgak2、Hvrgak9和Hvrgak5可能與Pm-v抗白粉病基因連鎖。
實(shí)施例4、6DL/6VS易位系Pm97633、Pm97034、Pm97035與6AL/6VS易位系92R179的異同分析6DL/6VS易位系Pm97633、Pm97034、Pm97035與6AL/6VS易位系92R179的異同分析6DL/6VS易位系的簇毛麥來自蘇聯(lián)，為冬性，6AL/6VS易位系的簇毛麥引自英國劍橋，為春性。前者6VS上的抗病基因暫取名為Pm-v，后者已定名為Pm-21。
經(jīng)檢測，來自蘇聯(lián)及劍橋的簇毛麥麥谷蛋白Glu-V1控制形成的HMW-Glutenin亞基不同，前者是2個亞基，后者為1個亞基；6VS染色體臂上的醇溶蛋白Gli-V1控制形成的特征帶也不相同，前者有1條特異帶，而且在雙二倍體、6D/6V代換系、6DL/6VS易位系中均能表達(dá)，后者沒有，如圖9所示；前者特有的RAPD分子標(biāo)記OPAL03750、OPAD17480和OPAG15600在其衍生系中均能顯現(xiàn)，而后者沒有此特征帶，RAPD標(biāo)記的結(jié)果如表4所示。
利用小麥第六部分同源群短臂上探針psr8、psr106、psr113、psr312、psr627、psr964和長臂上探針psr546、psr371，對EcoRI、HindIII、Dra I和EcoR V等限制酶切供試樣品基因組DNA進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明這些探針均能檢測出這兩個不同來源簇毛麥及6AL/6VS、6DL/6VS易位系的多態(tài)性。用小麥第六部分同源群短臂上探針psr8/EcoR V組合進(jìn)行RFLP分析，如圖10所示，圖中，1分子量標(biāo)樣；2中國春；3宛7107；4蘇聯(lián)簇毛麥(S)；5TH3；6蘇聯(lián)簇毛麥6V附加系；76D/6V代換系；8Pm97033；9Pm97034；10Pm97035；1197R179；126A/6V代換系；13劍橋簇毛麥(J)；14揚(yáng)麥5號。從圖中可以看出，蘇聯(lián)的簇毛麥有兩條特征帶，劍橋簇毛麥僅有一條特征帶，而且它們的大小、位置不同。用小麥第六部分同源群長臂上探針psr546/Dra I組合進(jìn)行RFLP分析，如圖11所示，圖中，1
表4、Pm與Pm-v基因的RAPD標(biāo)記品系 基因OPAI01700OPAN031700OPAL03750OPAD17480OPAG1560092-R149 Pm21M+ M+92-R137 Pm21M+ M+Pm941181 Pm21M+ M+Pm930640 Pm-vM+ M+M+ M+ M+RW14 Pm-vM+ M+M+ M+ M+RW15 Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH1 Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH1W Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH2W Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH3 Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH3W Pm-vM+ M+M+ M+ M+簇毛麥(原蘇聯(lián))Pm-vM+ M+M+ M+ M+墨75 感病-- ---Wan7107 感病-- ---冀麥30感病-- ---陜7859感病-- ---中國春；2宛7107；3TH3；4蘇聯(lián)簇毛麥6V附加系；56D/6V代換系；6Pm97033；7Pm97034；8Pm97035；9蘇聯(lián)簇毛麥；10劍橋簇毛麥；1197R179；12劍橋簇毛麥6V附加系；136A/6V代換系；14揚(yáng)麥5號。從圖中可以看出，蘇聯(lián)的簇毛麥有兩條特征帶，劍橋簇毛麥僅有一條特征帶，這些特征帶均能在附加系、代換系中顯現(xiàn)，而在易位系和普通小麥中沒有。上述結(jié)果說明這兩個不同來源的簇毛麥具有遺傳多樣性。
本發(fā)明把這兩個易位系雜交，F(xiàn)1對白粉病免疫，F(xiàn)2和F3抗性發(fā)生分離。Pm97033/92R179雜種F1、F2和F3抗病株人工接種鑒定的抗病分離結(jié)果如表5所示由此表可以看出，F(xiàn)2代抗性比例為R∶S＝21.8∶1，F(xiàn)3雜合抗病株系125個，感病株1366株，抗病株1360株，抗∶感比為1∶1。
表5 Pm97033/92R179雜種F1、F2和F3代抗白粉病性分離世代總株系總株數(shù)抗病株感 病純合抗病雜合抗病株數(shù) ％株系株系感病株/每株系F1180 180 0F2481164 1113 51 4.37 18 30 1.77F3210 4579 3213 1366 29.8 85 125 10.91∶1
6D/6V代換系和6DL/6VS易位系經(jīng)國內(nèi)外鑒定，對美國、德國、中國等80多個白粉病菌系均表現(xiàn)免疫和高抗，是已知抗性基因中抗性最強(qiáng)、抗譜最廣的。6AL/6VS易位系尚未見到有如此多菌系的鑒定報告。
權(quán)利要求
1.一種向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法，包括以下步驟1)硬粒小麥與簇毛麥遠(yuǎn)緣雜交，幼胚或幼穗離體培養(yǎng)，再生得到硬粒小麥-簇毛麥異源雙二倍體；2)硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體與普通小麥回交轉(zhuǎn)育后，對雜交種子再生植株的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，獲得加倍單倍體植株；自交和定向選擇，獲得具有簇毛麥抗白粉病基因的小麥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述遠(yuǎn)緣雜交過程中，對硬粒小麥-簇毛麥雜交種幼胚或幼穗離體培養(yǎng)獲得的具有綠芽點(diǎn)愈傷組織進(jìn)行秋水仙素處理，實(shí)現(xiàn)染色體加倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述秋水仙素濃度為100-200ppm，處理時間為6-10天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述秋水仙素濃度為150ppm，處理時間為8天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體與普通小麥回交轉(zhuǎn)育后，對雜交種子再生植株的花藥進(jìn)行培養(yǎng)之前，對雜交種子的幼胚進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)進(jìn)行2-3次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法，本發(fā)明向小麥中導(dǎo)入異屬抗白粉病基因的方法，包括以下步驟1)硬粒小麥與簇毛麥遠(yuǎn)緣雜交，幼胚或幼穗離體培養(yǎng)，再生得到硬粒小麥一簇毛麥異源雙二倍體；2)硬粒小麥一簇毛麥雙二倍體與普通小麥回交轉(zhuǎn)育后，對雜交種子再生植株的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，獲得加倍單倍體植株；自交和定向選擇，獲得具有簇毛麥抗白粉病基因的小麥。本發(fā)明方法對促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論研究和實(shí)際應(yīng)用價值。
文檔編號A01H1/02GK1589611SQ0315384
公開日2005年3月9日 申請日期2003年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者陳孝, 徐惠君, 李輝, 杜麗璞, 辛志勇, 尚立明, 孔繁晶, 黃惠宇, 韓彬, 林志珊, 馬有志, 葉興國, 張增艷, 張文祥, 李連城 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所