專利名稱：雙歧桿菌和含有它們的制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及長雙歧桿菌的非致病性微生物在輔助胃腸保健且特別是在預(yù)防和/或治療胃腸道不適、尤其是腸不適中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長時間以來已得知被用作對食品防腐或制備如酸牛奶這樣的乳品或其它乳制品的發(fā)酵劑的許多類型細菌；這些細菌一般稱作“乳酸菌”且包括許多屬，如乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬和片球菌屬。
近來這些細菌已經(jīng)成為更為關(guān)注的對象，這是因為當吞咽下這些細菌時，它們表現(xiàn)出對人和動物的顯著特性；特別是有時聯(lián)合施用的乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的菌株已經(jīng)通過防止其它有害微生物定居而在定居腸粘膜和輔助人體保健方面表現(xiàn)出功效，正如美國專利US5,494,664和US 6,241,983以及國際專利申請WO 0033854和WO0110453中所證實的。
這些微生物也稱作“益生菌”且對其有益作用的基本需求在于它們可以以一定的數(shù)量和一定的活力到達粘膜，使得它們能夠持續(xù)并定居在腸道，因此，它們必須適當耐受胃中的低pH。
在如便秘或腹瀉和使用抗生素治療后這樣的腸不適的情況下，即特別是在促使腸菌群缺乏的所有情況下且在攝取的食物中缺乏纖維、環(huán)境條件或應(yīng)力降低腸菌群活力時的所有情況下推薦指定的益生菌產(chǎn)品。
為了恢復(fù)人體菌群中天然存在的微生物的適宜水平，使用完全定性的并提取自健康人體的菌群的細菌菌株是這類施用的目標。
外源性微生物在腸中的定居活性取決于其濃度、其定居能力和它們在腸中找到的環(huán)境條件，因為給予更大量、高定居能力和適宜的環(huán)境條件有助于它們通過定居在腸中的大部分區(qū)域而起到防護和治療作用，卻不會因為它們是天然來源的產(chǎn)物而產(chǎn)生副作用。特別必須強調(diào)的是可能存在的例如菊糖或低聚果糖類這樣的營養(yǎng)纖維主要輔助所述的定居，因為這些化合物是益生菌的底物且由此它們增加定居的機會。所述的寡糖類因這種與益生菌的協(xié)同作用也稱作“益生素”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主題是命名為W11和W11a的寄存在比利時微生物協(xié)作保藏中心(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)-BCCM LMG-保藏中心的長雙歧桿菌的兩個菌株的生物純培養(yǎng)物，其中BCCM LMG-保藏中心已經(jīng)給上述兩個菌株登記了保藏號LMG P-21586和LMG P-21587；上述生物純培養(yǎng)物作為藥物或營養(yǎng)型制品中的益生菌的應(yīng)用；和含有它們的用于輔助胃腸保健并預(yù)防和治療腸道疾病的藥物或營養(yǎng)型制品。
已經(jīng)從健康人的腸菌群中分離出了長雙歧桿菌的兩個菌株W11和W11a且在同期分離的許多其它長雙歧桿菌菌株中篩選出了它們，因為它們已經(jīng)表現(xiàn)出在腸菌群上的定居能力和粘著腸細胞的能力，這兩個特征使得它們成為能夠輔助胃腸道良好健康狀態(tài)和由不同起因的胃腸炎中恢復(fù)其被改變的功能的良好益生菌。
首先在實驗室中且隨后在工業(yè)化制備中生產(chǎn)了本發(fā)明主題的細菌培養(yǎng)物且它們由已經(jīng)在37℃下和適宜的培養(yǎng)基中生長了20小時的純菌株制成，所述的適宜培養(yǎng)基稱作TPY，它含有作為主要成分的胰蛋白酶酪蛋白胨、大豆胨、酵母抽提物和葡萄糖并含有鉀、鈣、鎂和鋅的鹽。
已經(jīng)由這些初級培養(yǎng)物制備了隨后的傳代培養(yǎng)物，目的在于增加純菌株的數(shù)量，直到獲得被用作用于兩種益生菌長雙歧桿菌W11和W11a的細菌培養(yǎng)物的工業(yè)化生產(chǎn)的接種物的菌母為止。
所述細菌培養(yǎng)物的工業(yè)化生產(chǎn)方法包括下列步驟
1.在控制在5.5-7.5的pH下發(fā)酵；2.通過離心從培養(yǎng)物肉湯中分離細菌生物質(zhì)；3.在添加選自蛋白、碳水化合物和無機鹽的適宜低溫保護劑后凍干所述的細菌生物質(zhì)以便在冷凍和凍干步驟中保護細胞的活力，可能還需要在增加菌株耐受酶降解和酸性pH條件的能力范圍內(nèi)添加蛋白沉淀劑；4.磨碎凍干的培養(yǎng)物并使之成粒。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的細菌計數(shù)的微生物學方法進行的分析，例如在Ison A.P.和Matthew G.B.的應(yīng)用微生物生理學(Applied Microbial Physiology)中的“一種實施手段”(apractical approach)，Rhodes P.M.和Stanbury P.F.Editors-IRL Press Oxford，103-130，1997中所報道的，如此制備的產(chǎn)物含有約1×1010-約1×1012個長雙歧桿菌W11或W11a的活細胞的平均值/克終產(chǎn)物。
已經(jīng)在帶有陽性結(jié)果的小鼠腸中的定居試驗中檢驗了所述的細菌培養(yǎng)物，此時，長雙歧桿菌LMG P-21586或LMG P-21587的細菌加載量的計數(shù)已經(jīng)顯示出高于1×106個活細胞/克小鼠糞便的值。
確切地說作為主要目的，本發(fā)明的另一個目的是獲自長雙歧桿菌W11或W11a菌株的生物純培養(yǎng)物作為輔助胃腸保健并預(yù)防和治療腸疾病的藥物或營養(yǎng)型制品中的益生菌的用途，其中所述的腸疾病如腹瀉、不同起因的胃腸炎、便秘、腸過敏、憩室病和腸的慢性炎癥性疾病。
可以通過向含有長雙歧桿菌W11或W11a的細菌培養(yǎng)物的藥物或營養(yǎng)型制品中添加難消化的寡糖類形式的營養(yǎng)纖維來提高含有長雙歧桿菌W11或W11a的細菌培養(yǎng)物在輔助腸道保健中的功效，所述的難消化的寡糖類例如有低聚果糖類或菊糖，它們在腸道上部既不會被吸收也不會被水解并可強化所述的活性且刺激長雙歧桿菌LMG P-21586和LMG P-21587菌株的代謝至對致病菌不利。在實施本發(fā)明過程中優(yōu)選的寡糖類是由存在于葡萄糖分子(G)中的基本單元構(gòu)成的具有2-20的聚合度、即一定數(shù)量的單糖單位的低聚果糖的混合物，其中所述的葡萄糖分子(G)與通式GFn的果糖分子(F)鏈結(jié)合，其中，n≤4。用作與本發(fā)明主題的兩種類型益生菌混合的益生素的低聚果糖類具有2-10、優(yōu)選3-6的聚合度。
本發(fā)明主題的制品可以含有維生素、優(yōu)選E、B1、B2、B6和B12族維生素以及各種賦形劑，如增甜劑，例如天冬甜素、甘露糖醇或山梨醇；調(diào)味劑；和著色物質(zhì)；這些制品具有通過恢復(fù)在腸道疾病過程中顯著減少的維生素成分而進一步提高健康的能力。
本發(fā)明的目的是含有稱作W11和W11a且LMG P-21586或LMGP-21587保藏號登記的長雙歧桿菌的細菌培養(yǎng)物的藥物制劑和營養(yǎng)產(chǎn)品，它們可選地含有益生素，優(yōu)選低聚果糖類或菊糖和/或維生素、優(yōu)選E、B1、B2、B6和B12族維生素。
所述的藥物制劑優(yōu)選由可通過口服途徑給藥的組合物制成，其劑型有膠囊、片劑、袋裝制劑、錠劑、液體混懸劑、干口服補劑、液體口服補劑、瓶裝制劑等，它們含有穩(wěn)定期結(jié)束時1×107-1×1011個長雙歧桿菌W11或W11a的活細胞的細菌加載物。
所述的藥物制劑還可以含有益生素，如低聚果糖或菊糖，優(yōu)選每個劑量含有0.5-5g的低聚果糖、更優(yōu)選1-3g；和/或維生素，優(yōu)選E、B1、B2、B6和B12族維生素。
還可以在許多類型的營養(yǎng)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中混入1×107-1×1011個活細胞量的長雙歧桿菌益生菌，所述的營養(yǎng)產(chǎn)品如乳品；酸奶；新鮮干酪，如乳清干酪、斯特拉希諾干酪和莫澤雷勒干酪(意大利干酪類)；冰淇淋；由發(fā)酵乳品制成的產(chǎn)品；由發(fā)酵谷物制成的產(chǎn)品；奶粉；兒童產(chǎn)品和家養(yǎng)動物產(chǎn)品。
對細菌計數(shù)檢驗的測試已經(jīng)證實作為本發(fā)明目的的長雙歧桿菌的兩個菌株是耐受性的，因此它們在藥物或營養(yǎng)制品生產(chǎn)的工藝過程中或在其儲存的整個正常期限中不會發(fā)生大量死亡。實際上，已經(jīng)將這些細菌制品提交進行穩(wěn)定性試驗，該試驗顯示兩個細菌菌株在室溫下具有極佳的耐受性，使得它們在制成后的銷售期不少于2年。
下文報導的實施例用于進一步解釋本發(fā)明但不應(yīng)看作是對本發(fā)明的限定。
實施例1長雙歧桿菌W11菌株的細菌培養(yǎng)物的生產(chǎn)方法用作工業(yè)化發(fā)酵中的接種物的長雙歧桿菌W11菌株的“初級培養(yǎng)物”確實與寄存在比利時微生物協(xié)作保藏中心(BelgianCoordinated Collections of Microorganisms)-BCCM LMG-保藏中心-Laboratorium voor Microbiologie，Universiteit Gent的菌株相同，BCCM LMG-保藏中心在接受送達的該菌株時已經(jīng)確認了該菌株的純度和活力并已經(jīng)登記了其保藏號為LMG P-21586。
為了得到這種“初級培養(yǎng)物”，將所述的菌株培養(yǎng)在稱作TPY的含有下列組成的培養(yǎng)基中，以1升為準酪蛋白的胰蛋白酶胨 10g大豆胨 5g酵母抽提物 5g葡萄糖 10g無水K2HPO42gMgCl2·6H2O 0.5gZnSO4·7H2O 0.25gCaCl2·2H2O 0.15gTween 80 1ml鹽酸半胱氨酸 0.5g雙蒸水 適量至1000ml在37℃下使培養(yǎng)進行20小時且然后將該培養(yǎng)物分裝入管形瓶，向其中添加選自蛋白、碳水化合物和無機鹽的適宜低溫防護劑，然后將管形瓶冷凍并儲存在-196℃下的液氮中。
由接種物百分率為3％的該“初級培養(yǎng)物”作為原料制備3種傳代培養(yǎng)物，目的是為了增加所述細菌菌株的細胞數(shù)量。
將稱作“菌母”的約10升最后傳代培養(yǎng)物用于給具有約300升容量的“即刻培養(yǎng)物”反應(yīng)器接種。
隨后的長雙歧桿菌W11的生物純培養(yǎng)物的工業(yè)化生產(chǎn)過程包括下列步驟1.在控制在6.5-7.0的pH下發(fā)酵；2.從培養(yǎng)物肉湯中分離細菌生物質(zhì)；3.通過添加選自蛋白、碳水化合物和無機鹽的適宜低溫防護劑溶液保護所述的細菌生物質(zhì)以便在以后的冷凍和凍干步驟中保護細胞的活力，且可能還需要包括添加蛋白沉淀劑，目的在于使所述菌株耐受酶降解和酸性pH條件；4.凍干；5.磨碎凍干的培養(yǎng)物并使之成粒；6.摻合凍干的培養(yǎng)物；7.包裝。
所得的產(chǎn)物含有約8-10×1010個活細胞/克。
實施例2長雙歧桿菌W11a菌株的細菌培養(yǎng)物的生產(chǎn)方法按照實施例1中所述的方法、通過以確實對應(yīng)于寄存在比利時微生物協(xié)作保藏中心(Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms)-BCCM LMG-保藏中心-Laboratorium voorMicrobiologie，Universiteit Gent的長雙歧桿菌菌株的“初級培養(yǎng)物”作為原料制備了長雙歧桿菌W11a的生物純的細菌培養(yǎng)物，BCCM LMG-保藏中心在接受送達的該菌株時已經(jīng)確認了該菌株的純度和活力并已經(jīng)登記了其保藏號為LMG P-21587。
實施例3體內(nèi)定居試驗對各含2只小鼠的4組小鼠進行試驗，每只小鼠接受2次劑量的含有濃度等于1.6×109CFU/60μl的長雙歧桿菌LMG P-21586的葡萄糖溶液，第一次劑量后16小時給予第二次劑量。
通過計算存在于糞便中的長雙歧桿菌的量檢驗了所述菌株在這些小鼠腸中定居的能力在開始給藥前進行第一次取樣，而在第二次給藥后的2、4、8、24、48小時分別進行隨后的取樣。在糞便中發(fā)現(xiàn)的長雙歧桿菌菌株的量在106CFU/g左右，由此表明定居發(fā)生。特別發(fā)現(xiàn)相對于在糞便中發(fā)現(xiàn)的雙歧桿菌的所有菌株而言長雙歧桿菌是得到的菌群中的主要成分。
實施例4裝有低聚果糖類和維生素的袋裝制品將袋裝制品作為實施例報導，它們各自重3g、可以在水或奶中溶解且含有相當于約2×1010個長雙歧桿菌W11的活細胞、2500mg的低聚果糖類和B1、B2、B6和B12族維生素的250mg生物純的細菌培養(yǎng)物。
將商購稱作Actilight950P的由通過與n≤4并具有2-10的聚合度的通式GFn的一個葡萄糖分子連接的果糖分子鏈形成的低聚果糖類混合物構(gòu)成的產(chǎn)品特別被用作低聚果糖。
該袋裝組分的具體成分-含量如下

制備方法第一步將維生素與等份的Actilight950P進行混合，隨后在凈孔徑為0.5mm的篩上過篩。將這第一步的混合物加入到第二個等份的Actilight950P中并進行第二個混合步驟。最后加入長雙歧桿菌W11的細菌培養(yǎng)物、剩余等份的Actilight950P和制品中的其它成分，同時進行進一步的混合，隨后在0.8mm的篩上進行最終的過篩。
然后將產(chǎn)品分裝入重3g的鋁袋中。該鋁袋的制備工藝過程不會對所述菌株的活力產(chǎn)生任何損害。
穩(wěn)定性試驗通過在0時且分別在22℃下儲存1、2和3個月后測定細菌加載量對所述袋進行穩(wěn)定性試驗，由此確定半衰期。在1、2和3個月后的數(shù)據(jù)分析表明在這些期限中死亡率極低，從而使2年后就每個劑量而言上述袋裝制品中活細胞的數(shù)量不低于5×109個細胞。所述的結(jié)果表明該制品足以達到本發(fā)明需要達到的水平。
實施例5裝有維生素的軟膠囊制劑已經(jīng)通過以下步驟制備了具有下列成分-含量的軟膠囊

制備長雙歧桿菌W11的細菌培養(yǎng)物、維生素、大豆卵磷脂和脂肪酸的單和二甘油酯溶于大豆油的均勻混懸液；將所述的混懸液分裝入由營養(yǎng)明膠、甘油、二氧化鈦和黃色氧化鐵制成的7.5號大小的橢圓形膠囊中且隨后在約21℃的溫度和約20％的濕度下的氣流中干燥。
權(quán)利要求
1.由長雙歧桿菌的菌株LMG P-21586制成的生物純培養(yǎng)物。
2.由長雙歧桿菌的LMG P-21587菌株制成的生物純培養(yǎng)物。
3.權(quán)利要求1和2中之一的生物純培養(yǎng)物作為用于輔助胃腸保健并預(yù)防和治療腸道疾病的藥物或營養(yǎng)型制品中的益生菌的用途。
4.含有來源于由長雙歧桿菌菌株LMG P-21586制成的生物純培養(yǎng)物的1×107-1×1011個活細胞的細菌加載物的藥物或營養(yǎng)型制品。
5.含有來源于由長雙歧桿菌菌株LMG P-21587制成的生物純培養(yǎng)物的1×107-1×1011個活細胞的細菌加載物的藥物或營養(yǎng)型制品。
6.權(quán)利要求4和5中之一的制品，其特征在于它們含有寡糖形式的益生素。
7.權(quán)利要求6的制品，其特征在于所述的寡糖是具有2-10聚合度的低聚果糖或菊糖。
8.權(quán)利要求4-7中之一的制品，其特征在于它們含有維生素。
9.權(quán)利要求8的制品，其特征在于所述的維生素是維生素E、B1、B2、B6和B12。
10.權(quán)利要求4-9中之一的制品，其特征在于它們選自膠囊、片劑、袋裝制劑、錠劑、液體混懸劑、干口服補劑、液體口服補劑、瓶裝制劑、乳品、酸牛奶、新鮮干酪、冰淇淋、由發(fā)酵谷物制成的產(chǎn)品、奶粉、兒童產(chǎn)品和家養(yǎng)動物產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及命名為W11和W11a并寄存在比利時微生物協(xié)作保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)(BCCM)的長雙歧桿菌的兩個菌株的生物純培養(yǎng)物，其中BCCM已經(jīng)給上述兩個菌株登記了保藏號LMG P－21586和LMG P－21587；本發(fā)明涉及上述生物純培養(yǎng)物作為藥物或營養(yǎng)型制品中的益生菌的用途并涉及含有它們的用于輔助胃腸保健并預(yù)防和治療腸道疾病的藥物或營養(yǎng)型制品。
文檔編號A23K1/18GK1480528SQ0317840
公開日2004年3月10日 申請日期2003年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者G·C·威斯科米, G C 威斯科米, L·G·羅蒂尼, 羅蒂尼, ＠, L·莫埃里, P·費拉里, 潘塔里奧, M·R·潘塔里奧 申請人:阿爾法·瓦瑟曼公司, 阿爾法 瓦瑟曼公司