專利名稱：選擇性產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的方法
背景技術(shù)：
農(nóng)作物植物中的雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)產(chǎn)量提高有顯著的影響。一般地，雜種與非雜種品種比較顯示了增加的產(chǎn)量。雜種通常給予生長因子諸如水和肥料更多的回報(bào)單元(return unit)。雜種常常提供優(yōu)良的脅迫耐受性、產(chǎn)量和成熟的一致性，也提供了聯(lián)合以其它方式難以聯(lián)合的特性或性狀的簡單育種機(jī)會(huì)。通常，植物中的雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)于保證商業(yè)性開發(fā)足夠重要。商用雜種廣泛地用于許多農(nóng)作物包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和蕓苔中。然而，主要是由于缺少經(jīng)濟(jì)性雜種種子的生產(chǎn)方法，所以主要還是以近親交配培育小麥、大麥和水稻。
傳統(tǒng)地，雜種種子生產(chǎn)涉及以一定行距種植分開區(qū)塊的雌性和雄性親本系，僅收獲雌性親本的種子。為了確保該種子是雜種，必需通過使得該株系雄性不育來最小化雌性親本系的自花授粉。使得雌性親本株系雄性不育的方法包括機(jī)械、化學(xué)和遺傳方法。在雌雄同株植物，諸如玉米中，通過去雄雄性花序可以機(jī)械地、容易地獲得雄性不育。然而，大多數(shù)農(nóng)作物是雌雄異株，并且在相同的花朵中具有雄性和雌性器官，這使得這種物理去雄不實(shí)際。因此有時(shí)利用遺傳方法。
出現(xiàn)的遺傳雄性不育性狀正常地受核基因控制，核基因中通常相對(duì)于相應(yīng)的能育相關(guān)的等位基因，不育表型相關(guān)的等位基因隱性地表達(dá)。遺傳雄性不育出現(xiàn)時(shí)正常地與單個(gè)隱性基因相關(guān)，而為了表達(dá)雄性不育，該單個(gè)隱性基因必需是純合的。為了實(shí)際利用這種遺傳雄性不育性狀，育種者通常開發(fā)表型一致的雌性株系，該雌性株系分離為雄性不育和雄性能育植物。一旦鑒定雄性能育植物，就需要去劣，這是費(fèi)力的。因?yàn)樾坌阅苡参锸欠N群維持所必需的，所以不能從種群中排除它們，所以維持親本株系總是存在問題。除了依賴于天然雄性不育等位基因的存在，也可以利用分子生物學(xué)的方法?？梢曰蚬こ谈脑熘参?，使得植物表達(dá)例如反義或核酶基因，該反義或核酶基因減少或消除了能生育的花粉形成必需的關(guān)鍵基因的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)基因的植物株系是雄性不育的，并且通過利用來源于雄性可育植物的花粉雜交，用于雜種種子的生產(chǎn)。這種株系的主要問題是通過它們與等基因可育株系雜交，它們?cè)陔S后世代中只能維持雜合狀態(tài)。這在產(chǎn)量是至關(guān)重要的雜種種子生產(chǎn)中可能是個(gè)問題。盡管，例如，通過連接除草劑抗性和雄性不育，可以選擇性去劣雄性可育植物，但是仍舊必需在最初以超高的密度種植植物。
胞質(zhì)雄性不育用于商業(yè)雜種生產(chǎn)需要穩(wěn)定的雄性不育胞質(zhì)和花粉來源。雄性不育的胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)需要3種類型用于雜種生產(chǎn)的株系存在，A株系(胞質(zhì)雄性不育)，B株系(雄性可育維持系)和R株系(具有恢復(fù)系基因的雄性可育)。該系統(tǒng)產(chǎn)生的三方面雜交涉及4種株系的維持和產(chǎn)生，一種近交的A和B株系，其它兩種株系的雄性可育近親交配。依靠單一來源的雄性不育胞質(zhì)可能最小化育種靈活性，并且產(chǎn)生對(duì)特定疾病具有大規(guī)模敏感性的后代。
也可以通過抑制能生育的花粉形成的化學(xué)試劑的應(yīng)用生產(chǎn)雜種種子。這些化學(xué)試劑稱為殺配子劑，用于賦予短暫的雄性不育。但是殺配子劑的費(fèi)用、注冊(cè)性和可靠性限制了它們的應(yīng)用。
傳統(tǒng)雜種種子生產(chǎn)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是需要分開種植成排或成區(qū)塊的雄性和雌性親本株系。這里，低效率的授粉是農(nóng)作物物種，諸如小麥中特別棘手的問題，這種物種釋放不能隨風(fēng)漂移很遠(yuǎn)的小量的花粉。在這種農(nóng)作物中，多達(dá)三分之二的雜種生產(chǎn)田地需要專門用于雄性花粉供體植物，因此雜種種子生產(chǎn)變得不經(jīng)濟(jì)。
為了在小麥和其它農(nóng)作物中獲得更經(jīng)濟(jì)的種子生產(chǎn)，必需移動(dòng)雄性和雌性植物使得它們更靠近以進(jìn)行更有效的花粉轉(zhuǎn)移；通過在同一排中相互間隔幾厘米間作雄性和雌性植物，以進(jìn)行最有效的花粉轉(zhuǎn)移。在這種系統(tǒng)中，僅從(雄性不育)雌性親本收獲種子不實(shí)際。通過在種植混合中利用盡可能低百分?jǐn)?shù)的這種雄性親本植物和/或通過利用雌性不育的雄性植物可以最小化來源于雄性親本的非雜種種子的污染。
盡管已經(jīng)描述了構(gòu)建顯性雌性不育株系的方法(EP 412,006 A1(1990)；Goldman等，(1994)EMBO.J.，13，2976-2984)，但是，如同雄性不育株系一樣，該株系必需保持為雜合子。
因此，需要雜種種子生產(chǎn)的簡單、經(jīng)濟(jì)的方法。特別地，為了有效地生產(chǎn)雜種種子，需要提供可以作為純合株系容易維持并且可用于有效的雜種種子生產(chǎn)的雄性不育雌性親本株系和雌性不育雄性親本株系?，F(xiàn)有技術(shù)中所述用于達(dá)到該目的的方法包括這樣的方法其中從雄性和雌性親本株系生產(chǎn)雜種種子，該雄性和雌性親本株系的至少一個(gè)親本株系包含優(yōu)先地在花組織中表達(dá)的異源嵌合基因，其根據(jù)非毒害植物的物質(zhì)的外源施用，有條件地使得該株系不育，該非毒害植物的物質(zhì)可以被異源嵌合基因編碼并且優(yōu)先地在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的酶特異地和局部地轉(zhuǎn)化為毒植物素。非毒害植物的物質(zhì)可以是除草劑前體。具有這種有條件不育親本株系的優(yōu)點(diǎn)是它使得它們能夠做為關(guān)于不育性性狀的純合子維持。只有外源施用非毒害植物的物質(zhì)時(shí)，才破壞了可育性。在一個(gè)這種條件性雄性不育性系統(tǒng)的例子中，編碼脫乙?；傅幕騼?yōu)先地在雄性花組織的花藥氈絨層細(xì)胞中表達(dá)，在該細(xì)胞中，它轉(zhuǎn)化外源施用的除草劑前體N-乙酰L膦絲菌素為毒植物素L膦絲菌素，因此，阻止能生育的花粉形成。在另一個(gè)相似例子中(i)細(xì)菌細(xì)胞色素P450的氈絨層優(yōu)先表達(dá)催化除草劑前體R7402轉(zhuǎn)化為阻止能生育的花粉產(chǎn)生的磺脲毒植物素和(ii)膦酸單酯水解酶的氈絨層優(yōu)先表達(dá)催化甘油草甘磷除草劑前體轉(zhuǎn)化為毒植物素草甘磷，其也阻止能生育的花粉的產(chǎn)生。WO 98/03838描述了有條件雌性不育性系統(tǒng)的例子，其中能將除草劑前體轉(zhuǎn)化為毒植物素的酶優(yōu)先在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)。
盡管存在生產(chǎn)有條件不育的雄性和雌性親本系的這些方法，但是在農(nóng)作物諸如小麥中，雜種種子的生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有常規(guī)化。本發(fā)明涉及，尤其是現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于有條件雄性不育的雌性親本系和有條件雌性不育的雄性親本系產(chǎn)生的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及作物雜種種子生產(chǎn)方法的改進(jìn)。特別地，本發(fā)明涉及從雄性和雌性親本系生產(chǎn)雜種種子的方法，其中該雄性和雌性親本系的至少一個(gè)親本系是有條件雌性或雄性不育，該有條件雌性或雄性不育取決于對(duì)作物是非毒害植物性的物質(zhì)的外源施用，該物質(zhì)包括除草劑前體。本發(fā)明還涉及在一定時(shí)期和以足夠的量施用所述非毒害植物的物質(zhì)的方法，其中該時(shí)期和足夠的量能夠最小化或阻止有條件不育親本系中的自花受精。本發(fā)明也涉及也涉及產(chǎn)生有條件雄性或雌性不育植物的方法，該方法包括i)用單獨(dú)或一起編碼一種或多種酶的一種或多種嵌合基因轉(zhuǎn)化植物材料，所述酶具有與優(yōu)選地為除草劑前體形式的非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)以產(chǎn)生毒害植物物質(zhì)的能力。酶在一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子可操作控制下表達(dá)，其中在有條件雄性不育植物的情況下，所述啟動(dòng)子引起酶優(yōu)先在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)，或者在有條件雌性不育植物的情況下，所述啟動(dòng)子引起所述酶優(yōu)先在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)。植物材料再生為有條件雄性或雌性不育的形態(tài)學(xué)正常的可育植物。本發(fā)明也包括有條件雄性不育植物聯(lián)合有條件雌性不育植物以更有效生產(chǎn)雜種種子的用途，一些除草劑前體做為非毒害植物的物質(zhì)的用途，和嵌合基因更有效地生產(chǎn)雜種種子的用途，用于本發(fā)明的嵌合基因和酶。本發(fā)明也提供了有條件雄性不育，有條件雌性不育植物，這些植物的種子和通過該方法生產(chǎn)的雜種種子。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)雜種種子的方法應(yīng)用的農(nóng)作物植物是玉米、稻、高梁、小麥、黍、燕麥、蕓苔(canola)和大麥。
根據(jù)本發(fā)明，提供了生產(chǎn)雄性或雌性不育植物的方法，該方法包括步驟用編碼至少一種酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料，該酶與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)以產(chǎn)生毒害植物的物質(zhì)，并且將由此轉(zhuǎn)化的材料再生為植物，其中不超過雄或雌配子形成和/或成熟的時(shí)間，給植物施用所述非毒害植物的物質(zhì)，這樣非毒害植物的物質(zhì)提供了毒害植物物質(zhì)的產(chǎn)生，該毒害植物物質(zhì)選擇性阻止所述配子形成，或者以其它方式使得所述配子沒有功能，其中該酶優(yōu)先在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)，其特征在于(i)非毒害植物的物質(zhì)選自對(duì)非綠色組織是直接毒害植物性的非膦酸酯除草劑(non-phophonate herbicides)的酯衍生物，D-α氨基酸，非蛋白質(zhì)D-α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸類的S-對(duì)映體和芳氧基苯氧丙酸類的酯衍生物的S-對(duì)映體，和(ii)酶選自羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脫氫酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶、α-甲基?；?CoA消旋酶、硫酯酶和?；?CoA合成酶。
因?yàn)槠谕哪康氖亲畲蠡s種種子產(chǎn)量和因此最小化任何農(nóng)作物的損害，所以在優(yōu)選的實(shí)施方式中，非毒害植物的物質(zhì)是除草劑前體，該除草劑前體選自對(duì)農(nóng)作物相對(duì)非毒害植物的化合物。為了能夠具有抗花組織的作用，也期望除草劑前體是在“非綠色”組織中有效的毒植物素的前體。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，除草劑前體選自是毒植物素前體的那些除草劑前體，該毒植物素對(duì)非綠色組織具有直接植物毒性，而不是在光合作用或在光合作用色素產(chǎn)生中具有主要作用位點(diǎn)的那些。最小化雜種種子生產(chǎn)的花費(fèi)也是期望的目的。因此，在優(yōu)先的實(shí)施方式中，除草劑前體選自化學(xué)物質(zhì)，該化學(xué)物質(zhì)用在農(nóng)作物中已經(jīng)得到或正在受到適合的管理機(jī)關(guān)批準(zhǔn)。
術(shù)語定義這里所用“基因”指包含幾個(gè)可操作地連接的DNA片段的任何DNA序列，所述DNA片段是諸如啟動(dòng)子和5’調(diào)節(jié)區(qū)，編碼區(qū)和包含聚腺苷酸化位點(diǎn)的非翻譯3’區(qū)。
“嵌合”當(dāng)指基因或DNA序列時(shí)，用于指在自然界中，編碼序列不與基因中DNA的啟動(dòng)子或至少一個(gè)其它調(diào)節(jié)區(qū)相關(guān)的事實(shí)。
這里所用“嵌合基因”指一種基因，其中在自然界中，其編碼序列不與基因中DNA的啟動(dòng)子或至少一個(gè)其它調(diào)節(jié)區(qū)相關(guān)。
這里所用的“表達(dá)盒子”指可轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)，包含側(cè)翼有一個(gè)或多個(gè)限制或其它位點(diǎn)的嵌合基因，所述位點(diǎn)有利于從一個(gè)DNA基因座精確地切除并且插入另一個(gè)DNA基因座。
本發(fā)明上下文中“非毒害植物的物質(zhì)”是對(duì)本發(fā)明方法應(yīng)用的任何特定農(nóng)作物的植物、細(xì)胞或組織相對(duì)非毒害植物的物質(zhì)。非毒害植物的物質(zhì)不需要在所有植物的所有植物組織中都是非毒害植物的。非毒害植物的物質(zhì)包括除草劑前體物質(zhì)，該除草劑前體是對(duì)植物組織沒有明顯直接毒性作用的物質(zhì)，但是它是活性毒植物素的前體。在敏感植物物種中，通過植物中將這種除草劑前體轉(zhuǎn)化為毒植物素的內(nèi)源酶作用，這種除草劑前體間接地做為除草劑。
在本發(fā)明上下文中“毒植物素”是本發(fā)明方法應(yīng)用的特定農(nóng)作物的植物、植物組織和植物細(xì)胞具有毒性的物質(zhì)。這種毒植物素不需要對(duì)所有植物物種的所有植物組織都是植物毒性的。
“雌性生殖結(jié)構(gòu)”意指雌配子和那些專門用于雌配子產(chǎn)生、成熟和生育力的植物部分。通常地，該定義包括包含心皮或雌蕊群(“雌蕊”)的植物部分。植物的心皮包括但不限于柱頭、花柱、子房和柱頭、花柱、子房包含的細(xì)胞或組織。
“雄性生殖結(jié)構(gòu)”意指雄配子和專門用于雄配子產(chǎn)生、成熟和生育力的植物部分。該定義包括包含，例如小孢子、雄蕊、絨氈層、花藥和花粉的植物部分。
這里所用的“雌性不育植物”是當(dāng)有功能或能生育的花粉給其授粉時(shí)，不能支持能生育的種子形成的植物。這種雌性不育性可以是育種選擇或轉(zhuǎn)基因存在的結(jié)果?！坝袟l件雌性不育植物”指在正常生長條件下是雌性可育，而在特定條件下可以變成雌性不育的植物。在本發(fā)明上下文中，所述條件包括除草劑前體或其它非毒害植物的物質(zhì)的外源施用。在發(fā)明上下文中，這種“雌性不育植物”或“有條件雌性不育植物”保留了雄性可育并且能夠產(chǎn)生能生育的花粉。
這里所用“雄性不育植物”是不能支持能生育的花粉形成的植物。這種雄性不育性可以是育種選擇或轉(zhuǎn)基因存在的結(jié)果?！坝袟l件雄性不育植物”指在正常生長條件下是雄性可育，而在特定條件下可以變成雄性不育的植物。例如所述條件可以包括物理去雄或特定化學(xué)殺配子劑的施用。在本發(fā)明上下文中，所述條件特別地包括除草劑前體或其它非毒害植物的物質(zhì)的外源施用。在本發(fā)明上下文中，這種“雄性不育植物”或“有條件雄性不育植物”保留了雌性可育并且當(dāng)有功能或能生育的花粉給其授粉時(shí)，其能夠產(chǎn)生能生育的種子。
這里所用的“啟動(dòng)子區(qū)”是包含至少功能性啟動(dòng)子和可選地一些或所有它的相關(guān)上游調(diào)節(jié)序列和/或相關(guān)下游序列的DNA區(qū)，該上游調(diào)節(jié)序列包含增強(qiáng)子序列，該下游序列包含啟動(dòng)子內(nèi)源性基因的一些或所有5’非翻譯區(qū)。
這里所用“間作”指在大田中種植植物或種子的方法，該方法確保雄性可育植物對(duì)雄性不育或有條件雄性不育植物的充分異花授粉。通過種植前，以不同的混合比例(80/20；90；10；等)隨機(jī)混合雌性和雄性親本種子，或者通過以特定的田地模式種植，由此使得不同種子交替可以達(dá)到該目的。當(dāng)需要分開收獲不同植物時(shí)，優(yōu)選以交替區(qū)塊或排種植。
這里所用的“羧酸酯酶”僅僅包含正確分類為EC 3.1.n的酶。
在本發(fā)明方法中，所述非毒害植物的物質(zhì)可以與至少一種其它物質(zhì)一起以混合物形式施用，所述物質(zhì)選自氨基酸、安全劑、殺配子劑、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)物、細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)物、肥料、除草劑、殺線蟲劑、增效劑、殺蟲劑、殺真菌劑、激素、植物生長調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞色素P450抑制劑。在特定實(shí)施方式中，所述非毒害植物的物質(zhì)可以與胡椒基丁醚或馬拉硫磷以混合物形式施用。在特定實(shí)施方式中，所述非毒害植物的物質(zhì)可以與相同的毒害植物物質(zhì)以混合物形式施用，其中所述非毒害植物的物質(zhì)是毒害植物物質(zhì)的前體。
本發(fā)明方法中所用的酶可以是羧酸酯酶，非毒害植物的物質(zhì)可以是咪草酸(imazamethabenz)或氟燕靈(flamprop)的酯。在具體涉及小麥的本發(fā)明特別優(yōu)先的形式中，非毒害植物的物質(zhì)是除草劑前體，該除草劑前體選自咪草酸甲酯(imazamethabenz methyl)，氟燕靈甲酯(flamprop methyl)或氟燕靈異丙酯(flamprop isopropyl)。
所述酶可以是D-氨基酸氧化酶，D-氨基酸脫氫酶或D-氨基酸消旋酶，此時(shí)非毒害植物的物質(zhì)可以是D氨基酸，特別地，它可以是膦絲菌素的D對(duì)映體，雙丙氨酰膦的D對(duì)映體，或者選自D-丙氨酸、D絲氨酸、D異亮氨酸、D甲硫氨酸、D亮氨酸或D纈氨酸。這里所用“D-氨基酸氧化酶”意指能氧化D-氨基酸以產(chǎn)生2酮酸的任何酶，并且包括對(duì)天冬氨酸特異的酶，稱為“D-天冬氨酸氧化酶”。
做為替代技術(shù)方案，本發(fā)明方法中所用的酶選自2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和?；?CoA合成酶，那么非毒害植物的物質(zhì)可以是芳氧基苯氧丙酸的S-對(duì)映體和芳氧基苯氧丙酸酯的S-對(duì)映體。
編碼酶的嵌合基因可以選自包含DNA編碼序列的基因，其中該酶具有單獨(dú)或與其它物質(zhì)聯(lián)合與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生毒害植物物質(zhì)的能力，該DNA編碼序列編碼一種或多種下面的酶(1)能催化水解反應(yīng)的羧酸酯酶
(2)能催化水解反應(yīng)的羧酸酯酶和/或
(3)能催化氧化反應(yīng)的D-氨基酸氧化酶
和在一些實(shí)施方式中，特別地是反應(yīng)
(4)能催化氧化反應(yīng)的D-氨基酸脫氫酶
D-氨基酸脫氫酶可以是膜相關(guān)酶，該膜相關(guān)酶通過電子受體將電子與結(jié)合膜的電子傳遞鏈偶聯(lián)，通過該電子傳遞鏈，最終的電子受體可以是，例如NAD+或O2。
(5)能催化相互轉(zhuǎn)化的氨基酸消旋酶D-膦絲菌素<>L-膦絲菌素(6)能催化下面一種或多種反應(yīng)的2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶或α-甲基?；?CoA消旋酶S-吡氟禾草靈-CoA→R-吡氟禾草靈-CoA和/或S-喹禾靈-CoA→R-喹禾靈-CoA和/或S-喔草酯-CoA→R-喔草酯-CoA和/或S-吡氟氯禾靈-CoA→R-吡氟氯禾靈-CoA和/或S-噁唑禾草靈-CoA→R-噁唑禾草靈-CoA和/或S-氯甲草-CoA→R-氯甲草-CoA和/或S-Cyhalofop-CoA→R-Cyhalofop-CoA和/或S-炔草酯-CoA→R-炔草酯-CoA(7)能催化水解反應(yīng)的硫酯酶和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或
(8)能催化下列反應(yīng)的?；?CoA合成酶和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或所述羧酸酯酶可以選自羧酸酯酶B(EC 3.1.1.1)類型酶，特別是來源于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp)，芽孢桿菌屬(Bacillus sp)，豬肝臟，酵母屬(Saccharomyces sp)或集胞藻屬(Synechocystis sp)的羧酸酯酶。優(yōu)選的這種酶可以選自具有Swissprot記錄號(hào)Q01470，P37967，Q29550(來源于60-1703的成熟肽序列)，P40363或SEQID No.2(本申請(qǐng))的蛋白質(zhì)，并且編碼羧酸酯酶的DNA序列可以選自包含在EMBL記錄號(hào)M94965，BS06089，SSCE，Z34288和SEQID No.1(本申請(qǐng))中的DNA序列。適于本發(fā)明使用的其它羧酸酯酶和DNA編碼序列從植物和微生物中選擇，在基本培養(yǎng)基中，所述植物和微生物被發(fā)現(xiàn)對(duì)咪草酸甲酯的生長抑制顯示了和對(duì)咪草酸的生長抑制相似的敏感性。利用適合的DNA探針鑒定這種生物體DNA文庫的候選酯酶基因，并且通過亞克隆分離該候選酯酶基因。做為可替代的方案，通過篩選咪草酸甲酯敏感表型的轉(zhuǎn)化體，從適合的咪草酸甲酯不敏感宿主生物體中的表達(dá)文庫鑒定和篩選編碼適合的酶的基因。同樣地，可根據(jù)大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)，并且在體內(nèi)或體外，通過常規(guī)的方法檢測(cè)期望的氟燕靈酯或咪草酸酯(imazamethabenz ester)的酯酶活性，篩選適合和改進(jìn)的基因和酶，該常規(guī)方法包括通過靶酶諸如乙酰醇酸合酶的抑制，通過HPLC/UV和/或通過衍生化和GC MS檢測(cè)滅草煙或氟燕靈。
D-氨基酸氧化酶(DAMOX)可以選自紅冬孢屬(Rhodosporidiumsp)(紅酵母屬(Rhodotorula sp))，三角酵母屬(Trigonopsis Sp)，豬，鐮刀菌屬(Fusarium Sp)，假絲酵母屬(Candida Sp)，裂殖糖酵母屬(Schizosasaccharomyces Sp)，和輪枝孢屬(Verticillium Sp)，并且可以選自具有對(duì)應(yīng)于Swissprot記錄號(hào)P80324，Q99042，P00371，P24552或SPTREMBL號(hào)Q9HGY3和Q9Y7N4的序列的蛋白質(zhì)。編碼D氨基酸氧化酶的DNA序列可以選自包含在EMBL記錄號(hào)A56901，RGU60066，Z50019，SSDA04，D00809，AB042032，RCDAAOX，A81420和SPCC1450中的序列。D-氨基酸氧化酶是遍在黃素酶。
在非毒害植物的物質(zhì)是D-膦絲菌素或D-雙丙氨酰膦或D-天冬氨酸或D-ghitamate情況下，特別優(yōu)選的D-氨基酸氧化酶獲自纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)突變體或是D-天冬氨酸氧化酶。無論非毒害植物的物質(zhì)是什么，當(dāng)這種突變體與野生型序列比較時(shí)，其都可以在213和238位置含有單或雙氨基酸置換。優(yōu)選地，在位置213，用Arg，Lys，Ser，Cys，Asn或Ala置換野生型甲硫氨酸，而在位置238，用His，Ser，Gys，Asn或Ala置換野生型Tyr。
然而，所述酶可以在前段提到的位置以外還包含其它置換，或者在不同于前段提到的位置包含置換。特別地，可以用選自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp，優(yōu)選是His，Ser或Ala的殘基置換在野生型序列位置58的Phe。此外，或做為可替代方案，可以用選自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp，優(yōu)選是Ser或Ala的殘基置換在野生型序列位置213的Met。此外，或做為可替代的方案，可以用選自His，Ser，Ala，Arg和Asp的殘基置換在野生型序列位置223的Tyr。此外，或做為可替代的方案，可以用選自His，Ser，Lys，Ala，Arg和Asp的殘基置換在野生型序列位置238的Tyr。
該酶特別優(yōu)選的突變體形式包含至少2種上述突變。這種雙突變體的第一實(shí)施方式在位置58有His(而不是野生型序列中的Phe)，在位置213有Ser(而不是Met)。這種雙突變體的第二實(shí)施方式在位置58有Ser(而不是野生型序列中的Phe)，在位置213有Arg(而不是野生型Met)。
在非毒害植物的物質(zhì)是D-氨基酸，但不是D膦絲菌素或D-雙丙氨酰膦的情況下，那么酶是D-氨基酸氧化酶。優(yōu)選地，D-氨基酸不是內(nèi)源植物代謝物，并且選擇韌皮部可移動(dòng)、在植物中代謝穩(wěn)定(優(yōu)選地，在植物中具有約1周以上的t1/2)和是所述氧化酶有效底物的D-氨基酸。酶的D-氨基酸氧化作用伴隨著氧還原為毒害植物的過氧化物和/或超氧陰離子的還原作用。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，氧化酶靶向過氧化物酶體外的亞細(xì)胞位置。例如，通過修飾基因以缺失或修飾3個(gè)C-末端氨基酸(例如，在纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶的情況下是SKL)，和/或通過向N-末端添加葉綠體或線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列可以達(dá)到該目的。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本發(fā)明公開擴(kuò)充的突變和篩選方法，優(yōu)選地可以從真菌來源獲得其它適合的D氨基酸氧化酶。
適于本發(fā)明使用的其它D氨基酸氧化酶(或同樣地，膦絲菌素消旋酶)和DNA編碼序列選自生物體，可選地經(jīng)過誘變的生物體，其中發(fā)現(xiàn)在D-膦絲菌素存在的情況下，在誘導(dǎo)D-氨基酸氧化酶(或膦絲菌素消旋酶)的條件下，N限制性培養(yǎng)基上的生長選擇性地受到抑制。因此，例如，通過用適合的簡并DNA探針(例如，根據(jù)確定的D-氨基酸氧化酶共有序列諸如PROSITE，PS00677)探測(cè)雜交這種生物體的基因文庫，和亞克隆，可以獲得適于本發(fā)明的D-氨基酸氧化酶基因。做為可替代的方案，通過篩選基本培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化為對(duì)D-膦絲菌素的生長抑制具有增加敏感性表型的適合宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌(E.coli)或酵母(適合的宿主株系缺少對(duì)D-膦絲菌素的內(nèi)源氧化酶或脫氫酶活性)中基因表達(dá)文庫，獲得編碼適合的酶的基因。該方法取決于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)克隆通過它們內(nèi)源L轉(zhuǎn)氨酶活性和異源氧化酶的聯(lián)合作用，從D-PPT產(chǎn)生L-PPT的能力。做為可替代的方案，根據(jù)所表達(dá)酶氧化D-膦絲菌素期望能力的體外測(cè)定篩選適合和改進(jìn)的基因。存在許多直接測(cè)定D-氨基酸氧化酶活性的方法，諸如基于過氧化物(Enzyme Microb.Technol.，(2000)，27(8)，605-611)的測(cè)定，利用氧電極的氧消耗的測(cè)定法或基于氨的直接測(cè)定法。
在本發(fā)明實(shí)施方式中，將優(yōu)選真菌來源的DAMOX基因克隆到啟動(dòng)子(例如，GAL啟動(dòng)子)可操作控制的穿梭載體中，該啟動(dòng)子能夠在將要進(jìn)行篩選的宿主生物體(優(yōu)選酵母)中表達(dá)。然后，例如通過Mn2+-有毒PCR，在DNA修復(fù)/編輯過程缺陷的株系諸如大腸桿菌(E.coli)株系XL1 red中進(jìn)行質(zhì)粒DNA復(fù)制，或者通過在利用，例如X射線、UV光線、化學(xué)誘變劑添加經(jīng)過誘變的宿主株系中進(jìn)行質(zhì)粒DNA復(fù)制對(duì)該基因進(jìn)行誘變，并且將其轉(zhuǎn)化到宿主生物體(優(yōu)選酵母)中。通過例如以下方式篩選具有增強(qiáng)的氧化D-PPT能力的期望特性的編碼DAMOX的期望DNA(這在基于穿梭載體中存在的選擇性標(biāo)記的可選的，最初的轉(zhuǎn)化體篩選步驟之后進(jìn)行，所述篩選步驟允許，例如通過在潮霉素存在情況下的生長或原養(yǎng)型的恢復(fù)進(jìn)行篩選)(a)篩選有能力利用作為唯一氮源的氨基酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，該氨基酸與D-膦絲菌素化學(xué)上相似。例如，篩選在作為唯一氮源的D-PPT(和其酯)的類似物上能生長的轉(zhuǎn)化酵母菌落，在D-PPT(和其酯)類似物中，用羧酸(即，D-谷氨酸)、磺酸、膦酸、砜或亞砜部分(或它們的酯)置換次膦酸(phosphinic acid)部分。例如 (b)篩選能利用D-PPT本身做為唯一N源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。為了進(jìn)行該篩選，還必需使用能使L-膦絲菌素對(duì)谷氨酰胺合成酶抑制作用無效的基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。例如穿梭載體也可以包含編碼酶諸如失活L-PPT的PAT的基因。
可以重復(fù)突變和篩選的循環(huán)?？梢赃M(jìn)行克隆、表達(dá)、部分純化和動(dòng)力學(xué)表征D-氨基酸氧化酶以鑒定具有最適特性(例如，酶穩(wěn)定性、D-PPT氧化作用的高kcat/Km值、任何內(nèi)源植物底物的最小氧化作用、最適宜pH等)的基因和DAMOXs。
在非毒害植物的物質(zhì)是D-膦絲菌素(PPT)的情況下，可以從D和L-PPT混合物獲得它?？梢韵虼竽c桿菌(E.coli)細(xì)胞(可選地，最小化N-乙酰PPT脫乙?；富钚员尘八降腶rg E突變體)的(優(yōu)選基本)培養(yǎng)基添加DL PPT，所述大腸桿菌被轉(zhuǎn)化并且以高水平誘導(dǎo)表達(dá)PAT基因(編碼從乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙?；絃-PPT的酶)。在(例如，通過利用31-P NMR監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化判斷)使得L成分基本所有都是N-乙?；倪m合時(shí)間后，利用連續(xù)步驟，例如，在高和低pH的溶劑萃取，陰離子和陽離子交換層析，用手性陽離子諸如chinchocine的選擇性結(jié)晶作用，或本領(lǐng)域已知的其它方法諸如具有兩個(gè)非混溶含水相做為相系統(tǒng)的液體/液體萃取(參見，USP 5,153,355中的方法)，從無細(xì)胞培養(yǎng)基回收和純化D-PPT。
做為可替代方案，可以通過酶促方法獲得D-PPT，在該方法中通過(I)L-氨基轉(zhuǎn)移酶(例如，來源于大腸桿菌(E.coli))和(II)谷氨酸脫羧酶的聯(lián)合作用，將DL PPT+2酮戊二酸轉(zhuǎn)化為主要是DPPT，2-氧代PPT(和其脫羧基產(chǎn)物)和GABA的混合物。利用本領(lǐng)域已知和上文概述的方法，從反應(yīng)混合物解析期望的純D PPT。
D-PPT也可以用酶促方法獲得，在該方法中，通過(I)L-氨基轉(zhuǎn)移酶和(II)谷氨酸脫氫酶的聯(lián)合作用將DL PPT+2酮戊二酸+NAD轉(zhuǎn)化為主要是D-PPT、2-氧代PPT(和其脫羧化產(chǎn)物)NADH和氨的混合物。目的D-PPT從反應(yīng)混合物中純化。
在產(chǎn)生D-PPT的另一個(gè)方法中，用L-氨基酸氧化酶處理DL PPT，這樣僅僅保留了期望的D形式氨基酸。然后，從反應(yīng)混合物純化該D-PPT。
另一個(gè)方法包括(I)轉(zhuǎn)化DL PPT為N-乙酰DL PPT(利用本領(lǐng)域熟知的醋酸酐或其它乙?；噭┖头椒?和(II)用D-氨?；柑幚鞱-乙酰DL PPT，這樣僅N-乙酰D PPT脫乙?；?。從反應(yīng)混合物純化由此得到的D-PPT。例如，通過結(jié)合至Dowex陰離子交換樹脂和用40mM甲酸洗脫，從N-乙酰-L-PPT解析D-PPT。在適合的加樣條件下，該酸洗脫D-PPT，而留下與結(jié)合柱子的N-乙酰-L-PPT。
另一個(gè)方法包括在非水溶劑中，用L-氨基?；负王；噭┨幚鞤L PPT，這樣僅留下非乙?；问降钠谕鸇-PPT。
制備純D-PPT的另一個(gè)方法包括利用手性堿(chiral base)諸如chinchocine和純D-PPT和手性堿的晶種的添加，從DL PPT的對(duì)映體選擇性結(jié)晶作用。
從DL-PPT制備純D-PPT的另一種方法利用手性堿柱子，通過直接手性層析。
在下面的一個(gè)實(shí)施例中給出了純D-PPT產(chǎn)生的詳細(xì)方法。
2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶或α-甲基?；?CoA消旋酶(EC 5.1.99.4)可以選自通過大鼠肝臟、支頂孢屬(Acremomium sp)或粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)產(chǎn)生的這種酶。2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶或α-甲基酰基-CoA消旋酶(EC 5.1.99.4)可以選自具有對(duì)應(yīng)于GENESEQP Derwent數(shù)據(jù)庫中AAR49827，Swisspro中P70473或SEQ ID No.4(本申請(qǐng))的序列的蛋白質(zhì)，2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶或α-甲基?；?CoA消旋酶(EC 5.1.99.4)可以由下列DNA編碼序列編碼，所述DNA序列選自包含在GENESEQNDerwent數(shù)據(jù)庫記錄號(hào)AAQ44447，EMBL記錄號(hào)RN2ARYLCO和RNU89905和SEQ ID No.3(本申請(qǐng))中的序列。
本發(fā)明所用的?；鵆oA合成酶可以是“長鏈”酰基CoA合成酶(EC 6.2.1.3)，其選自歐洲油菜(Brassica napus)，大鼠肝臟，酵母屬(Saccharomyces sp)或擬南介屬(Arabidopsis)產(chǎn)生的那些酶。所述合成酶可以選自具有對(duì)應(yīng)于SPTREMBL序列Q96338，Swissprot P18163，Swissprot P39518，SPTREMBL Q9C5U7或SPTREMBL Q9TOAO的序列的蛋白質(zhì)，而編碼?；鵆oA合成酶的DNA序列可以選自包含在EMBL記錄號(hào)BNAMPBP2，J05439，X77783和AB030317中的序列。
可以根據(jù)來源生物體轉(zhuǎn)化S-芳氧基苯氧丙酸類為R-芳氧基苯氧丙酸類和/或轉(zhuǎn)化S-ibuprofen為R-ibuprofen的能力，選擇適于本發(fā)明所用的酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶和硫酯酶和/或編碼它們的DNA序列。例如，可以從土壤樣品獲得這種生物體，并且本領(lǐng)域熟知細(xì)胞培養(yǎng)物和微生物肉湯中測(cè)定和檢測(cè)這種手性轉(zhuǎn)換的方法(參見，Menzel-Soglowek等，(1990)J.Chromatogr.，532,295-303；Bewick(1986)Pestic.Sci.，17，349-356)。因此，酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶和/或硫酯酶，和可選地編碼它們的DNA序列可以來源于簡單節(jié)桿菌(4rthrobacter simplex)NCIB 8929；玫瑰色石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter roseoparaffineus)ATCC15584；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC 15841；灰葡萄孢(Botrytis cinerea)CM1 124882；Brevibacterium butanicum ATCC15841；希氏短桿菌屬(Brevibacterium healii)ATCC 15527；酮戊二酸短桿菌(Brevibacterium ketoglutamicum)ATCC 21004；Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195；束棒桿菌(Corynebacterium fascians)；Corynebacterium fijikoense ATCC 21496；Methanomonas methanolica NRRL B-5758；玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)；金色分枝桿菌(Mycobacterium aurum)NCTC 1043；嗜石油分枝桿菌(Mycobacterium petroteophilum)ATCC21497；草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)NCTC 10266；恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)ATCC 19420；不透明諾卡菌(Nocardia opaca)NCIB 9409；Nocardiopsis asteroids ATCC 21943；缺陷假單孢菌(Psuedomonas dimimuta)NCIB 9393；勒氏假單孢菌(Psuedomonas lemoignei)NCIB 9947；紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodocrous)ATCC 13808；紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodocrous)ATCC 21197；紅球菌屬(Rhodococcus sp)ATCC 21499；和紅球菌屬(Rhodococcus sp)ATCC 31337。利用本領(lǐng)域熟知的方法，利用基于其它酰基CoA合成酶，2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶和硫酯酶已知序列的適合簡并的探針，容易從這些生物體的適合基因文庫克隆和篩選包含DNA編碼序列的候選和改進(jìn)基因。通過在適合宿主中制備表達(dá)文庫，和利用體外或整個(gè)生物體培養(yǎng)測(cè)定法，篩選文庫克隆進(jìn)行全部手性轉(zhuǎn)換的能力，或可替代地催化單個(gè)酰基CoA合成酶(利用微粒體部分)，2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶或硫酯酶部分反應(yīng)中每一個(gè)的能力，選擇替代的和額外的適當(dāng)基因。這些活性體外測(cè)定的適合方法與文獻(xiàn)中所述用于ibuprofen的方法相似或相同(例如，Shieh和Chen(1993)JBC，268，3487-3493)。
本發(fā)明方法中所用的酶可以是膦絲菌素消旋酶，通過谷氨酸消旋酶基因的誘變和/或重組改組，接著進(jìn)行重復(fù)循環(huán)的篩選和向增加膦絲菌素消旋酶活性水平的方向進(jìn)化產(chǎn)生它的DNA編碼序列。谷氨酸消旋酶普遍存在細(xì)菌中，并且具有兩種類型，一種類型依賴于吡哆醛磷酸做為輔因子，另一種類型是輔因子依賴型，并且包含2個(gè)活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，選擇編碼戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，溶血葡萄球菌(Staphylococcushemolyticus)和球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)谷氨酸消旋酶的序列用于突變和/或重組家族改組。在特定實(shí)施方式中，選定用于改組的基因編碼具有對(duì)應(yīng)于(Swissprot)序列O82826，P94556和031332的序列的蛋白質(zhì)。通過從適合的宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌(E.coli)或酵母中的表達(dá)文庫篩選那些菌落，選擇適于本發(fā)明使用的基因，其中在基本培養(yǎng)基中該菌落對(duì)D-膦絲菌素生長抑制顯示了增加的敏感性。L-PPT抑制谷氨酰胺合成酶，而D-PPT不抑制。除非補(bǔ)加谷氨酰胺，否則轉(zhuǎn)化D-為L-PPT的谷氨酸消旋酶突變體克隆將不在基本培養(yǎng)基上生長。在適合的宿主株系中，不表達(dá)內(nèi)源D-氨基酸氧化酶或D-氨基酸脫氫酶活性，或者該活性不包含D-膦絲菌素做為底物。做為可替代的方案，可以根據(jù)所編碼酶互換D和L膦絲菌素能力的體外或體內(nèi)測(cè)定，選擇適合的基因。適合的這種測(cè)定法可以根據(jù)α-質(zhì)子交換，檢測(cè)從D-膦絲菌素到L-膦絲菌素形成的生物測(cè)定法的應(yīng)用，或者，例如，利用與適合的D-氨基酸氧化酶偶聯(lián)，L-膦絲菌素到D-膦絲菌素轉(zhuǎn)換的檢測(cè)。
可選地，可以進(jìn)一步突變和選擇本發(fā)明所用編碼酶的DNA序列，以產(chǎn)生具有改進(jìn)效用的其它有用的酶。因此，改進(jìn)酶的許多特性，包括對(duì)期望底物的催化活性(kcat/Km)，溫度穩(wěn)定性和最適宜pH。產(chǎn)生、篩選和選擇這種改進(jìn)的變異體的方法是公知的。例如，通過誘變方法(例如，通過UV，化學(xué)或靶向寡核苷酸PCR誘變，通過具有易錯(cuò)DNA復(fù)制的細(xì)菌或酵母株系，諸如大腸桿菌(E.coli)XL1 red傳代DNA)產(chǎn)生適合的變異體DNA序列。特別地，通過在例如WO0061740，28-41頁中概述的大量DNA改組或“有性PCR”替代方法中的任何一種方法產(chǎn)生這種基因，這里本發(fā)明參考文獻(xiàn)包含這篇文獻(xiàn)的所有內(nèi)容。許多方法適于選擇這種改進(jìn)的基因?？梢赃m合地在適合的宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌(E.coli)或酵母中表達(dá)該基因，并且利用如，例如這里所述適合的這種測(cè)定法選擇改進(jìn)的該基因。
能單獨(dú)或與其它酶聯(lián)合，轉(zhuǎn)化非毒害植物的物質(zhì)為毒害植物物質(zhì)的本發(fā)明所用酶的編碼嵌合基因每個(gè)都可以包含編碼一種所述酶的DNA序列，該DNA序列可操作地連接5’啟動(dòng)子區(qū)，該啟動(dòng)子區(qū)優(yōu)先地將表達(dá)定向到雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)。該表達(dá)特異性確保僅在能生育的種子或能生育的花粉形成所必需的組織和細(xì)胞位點(diǎn)中發(fā)揮所表達(dá)酶的作用，并且在適合的非毒害植物的物質(zhì)(可以是除草劑前體)存在的情況下，除了該表達(dá)酶對(duì)生育力的作用外，它不會(huì)對(duì)植物有害。除了啟動(dòng)子區(qū)外，本發(fā)明嵌合基因還可以包含3’轉(zhuǎn)錄終止子序列。它負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄終止和正確的mRNA聚腺苷酸化。本領(lǐng)域已知許多這種3’轉(zhuǎn)錄終止子序列，并且其適于用在本發(fā)明嵌合基因中。在特定的實(shí)施方式中，3’轉(zhuǎn)錄終止子序列選自CMV 35S終止子，tml終止子，胭脂氨酸合酶(nos)終止子和豌豆rbcS E0終止子。
適于用在所述嵌合基因一些實(shí)施方式中的5’啟動(dòng)子區(qū)包含優(yōu)先在雌性花組織中表達(dá)的基因5’區(qū)。在一些實(shí)施方式中，5’啟動(dòng)子區(qū)選自煙草stig 1啟動(dòng)子(Goldman等，(1994)EMBO J.，13，2976-2984)，修飾的S13啟動(dòng)子(Dzelkalns等，(1993)Plant Cell，5，8555)，AGL5啟動(dòng)子(Savidge等，(1995)Plant Cell，7，721-733)和玉米-心皮特異性ZAG2基因的5’啟動(dòng)子區(qū)(Thiessen等，(1995)Gene，156，155-166)?？蛇x地，從對(duì)應(yīng)于本領(lǐng)域已知優(yōu)先在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的cDNA序列的基因組DNA編碼序列上游區(qū)獲得其它適合的啟動(dòng)子區(qū)。在一些實(shí)施方式中，這種探針cDNAs選自擬南介屬(Arabidopsis)Fbp7和Fbp11基因(Angenent等，(1995)Plant Cell，7，1569-1582)和蘭花特異性cDNAs O40，O108，O39，O126和O141(Nadeau等，(1996)Plant Cell，8，213-239)。在特定的實(shí)施方式中，含有與雌性生殖結(jié)構(gòu)優(yōu)先表達(dá)相關(guān)的基因組DNA的5’啟動(dòng)子區(qū)選自包含在如下克隆中的DNA區(qū)域具有記錄號(hào)NRRL B-21920的基因組DNA克隆pSH64，與cDNA P26-A4雜交的具有記錄號(hào)NRRL B-21655的基因組克隆pCIB 10302，和與cDNA克隆P19-QA雜交的具有記錄號(hào)NRRLB-21919的基因組DNA克隆X2-1。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中，這些啟動(dòng)子區(qū)包含WO 98/39462中SEQ ID No.11的核苷酸1到1390，SEQID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸1到1093。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法分離和克隆適于本發(fā)明嵌合基因中使用的其它5’啟動(dòng)子區(qū)。例如，通過從組織諸如玉米須或小麥雌蕊分離RNA，接著利用技術(shù)諸如差異顯示、PCR選擇cDNA扣除和扣除cDNA文庫的構(gòu)建進(jìn)行差異篩選，鑒定在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的新的轉(zhuǎn)錄物。分離優(yōu)選在雌性組織表達(dá)，不在植物其它部分諸如葉片、根和穗中表達(dá)的cDNA克隆?？蛇x地，通過Northern印跡進(jìn)一步證實(shí)表達(dá)的組織特異性。cDNA克隆用作基因組文庫篩選的探針。從基因組DNA克隆獲得與組織優(yōu)先表達(dá)相關(guān)的5’啟動(dòng)子區(qū)和可選地，3’非翻譯DNA區(qū)，并且用于在雌性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)的嵌合基因構(gòu)建中。
適于用在所述嵌合基因一些實(shí)施方式中的5’啟動(dòng)子區(qū)包含在雄性花組織中優(yōu)先表達(dá)的基因5’區(qū)。這些包括在花粉、絨氈層或花藥中其它結(jié)構(gòu)中表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。在一些實(shí)施方式中，這些5’啟動(dòng)子區(qū)選自LAT52啟動(dòng)子(Twell等，(1989)Dev.，109，705-713)，番茄A127啟動(dòng)子(Dotson等，(1996)Plant J.，10，383＝392)，玉米Zmg啟動(dòng)子(Hamilton等，(1989)Sex.Plant Reprod.2，208-212)，玉米CDPK啟動(dòng)子(Guerro等，(1990)Mol.Gen.Genet.，224，161-168)和USP5477002(全部引入本文作為參考)中公開的花藥特異性ant32和ant43D啟動(dòng)子。在一些其它實(shí)施方式中，5’啟動(dòng)子區(qū)選自玉米的絨氈層特異性啟動(dòng)子CA55(WO 92/13956中所述“Pca55”)，水稻絨氈層特異性啟動(dòng)子E1(USP 5639948中所述)，水稻絨氈層特異性啟動(dòng)子T72(USP 5639948中所述)，水稻RA8花藥特異性啟動(dòng)子(EMBL/Genbank記錄號(hào)AF042275；Jean Js等，(1999)PMB，39，35-44)，花藥特異性Tap1啟動(dòng)子(Spena等，(1992)Theor ApplGenet 84，520-527)和玉米ZmC5-花粉特異性啟動(dòng)子(EMBL/Genbank記錄號(hào)Y13285；Wakeley等，(1998)PMB，37，187-192)?？蛇x地，從對(duì)應(yīng)于本領(lǐng)域已知優(yōu)先在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的cDNA序列的基因組DNA編碼序列上游區(qū)獲得其它適合的啟動(dòng)子區(qū)。在一些實(shí)施方式中，這種探針cDNAs選自蘭花花粉管特異性細(xì)胞色素P450基因(Nadeau等，(1996)Plant Cell，8，213-239)，擬南介(Arabidopsis)的Bcp1基因(Xu等，(1995)P.N.A.S.，92，2106-2110)和玉米雄花特異性MFS14基因(Wright S Y等，(1993)Plant J 3，41-49)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法分離和克隆適于本發(fā)明嵌合基因中使用的其它5’啟動(dòng)子區(qū)。例如，通過從組織諸如穗、花粉管、花藥或絨氈層分離RNA，接著利用技術(shù)諸如差異顯示、PCR選擇cDNA扣除和扣除cDNA文庫的構(gòu)建進(jìn)行差異篩選，鑒定在雄性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的新的轉(zhuǎn)錄物。分離優(yōu)選在雄性組織表達(dá)，不在植物其它部分諸如葉片、根和柱頭中表達(dá)的cDNA克隆?？蛇x地，通過Northern印跡進(jìn)一步證實(shí)表達(dá)的組織特異性。cDNA克隆用作基因組文庫篩選的探針。從基因組DNA克隆獲得與組織優(yōu)先表達(dá)相關(guān)的5’啟動(dòng)子區(qū)和3’非翻譯DNA區(qū)，并且用于在雄性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)的嵌合基因構(gòu)建中。
用在本發(fā)明嵌合基因中的其它啟動(dòng)子區(qū)包含水稻Osmads 13基因上游區(qū)，水稻花藥的OSG基因，和水稻YY2基因。一般地，選擇在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生高效、早期、持續(xù)和優(yōu)先表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)做為最適合的啟動(dòng)子區(qū)。啟動(dòng)子區(qū)還可以包含互相的嵌合聯(lián)合和與增強(qiáng)子區(qū)的嵌合聯(lián)合。
可選地，嵌合基因在緊鄰編碼參與非毒害植物的物質(zhì)到毒植物素轉(zhuǎn)換的酶的DNA序列之前包含區(qū)域，其編碼能將所述酶靶向亞細(xì)胞細(xì)胞器諸如葉綠體、過氧化物酶體(除了當(dāng)毒植物素是過氧化物或超氧陰離子時(shí)外)或線粒體的肽序列，并且所述靶向蛋白質(zhì)可以具有(i)葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列或(ii)葉綠體轉(zhuǎn)移肽-葉綠體蛋白質(zhì)N-末端部分-葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。例如，在所述DNA序列編碼D-氨基酸脫氫酶的情況下，其中預(yù)期所述D-氨基酸脫氫酶在包含膜電子傳遞鏈的區(qū)室諸如線粒體或葉綠體中最好地起作用，或者，例如，在DNA序列編碼僅僅催化整個(gè)期望轉(zhuǎn)化中部分步驟的酶且全部反應(yīng)需要與區(qū)室化代謝物和內(nèi)源活性聯(lián)合的情況下，這特別有利。特別地，為了靶向線粒體，緊鄰編碼酶的DNA序列之前的所述DNA區(qū)編碼線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列可以選自Nicotiniaplumbaginifolia線粒體ATP合酶β-亞基，線粒體特異性依賴于NADP的異檸檬酸脫氫酶，呼吸鏈復(fù)合物I的NADPH結(jié)合亞基和酵母線粒體色氨酰-tRNA-合成酶的內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(WO 6121513)。
本發(fā)明方法中所用的多核苷酸可以包含一種或多種編碼酶的嵌合基因，該酶催化參與從非毒害植物的物質(zhì)產(chǎn)生毒植物素的反應(yīng)?？蛇x地，多核苷酸還包含基因和嵌合基因，諸如嵌合標(biāo)記基因。這里所用的嵌合標(biāo)記基因包含植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子表達(dá)控制下的標(biāo)記DNA。該標(biāo)記DNA編碼RNA，蛋白質(zhì)或多肽，當(dāng)在植物、植物組織或植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其能夠使得這種植物材料區(qū)別于沒有表達(dá)標(biāo)記DNA的植物材料。標(biāo)記基因的例子是給細(xì)胞提供特定顏色的基因，如A1基因(Meyer等，(1987)Nature 330，667)或賦予植物細(xì)胞對(duì)用抗生素(例如，編碼對(duì)慶大霉素抗性的aac(6’)基因，WO 94/01560或提供對(duì)潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)，或者除草劑諸如草甘膦(例如，諸如在USP 5510471或WO 00/66748者的EPSPS基因)，苯敵草(例如，pmph基因，USP 5347047；USP 5543306)，bromoxynyl(例如，USP 4810648中所述基因)，磺酰脲類(例如，EP 0360750中所述基因)，茅草枯(WO 99/48023中所述基因)，氰氨鈣(WO98/48023；WO 98/56238中所述基因)進(jìn)行的本來致死的選擇有抗性的基因和編碼對(duì)谷氨酰胺合成酶抑制劑諸如L-膦絲菌素抗性的基因(例如，EP 0242246，EP 0242246和EP 0257542中所述，N-乙酰-轉(zhuǎn)移酶基因)。在包含除草劑抗性基因做為標(biāo)記基因的本發(fā)明多核苷酸優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述除草劑是用于農(nóng)作物中雜草控制的除草劑，和此外，除草劑抗性基因被充足地表達(dá)以提供對(duì)所述除草劑田地頻率(fieldrates)的加強(qiáng)耐受性。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，除草劑是草甘膦，除草劑抗性基因是EPSP合酶。然而，標(biāo)記基因可以是提供正選擇的基因，其中標(biāo)記基因編碼給特定培養(yǎng)基環(huán)境中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞提供陽性代謝優(yōu)點(diǎn)的酶。USP 5767378描述了大量適合的正選擇系統(tǒng)和基因。
在本發(fā)明多核苷酸包含除草劑抗性基因的情況下，給農(nóng)作物植物外源施用除草劑，該農(nóng)作物植物以足夠的密度間作，以排除來源于非轉(zhuǎn)基因自體受精親本植物的非雜種種子的產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除草劑是草甘膦或其農(nóng)藝學(xué)有用的鹽，并且所述除草劑抗性標(biāo)記基因選自WO 00/66748中所述草甘膦抗性賦予基因。
當(dāng)存在標(biāo)記基因的情況下，也可以提供除去所述標(biāo)記基因的工具。例如，在決定聯(lián)合性狀的情況下，期望這樣做。此外，也期望除去這樣的除草劑抗性標(biāo)記基因，其可能干擾本發(fā)明的依賴于除草劑前體的有條件可育機(jī)制的運(yùn)作。例如，可能期望從多核苷酸除去膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)除草劑抗性標(biāo)記基因，該多核苷酸也包含嵌合基因，其根據(jù)D-膦絲菌素除草劑前體的外源施用，用于提供有條件雄性或雌性不育。PAT基因的存在可以通過失活L-膦絲菌素毒植物素，潛在地干擾成功的有條件不育。因此，包含標(biāo)記基因的多核苷酸在位于標(biāo)記基因側(cè)翼并且使得該序列將被“剔除”的位置，可選地可以包含特異性重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)。帶有含這種側(cè)翼的標(biāo)記基因的植物和帶有編碼相應(yīng)的特異性重組酶的基因的植物雜交產(chǎn)生特異性切除標(biāo)記的子代植物。適合的這種位點(diǎn)特異性同源重組系統(tǒng)的例子是flp/frt系統(tǒng)(Lyznik等，(1996)，Nucleic Acids Res.24，3784-3789)和Cre/Lox系統(tǒng)(Bayley，C.C.等，(1992)PMB，18，353-361)。
本發(fā)明方法中所用多核苷酸可選地可以包含一種或多種翻譯增強(qiáng)子，其位于蛋白質(zhì)編碼序列的5’非翻譯區(qū)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這種適合的翻譯增強(qiáng)子，諸如來源于TMV的Ω和Ω原初序列和來源于煙草蝕刻病毒的增強(qiáng)子，和如何可以將這種翻譯增強(qiáng)子引入多核苷酸中以提供增加的蛋白質(zhì)表達(dá)的期望結(jié)果。其它例子包括來源于玉米褪綠斑駁病毒和苜?；ㄈ~病毒的翻譯增強(qiáng)子(Gallie等，(1987)Nucl.Acids Res.，15，8693-8711；Skuzeski等，(1990)PMB.，15，65-79)。為了進(jìn)一步優(yōu)化從嵌合基因和嵌合標(biāo)記基因的蛋白質(zhì)表達(dá)，所述多核苷酸還可以包含諸如增強(qiáng)子、支架連接區(qū)(SARS或MARS)和內(nèi)含子的元件。已經(jīng)證明當(dāng)將各種內(nèi)含子序列諸如玉米adh1內(nèi)含子1包含在基因5’非翻譯區(qū)時(shí)，其增強(qiáng)表達(dá)，并且，可選地，其用在本發(fā)明嵌合基因中。
也可以用包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)的多核苷酸轉(zhuǎn)化本發(fā)明已經(jīng)轉(zhuǎn)化以顯示期望雄性/雌性不育特性的植物，該蛋白質(zhì)賦予包含它的植物材料至少一種下面的農(nóng)藝學(xué)期望性狀對(duì)昆蟲、真菌、病毒、細(xì)菌、線蟲、脅迫、干旱和除草劑的抗性。
例如，賦予除草劑抗性的基因可以選自編碼下列蛋白質(zhì)的基因草甘膦氧化酶(GOX)，EPSP合酶，膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，細(xì)胞色素P450，乙酰-CoA羧化酶(ACCase)，乙酰乳酸合酶(ALS)，原卟啉原氧化酶(PPO)，dihydropteroate合酶，聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，超氧化物歧化酶(SOD)，溴苯腈腈水解酶，八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)，從真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)可獲得的tfdA基因產(chǎn)物，和所述蛋白質(zhì)的已知誘變或其它修飾的變體。仔細(xì)地考慮到本領(lǐng)域技術(shù)人員使用來轉(zhuǎn)化非毒害植物的物質(zhì)的酶的特性，他將認(rèn)識(shí)到關(guān)閉這種基因和驅(qū)動(dòng)它們表達(dá)的啟動(dòng)子的需要。在多核苷酸提供多種除草劑抗性的情況下，這種除草劑可以選自二硝基苯胺類除草劑、三唑并嘧啶類、尿嘧啶類、苯基脲類、三酮類、異噁唑類、乙酰苯胺類、噁二唑類、三嗪酮類、sulfonanilide、酰胺類、酰替苯胺類、異噁氟草、flurochloridone、達(dá)草滅和triazolinone類型除草劑，苗后除草劑，選自草甘膦和其鹽、草銨膦、黃草靈、噻草平、雙丙胺膦、除草定、稀禾定，或其它環(huán)己二酮類、麥草畏、膦銨素、胺草唑、苯氧基丙酸酯類、喹禾靈，或其它芳氧-苯氧基丙酸酯類、毒莠定、fluormetron、butafenacil、莠去津、或其它三嗪類、賽克津、chlorimuron、綠黃隆、氟唑啶草、吡氯磺隆、sulfometron、滅草喹、咪草煙、異噁草胺、咪草啶酸、唑草磺胺、pyrithrobac、玉嘧磺隆、芐嘧磺隆、煙嘧磺隆、氟黃胺草醚、fluroglycofen、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、磺草酮、對(duì)草快、敵草快、溴苯腈、噁唑禾草靈。
在多核苷酸包含編碼殺蟲蛋白質(zhì)的序列的情況下，這些蛋白質(zhì)可以選自來源于Bt的晶體毒素，包括分泌的Bt毒素諸如稱為“VIP”的毒素；蛋白酶抑制劑，凝集素和Xenhorabdus/Photorhabdus毒素。賦予真菌抗性的基因可以選自編碼已知AFPs，防衛(wèi)素、殼多糖酶、葡聚糖酶和Avr-Cf9的基因。特別優(yōu)選的殺蟲蛋白質(zhì)是cryIAc，cryIAb，cry3A，Vip 1A，Vip 1B，Vip3A，Vip3B，半胱氨酸蛋白酶抑制劑和雪花蓮凝集素。在多核苷酸包含賦予細(xì)菌抗性的基因的情況下，這些基因可以選自編碼殺菌肽和techyplesin和其類似物的基因。賦予病毒抗性的基因可以選自已知提供對(duì)病毒抗性的編碼病毒外被蛋白、移動(dòng)蛋白、病毒復(fù)制酶，和反義和核酶序列的基因。而賦予脅迫、鹽和干旱抗性的基因可以選自編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶的基因、組成已知CBF1調(diào)節(jié)序列的序列和已知提供海藻糖積累的基因。
也可以修飾本發(fā)明所用的多核苷酸以增強(qiáng)它們所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的表達(dá)，因?yàn)榭梢猿RNA不穩(wěn)定基序和/或偶然剪接區(qū)，或者可以使用農(nóng)作物優(yōu)選的密碼子，以使得植物中由此修飾的多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生與生物體中未修飾的核苷酸蛋白質(zhì)編碼區(qū)表達(dá)獲得的蛋白質(zhì)具有基本相似活性/功能的基本相似的蛋白質(zhì)，在所述生物體中，這種未修飾的多核苷酸區(qū)是內(nèi)源的。修飾的多核苷酸和內(nèi)源地包含在所述植物中和編碼基本相同蛋白質(zhì)的多核苷酸之間的同一性程度可以是防止修飾和內(nèi)源序列之間的共抑制的程度。在這種情況下，序列間同一性的程度應(yīng)該優(yōu)選小于約70％。此外，可以修飾翻譯起始位置周圍的序列，使得它是“Kozack優(yōu)選的”。其含義是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明還包括植物雜交產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)正常的有條件可育的整個(gè)植物，其中所述的植物從用本發(fā)明核酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化和因此提供這種性狀的材料再生。本發(fā)明也包括由此得到的植物的子代，它們的種子和部分。
本發(fā)明的植物可以選自大田作物、水果和蔬菜諸如canola、向日葵、煙草、甜菜、棉花、玉米、小麥、大麥、稻、高梁、mangel worzels、番茄、芒果、桃、蘋果、梨、草莓、香蕉、瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、萵苣、甘藍(lán)、洋蔥、大豆屬、甘蔗、豌豆、蠶豆、白楊、葡萄、柑桔、紫花苜蓿、黑麥、燕麥、草皮草和牧草、亞麻和油籽油菜和還沒有特別提到的堅(jiān)果生產(chǎn)植物，它們的后代，種子和部分。
特別地，優(yōu)選的這種植物包括小麥、大麥、燕麥、稻、玉米、黍和高梁。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)雜種小麥種子的優(yōu)選方法，該方法包括步驟(i)用多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物材料，該多核苷酸或載體包含在外源施用除草劑前體或其它非毒害植物的物質(zhì)時(shí)賦予有條件雄性不育的基因；(ii)選擇由此轉(zhuǎn)化的材料；和(iii)將由此選擇的材料再生為形態(tài)學(xué)正常的有條件雄性不育的整株植物；(iv)培育純合有條件雄性不育雌性親本系；(v)用多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化植物材料，該多核苷酸或載體包含在外源施用如(i)中相同的除草劑前體或非毒害植物的物質(zhì)時(shí)賦予有條件雌性不育的基因；(vi)選擇由此轉(zhuǎn)化的材料；和(vii)將由此選擇的材料再生為形態(tài)學(xué)正常的有條件雌性不育的整株植物；(viii)培育純合有條件雌性不育雄性親本系；(ix)以確保有效授粉的這種比率，間作所述有條件不育的雄性和雌性親本系；(x)在最小化自體受精的劑量和發(fā)育階段，給間作親本系施用所述的除草劑前體或其它非毒植物素物質(zhì)；(xi)從間作的親本植物收獲雜種小麥種子。
本發(fā)明也提供了上述方法的變化形式，其中雄性親本是通過任何方法雌性不育的，雌性親本是通過任何方法雄性不育的，雄性和雌性親本系依賴于其所施用的不同除草劑前體的施用有條件不育，以及農(nóng)作物不是小麥。
本發(fā)明也包括診斷試劑盒，該診斷試劑盒包含檢測(cè)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物中存在的蛋白質(zhì)或編碼它們的DNA序列的工具，因此適于鑒定包含蛋白質(zhì)或編碼它們的DNA序列的組織或樣品。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的PCR擴(kuò)增檢測(cè)DNA序列，該P(yáng)CR擴(kuò)增是基于本領(lǐng)域技術(shù)人員從本申請(qǐng)中公開或提到的酶編碼序列容易獲得的引物。通過，例如，抗體的應(yīng)用可以檢測(cè)酶本身，其中抗體是針對(duì)它們產(chǎn)生的，用于診斷性地區(qū)別它們包含的抗原區(qū)。
本發(fā)明也提供了產(chǎn)生對(duì)映體純的D-膦絲菌素(D-PPT)的方法，該方法包括步驟(a)提供包含酶的細(xì)胞，該酶具有選擇性N-?；疨PT的能力；(b)在含有D-L PTT的培養(yǎng)基中生長所述細(xì)胞以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基；(c)從(b)的條件培養(yǎng)基分離細(xì)胞；(d)可選地，在各種pH用非水、非混溶的溶劑萃取條件培養(yǎng)基，使得從含有水溶性比PPT大的分子的級(jí)份分離含有PPT的級(jí)份；(e)可選地，以足以從培養(yǎng)基吸附相當(dāng)比例的除了PTT外的陽離子的量和pH，混合質(zhì)子化形式的陽離子交換樹脂和條件培養(yǎng)基或步驟(d)的含有PPT的萃取培養(yǎng)基，(f)以足以結(jié)合培養(yǎng)基中大部分PPT的量和pH，混合質(zhì)子化形式陽離子交換樹脂和條件培養(yǎng)基、萃取培養(yǎng)基或得自步驟(e)的培養(yǎng)基，(g)收集步驟(f)的與PPT結(jié)合的陽離子離子交換樹脂，并且利用有足夠pH和離子強(qiáng)度的洗脫介質(zhì)從該樹脂選擇性洗脫P(yáng)PT，條件是所述洗脫介質(zhì)的pH不至于低到引起由此洗脫的PPT外消旋。
在植物材料轉(zhuǎn)化方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白盡管在下面的實(shí)施例中具體說明了特定靶材料類型(例如，胚生成性的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物或去分化的未成熟胚)和特定的轉(zhuǎn)化方法(例如，利用農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或顆粒轟擊)，但是本發(fā)明不限于這些特定的實(shí)施方式，可以互換地使用這些靶材料和方法。而且，本發(fā)明整個(gè)說明書所用術(shù)語“植物細(xì)胞”可以指分離的細(xì)胞，包括懸浮培養(yǎng)物，也指完整的或部分完整的組織諸如胚、盾片、小孢子、小孢子來源的胚中的細(xì)胞或來源于植物器官的體細(xì)胞。相似地，盡管具體的實(shí)施例限于玉米和小麥，但是，本發(fā)明同樣可應(yīng)用于廣泛范圍的、可以利用適合的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物。
聯(lián)合序列表和附圖一起，從下列非限制性實(shí)施例將會(huì)更清楚理解本發(fā)明。
SEQ ID NO1表示從集胞藻屬(Synechocystis sp.)分離的DNA序列，其編碼具有酯酶B活性的酶(SEQ ID NO2所示)。
SEQ ID NO3表示從粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)分離的DNA序列，其編碼具有酰基-甲基?；?CoA消旋酶序列的活性的酶(SEQ ID NO4所示)。
SEQ ID NO5和6描述了用于獲得TA29啟動(dòng)子區(qū)的PCR引物。
SEQ ID NO7描述了從纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)分離的DNA序列，其編碼具有D-氨基酸氧化酶活性的酶。
SEQ ID NO8和9描述了用于提供變異體D-氨基氧化酶的簡并寡聚物。
SEQ ID NO10和11描述了一些基序，其中可以用可替代的氨基酸進(jìn)行置換以提供變異體D-氨基酸氧化酶。


圖1是用于煙草轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體示意圖，該構(gòu)建體包含stig1啟動(dòng)子區(qū)可操作地控制下的紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶。標(biāo)明的組件是LB(左邊界序列)，AOPR1(AoPR1啟動(dòng)子)，PSTIG1(EMBL記錄號(hào)X77823)，RGDAO (OPT)(SEQ ID NO7)，PC啟動(dòng)子(EMBL記錄號(hào)X16082)，PAT(EMBL記錄號(hào)A02774)，NOS(從EMBL記錄號(hào)ATU237588獲得的nos終止子)和RB(右邊界序列)。
圖2是用于煙草轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體示意圖，其中紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶編碼區(qū)在3’末端被截短3個(gè)密碼子，并且在5’末端(RGDAO(OPT)-SKL)融合編碼優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(FR2673643)的區(qū)域。
圖3a是質(zhì)粒Ubi-CoA合成酶的圖譜，其中PUB 11-01-01具有EMBL記錄號(hào)SM29159，CoA合成酶具有記錄號(hào)J05439。
圖3b是質(zhì)粒Ubi-差向異構(gòu)酶的圖譜，其中差向異構(gòu)酶具有EMBL記錄號(hào)Y0817Z。
根據(jù)非常成熟的方法進(jìn)行一般的生物學(xué)方法。
對(duì)于下面大部分實(shí)施例，每個(gè)實(shí)施例都包含本發(fā)明的多個(gè)示例。其中采用所用術(shù)語“基因的啟動(dòng)子區(qū)”意指包含啟動(dòng)子、啟動(dòng)子上游序列和可選地，編碼mRNA 5’非翻譯前導(dǎo)區(qū)的所有或部分DNA序列的DNA序列。
實(shí)施例1.
依賴于D-膦絲菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-甲硫氨酸或D-天冬酰胺D-天冬氨酸或或D-谷氨酸的外源施用有條件雌性不育的煙草植物通過RT-PCR從變異三角酶母(Trigonopsis variabilis)mRNA獲得或合成獲得編碼EMBL序列Z50019中D-氨基酸氧化酶蛋白質(zhì)序列Q99042(Swissprot)的DNA序列。做為可替代方案，通過RT-PCR從類酵母紅冬孢(Rhodosporidium tolruloides)(纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis))mRNA獲得或通過合成獲得(這更容易控制存在的內(nèi)部限制酶位點(diǎn)和產(chǎn)生有利于克隆的側(cè)翼位點(diǎn))編碼EMBL序列A56901中D-氨基酸氧化酶蛋白質(zhì)序列P80324(Swissprot)的DNA序列，該DNA可以合成為例如，SEQ ID #7，設(shè)計(jì)該序列用于符合植物(在這里是小麥)密碼子使用和用于最小化對(duì)表達(dá)潛在不利的DNA特征。做為可替代方案，(例如，來源于EMBL記錄號(hào)X95310的)該DNA序列編碼“D-天冬氨酸氧化酶”諸如P31228(Swiss Prot)，并且，再一次合成該DNA序列以解釋植物密碼子使用和最小化對(duì)表達(dá)不利的特征。做為可替代方案，獲得和實(shí)施例2中所述相同的D-氨基酸氧化酶編碼序列。設(shè)計(jì)側(cè)翼PCR-引物和合成的DNA序列以放置用于克隆的有用單一限制位點(diǎn)。優(yōu)選地，和在氧化酶編碼序列不含有混淆的內(nèi)部位點(diǎn)的情況下，在5’末端置放Nco1和Nde1位點(diǎn)以方便與添加到ORF 5’的序列，諸如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列的符合讀框融合物的克隆。在該實(shí)施例的一些變化形式中，克隆D-氨基酸氧化酶(在一些變異形式中稱為“D-天冬氨酸氧化酶”)基因使得截短末端的3個(gè)氨基酸，因此所編碼的酶不再向過氧化物酶體靶向。在其它一系列變化形式的方法中，通過PCR改造基因，以編碼在位置213和238具有可替代氨基酸的纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶，特別地，用精氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬酰胺或丙氨酸置換在位置213的甲硫氨酸和/或用組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或丙氨酸置換在位置238的酪氨酸。在天然蛋白質(zhì)序列基序RCTMDSS中在“213”位置的甲硫氨酸鑒定為M。在天然蛋白質(zhì)序列基序GGTYGVG中在位置238中的甲硫氨酸鑒定為“Y”。當(dāng)雌性不育將被制成施用D-天冬氨酸，D-谷氨酸或D-膦絲菌素的情況下有條件的雌性不育時(shí)，使用這些變異形式的來源于紅酵母屬(Rhodotorula)的D氨基酸氧化酶或“D-天冬氨酸氧化酶”。
可以將限制位點(diǎn)放置于ATG翻譯起始位點(diǎn)間插序列的上游以符合植物翻譯的共有序列諸如根據(jù)Kozak的那些。
“δ-S13啟動(dòng)子”是用于在雌性花部分中獲得優(yōu)先表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。其包含與CMV 35S核心啟動(dòng)子-46到+8融合的SLG13啟動(dòng)子區(qū)-399到-79的區(qū)域(Dzelkalns等，(1993)Plant Cell，5,833-863)。將該S13啟動(dòng)子克隆到bluescript sk中，然后，進(jìn)一步限制消化該質(zhì)粒，并且連接限制性片段，該限制性片段包含nos 3’轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)和氨基酸氧化酶編碼序列，以在bluescript sk質(zhì)粒中產(chǎn)生“δ-S13-D-氨基酸氧化酶-Nos終止子”表達(dá)盒。然后，限制性消化做為例如EcoR1片段，就這樣連接回到載體諸如pBIN19(Bevan(1984)Nucleic Acids Res.)或PCIB200或PCIB2001(WO 98/39462)的適合位點(diǎn)，用于利用農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)的轉(zhuǎn)化。如WO 98/39462中所述，PCIB200包含下面的單一多接頭限制位點(diǎn)EcoR1，Sstl，Kpnl，BglII，Xbal和SaII。PCIB2001在多接頭中含有插入，該多接頭進(jìn)一步添加了單一限制位點(diǎn)，包含MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。PCIB200和pCIB2001還提供了用于卡那霉素上植物和細(xì)菌篩選的選擇性標(biāo)記基因，左和右T-DNA邊界、用于在大腸桿菌(E.coli)和其它宿主之間移動(dòng)的RK2來源的trfA功能和來源于RK2的oriT和oriV功能。做為可替代方案，利用引入來源于廣譜宿主范圍質(zhì)粒pRK252序列的雙元載體PCIB10(Rothstein等，(1987)Gene 53，153-161)或利用引入卡那霉素抗性基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的其衍生物之一如pCIB715(Gritz等，(1983)Gene 25，179-188)。
做為可替代方案，利用約1.6kb Stig啟動(dòng)子區(qū)(來源于EMBL記錄號(hào)X77823)。例如，利用適合的限制酶，用編碼P80324或Q99042編碼序列的DNA序列置換Goldman等，(1994)在EMBO J.，13，2976-2984中所述stig1-GUS構(gòu)建體中的GUS基因編碼區(qū)，在鄰接適合標(biāo)記基因的3’終止子序列上游位置和T-DNA邊界序列之間，將由此得到的stig1-D-氨基酸氧化酶表達(dá)構(gòu)建體克隆到適合的載體諸如pCIB200中。
在另一個(gè)特定的實(shí)例中，根據(jù)
圖1構(gòu)建雙元載體中的T-DNA插入。將包含stig1啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下的編碼纖細(xì)紅酶母(Rhodotorulagracilis)D-氨基酸氧化酶的合成DNA序列(SEQ ID #7)和豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下的編碼L-膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的DNA序列(A02774)的構(gòu)建體克隆到雙元載體T-DNA的LB/npt II基因和RB之間的位點(diǎn)中。簡而言之，將序列ID#7做為NcoI/PstI片段克隆到質(zhì)粒pFse4-Stiglnos(WO9942598中所述)的Stig1啟動(dòng)子后和nos終止子區(qū)(包含在EMBLATU237588中)之前。通過PCR，從豌豆基因組DNA獲得豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)(來源于EMBL記錄號(hào)X16082)，克隆到PAT基因/nos終止子前。將由此得到的PC-PAT-nos盒子做為NotI片段克隆到Stigl-RGDAMOX-nos之后，這整個(gè)兩基因構(gòu)建體做為FseI片段轉(zhuǎn)移到雙元載體(pVB6，Binl9衍生物)。
在本方法的進(jìn)一步變化形式中，所用的構(gòu)建體是根據(jù)圖2中的示圖。紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶編碼序列SEQ ID# 7在3’末端截短3個(gè)密碼子，可選地，定向突變它以編碼M213R形式，并且在5’末端，將其克隆置于緊鄰著編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的區(qū)域下游，因此編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽D-氨基酸氧化酶融合蛋白質(zhì)。葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列來源于編碼EPSP合酶小亞基的擬南芥(Arabidopsis)基因(Klee等，1987 in Mol.Gen.Genet.，210，437)?？蛇x地，進(jìn)行修飾以在CTP加工位點(diǎn)包含Sph1位點(diǎn)，由此在該位置用Cry-Met置換Glu-Lys(WO92044490的圖9中SEQ)。相應(yīng)地，可以在D-氨基酸氧化酶編碼序列的N-末端工程改造SPh1位點(diǎn)(轉(zhuǎn)化甲硫氨酸后面的氨基酸為亮氨酸)。做為可替代的方案，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列來源于編碼EPSP合酶的矮牽牛基因(WO 92044490的
圖11)。做為可替代的方案，葉綠體編碼序列是大量的可能編碼序列中的任何一種編碼序列，包括來源于編碼核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基的基因的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列，并且包括稱為“最佳化”嵌合轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(FR 2673643)。在所有這些情況下，除了依賴于亞克隆以外，可以簡單地通過合成獲得編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽/紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶融合多肽的整個(gè)DNA序列。將該序列克隆到適合載體中的stig1啟動(dòng)子區(qū)下游和(例如，nos)終止子序列下游的位點(diǎn)(例如在含有stig1→GUS構(gòu)建體的載體中置換GUS編碼序列，Goldman等，(1994)in EMBO J.，13，2976-2984所述)。然后將整個(gè)基因表達(dá)構(gòu)建體克隆到PVB6載體T-DNA右和左邊界之間適合的位點(diǎn)中。
利用與Horsch等，(1985)Science，227，1229-1231中所述相似的方法，用重組雙元載體轉(zhuǎn)化煙草葉片圓盤。可以利用該方法的許多變化形式。利用冷凍融溶的轉(zhuǎn)化方法，雙元載體可以轉(zhuǎn)化到，例如根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。根據(jù)Draper等(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci.Pub.1989)所述的方法，利用Nicotiana tabacum var.Samsun進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化和整株植物再生。在含有卡那霉素或其它適合抗生素的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化事件。通過PCR證實(shí)整合的轉(zhuǎn)基因的存在。再生植物，并且使得植物達(dá)到成熟和自花受精以產(chǎn)生種子。利用Northern和/或Western分析證實(shí)D-氨基酸氧化酶基因的組織特異性表達(dá)。植物是自花能育的，但是具有有條件雌性不育的條件。以一定行距種植T1代的種子。一旦小植株生長到足夠的大小，就通過PCR檢測(cè)它們的轉(zhuǎn)基因的存在。將PCR陽性植物轉(zhuǎn)移到溫室。在沒有外源施用的除草劑前體存在的情況下，這些植物是完全可育的。在各種生長階段，用各種量的D-膦絲菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-天冬酰胺或D-甲硫氨酸或D-天冬氨酸或D-谷氨酸處理一小批這些(推測(cè)地)有條件不育的植物。對(duì)PCR證實(shí)為D-氨基酸氧化酶基因陽性的T1植物進(jìn)行這種處理，或者，同樣地，直接對(duì)To代植物進(jìn)行這種處理(營養(yǎng)克隆To代植物，這樣可以留出每個(gè)事件未處理的克隆用于種子生產(chǎn))。然后，觀察到的可育性做為選擇適合的植物株系的基礎(chǔ)，該適合的植物株系顯示了最明顯的有條件不育性表型。例如，這些氨基酸是純D對(duì)映體，或者可替代地是DL外消旋物。例如，在花形成早期階段之前或期間，以通常0.25和20kg/ha之間的比率，做為葉面噴霧施用它們。通過進(jìn)一步施用做為噴霧薄霧的水重新溶解和重新調(diào)動(dòng)葉面施用后可能從溶液結(jié)晶出來的氨基酸而用于葉片吸收。例如，還可以做為灌根施用氨基酸，并且可選地，還可以做為約50μl的10-200mM的溶液施用該氨基酸，該溶液直接灌浸入新出現(xiàn)小花的芽中。收集來源于處理植物的花粉，檢測(cè)生育力。獲得用D-膦絲菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-天冬酰胺或D-甲硫氨酸或D-天冬氨酸或D-谷氨酸處理后相對(duì)幾乎沒有產(chǎn)生種子或沒有產(chǎn)生種子，但是，在相同處理?xiàng)l件下確實(shí)產(chǎn)生接近正常水平能生育的花粉的植物。對(duì)照植物是轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因兩種植物，并且除了處理溶液是水或等同濃度的純L-氨基酸外，在相同條件和相同的物理處理方案下生長該對(duì)照植物。
在該方法的一個(gè)變化形式中，施用的氨基酸是外消旋DL膦絲菌素。在這種情況下，用于轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體除了包含組織特異性雌性花啟動(dòng)子區(qū)諸如“stig1”可操作表達(dá)控制下的編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列外，還包含啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下的‘PAT’基因的DNA序列(EMBLA02774)，所述啟動(dòng)子區(qū)是諸如豌豆(Pisum sativum)質(zhì)體藍(lán)素基因的質(zhì)體藍(lán)素基因翻譯起始的5’區(qū)(EMBL記錄號(hào)X16082)。例如，除了位點(diǎn)特異性突變編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列，使得編碼M213R形式的酶外，構(gòu)建體與
圖1中所述相同。質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)提供了在植物綠色組織中的優(yōu)先表達(dá)。意外地發(fā)現(xiàn)這種不同于例如35S啟動(dòng)子區(qū)的啟動(dòng)子基本上僅在植物的一些組織中表達(dá)，最明顯地是綠色組織中表達(dá)，但是，當(dāng)其與PAT基因聯(lián)合使用時(shí)，其提供了對(duì)甚至超過2kg/ha比率的除草劑DL PPT的基本上完全生殖耐受性。而且，在花組織中缺少共表達(dá)的任何適合異源D-氨基酸氧化酶或相似的D到L轉(zhuǎn)換活性的情況下，盡管當(dāng)在該啟動(dòng)子區(qū)控制下表達(dá)時(shí)，在許多重要花組織中PAT表達(dá)水平低或者不存在，但是質(zhì)體藍(lán)素/PAT基因聯(lián)合提供了基本完全的生殖耐受性，而沒有明顯的產(chǎn)量損失。因此，在該實(shí)例的變化形式中，非毒害植物的物質(zhì)D膦絲菌素以其最少的花費(fèi)和最容易獲得的形式，做為商用除草劑DL膦絲菌素外消旋物施用。在適合的噴霧次數(shù)，和250g/ha至5kg/ha的DL膦絲菌素比率，沒有觀察到處理植物明顯的損害，但是使得該處理植物有條件雌性不育，又保留了正?；蚪咏５男坌钥捎?br> 實(shí)施例2.
依賴于D-膦絲菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-甲硫氨酸或D-天冬酰胺或D-天冬氨酸或D-谷氨酸的外源施用有條件雌性不育的煙草植物通過RT-PCR從博伊丁氏假絲酵母(Candida boidini)mRNA獲得或通過合成獲得編碼EMBL序列AB042032中D-氨基酸氧化酶蛋白質(zhì)序列Q9HGY3(Sptrembl)的DNA序列。做為可替代方案，通過RT-PCR從茄病鐮胞(Fusarium solani)mRNA獲得或通過合成獲得編碼EMBL序列D00809中D-氨基酸氧化酶蛋白質(zhì)序列P24552(Swissprot)的DNA序列。設(shè)計(jì)側(cè)翼PCR引物或合成DNA序列以放置有用的單一限制性位點(diǎn)。優(yōu)選地和在氧化酶編碼序列不含有混淆的內(nèi)部位點(diǎn)的情況下，在5’末端置放Nco1和Nde1位點(diǎn)以方便與添加到ORF 5’序列的符合讀框融合物的克隆?；蛘?，在將限制位點(diǎn)放置于ATG翻譯起始位點(diǎn)上游時(shí)，設(shè)計(jì)間插序列以符合植物翻譯的共有序列諸如根據(jù)Kozak的那些。做為可替代的方案，獲得的D-氨基酸氧化酶編碼序列與實(shí)施例1中相同。而且，和在前述實(shí)施例中一樣，在根據(jù)D-天冬氨酸、D-谷氨酸或D-膦絲菌素的施用產(chǎn)生不育性的情況下，優(yōu)選地，D-氨基酸氧化酶是在氨基酸位置213和/或238的變異體。
利用引物5′-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3′(SEQ ID #5)和，5′-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3′(SEQ ID #6)通過PCR，從煙草基因組DNA克隆TA29啟動(dòng)子區(qū)(Kriete等，(1996)Plant J.，9，808-818)。通過一系列限制和亞克隆步驟，將由此獲得的PCR片段置于D-氨基酸氧化酶編碼序列的上游，并將nos轉(zhuǎn)錄終止子添加到編碼區(qū)3’。如實(shí)施例1中所述，然后，克隆由此獲得的T29-D-氨基酸氧化酶-nos終止子表達(dá)盒子，獲得適合的限制片段，克隆到雙元載體中。如實(shí)施例1中所述，在通過施用D-天冬氨酸、D-谷氨酸或D-膦絲菌素產(chǎn)生有條件不育性的情況下，優(yōu)選地，使用在位置213和/或238有突變的纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)D-氨基酸氧化酶變異體。
做為可替代技術(shù)方案，將任何上述D-氨基酸氧化酶編碼序列區(qū)克隆為適合的限制片段(例如，BamHI，Bg1/II，其中設(shè)計(jì)合成的編碼序列變異體以除去內(nèi)部限制位點(diǎn))，并通過以有義構(gòu)型插入到(例如)雙元載體pROK1(Baulcombe等，(1986)Nature，321，446-449)的BamH1位點(diǎn)，融合到CaMV 35S啟動(dòng)子和胭脂氨酸合酶終止子區(qū)。然后切除和用帶有TA29s啟動(dòng)子區(qū)片段(-810到+54)，來源于pAP30(Kriete等，(1996)The Plant Journal 9，809-818)的EcoR1-BamH1片段置換帶有35S啟動(dòng)子區(qū)的EcoR1-BamH1片段。根據(jù)所編碼的蛋白質(zhì)序列，命名由此得到的載體為pGKTA29_Q99042，pGKTA29_P80324，pGKTA29_Q9HGY3和pGKTA29_P24552等。
用載體通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化煙草植物材料，用前述實(shí)施例中所述相似的方法再生轉(zhuǎn)基因植物。產(chǎn)生的植物是自花能育的，但是其是有條件雄性不育的。以一定行距將T1代種子種植到土壤中。一旦小植株生長到足夠的大小，就通過PCR檢測(cè)它們的轉(zhuǎn)基因的存在。將PCR陽性植物轉(zhuǎn)移到溫室。在外源施用的除草劑前體不存在的情況下，這些植物是完全可育的。在各種生長階段，用各種量的D-膦絲菌素或D-丙氨酸或D-亮氨酸或D-甲硫氨酸或D-天冬酰胺或D-天冬氨酸或D-谷氨酸處理一小批這些推測(cè)地有條件不育的T1植物或者可替代的T0“事件”的小植株(轉(zhuǎn)化的直接再生體)。在處理T0代植物時(shí)，將它們營養(yǎng)克隆，這樣可以留出事件的未處理的同胞用于種子生產(chǎn)。然后，觀察到的可育性做為選擇適合的植物株系的基礎(chǔ)，該適合的植物株系顯示了最明顯的有條件不育性表型。例如，這些氨基酸是純D對(duì)映體，或者可替代地是DL外消旋物。例如，在花形成早期階段之前或期間，以通常0.25和20kg/ha之間的比率，做為葉面噴霧施用它們。通過進(jìn)一步施用做為噴霧薄霧的水可以重新溶解和重新調(diào)動(dòng)葉面施用后可能從葉片上溶液結(jié)晶出來的氨基酸，而用于葉片吸收。例如，還可以做為灌根施用氨基酸，并且可選地，還可以做為約50μl的10-200mM的溶液施用該氨基酸直接到新出現(xiàn)小花的芽中。
收集來源于處理植物的花粉，檢測(cè)生育力。獲得沒有散發(fā)花粉或者相對(duì)幾乎沒有花粉和/或花粉沒有活力的植物。檢測(cè)從一些處理的植物收集的花粉，發(fā)現(xiàn)其是畸形或不能生育的。然而，這種雄性不育植物保留了雌性可育，并且用從其它未處理的非轉(zhuǎn)基因或有條件雌性不育的煙草植物收集的花粉給其授粉時(shí)，其產(chǎn)生了(雜種)種子。對(duì)照植物是轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因兩種植物，并且除了處理溶液是水或等同濃度的純L-氨基酸外，在相同條件和相同的物理處理方案下生長該對(duì)照植物。
與實(shí)施例1類似，在該實(shí)施例的一個(gè)變化形式中，施用的氨基酸是外消旋DL膦絲菌素。在這種情況下，用于轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建體除了包含組織特異性雄性花啟動(dòng)子區(qū)諸如“TA29”可操作表達(dá)控制下的編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列外，還包含啟動(dòng)子區(qū)諸如來源于質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動(dòng)子區(qū)(在這里，該啟動(dòng)子區(qū)來源于豌豆(Pisumsativum)質(zhì)體藍(lán)素基因)可操作控制下的編碼膦絲菌素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因諸如‘PAT’基因的DNA序列。在適合的噴霧次數(shù)，和250g/ha至5kg/ha的DL膦絲菌素比率，沒有觀察到處理植物明顯的損害，但是使得該處理植物有條件雄性不育，又保留了正常或接近正常的雌性可育。
實(shí)施例3.
在雄性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)和編碼具有水解咪草酸甲酯或氟燕靈甲酯M(flamprop M methyl)或氟燕靈異丙酯M(flamprop M isopropyl)為它們各自羧酸能力的酶的嵌合基因通過PCR從氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)基因組DNA獲得或通過合成獲得編碼EMBL序列M94965中羧酸酯酶蛋白質(zhì)序列Q01470(Swissprot)的DNA序列。做為可替代的方案，通過PCR從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因組DNA獲得或合成獲得編碼EMBL序列BS06089中羧酸酯酶蛋白質(zhì)序列P37967(Swissprot)的DNA序列?；蛘撸ㄟ^RT-PCR從釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)mRNA獲得或合成獲得編碼EMBL序列Z34288中羧酸酯酶蛋白質(zhì)序列P40363(Swissprot)的DNA序列。設(shè)計(jì)側(cè)翼PCR引物或合成DNA序列以置放用于克隆的有用的單一限制位點(diǎn)。優(yōu)選地和在羧酸酯酶編碼序列不含有混淆的內(nèi)部位點(diǎn)的情況下，在5’末端置放Nc01或者Nde1位點(diǎn)以方便與添加到ORF 5’的序列的符合讀框融合物的克隆。做為可替代的方案，當(dāng)限制位點(diǎn)放置于ATG翻譯起始位點(diǎn)上游時(shí)，設(shè)計(jì)間插序列以符合植物翻譯的共有序列諸如根據(jù)Kozak的共有序列。
質(zhì)粒pGK73帶有從-810到+54的TA29s啟動(dòng)子區(qū)EcoR1-BamH1片段(Kriete等，(1996)，9，809-818)。在編碼羧酸酯酶Q01470或P37967的DNA序列上游位置，將該限制片段或相似的適合PCR產(chǎn)生的片段優(yōu)選做為符合讀框的融合物克隆到bluescript sk中。利用適合的一系列限制、連接和亞克隆步驟，根據(jù)編碼序列，將nos轉(zhuǎn)錄終止子添加到編碼區(qū)的3’以在Bluescript sk質(zhì)粒pBLTA_Q01470、pBLTA_P37967和pBLTA_P40363中產(chǎn)生TA29-羧酸酯酶-nos類型可替代的表達(dá)盒。
在進(jìn)一步實(shí)例中，使用USP 5470359的Seq ID No.1的花藥特異性SGB6啟動(dòng)子區(qū)。例如，進(jìn)一步亞克隆包含來源于pSGB6g1的3kb基因組EcoR1-Nhe1亞克隆片段的pSGBNE1(USP 5470359)，以放置在SmaI位點(diǎn)克隆到Bluescript sk中的1558bp ApaII/Xba1片段平端。如先前一樣，通過進(jìn)一步限制和克隆步驟，該片段以符合讀框方式融合在P37967，Q01470或P40363 DNA編碼序列上游。而且，向編碼區(qū)3’添加nos終止子以產(chǎn)生可替代的Bluescript sk質(zhì)粒pBLB6_Q01470，pBLB6_P37967和pBLB6_P40363，其含有可替代的SGB6-羧酸酯酶-nos表達(dá)盒。
在相似的一組實(shí)例中，相似地，在符合讀框的和編碼羧酸酯酶的DNA序列和nos3’終止子上游的位點(diǎn)融合來源于水稻的RA8花藥特異性啟動(dòng)子區(qū)(EMBL/genbank記錄號(hào)AF042275；Jean Js等，(1999)PMB，39，35-44)，以在一系列Bluescript sk載體，pBLRA8_Q01470，pBLRA8_P37967和pBLRA8_P40363中包含可替代的RA8-羧酸酯酶-nos表達(dá)盒。
實(shí)施例4.
在雌性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)和編碼具有氧化D-膦絲菌素和/或D-丙氨酸和/或D-亮氨酸和/或D-甲硫氨酸和/或D-天冬酰胺和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸能力的酶的嵌合基因如實(shí)施例1和2中所述獲得編碼D-氨基酸氧化酶蛋白質(zhì)序列的DNA序列。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在1998年2月27日，將基因組克隆pSH64保藏在NRRL，分配給其的保藏號(hào)是NRRL B-21920。檢測(cè)它為與穗絲特異性cDNA克隆B200i4-2(WO 98/39462)雜交的基因組克隆。如下所述，構(gòu)建優(yōu)先在雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的嵌合基因。如WO 98/39462中所述，構(gòu)建與pSH70相似的具有“空”表達(dá)盒子的bluescript ks來源的質(zhì)粒，-該“空”表達(dá)盒子包含，從5’到3’，由WO 98/39462的SEQ IDNo 11核苷酸1-3790組成的B200i 5’啟動(dòng)子區(qū)，BamH1位點(diǎn)和含有WO 98/39462的SEQ ID No 11核苷酸4427-6397的B200i3’非翻譯終止子區(qū)。利用部分BamH1消化，或者可替代地的方案，通過進(jìn)一步亞克隆，PCR和連接步驟，將可替代的D-氨基酸氧化酶編碼序列連接到BamH1位置或鄰接BamH1的位置，使得它們緊鄰B200i啟動(dòng)子區(qū)3’和B200i終止子區(qū)5’。因此，產(chǎn)生一系列編碼可替代的B200i-D-氨基酸氧化酶-B200i表達(dá)盒子的bluescript載體pBLB200_Q99042，pBLB200_P80324，pBLB200_Q9HGY3和pBLB200_P24552。
做為可替代的方案，如WO 98/39462中所述，從基因組克隆X2-1切除P19基因5’啟動(dòng)子區(qū)的Pst I/NcoI片段，該基因組克隆根據(jù)布達(dá)佩斯條約，在1998年2月27日保藏在NRRL，分配給其的保藏號(hào)是B-21919。在WO 98/39462的SEQ ID No 14核苷酸1088的Nco I位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于P19基因的ATG翻譯起始。利用適合的亞克隆、限制、連接和PCR步驟，連接該片段以形成與編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列的符合讀框的融合，并且向編碼序列的3’添加nos終止子序列。因此，產(chǎn)生一系列編碼可替代的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表達(dá)盒子的bluescript載體pBLP19_Q99042，pBLP19_P80324，pBLP19_Q9HGY3和pBLP19_P24552等。做為可替代的方案，利用相似的方法，獲得相似的質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有代替P19啟動(dòng)子區(qū)的P26基因5’啟動(dòng)子區(qū)(包含WO 98/39462的SEQ ID No 2核苷酸1-3987的所有或部分核苷酸)。如WO 98/39462中所述，亞克隆基因組P26-4克隆，pCIB10302，其根據(jù)布達(dá)佩斯條約，1997年1月21日保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)，保藏號(hào)是NRRL B-21655。因此，產(chǎn)生了一系列編碼可替代的P19-D-氨基酸氧化酶-nos表達(dá)盒子的bluescript載體pBLP26_Q99042，pBLP26_P80324，pBLP26_Q9HGY3和pBLP26_P24552。
實(shí)施例5.
在雄性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)和編碼具有氧化D-膦絲菌素和/或D-丙氨酸和/或D-亮氨酸和/或D-甲硫氨酸和/或D-天冬酰胺和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸能力的酶的嵌合基因如實(shí)施例1和2中所述獲得編碼D-氨基酸氧化酶蛋白質(zhì)序列的DNA序列。
質(zhì)粒pGK73帶有從-810到+54的TA29s啟動(dòng)子區(qū)EcoR1-BamH1片段(Kriete等，(1996)，9，809-818)。在編碼D氨基酸氧化酶的DNA序列上游位置，將該限制片段或相似的適合PCR產(chǎn)生的片段優(yōu)選做為符合讀框的融合物克隆到bluescript sk中。利用適合的一系列限制、連接和亞克隆步驟，根據(jù)編碼序列，將nos轉(zhuǎn)錄終止子添加到編碼區(qū)的3’以在Bluescript sk質(zhì)粒中產(chǎn)生TA29-D-氨基酸氧化酶-nos類型可替代的表達(dá)盒。
在進(jìn)一步實(shí)例中，使用USP 5470359的Seq ID No.1的花藥特異性SGB6啟動(dòng)子區(qū)。例如，進(jìn)一步亞克隆包含來源于pSGB6g1的3kb基因組EcoR1-Nhe1亞克隆片段的pSGBNE1(USP 5470359)，以放置在SmaI位點(diǎn)克隆到Bluescript sk中的1558bp ApaII/Xba1片段平端。如先前一樣，通過進(jìn)一步限制和克隆步驟，該片段以符合讀框方式融合在D-氨基酸氧化酶編碼序列上游。而且，向編碼區(qū)3’添加nos終止子以產(chǎn)生可替代的Bluescript sk質(zhì)粒，其含有可替代的SGB6-D-氨基酸氧化酶-nos表達(dá)盒。
在相似的一組實(shí)例中，相似地，在符合讀框的和編碼D-氨基酸氧化酶的DNA序列和nos3’終止子上游的位點(diǎn)融合來源于水稻的RA8花藥特異性啟動(dòng)子區(qū)(EMBL/genbank記錄號(hào)AF042275；Jean Js等，(1999)PMB，39，35-44)，以在一系列Bluescript sk載體中包含可替代的RA8-D-氨基酸氧化酶-nos表達(dá)盒。
實(shí)施例6.
用在本發(fā)明方法中的一對(duì)互補(bǔ)構(gòu)建體，提供了(a)依賴于DL膦絲菌素施用，有條件雄性不育的雌性自交親本系，和(b)依賴于DL膦絲菌素的施用，有條件雌性不育的互補(bǔ)雄性自交親本系適于提供依賴于DL膦絲菌素外源施用，有條件雄性不育的雌性自交親本谷類或水稻的第一個(gè)DNA構(gòu)建體包含三種基因A)，B)和C)。A)由來源于大麥質(zhì)體藍(lán)素基因(EMBLZ28347)的約1kb啟動(dòng)子區(qū)和適合的終止子區(qū)諸如來源于nos或35S基因的終止子區(qū)可操作控制下的編碼能N-乙?；疞-膦絲菌素的PAT酶的DNA序列組成，B)由與第一基因相似的PAT編碼序列組成但是這次該編碼序列受組織特異性雌性花啟動(dòng)子區(qū)(諸如實(shí)施例4中所述的P19或P26)和適合的終止子可操作控制，和C)由如實(shí)施例1，2，12和13中所述適合的DAMOX編碼序列組成，該編碼序列處在組織特異性雄性花啟動(dòng)子區(qū)(如實(shí)施例5中所述SGB6或RA8)和適合的終止子區(qū)可操作控制下，編碼例如在位置213有置換甲硫氨酸的精氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬酰胺或丙氨酸和/或在位置238有置換酪氨酸的組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或丙氨酸的突變體形式的纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶。利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和先前實(shí)施例中所教導(dǎo)的方法裝配該構(gòu)建體。
適于提供依賴于DL膦絲菌素外源施用，有條件雌性不育的雄性自交親本谷類或水稻的第二個(gè)DNA構(gòu)建體包含三種基因A)，D)和F)。A)由來源于大麥質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動(dòng)子區(qū)和適合的終止子區(qū)諸如來源于nos或35S基因的終止子可操作控制下的編碼能N-乙酰化L-膦絲菌素的PAT酶的DNA序列組成，D)由與第一基因相似的PAT編碼序列組成，但是這次該編碼序列受與構(gòu)建體1中所用相同的組織特異性雄性花啟動(dòng)子區(qū)(如實(shí)施例5中所述的SGB6或RA8)和適合的終止子可操作控制，和F)由如實(shí)施例1，2，12和13中所述適合的DAMOX基因組成，該基因處在與構(gòu)建體1中所用相同的組織特異性雌性花啟動(dòng)子區(qū)(如實(shí)施例4中所述的P19或P26)和適合的終止子區(qū)可操作控制下，例如編碼在位置213有置換甲硫氨酸的精氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬酰胺或丙氨酸和/或在位置238有置換酪氨酸的組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或丙氨酸的突變體形式的纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶。利用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和先前實(shí)施例中所教導(dǎo)的方法裝配該構(gòu)建體。
該實(shí)施例的一對(duì)DNA構(gòu)建體包含，例如下面的元件構(gòu)建體1A＝大麥質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)→PAT編碼區(qū)，Nos終止子；B＝P19啟動(dòng)子區(qū)→PAT編碼區(qū)，35S終止子；C＝RA8啟動(dòng)子區(qū)→紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶(M213R突變體)編碼序列，Nos終止子。
構(gòu)建體2A＝大麥質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)→PAT編碼區(qū)，Nos終止子；D＝RA8啟動(dòng)子區(qū)→PAT編碼區(qū)，35S終止子；C＝P19啟動(dòng)子區(qū)→紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶(M213R突變體)編碼序列，Nos終止子。
實(shí)施例7.用于小麥轉(zhuǎn)化的多核苷酸載體實(shí)施3、4、5和6描述了通?？寺〉絙luescript sk(例如，pBLRA8_Q01470，pBLRA8_P37967，pBLRA8_P40363，pBLB200_Q99042，pBLB200_P80324，pBLB200_Q9HGY3和pBLB200_P24552等)中的表達(dá)盒子中各種嵌合基因的構(gòu)建?？蛇x地，如WO 98/39462中所述，大量制備用于直接DNA轉(zhuǎn)化的這些載體，以與共轟擊選擇性標(biāo)記諸如pSOG35(DHFR/氨甲喋呤)或pUbi-Hyg(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶/潮霉素)一起使用。優(yōu)選地，大量制備后，利用適合的限制酶線性化該載體以除去bluescript的氨芐青霉素抗性基因。
可選地，除了使用共轟擊外，通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步基因工程改造所述bluescript載體，這樣它們還包含植物選擇性標(biāo)記基因諸如卡那霉素抗性、潮霉素抗性、氨甲喋呤抗性或草甘膦抗性基因，并且直接使用它們。在一些前述實(shí)施例中，PAT基因是載體設(shè)計(jì)必需的，在這些情況下，可選地，在轉(zhuǎn)化后的一些階段，DL膦絲菌素可以用于篩選。
做為可替代的技術(shù)方案，切除適合的限制片段內(nèi)的表達(dá)盒，并且克隆到pIGPD9來源的載體中(WO 00/66748的
圖12中所述)。該載體用于轉(zhuǎn)化的用途避免了抗生素標(biāo)記基因轉(zhuǎn)移到植物，這是因?yàn)樗诩?xì)菌中的維持依賴于營養(yǎng)缺陷型his B大腸桿菌(E.coli)突變體的互補(bǔ)。該載體含有表達(dá)IGPD(his B產(chǎn)物)的基因，并且進(jìn)一步基因工程改造該載體以包含植物選擇性標(biāo)記基因諸如，克隆到例如WO00/66748的pZEN16i和pZEN18i中XmaI位點(diǎn)的EPSPS基因。做為可替代技術(shù)方案，使用對(duì)甘露糖或木糖提供正選擇的標(biāo)記基因(USP5767378)。
在利用pIGPD9載體的特定實(shí)例中，構(gòu)建用于小麥轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。示例性例子是pZEN18_BLB200_Q99042和pZEN18_BLRA8_Q01470。這些是pIGPD9-來源的載體，其分別包含pZEN18 EPSPS基因(WO 00/66748)和，在這種情況下，B200i-(Q99042)D-氨基酸氧化酶-B200i或RA8-(Q01470)羧酸酯酶-nos表達(dá)盒。
利用Maxi-prep方法(Qiagen)，利用制造商提供的程序獲得用在植物轉(zhuǎn)化中的大規(guī)模DNA制備物。
實(shí)施例8.
用多核苷酸轉(zhuǎn)化/再生小麥，該多核苷酸包含在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)和編碼酶的嵌合基因，該酶具有氧化D-膦絲菌素和/或D-丙氨酸和/或D-亮氨酸和/或D-甲硫氨酸和/或D-天冬酰胺和/或D-天冬氨酸和/或D-谷氨酸的能力在一個(gè)實(shí)例中，將基因型UC703的未成熟胚(0.75-1.0mm長)放置在含有3mg/l 2，4-D和3％蔗糖的MS培養(yǎng)基上。約4h后，將胚放置到用濾紙支持的瓊脂糖片覆蓋的，含有15％麥芽糖，3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養(yǎng)基上，瓊脂糖含有相同成分。在轟擊前，使胚質(zhì)壁分離2-3h。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法，在微米大小的金顆粒上沉淀如實(shí)施例7中和前述實(shí)施例中所述制備的DNA。用DuPont生物彈擊氨裝置，利用1100psi的爆破壓力射擊每個(gè)靶有16個(gè)胚的4個(gè)靶平板2次。用載料臺(tái)和靶之間適當(dāng)位置的80目網(wǎng)篩，射擊平板。轟擊后，在25℃，將靶放置在黑暗中24小時(shí)，然后將具有胚的片平鋪到含有3％蔗糖和3mg/l 2，4-D的MS培養(yǎng)基平板上。48h后，從片上移除每個(gè)胚，并且將其直接放置在相同組成的新鮮培養(yǎng)基上?；蜻f送后約6周，將組織放置在具有3mg/l 2，4-D，3％蔗糖和0.2mg/l氨甲喋呤的MS培養(yǎng)基上3周。然后將組織放置在包含MS培養(yǎng)基的再生培養(yǎng)基上，該MS培養(yǎng)基包含1mg/l玉米素核苷和1mg/l氨甲喋呤。2周后，將再生的小植株放在具有一半濃度MS培養(yǎng)基的無菌容器中，該MS培養(yǎng)基含有2％蔗糖、1mg/l napthylacetic acid和4mg/l氨甲喋呤。
在該實(shí)施例特定的變化形式中，共轟擊包含在雄性生殖結(jié)構(gòu)中優(yōu)先表達(dá)的嵌合基因的載體和可替代的選擇性標(biāo)記基因。因此，例如，制備RA8啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下的質(zhì)粒DNA如pBLRA8_P24552，其與實(shí)施例3類似地制得(但是其表達(dá)D-氨基酸氧化酶而不是羧酸酯酶序列)，并且與pUbiHyg(編碼玉米聚泛素啟動(dòng)子可操作控制下潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒)一起包覆在金顆粒上。在這種情況下，除了轟擊后，再生培養(yǎng)基含有2和20mg/l之間增加濃度的潮霉素外，如上所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生。
在進(jìn)一步實(shí)施例中，用pZEN18 BLB200 Q99042轉(zhuǎn)化小麥，利用草甘膦篩選，如WO 00/66748的實(shí)施例15中所述進(jìn)行再生。
從來源于轉(zhuǎn)化的植物葉片組織提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)選擇性標(biāo)記基因和編碼D氨基酸氧化酶的基因的存在。繁殖PCR陽性植物。在開花期間，收集雌蕊和花藥，并且制備RNA。通過Northern分析證實(shí)DNA表達(dá)。此外，用pET載體在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)D-氨基酸氧化酶基因，并且部分純化。從SDS凝膠切下表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)條帶以產(chǎn)生多克隆抗體。通過Western分析，用這些抗體檢測(cè)花組織和其它組織中的表達(dá)。
實(shí)施例9.
有效地產(chǎn)生雜種谷類農(nóng)作物的方法，其中施用DL膦絲菌素用于雜草控制，同時(shí)用作化學(xué)雜交試劑，和其中由這樣產(chǎn)生的雜種種子獲得的植物F1雜種后代對(duì)DL膦絲菌素的施用基本上具有營養(yǎng)和生殖耐受性化學(xué)雜交試劑是昂貴的。期望利用相對(duì)便宜的物質(zhì)如商品除草劑做為化學(xué)雜交試劑。因?yàn)殡s草控制將和化學(xué)雜交聯(lián)合，所以這將獲得更進(jìn)一步的效率。然而，需要克服大量的問題，以實(shí)現(xiàn)這個(gè)建議。首先，需要建定對(duì)所述除草劑具有耐受性的雄性和雌性親本系。而且，為了獲得對(duì)除草劑施用應(yīng)答的期望的“有條件”可育性，需要改造兩個(gè)株系這樣對(duì)除草劑的耐受性不會(huì)延伸到所有組織，而是以組織特異性的方式表達(dá)，使得每個(gè)所需的花組織保留了選擇性敏感性。因此，在一個(gè)系(雌性親本系)中，必須使得植物的大部分加上雌性組織具有耐受性，而雄性花組織的一些重要部分必須保留對(duì)施用的敏感性，而在另一個(gè)(雄性親本系)中，所需要的正相反，僅形成雌性配子的組織一些重要部分保留了敏感性。假設(shè)可以達(dá)到上述目的，在雜種種子和F1代方面還要克服另外的問題。假設(shè)農(nóng)作物的這代將必需包含至少兩個(gè)賦予對(duì)除草劑抗性的基因，期望這種同樣的除草劑也可以用于農(nóng)作物的雜草控制。然而，設(shè)想允許F1代該同樣除草劑的這種應(yīng)用的除草劑、組織特異性啟動(dòng)子區(qū)和耐受性基因的聯(lián)合是非常困難的。很可能在將除草劑施用給F1代后，雜種植物將顯示營養(yǎng)耐受性，但是很少有或沒有谷粒產(chǎn)量。例如，對(duì)于除草劑草甘膦，通常的抗性機(jī)理是EPSP合酶抗性形式的表達(dá)。很難鑒定允許在所有組織中和除了在雄蕊或柱頭發(fā)育的重要階段外的所有時(shí)期R-EPSPS足夠表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)聯(lián)合。關(guān)于這個(gè)的最直接方法是利用反義或類似的方法，其中通過組織非特異性/組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)R-EPSPS的表達(dá)，并且由于反義EPSPS基因的表達(dá)，例如在雄蕊中僅局部和暫時(shí)地抑制該R-EPSPS的表達(dá)(參見，例如WO 9946396)。然而，在那種情況下，雄蕊(柱頭)中表達(dá)抑制將由顯性基因驅(qū)動(dòng)。對(duì)于任何這種機(jī)理，由于顯性雄性和雌性條件不育性基因的加和作用，給F1代施用除草劑將引起不育的沒有產(chǎn)量的農(nóng)作物，這點(diǎn)是清楚的。
本發(fā)明提供了克服該問題的方法，該方法可以使用便宜的商品除草劑DL膦絲菌素既用作雜草控制，還用作雜種谷類產(chǎn)生中的雜交試劑，該方法還提供了由此得到的雜種谷類或水稻，其中DL膦絲菌素(或L膦絲菌素)可以安全地用于雜草控制而不會(huì)有明顯的產(chǎn)量損失。做為另一個(gè)益處，更容易管理在隨后農(nóng)作物中后來可能因自生自長出現(xiàn)的F1代自交種子，因?yàn)槿绻每刂屏康腄L膦絲菌素噴霧，一般地它們本身將是不育的。對(duì)于從F1植物到雜草(例如紅米)或其它谷類的異型雜交的花粉后代也具有相同的益處。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化商品除草劑形式DL膦絲菌素的非毒害植物的成分，D-膦絲菌素為活性L形式的基因和酶。已經(jīng)知道了轉(zhuǎn)化L-膦絲菌素為N-乙酰L膦絲菌素的PAT基因，并且商業(yè)上利用它提供農(nóng)作物中對(duì)DL膦絲菌素的耐受性。與本發(fā)明密切相關(guān)的另一個(gè)重要的觀察結(jié)果是，意外地，發(fā)現(xiàn)含有處于大麥質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下的PAT基因的小麥基本上對(duì)以至少2kg/ha以上比率施用的DL膦絲菌素具有生殖耐受性。因此，用于提供給本實(shí)施例植物的實(shí)施例6中所述構(gòu)建體的重要特征是提供抗性性狀的PAT基因在啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下表達(dá)，該啟動(dòng)子區(qū)提供了基本上僅在綠色組織中的表達(dá)。這種有用的啟動(dòng)子區(qū)特征是它應(yīng)該這樣表達(dá)PAT基因，以使得它充分地保護(hù)所有的非綠色花組織不受葉面施用DL膦絲菌素的影響，而同時(shí)，在花組織本身僅僅提供最低水平的PAT表達(dá)，并且在有條件不育性靶向的那些部分中具有特別低的PAT表達(dá)。用大麥質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子區(qū)可操作控制下表達(dá)的PAT，看起來滿足了這種條件，因?yàn)榛旧辖財(cái)嗔怂袊婌F的通過葉片進(jìn)入的L-膦絲菌素，并且在它轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)育中的花組織前，將其轉(zhuǎn)化為非毒害植物的N-乙酰-L-膦絲菌素。因此，在本發(fā)明中，通過D氨基酸氧化酶，僅從韌皮部可移動(dòng)的非毒害植物的D-膦絲菌素暫時(shí)和局部地產(chǎn)生L膦絲菌素，該L膦絲菌素在親本系中引起了組織選擇性不育性作用。通過在互補(bǔ)對(duì)構(gòu)建體(實(shí)施例6)中，精確匹配驅(qū)動(dòng)PAT表達(dá)的花控制元件和驅(qū)動(dòng)D-氨基酸氧化酶表達(dá)的元件，確保在F1雜種中，靶花組織中L-膦絲菌素的短暫出現(xiàn)很快地被同時(shí)和相同局部組織中相應(yīng)的PAT表達(dá)出現(xiàn)所中和。因此，除草劑的施用在雜種中沒有誘導(dǎo)不育性。然而，在以后的世代中，雜種的花相應(yīng)的PAT和D-氨基酸氧化酶將分離，因此，一旦施用控制量的DL膦絲菌素，由此得到的植物將再一次是雄性或雌性不育的。
利用實(shí)施例7和8中所述的方法，將實(shí)施例6中所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到小麥中或(利用標(biāo)準(zhǔn)超級(jí)雙元載體(superbinary vector)方法)，將其轉(zhuǎn)化到水稻中，篩選和再生為小植株。篩選T0轉(zhuǎn)化事件(利用分蘗的無性繁殖維持未處理的株系)，并且做為可替代方案，利用基本如實(shí)施例1和2中所述的方法篩選適合的轉(zhuǎn)化事件用于培育做為依賴于DL膦絲菌素的施用，有條件雌性不育的雄性近交親本系或依賴于DL膦絲菌素的施用，有條件雄性不育的雌性近交系。最好的株系顯示了最好的除草劑耐受性、最小的產(chǎn)量損失，最純的有條件不育性表型等。選擇可替代的雄性和雌性親本系，并且可選地，回交至適合的原種系用于產(chǎn)生大量的后代。充分地表征這些最終選定事件中的基因插入，以及有條件可育，除草劑抗性性狀和所表達(dá)的基因產(chǎn)物特性遺傳的遺傳學(xué)。
然后，在田地中，以適合的比率，一起間作選定的雌性和雄性親本系，并且用DL膦絲菌素，以選定用于優(yōu)化雜種種子產(chǎn)量的0.05到5kg/ha之間的適合比率和不超過早期開花期的時(shí)間安排，進(jìn)行噴霧。由此產(chǎn)生的種子具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即它們將產(chǎn)生不僅從雜種優(yōu)勢(shì)獲益，同時(shí)還具有對(duì)包含DL膦絲菌素的除草劑制劑具有耐受性的植物，因此該除草劑制劑可以用于雜草控制。雜種種子也有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即它們表達(dá)的除草劑耐受性性狀僅不完整地傳遞給將來的自交代和運(yùn)交至相關(guān)的雜草。因此，例如，可以利用DL膦絲菌素做為雜草控制試劑生長本發(fā)明產(chǎn)生的雜種水稻，而沒有明顯的產(chǎn)量損失。然而，做為來源于雜種水稻花粉與紅米雌性親本遠(yuǎn)交的后代出現(xiàn)的紅米植物將來的世代將具有對(duì)用DL膦絲菌素處理的營養(yǎng)耐受性，但是具有減少的自稔性(由于花組織中D-氨基酸氧化酶的表達(dá))和因此幾乎不產(chǎn)生谷粒。因此，利用本發(fā)明的雜種水稻，DL膦絲菌素可以用于雜草控制，同時(shí)大大降低將來做為除草劑抗性性狀遠(yuǎn)交至親密相關(guān)紅米結(jié)果的紅米谷粒污染風(fēng)險(xiǎn)。相似地，來源于雜種農(nóng)作物的第二代水稻或小麥自生作物在用DL膦絲菌素噴霧后，大部分將不產(chǎn)生谷粒。
實(shí)施例10.
用包含嵌合基因的多核苷酸進(jìn)行的玉米的轉(zhuǎn)化/再生，該嵌合基因在雄性生殖組織中優(yōu)先表達(dá)并且編碼具有水解咪草酸甲酯或氟燕靈甲酯(famprop methyl)或氟燕靈異丙酯(flamprop methyl)為它們各自的酸能力的酶如上所述，將RA8-羧酸酯酶-nos表達(dá)盒子克隆到一系列bluescript sk載體，pBLRA8_Q01470，pBLRA8_P37967和pBLRA8_P40363中?？蛇x地，與包含選擇性標(biāo)記如pUbiHyg或pSOG35的DNA一起共轟擊它們，按例如在WO 98/39462的實(shí)施例11中所述，用潮霉素或氨甲喋呤篩選和再生。
做為可替代的方案，在碳化硅須晶上，將pZEN18_BLRA8_Q01470直接轟擊或轉(zhuǎn)移到玉米細(xì)胞中，例如，如WO 00/66748的實(shí)施例12和13中所述，在草甘膦上篩選和再生玉米植物。
做為可替代的方案，利用含有超級(jí)雙元載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進(jìn)行玉米的轉(zhuǎn)化。例如，從pZEN18BLRA8_Q01470切除pZEN18表達(dá)盒子和BLRA8_Q01470嵌合基因，通過與WO 00/66748中所述相似的一系列步驟中一系列的亞克隆和同源重組，將它們克隆到pSB 1-來源的超級(jí)雙元載體的右和左T-DNA邊界之間的位置。用含有超級(jí)載體的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)感染來源于未成熟胚的植物材料，該超級(jí)雙元載體含有草甘膦標(biāo)記基因和本發(fā)明嵌合基因。如WO 00/66748中所述，利用草甘膦篩選和再生植物。
從來源于轉(zhuǎn)化的植物葉片組織提取DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)選擇性標(biāo)記基因和編碼羧酸酯酶的基因的存在。繁殖PCR陽性植物。在開花期間，收集雌蕊和花藥，并且制備RNA。通過Northern分析證實(shí)DNA表達(dá)。此外，用pET載體在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)羧酸酯酶基因，并且部分純化。從SDS凝膠切下表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)條帶以產(chǎn)生多克隆抗體。通過Western分析，用這些抗體檢測(cè)花組織和其它組織中的表達(dá)。
實(shí)施例11.
將玉米細(xì)胞轉(zhuǎn)化為對(duì)S-吡氟禾草靈酸(S-fluazifop acid)的生長抑制顯示了增加的敏感性的表型通過RT-PCR或合成獲得編碼GENESEQP Derwent數(shù)據(jù)庫中2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶蛋白質(zhì)序列AAR49827的DNA序列，或者分別包含在GENESEQN Derwent數(shù)據(jù)庫記錄號(hào)AAQ44447或EMBL記錄號(hào)RN2ARYLCO的DNA序列中的P70473(Swissprot)，以優(yōu)化植物組織中的表達(dá)。
設(shè)計(jì)側(cè)翼PCR引物或合成DNA序列以放置用于克隆的有用的單一限制位點(diǎn)。優(yōu)選地和在差向異構(gòu)酶編碼序列不含有混淆的內(nèi)部位點(diǎn)的情況下，在5’末端置放Nco1和Nde1位點(diǎn)以方便與添加到ORF 5’的序列的符合讀框融合物的克隆。做為可替代的方案，當(dāng)將限制位點(diǎn)放置于ATG翻譯起始位點(diǎn)的上游時(shí)，設(shè)計(jì)間插序列以符合植物翻譯的共有序列諸如根據(jù)Kozak的共有序列。
通過RT-PCR或合成獲得EMBL記錄號(hào)J05439或X77783 DNA序列中的編碼“長鏈”?；鵆oA合成酶蛋白質(zhì)序列P18163或P39518(Swissprot)的DNA序列。設(shè)計(jì)側(cè)翼PCR引物或合成DNA序列以置放用于克隆的有用的單一限制位點(diǎn)。優(yōu)選地和在差向異構(gòu)酶編碼序列不含有混淆的內(nèi)部位點(diǎn)的情況下，在5’末端置放Nco1和Nde1位點(diǎn)以方便與添加到ORF 5’的序列的符合讀框融合物的克隆。做為可替代的方案，如果限制位點(diǎn)放置于ATG翻譯起始位點(diǎn)的上游，可設(shè)計(jì)間插序列以符合植物翻譯的共有序列諸如根據(jù)Kozak的那些。
與實(shí)施例1和2類似，最初將上述編碼序列克隆到pUC19或bluescript sk。然后，用適合的限制酶，優(yōu)選地利用編碼序列5’末端的Nco 1位點(diǎn)，切除編碼序列，克隆到pMJB1中以產(chǎn)生可替代的符合讀框融合的表達(dá)盒子，在5’到3’方向包含CaMV35S啟動(dòng)子，TMV翻譯增強(qiáng)子，酰基CoA合成酶或差向異構(gòu)酶編碼序列-nos終止子。pMJB1是pUC19-來源的質(zhì)粒，其包含可操作的雙增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子；TMVΩ增強(qiáng)子和nos終止子序列。在WO 98/20144的圖2中描述了pMJB1的示意圖。
用這種方法產(chǎn)生了一系列pMJB1衍生物，pMJ35S_AAR49827等和pMJ35S_P18163等，其分別含有可替代的差向異構(gòu)酶和酰基CoA合成酶表達(dá)盒子。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可選地，可以進(jìn)一步將它們克隆至包含植物選擇性標(biāo)記基因的載體如pUbiHyg。
做為可替代的方案，根據(jù)圖3A和圖3B的示意設(shè)計(jì)，構(gòu)建兩個(gè)構(gòu)建體，其中一個(gè)用于“長鏈”?；鵆oA合成酶的表達(dá)，另一個(gè)用于2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶的表達(dá)。在3A中，DNA構(gòu)建體在5’到3’方向含有玉米多泛素啟動(dòng)子區(qū)(EMBLZM29159)，編碼酰基-CoA合成酶的DNA序列(EMBLJ05439)，nos終止子序列，CAM 35S啟動(dòng)子區(qū)，編碼含有玉米ADH內(nèi)含子的5’非翻譯前導(dǎo)序列的區(qū)域，編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的DNA序列和nos終止子。照例，將該整個(gè)DNA構(gòu)建體克隆到載體(例如，pUC衍生物)的適合位點(diǎn)，該載體含有大腸桿菌(E.coli)復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因。構(gòu)建體3B除了編碼?；?CoA合成酶的DNA序列被編碼2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶(EMBLY08172)的DNA序列置換外，與構(gòu)建體3A相同。
利用晶須，將這些載體單獨(dú)或聯(lián)合地轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞培養(yǎng)物中。例如，通過利用基本如Frame等，(1994)，Plant J.，6，941-948所述的方法，通過將細(xì)胞與DNA包覆的碳化硅晶須接觸轉(zhuǎn)化BMS細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。根據(jù)在含有一系列濃度的篩選試劑的培養(yǎng)基中差異生長篩選這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化愈傷組織，所述篩選試劑根據(jù)用于轉(zhuǎn)化的DNA可以是，例如草甘膦、潮霉素、L-膦絲菌素或卡那霉素。在圖3A和3B中所描述的構(gòu)建體的情況下，在DL膦絲菌素或其衍生物上進(jìn)行篩選。選定穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的株系做為愈傷組織，在篩選試劑中繁殖和繼續(xù)生長。
例如，利用碳化硅晶須轉(zhuǎn)化后，在補(bǔ)加1mg/L雙丙氨酰膦的MS培養(yǎng)基上生長BMS細(xì)胞。2周后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加5mg/L雙丙氨酰膦的MS培養(yǎng)基上，它們?cè)谠撆囵B(yǎng)基上生長6-8周。形成的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加2mg/L雙丙氨酰膦的MS培養(yǎng)基上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體MS培養(yǎng)基中，生長2周。這個(gè)時(shí)期以后，沉淀細(xì)胞和以1∶10的培養(yǎng)基稀釋物重懸浮細(xì)胞。然后，將它們平均分配到6孔測(cè)定板中，暴露于2.5ppm和10ppm的R或S吡氟禾草靈。在R或S吡氟禾草靈存在的情況下4天后，從孔中除去0.1ml固定體積的細(xì)胞，用新鮮的液體MS培養(yǎng)基沖洗，鋪平板到固體MS培養(yǎng)基上。7天后，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力生長和分化的能力。
比較轉(zhuǎn)化株系和非轉(zhuǎn)化株系對(duì)S-吡氟禾草靈，S-吡氟禾草靈丁酯(fluazifop butyl)或類似的S-芳氧基苯氧丙酸類和衍生物的敏感性。篩選優(yōu)選用在本發(fā)明方法中的編碼酶的DNA編碼序列為這樣的序列，即當(dāng)在BMS細(xì)胞中表達(dá)這些序列時(shí)，它們編碼酶或酶的聯(lián)合，將轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞的表型從僅對(duì)相對(duì)高濃度S吡氟禾草靈或S-吡氟禾草靈丁酯的生長抑制具有敏感性轉(zhuǎn)化為對(duì)低得多(至少2-3倍)濃度的S吡氟禾草靈或S-吡氟禾草靈丁酯的生長抑制具有敏感性。
然后如其它實(shí)施例中所述利用這種選定的DNA編碼序列以產(chǎn)生依賴于外源S-吡氟禾草靈或S-吡氟禾草靈酯的施用，雄性或雌性不育的小麥植物株系。
實(shí)施例12定點(diǎn)誘變以產(chǎn)生編碼氧化D-膦絲菌素的D-氨基酸氧化酶的基因本實(shí)施例涉及產(chǎn)生編碼纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)D-氨基酸氧化酶變異體的基因，該D-氨基酸氧化酶變異體具有改進(jìn)的氧化D-膦絲菌素的能力。這些基因用在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，在其它實(shí)施例中描述這些實(shí)施方式，其中一旦施用D-膦絲菌素就產(chǎn)生有條件的不育性。在本實(shí)施例中，這些基因編碼在位置“213”和/或在位置“238”具有單個(gè)氨基酸改變的酶。在天然蛋白質(zhì)序列基序RCTMDSS中，將“213”位置的甲硫氨酸標(biāo)識(shí)為M。在天然蛋白質(zhì)序列基序GGTYGVG中位置238的酪氨酸被標(biāo)識(shí)為“Y”。本領(lǐng)域已知許多方法可以提供編碼一系列D-氨基酸氧化酶變異體的一系列基因，這些D-氨基酸氧化酶變異體在這些位置的一個(gè)或兩個(gè)位置具有氨基酸改變。根據(jù)用途選擇用于誘變的DNA模板。因此，例如，如果突變基因的期望用途是用于植物中的表達(dá)，那么編碼纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)D-氨基酸氧化酶的合成DNA諸如SEQ ID#7是適合的起始點(diǎn)。另一方面，當(dāng)突變基因期望的直接用途是用作酵母篩選系統(tǒng)中進(jìn)一步誘變和改進(jìn)循環(huán)的起始點(diǎn)時(shí)(如實(shí)施例13中所述)，那么天然DNA序列(可選地，被改進(jìn)用于在釀酒酵母(S.cerevisiae)中的表達(dá))更適合。
提供纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)D-氨基酸氧化酶的適合突變體的優(yōu)選方法是利用Strategenes Quickchange誘變?cè)噭┖泻秃啿⒐押塑账?。所用的方法按照制造商的說明書進(jìn)行。
例如，(在編碼D-氨基酸氧化酶的天然纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)DNA序列是誘變的DNA模板的情況下)，適合地，成對(duì)的“上部”(RGMUTTOP)和“下部”(RGMUTBOT)簡并寡核苷酸具有50-250個(gè)核苷酸的長度，經(jīng)設(shè)計(jì)它們包含如下的序列區(qū)RGMUTTOP中包含的序列(SEQ ID #8)tccccatgcaagcgatgcacgNNNgactcgtccgaccccgcttctcccgcctacatcattccccgaccaggtggcgaagtcatctgcggcgggacgNNNggcgtgggagactgggacttgRGMUTBOT中包含的序列(SEQ ID#9)caagtcccagtctcccacgccNNNcgtcccgccgcagatgacttcgccacctggtcggggaatgatgtaggcgggagaagcggggtcggacgagtcNNNcgtgcatcgcttgcatgggga此外，這兩個(gè)寡核苷酸，RGMUTTOP和RGMUTBOT的每個(gè)末端包含有這樣一種序列，即一旦兩個(gè)寡核苷酸相互退火，所述序列將組成5’和3’末端，該末端將精確地匹配當(dāng)在一對(duì)適宜的單一限制位點(diǎn)切割模板DNA時(shí)產(chǎn)生的末端(即，這樣設(shè)計(jì)使得退火的寡核苷酸可以置換從D-氨基酸氧化酶編碼模板DNA切下的單一限制片段)。
將0.5到1.0μg每種寡核苷酸轉(zhuǎn)移到0.5ml Eppendorf離心管中，在適合的溫度下加熱(例如，94℃，根據(jù)計(jì)算的熔點(diǎn))5分鐘，通過冷卻到室溫慢慢地退火。然后用兩個(gè)限制酶(根據(jù)模板DNA中兩個(gè)單一限制位點(diǎn)，這兩個(gè)單一限制位點(diǎn)橫跨包含兩個(gè)將要被置換的密碼子的區(qū)，并且以退火DNA的末端為特征)切割模板DNA(例如，pYES6/CT酵母穿梭載體)，凝膠純化，與退火的寡核苷酸連接，按例如實(shí)施例13中所述，轉(zhuǎn)化到酵母中，由此，在酵母中表達(dá)通過誘變產(chǎn)生的替代D-氨基酸氧化酶。然后，如所述，選擇在作為唯一氮源的D膦絲菌素類似物(如，D-高半胱磺酸(D-homo-cysteic acid))上或D-膦絲菌素上(當(dāng)共表達(dá)PAT基因時(shí))產(chǎn)生最好生長的酵母克隆做為包含具有期望特性的變異體D-氨基酸氧化酶編碼序列的酵母克隆。做為可替代方案，在一些非酵母的微生物中，例如，在大腸桿菌(E.coli)溶原菌中，pET載體t7啟動(dòng)子表達(dá)控制下進(jìn)行D-氨基酸氧化酶表達(dá)。在這種情況，轉(zhuǎn)化后，利用本領(lǐng)域已知的方法(例如，用于過氧化物產(chǎn)生的熒光測(cè)定篩選法或用于氨產(chǎn)生的比色測(cè)定法)，可以挑選單菌落，涂平板復(fù)制，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂解和篩選相對(duì)于D膦絲菌素的期望底物活性。然后，培育這樣選定的酵母或其它微生物克隆，制備DNA，通過校正PCR克隆全長D-氨基酸氧化酶DNA序列，利用InvitrogensZero Blunt TOPO試劑盒克隆到pCRBlunt II中。檢測(cè)表征選定克隆的D-氨基酸氧化酶編碼序列。進(jìn)一步亞克隆這些D-氨基酸氧化酶編碼序列用于在pET載體(例如，Novagen pET 24a)中表達(dá)，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)BL21 DE3中。在發(fā)酵罐中，在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培養(yǎng)基上生長細(xì)胞，之后IPTG誘導(dǎo)，收獲細(xì)胞、破碎并部分純化提取物和測(cè)定D-氨基酸氧化酶活性(如下文所述)。選擇編碼D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因，在pH7.0，該酶的每mg純蛋白質(zhì)對(duì)D-膦絲菌素產(chǎn)生可接受的穩(wěn)定性和最高活性(Kcat/Km)。
此外，產(chǎn)生一系列編碼特定靶向的D-氨基酸氧化酶的特定DNA序列。具體地，編碼纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)D氨基酸氧化酶的基因，在位置213具有置換甲硫氨酸的精氨酸、絲氨酸，半胱氨酸、賴氨酸、天冬酰胺或丙氨酸，和/或在位置238具有置換酪氨酸的組氨酸、絲氨酸、半胱氨酸，天冬酰胺或丙氨酸。所用方法與上述方法相同，只是不使用寡核苷酸混合物，而是設(shè)計(jì)單獨(dú)的寡核苷酸對(duì)，并且用于實(shí)現(xiàn)每一單或雙氨基酸的改變。克隆每個(gè)由此得到的D-氨基酸氧化酶編碼序列用于在Novagen pET 24A中T7啟動(dòng)子后(未加標(biāo)簽的)表達(dá)，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)BL21 DE3中。在1.0L發(fā)酵罐中，在含有100μg/ml卡那霉素的LCM50培養(yǎng)基中生長細(xì)胞，用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過低速離心收獲細(xì)胞。
LCM50培養(yǎng)基含有(1L中)KH2PO4(3g)，Na2HPO4(6g)，NaCl(0.5g)，酪蛋白水解產(chǎn)物(Oxoid)(2g)，(NH4)2SO4(10g)，酵母提取物(Difco)(10g)，甘油(35g)(將這些組分配制成溶液并高壓滅菌)。下面的另外組分做為溶液無菌過濾，并且添加到培養(yǎng)基中MgSO4(246.5mg/ml溶液2.5ml)，硫胺素。HCl(8mg/ml溶液lml)，CaCl2·2H2O(147g/l的溶液，0.2ml)，*FeSO4·7H2O/檸檬酸母液(2ml)，**痕量元素溶液(5ml)，配制成1L。
*每100ml FeSO4·7H2O/檸檬酸母液由FeSO4·7H2O(0.415mg)，檸檬酸(0.202mg)組成。
**每1ml痕量元素溶液組合物是AlCl3·6H2O(20mg)，CoCl2·6H2O(8mg)，KCo(SO4)2·12H2O(2mg)，CuCl2·H2O(2mg)，H3BO3(1mg)，KI(20mg)，MnSO4·H2O(0.8mg)，Na2MoO4·2H2O(4mg)，ZnSO4·7H20(4mg)。
在水中洗約7g濕重的細(xì)胞。在pH7.0，在等體積含有2mM EDTA，2mM DTT和0.01mM FAD的50mM/Mops/KOH緩沖液中重懸浮細(xì)胞。利用玻璃勻漿器均勻地懸浮細(xì)胞，然后在13500psi，利用ConstantSystems(BudBrooke Rd，Warwick U.K.)Basic Z細(xì)胞破裂器中以一個(gè)射擊頭破裂細(xì)胞。在30,000重力，保持冷卻(～4℃)離心粗提取物1h，并且棄去沉淀。一些提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS PAGE凝膠電泳，用考馬斯藍(lán)染色，通過與相似制備的僅含有“空”pET載體的細(xì)胞提取物并排比較，估計(jì)提取物中2-50％的總的可溶蛋白質(zhì)是D-氨基酸氧化酶。將一些提取蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換到pH7.0含有0.01mM FAD的50mM/Mops/KOH緩沖液中。在標(biāo)準(zhǔn)氧電極室中(在25℃，在0和飽和濃度的氧之間校正)，用相同的緩沖液進(jìn)行稀釋?？蛇x地，利用離子交換、苯基瓊脂糖凝膠、分級(jí)硫酸胺沉淀和凝膠過濾進(jìn)一步純化D-氨基酸氧化酶。在25℃，通過向稀釋的酶添加200mM DL膦絲菌素銨鹽溶液開始測(cè)定。氧電極室中最終反應(yīng)體積是2ml。(扣除基線中的任何偏差后)測(cè)定氧消耗率。M213R(精氨酸置換甲硫氨酸)突變體形式的纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)D氨基酸氧化酶以約14nmol/min/mg蛋白質(zhì)粗提取物的速率氧化DL膦絲菌素(提取物中估算的D-氨基酸氧化酶純度是總蛋白質(zhì)的35％+/-15％)。M213S(絲氨酸置換甲硫氨酸)突變體形式的纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)D氨基酸氧化酶以約4nmol/min/mg蛋白質(zhì)粗提取物的速率氧化DL膦絲菌素(提取物中估算的D-氨基酸氧化酶純度是總蛋白質(zhì)的35％+/-15％)。在對(duì)照試驗(yàn)中，根本沒有氧化純的L形式，并且根據(jù)濃度，以達(dá)到DL氧化速率2倍的速率氧化純的D形式。在相似的條件下，天然(未突變的)纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)D氨基酸氧化酶沒有顯示氧化DL或D-膦絲菌素的顯著能力(＜0.4nmol/min/mg)。
實(shí)施例13.
突變和篩選以產(chǎn)生編碼對(duì)D-膦絲菌素氧化具有改進(jìn)的特異性(Kcat/Km)的酶的D-氨基酸氧化酶基因?qū)⑻烊坏睦w細(xì)紅酵母(Rhodotorula gracillis)D-氨基酸氧化酶編碼序列克隆到Invitrogen的pYES6/CT穿梭載體中，做為GAL1啟動(dòng)子下游的HindIII/PmeI片段。相似地，將天然的紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶編碼序列克隆到pAUR123蛋白質(zhì)表達(dá)穿梭載體(Panvera)中做為ADHI組成型啟動(dòng)子下游的XbaI片段。在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行這些載體的構(gòu)建，接著轉(zhuǎn)化到S288C釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。當(dāng)適合的時(shí)候，用PAT基因分別置換pYES6/CT/pAUR123載體上的殺稻瘟素或aureobasidin抗生素抗性基因，用DL膦絲菌素而不是抗生素維持篩選。此外，克隆編碼M213R或M213S基因或M213S，Y238S突變體形式的紅酵母屬(Rhodotorula)D-氨基酸氧化酶的序列置換野生型編碼序列。
利用各種誘變方法產(chǎn)生其它D-氨基酸氧化酶的突變體形式。例如，通過Mn2+-毒害的PCR產(chǎn)生D-氨基酸氧化酶編碼序列的多種變異體，在兩個(gè)穿梭載體的GAL1或ADH1啟動(dòng)子前克隆此混合群體，轉(zhuǎn)化到酵母中，并根據(jù)新序列賦予酵母在D-高半胱磺酸(做為唯一氮源)上生長的能力進(jìn)行篩選。作為替代方案，對(duì)轉(zhuǎn)化的酵母直接進(jìn)行突變和篩選。例如，在含有10-50mM D-高半胱磺酸或(在表達(dá)PAT基因的情況下)20-100mM DL膦絲菌素的氮限制培養(yǎng)基中，在化學(xué)誘變劑如EMS存在的情況下，在發(fā)酵罐中生長用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的酵母，并誘導(dǎo)D-氨基酸氧化酶表達(dá)(如培養(yǎng)在作為碳源的半乳糖上)。連續(xù)傳代培養(yǎng)后，鑒定生長在D-高半胱磺酸或膦絲菌素(做為唯一氮源)上的傳代培養(yǎng)物，涂平板并亞克隆D-氨基酸氧化酶序列，測(cè)序，在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)用于進(jìn)一步鑒定。
在另一優(yōu)選的方法中，通過擴(kuò)增和傳代大腸桿菌(E.coli)株系XL1-紅，對(duì)兩個(gè)穿梭載體進(jìn)行誘變。該株系缺陷3個(gè)主要的DNA修復(fù)途徑，mut S，mut D和mut T。這在DNA復(fù)制期間導(dǎo)致約5000倍突變率的增加。所用方法根據(jù)Stratagene實(shí)施。例如，將10ng的穿梭載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)株系XL1-紅中，生長細(xì)胞，然后在含有氨芐青霉素的L-Broth瓊脂上涂平板24小時(shí)。從每個(gè)平板，通過從平板刮擦菌落到L肉湯中合并大于200個(gè)轉(zhuǎn)化體的菌落，然后在37℃，在L-肉湯/氨芐青霉素中以1比100和1比1000的稀釋度生長和連續(xù)傳代1-2周，以確保大量的細(xì)胞分裂。從大量的平板開始實(shí)施相似的方法。從過夜生長的細(xì)胞制備小量制備的穿梭載體DNA，轉(zhuǎn)化回到酵母中。如上所述，生長轉(zhuǎn)化的酵母和篩選含有改進(jìn)的D-氨基酸氧化酶的菌落。
做為可替代方案，在一些微生物但不是酵母中，例如，在大腸桿菌(E.coli)溶原菌中，pET載體t7啟動(dòng)子表達(dá)控制下進(jìn)行D-氨基酸氧化酶的表達(dá)篩選。在這種情況下，將D-氨基酸氧化酶編碼序列(可選地，通過Mn2+-有毒PCR誘變)克隆到pET載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)株系XL1-紅中，并且在傳代數(shù)個(gè)世代后，轉(zhuǎn)化回大腸桿菌(E.coli)溶原菌如BL212 DE3中。然后可以利用本領(lǐng)域已知的方法(例如，用于過氧化物產(chǎn)生的熒光測(cè)定篩選法或用于氨產(chǎn)生的比色測(cè)定法)，挑選每個(gè)菌落，涂平板復(fù)制、生長、用IPTG誘導(dǎo)，裂解和篩選對(duì)D膦絲菌素期望的底物活性。
做為可替代的方案，直接在纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)中進(jìn)行改進(jìn)的D-氨基酸氧化酶編碼序列的誘變和篩選。在用D-丙氨酸或D-谷氨酸做為唯一氮源的基本培養(yǎng)基中生長纖細(xì)紅酵母(R.gracilis)，用EMS進(jìn)行連續(xù)循環(huán)的誘變，通過傳代培養(yǎng)到漸增嚴(yán)格性的培養(yǎng)基中實(shí)施篩選，其中，唯一氮源從D-谷氨酸向D-高半胱磺酸轉(zhuǎn)移。在該實(shí)施例的變化形式中，利用上述一個(gè)酵母載體轉(zhuǎn)化纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)，使它表達(dá)PAT(當(dāng)在半乳糖上生長時(shí)或組成型地)，并且針對(duì)DL膦絲菌素或D膦絲菌素做為唯一氮源進(jìn)行最后階段的嚴(yán)格篩選。
可選地，用于酵母篩選的培養(yǎng)基包含低濃度的溶劑(例如，0.1％DMSO)。
實(shí)施例14.
對(duì)映體純形式的D-膦絲菌素的產(chǎn)生用Novagen pET 24A轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21 DE3 codon plusRIL，該Novagen pET 24A具有克隆在T7啟動(dòng)子后用于(未加標(biāo)簽)表達(dá)的PAT編碼序列(A02774)。在含有卡那霉素的LCM50培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中生長這些細(xì)胞達(dá)到約40OD600nm的密度，用0.2mM IPTG誘導(dǎo)，通過低速離心收集，快速轉(zhuǎn)移到含有9.91g D/L膦絲菌素(PPT)銨鹽的基本培養(yǎng)基中。
基本培養(yǎng)基(1L中)是在水中溶解Na2HPO4(6g)，KH2PO4(3g)，NaCl(1g)，NH4Cl(1g)，高壓滅菌，加入無菌過濾后的下面的溶液CaCl2(14.7g/l，1ml)，MgSO4(246.5g/l，1ml)，硫胺素.HCl(1mg/ml，5ml)，葡萄糖(30ml 20％溶液，單獨(dú)高壓滅菌)，DMSO 0.5ml。
發(fā)酵細(xì)節(jié)如下。用含有PAT基因的大腸桿菌(E.coli)BL21 DE3密碼子加RIL的LB肉湯生長接種物(200ml)接種LCM50培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐，在30℃，200rpm，pH6.5，50％空氣飽和的氧濃度下維持。約12h后，培養(yǎng)物生長到約30 OD600nm。然后，通過0.2mM IPTG的添加誘導(dǎo)培養(yǎng)物的PAT表達(dá)。1.5h后，通常培養(yǎng)物進(jìn)一步生長到約40 OD600之后通過離心收集細(xì)胞和在8L基本培養(yǎng)基中洗細(xì)胞。再一次離心細(xì)胞，在發(fā)酵罐中，在含有9.91g商購D/L膦絲菌素銨鹽和0.2mMIPTG的基本培養(yǎng)基中重懸浮到10L的最終體積。升高溫度到37℃，通過質(zhì)子和磷NMR監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的樣品以檢測(cè)a)什么時(shí)候葡萄糖水平已經(jīng)實(shí)質(zhì)上下降并且需要補(bǔ)充，和b)膦絲菌素轉(zhuǎn)化為正乙酰膦絲菌素的程度。經(jīng)約12h的過程，向發(fā)酵罐添加約500g葡萄糖。幾小時(shí)后，開始觀察到正乙酰膦絲菌素的形成，并且到約20h時(shí)，達(dá)到＞93％的L-PPT(46.5％v的D/L)到N-乙酰-L-PP的轉(zhuǎn)化。之后迅速收集發(fā)酵培養(yǎng)基，通過低速離心除去細(xì)胞。
利用離子交換層析，從發(fā)酵培養(yǎng)基純化D-PPT。在4℃貯藏發(fā)酵培養(yǎng)基(～9.51)。它與H+形式的900ml Dowex 50W-X8 200-400篩目陽離子交換樹脂(用HCl預(yù)制備)混合，由此，樹脂上方上清液pH值降低到約pH3.0。在重力下沉淀Dowex樹脂，并且一起傾析上清液和2L Dowex樹脂漂洗水，然后離心澄清化。棄掉洗過的Dowex(最終被回收)。然后，通過分液漏斗用醋酸乙酯(1/4上清液體積)萃取澄清的上清液，保留水性級(jí)分(～12L)。然后，添加另一2.3升的H+形式Dowex 50W-X8樹脂，與此約12L攪拌。然后允許樹脂沉淀。在這個(gè)階段，樹脂上上清液的pH是～pH1.6。傾析和棄掉上清液，用約12L的水洗樹脂，再一次進(jìn)行沉淀。再一次棄掉上清液。將樹脂傾倒在燒結(jié)的Buchner漏斗濾器上，用另外約4.5L的水漂洗(除去大多數(shù)殘留的N-乙酰-膦絲菌素)。用15L 0.4M氫氧化銨，接著用1.4L水漂洗樹脂，從樹脂洗脫含有D-膦絲菌素的主要級(jí)分。該含有D-膦絲菌素的級(jí)分的pH是約11.4。可選地，通過，例如0.13mol醋酸和約600ml H+形式的陽離子交換樹脂的添加，將該pH減少到約pH10。如果進(jìn)行上述添加，那么要沉淀樹脂。然后，將D-膦絲菌素(上清液)級(jí)分加樣到OH-形式的Dowex 1X8-400篩目陰離子交換樹脂的565ml(5×28cm)柱子上(用NaOH預(yù)平衡和用水沖洗)。給柱子施用0-0.32M醋酸銨梯度，超過17柱床體積。整個(gè)收集55ml的級(jí)分。在215nm通過UV和通過質(zhì)子和31P NMR監(jiān)測(cè)級(jí)分。該分析表明在級(jí)分39和78之間洗脫高純度的膦絲菌素。N-乙酰膦絲菌素做為未結(jié)合的物質(zhì)洗脫，并且在梯度中較早洗脫，稍后級(jí)分79-90中洗脫一些谷氨酸。
級(jí)分63到78(對(duì)應(yīng)于6-7.6柱床體積)組成了大量高純度的膦絲菌素。冷凍干燥膦絲菌素級(jí)分，通過質(zhì)子和磷NMR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其是純的(除了醋酸鹽外，沒有觀察到其它的峰，＞95％的有機(jī)物質(zhì)是膦絲菌素)，盡管，根據(jù)計(jì)算和觀察到的干重偏差，發(fā)現(xiàn)在膦絲菌素樣品中通常仍有一些無機(jī)鹽(例如，氯化銨)殘留。對(duì)于實(shí)際的目的，當(dāng)使用D-膦絲菌素時(shí)(例如，噴霧到植物上)，可以將這些無機(jī)物視為惰性的，并且僅當(dāng)D-膦絲菌素溶液由稱重的干樣品配制時(shí)，才需要考慮調(diào)整計(jì)算的濃度。
預(yù)期根據(jù)上述方法分離的膦絲菌素應(yīng)該基本上是對(duì)映體純的D-膦絲菌素。這可以根據(jù)Hori等，(2002)J.Chrom.B776，191-198的熒光HPLC分析方法證實(shí)。例如，在pH8.5的0.1M硼酸鹽緩沖液中溶解50μl商品DL膦絲菌素(0.01-10μg/ml)或50μl樣品，與200μl同樣硼酸鹽緩沖液混合。然后添加50μl的18mM FLEC((+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯，并且在40℃，進(jìn)一步溫育該混合物30分鐘。通過用500μl醋酸乙酯振蕩3分鐘除去多余的FLEC。移出100μl底部水層用于HPLC分析。
用77％10mM含水醋酸銨(pH5.0)23％乙腈以0.8ml/min的速率平衡Inertsil ODS2(15×4.6)5uM的partical HPLC柱子。將2μl樣品注射到柱子上，并且進(jìn)行恒溶劑過柱60分鐘，利用熒光檢測(cè)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，該熒光檢測(cè)具有在260nm的激發(fā)和在305nm的發(fā)射波長。觀察到清楚地分離了D&L膦絲菌素異構(gòu)體，并且它們分別在12.4和13.4分鐘被洗脫。檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明方法分離的D膦絲菌素樣品，估算其為超過99％的對(duì)映體過量。這種估算的基礎(chǔ)是用已知量的商品DL膦絲菌素形成峰，并且觀察右側(cè)13.2分鐘的峰如何小量的增加在該樣品產(chǎn)生的12.4分鐘的明顯單峰背景下是可檢測(cè)的。
此外，根據(jù)峰積分和與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，利用HPLC方法估算膦絲菌素的量。另外通過NMR信號(hào)積分估算膦絲菌素的總量。
估算從開始的約9.91gDL外消旋物，總計(jì)產(chǎn)生了＞99％對(duì)映體過量的約1.9g(38％產(chǎn)率)純D膦絲菌素銨鹽。50-70％干重的樣品包含其一直帶有的無機(jī)鹽。可選地，通過進(jìn)一步的離子交換，并且(交換為揮發(fā)性的鹽后)冷凍干燥來移除它們。
實(shí)施例15.
對(duì)映體純S-吡氟禾草靈和S-吡氟禾草丁酯的產(chǎn)生利用熟知用于R-吡氟禾草靈的類似方法和如文獻(xiàn)中所述(例如，D.Cartwright，Proceedings of the Brighton Crop ProtectionConference-Weeds(1989)2，707-716和其中的參考文獻(xiàn))，產(chǎn)生S-吡氟禾草靈酸和它們的酯。相似地，熟知產(chǎn)生RS外消旋物的方法。可選地，通過從RS外消旋物制備性層析拆分產(chǎn)生純的S-吡氟禾草靈(例如，如Bewick(1986)，Pesticide Sci.，17，349-356)。從吡氟禾草靈丁酯的RS混合物，利用Bewick所述的HPLC方法，以超過97％的對(duì)映體過量分離S對(duì)映體。做為可替代的方案，通過沿著適合環(huán)糊精柱子的層析(Journal of Chromatography(1993)，634(2)，197-204)，或者通過利用其它柱層析方法(Biomedical Chromatography(1998)，12(6)，309-316；Journal of Chromatography，A(2001)，937(1-2)，135-138)，從酸的RS混合物直接拆分S-吡氟禾草靈。在Chimiques Des Pays-Bas(1991)110(05)，185-188中描述了分離對(duì)映體純的S芳氧基苯氧基丙酸和它們的酯的另一種一般制備應(yīng)用方法。在這種情況下，產(chǎn)生羧酸酯酶NP酶，并且用于芳氧基苯氧基丙酸類的外消旋酯的對(duì)映選擇性水解(可以容易地從剩余的酯分離出由此得到的酸)。
在優(yōu)選的方法中，通過直接合成方法產(chǎn)生對(duì)映體純的S-吡氟禾草靈。在第一步驟中，合成中間體4-(5-三氟甲基-oyridin-2-基氧基)-苯酚。
4-(5-三氟甲基-oyridin-2-基氧基)-苯酚的制備在室溫，向干燥DMF(200mls)中的碳酸鉀懸浮液(13.81g，99mmol)添加氫醌(10.0g，91mmol)，并且攪拌混合物30分鐘。添加2-氯-5-三氟甲基吡啶(16.49g，91mmol)，并且溫?zé)峄旌衔锏?0℃，16小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾倒到水中，用稀釋的HCl酸化，用醋酸乙酯萃取。用水洗合并的有機(jī)層，硫酸鎂干燥，過濾并且在減壓條件下除去溶劑。利用10-20％醋酸乙酯/己烷做為洗脫液，在硅膠上進(jìn)行柱層析以例如約44％產(chǎn)率產(chǎn)生約10.22g 4-(5-三氟甲基-oyridin-2-基氧基)-苯酚。
δH(400MHz；CDC13)8.45，s，1H；7.9，dd，1H；7.0，m，1H；7.0，d，2H；6.8，d，2H；5.75，s，1H.
在下一步中，合成中間體(R)-2-羥基丙酸芐基酯。
(R)-2-羥基丙酸芐基酯的制備在0℃，在氮?dú)庀拢駾MF中的D-乳酸鈉懸浮液逐滴地添加芐基溴。在0℃，攪拌混合物16小時(shí)。在減壓條件下除去溶劑，在乙醚和水之間分配殘留物。分離各層，用飽和碳酸氫鈉、鹽水洗有機(jī)相，硫酸鎂干燥，過濾并在減壓條件下除去溶劑產(chǎn)生作為無色油的(R)-2-羥基丙酸芐基酯。例如以88％產(chǎn)率制備2.81g。
δH(400MHz；CDC13)7.4，m，5H；5.23，s，2H；4.35，q，1H；2.85，d，1H；1.45，d，3H.
在下一步中，合成中間體(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸芐基酯(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸芐基酯的制備在0℃，在氮?dú)庀拢?-(5-三氟甲基)-oyridin-2-基氧基)-苯酚(2.90g，11.4mmol)和(R)-2-羥基丙酸芐酯(2.25g，12.5mol)在干燥THF(100ml)中的溶液添加三苯膦，接著逐滴地添加偶氮二羧酸二異丙基酯(3.36ml，17mmol)。攪拌由此得到的黃色混合物1小時(shí)，然后保持靜止16小時(shí)。反應(yīng)混合物在水和醋酸乙酯之間分配，分離各層。用醋酸乙酯進(jìn)一步提取含水相，硫酸鎂干燥合并的有機(jī)層，過濾并在減壓條件下除去溶劑。利用10％醋酸乙酯/己烷做為洗脫液在硅膠上進(jìn)行柱層析產(chǎn)生了無色油狀物(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸芐酯。在一個(gè)實(shí)施例中，制備了3.25g，69％的產(chǎn)率，并且＞99％ee(通過nmr所測(cè)定)。
δH(400MHz；CDCl3)8.42，s，1H；7.89，dd，1H；7.35，m，5H；7.25，d，2H；6.95，d，1H；6.9，d，2H；5.22，s，2H；4.78，q，1H；1.65，d，3H.
在最后步驟中，制備S酸。
(S)-2-[4-[5-三氟甲基-吡啶-s-基氧基]-苯氧基]-丙酸的制備在2.5巴氫氣氛下，在醋酸乙酯中攪拌(S)-2-[4-(5-三氟甲基-吡啶-2-基氧基)-苯氧基]-丙酸芐酯(3.12g)和Pd/C(5％，0.1g)的混合物2.5小時(shí)。通過硅藻土過濾反應(yīng)混合物，在減壓條件下除去溶劑。利用25％醋酸乙酯/己烷1％醋酸做為洗脫液在硅膠上進(jìn)行柱層析產(chǎn)生無色油狀物(S)-2-[4-[5-三氟甲基-吡啶-s-基氧基]-苯氧基]-丙酸。例如，以99％ee+/-0.5％，以99％產(chǎn)率制備2.41g(通過nmr所測(cè)定)。
DH(400MHz；CDCl3)8.42，s，1H；7.9，dd，1H；7.1，m，2H；6.9，m，3H；4.8，q，1H；1.7，d，3H.
利用與上述方法類似的方法產(chǎn)生其它芳氧基苯氧基丙酸除草劑(例如，噁唑禾草靈、吡氟氯禾靈、fluozifop、喹禾靈和它們的酯)的S-對(duì)映體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，盡管示例了本發(fā)明，但是上述實(shí)施例沒有限制它的范圍。
序列表<110>Syngenta Limited<120>選擇性產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的方法<130>PPD50695<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>831<212>DNA<213>集胞藻屬<400>1atggaacgat tagaacacca cgccagcttt gggggttggc aaagcgttta tagccatcac60agcgctgtgc ttaattgcac catgaacgtt ggcgtttacc tgcctcccca ggctactaac120caacattgcc cagttttgta ctggctgtct ggcctcacct gtactgaaca aaatgccatc180actaaatcgg gtctacagca gcacgcagca aagcatggac taattatggt gacgccagac240actagccccc ggggtgaagg cgtaactgat tctgaagatt atgacctcgg tatgggagcc300ggtttctatc tcaacgccac ccaacctccc tgggcagccc actatcaaat gcatgattac360attgtgcaag agctgcctac gtggattgag gctaattttg ccgccaccga tgcccggagt420atttttggcc attccatggg gggccatggg gccctagtca ttgccctgcg taatcccggt480cgttatcgca gtgtttccac cttctctccc attgttgccc ccactcaagt tccctgggga540caaaaggcct tccaagctta tttaggggat aaccagttaa gctggcaagc ttgggatacc600tgtgctctga ttaaatcggc tccagagcgg ctaccatttt tcgtggacta tggcgacgct660gatccattcc tccctaccca attgcggcca gagttactcc aagcggcctg cacggcggct720aaccatcccc tcaccctccg tatgcaaccg ggctatgacc atagctatta ctttattgct780agtttcatcg gtgatcacat ggattggcat ggagcggcgc tgctaaacta g 831<210>2<211>276<212>PRT<213>集胞藻屬<400>2Met Glu Arg Leu Glu His His Ala Ser Phe Gly Gly Trp Gln Ser Val1 5 10 15Tyr Ser His His Ser Ala Val Leu Asn Cys Thr Met Asn Val Gly Val20 25 30Tyr Leu Pro Pro Gln Ala Thr Asn Gln His Cys Pro Val Leu Tyr Trp35 40 45Leu Ser Gly Leu Thr Cys Thr Glu Gln Asn Ala Ile Thr Lys Ser Gly50 55 60Leu Gln Gln His Ala Ala Lys His Gly Leu Ile Met Val Thr Pro Asp65 70 75 80
Thr Ser Pro Arg Gly Glu Gly Val Thr Asp Ser Glu Asp Tyr Asp Leu85 90 95Gly Met Gly Ala Gly Phe Tyr Leu Asn Ala Thr Gln Pro Pro Trp Ala100 105 110Ala His Tyr Gln Met His Asp Tyr Ile Val Gln Glu Leu Pro Thr Trp115 120 125Ile Glu Ala Asn Phe Ala Ala Thr Asp Ala Arg Ser Ile Phe Gly His130 135 140Ser Met Gly Gly His Gly Ala Leu Val Ile Ala Leu Arg Asn Pro Gly145 150 155 160Arg Tyr Arg Ser Val Ser Thr Phe Ser Pro Ile Val Ala Pro Thr Gln165 170 175Val Pro Trp Gly Gln Lys Ala Phe Gln Ala Tyr Leu Gly Asp Asn Gln180 185 190Leu Ser Trp Gln Ala Trp Asp Thr Cys Ala Leu Ile Lys Ser Ala Pro195 200 205Glu Arg Leu Pro Phe Phe val Asp Tyr Gly Asp Ala Asp Pro Phe Leu210 215 220Pro Thr Gln Leu Arg Pro Glu Leu Leu Gln Ala Ala Cys Thr Ala Ala225 230 235 240Asn His Pro Leu Thr Leu Arg Met Gln Pro Gly Tyr Asp His Ser Tyr245 250 255Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Ile Gly Asp Hig Met Asp Trp His Gly Ala260 265 270Ala Leu Leu Asn275<210>3<211>1374<212>DNA<213>粗糙鏈孢霉<400>3ggaaggaatc agtatggttg gccaaccgcc tcttaccggc ctcaaggtcc tggagtttgc60cggtctagct ccaggtcagc cctccatctc tcacttttcc tccgacttac acacacagag120gctttcggcc gaaacccggc cgatcttgag gtctcactta tacacttcac ttacacttca180ctctcacttg gaaaaaaaca aaatgtcaca aaactaattc cccgcttggg aacaggtccc240ttcgccgggc tcctcctcgc cgacgctggc gcctccgtcc tgcgcatcga ccgcgccgtc300tccggccccg tcgcccgcca agttcccgac caactaaccc gccacaaatc ctccttggtg360
gtcgacctca agtccccctc cggaatcgcc ctcatcaaat ccctcgccgc cgtatcggac420gttctcatcg acccttaccg ccccggcgtc ctggagaagc tcgggctggg cccctctgtc480ctgtgcagcg acgaatgcaa cccccgcctc atctacgccc gcctgacggg cttccggcga540gacggccggt tcgccaccat ggccgggcac gatatcaact acctggctgt gagcggggtg600ttgagtctgc tggggaggaa gggcgagaag ccgacgccgc ccatcaacat tctgggagac660tttgccggcg gcggagcggt tttgttccag ggcatcctgc ttgcgctggc cgcgagggag720aggacgggca agggacaggt ggtggaggcg aatatcgtcg acggagcgag ttacttggct780acttttaacc ggtttgcgct caaaacggcc gtggggaacg caccgagggg ggagaacctg840ctggatacgg gctgccctta ctatgatacg tacgagaccg cggatgggaa gtacatagct900gtcggggcgt tggagccgca gtttttcaag gagttggtta aagggttggg gttagaggga960caagggtggg aggagaggag aggggacaag gagaattggc ccgagctgag gagggtgttg1020gagcacaagt tcaagaccaa aacgaggagg gagtgggagg atatctttga cgggactgat1080gcgtgctgca cggcggtgtt tgagtacggc gagatggaaa gggagaggga gcggttggag1140ggcgatcaga gacccgtggt tacgcttagg gagacgccct gcttggcgct gaggagcgat1200gcgaaggatg ctagccatgg gcaagggccg ggcgtcaagg gggaagcgta tgtaggcatt1260cccttgaaac ctggaaaggg aggcgaatct gtcgtggaga agtggcttgg ttggaagaag1320ggcaaggagt ttgatgtgtt gaatgggagc gctgtcgcta tcaagtccag actg 1374<210>4<211>460<212>PRT<213>粗糙鏈孢霉<400>4Gly Arg Asn Gln Tyr Gly Trp Pro Thr Ala Ser Tyr Arg Pro Gln Gly1 5 10 15Pro Gly Val Cys Arg Ser Ser Ser Arg Ser Ala Leu His Leu Ser Leu20 25 30Phe Leu Arg Leu Thr His Thr Glu Ala Phe Gly Arg Asn Pro Ala Asp35 40 45Leu Glu Val Ser Leu Ile His Phe Thr Tyr Thr Ser Leu Ser Leu Gly50 55 60Lys Lys Gln Asn Val Thr Lys Leu Ile Pro Arg Leu Gly Thr Gly Pro65 70 75 80Phe Ala Gly Leu Leu Leu Ala Asp Ala Gly Ala Ser Val Leu Arg Ile85 90 95Asp Arg Ala Val Ser Gly Pro Val Ala Arg Gln Val Pro Asp Gln Leu100 105 110Thr Arg His LYs Ser Ser Leu Val Val Asp Leu Lys Ser Pro Ser Gly115 120 125
Ile Ala Leu Ile Lys Ser Leu Ala Ala Val Ser Asp Val Leu Ile Asp130 135 140Pro Tyr Arg Pro Gly Val Leu Glu Lys Leu Gly Leu Gly Pro Ser Val145 150 155 160Leu Cys Ser Agp Glu Cys Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Ala Arg Leu Thr165 170 175Gly Phe Arg Arg Asp Gly Arg Phe Ala Thr Met Ala Gly His Asp Ile180 185 190Agn Tyr Leu Ala Val Ser Gly Val Leu Ser Leu Leu Gly Arg Lys Gly195 200 205Glu Lys Pro Thr Pro Pro Ile Asn Ile Leu Gly Asp Phe Ala Gly Gly210 215 220Gly Ala Val Leu Phe Gln Gly Ile Leu Leu Ala Leu Ala Ala Arg Glu225 230 235 240Arg Thr Gly Lys Gly Gln Val Val Glu Ala Asn Ile Val Asp Gly Ala245 250 255Ser Tyr Leu Ala Thr Phe Asn Arg Phe Ala Leu Lys Thr Ala Val Gly260 265 270Asn Ala Pro Arg Gly Glu Asn Leu Leu Asp Thr Gly Cys Pro Tyr Tyr275 280 285Asp Thr Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Lys Tyr Ile Ala Val Gly Ala Leu290 295 300Glu Pro Gln Phe Phe Lys Glu Leu Val Lys Gly Leu Gly Leu Glu Gly305 310 315 320Gln Gly Trp Glu Glu Arg Arg Gly Asp Lys Glu Asn Trp Pro Glu Leu325 330 335Arg Arg Val Leu Glu His Lys Phe Lys Thr Lys Thr Arg Arg Glu Trp340 345 350Glu Asp Ile Phe Asp Gly Thr Asp Ala Cys Cys Thr Ala Val Phe Glu355 360 365Tyr Gly Glu Met Glu Arg Glu Arg Glu Arg Leu Glu Gly Asp Gln Arg370 375 380Pro Val Val Thr Leu Arg Glu Thr Pro Cys Leu Ala Leu Arg Ser Asp385 390 395 400Ala Lys Asp Ala Ser His Gly Gln Gly Pro Gly Val Lys Gly Glu Ala405 410 415
Tyr Val Gly Ile Pro Leu Lys Pro Gly Lys Gly Gly Glu Ser Val Val420 425 430Glu Lys Trp Leu Gly Trp Lys Lys Gly Lys Glu Phe Asp Val Leu Asn435 440 445Gly Ser Ala Val Ala Ile Lys Ser Arg Leu Ser Gln450 455 460<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5aactgcagct ttttggttag cgaatgc27<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cagactagtt ttagctaatt tctttaagta aaaac 35<210>7<211>1107<212>DNA<213>纖細(xì)紅酵母<400>7atgggatccc aaaagagggt tgtggtgctg ggttccggcg tgataggact cagctccgcg60cttatacttg cccggaaggg gtactccgtc cacatcctgg cccgggacct cccagaggat120gttagctcac agaccttcgc gtccccttgg gctggagcca actggacccc ttttatgacc180ctcactgacg gcccgaggca ggcaaagtgg gaggagtcta cattcaagaa gtgggtggaa240cttgtgccaa cggggcatgc catgtggttg aagggaacca ggcgtttcgc ccaaaatgag300gacggactgc tcggtcactg gtacaaagat atcaccccca attatagacc cttgccctct360tccgaatgtc caccaggcgc tattggcgtg acttatgaca cattgtcagt gcacgctcca420aagtactgcc aatacctcgc aagggagctc cagaagctgg gggcgacatt cgagcgccgc480accgttactt ccctcgagca agcttttgat ggggctgacc tcgtcgttaa cgcgacgggg540ctgggtgcca agtccatcgc tggcatcgat gaccaggcgg ccgagcctat tcgcggtcaa600acggtgctcg tcaagtcgcc ctgcaaaagg tgtactatgg acagctcgga cccggcatca660ccggcgtaca tcatcccgcg gccaggaggc gaagtgattt gcggcggtac gtacggggtc720ggagactggg atctctcggt caacccagag accgtccagc gcatcctcaa acactgcctg780cgcctggatc cgactatttc ttcggacggc acaatcgaag gcatcgaggt gctgcggcat840
aacgtcggac tcagaccggc gaggagggga ggccctcgcg ttgaagccga gaggattgtt900cttccacttg acagaacgaa gagccccctc tcactgggcc gtgggagcgc tcgtgcggcc960aaggagaagg aggtgacttt ggtgcatgcc tacggtttct ccagcgctgg ctatcaacag1020tcttggggcg cagccgaaga cgtcgcacaa ttggtcgatg aggcgtttca gaggtatcat1080ggggccgccc gcgagtctaa gctctga1107<210>8<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(97)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(98)..(98)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(99)..(99)<223>其中n＝a，t，c或g.
<400>8tccccatgca agcgatgcac gnnngactcg tccgaccccg cttctcccgc ctacatcatt60ccccgaccag gtggcgaagt catctgcggc gggacgnnng gcgtgggaga ctgggacttg120<210>9<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(22)..(22)
<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(23)..(23)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(97)..(97)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(98)..(98)<223>其中n＝a，t，c或g.
<220>
<221>misc_feature<222>(99)..(99)<223>其中n＝a，t，c或g.
<400>9caagtcccag tctcccacgc cnnncgtccc gccgcagatg acttcgccac ctggtcgggg60aatgatgtag gcgggagaag cggggtcgga cgagtcnnnc gtgcatcgct tgcatgggga120<210>10<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基序<400>10Arg cys Thr Met Asp Ser Ser1 5<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>基序<400>11Gly Gly Thr Tyr Gly Val Gly1 權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)雄性或雌性不育植物的方法，該方法包括步驟用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料，該多核苷酸編碼至少一種與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生毒害植物的物質(zhì)的酶，和將由此轉(zhuǎn)化的材料再生為植物，其中不超過雄性或雌性配子形成和/或成熟的時(shí)期，向所述植物施用所述非毒害植物的物質(zhì)，使得非毒害植物的物質(zhì)提供毒害植物的物質(zhì)的產(chǎn)生，該毒害植物的物質(zhì)選擇性地阻止所述配子的形成或使其沒有功能，其中所述酶優(yōu)先在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)，其特征在于(i)非毒害植物的物質(zhì)選自對(duì)非綠色組織有直接植物毒性的非膦酸酯類除草劑的酯衍生物，D-α氨基酸，非蛋白質(zhì)D-α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸類的S-對(duì)映體和芳氧基苯氧丙酸類的酯衍生物的S-對(duì)映體，和(ii)所述酶選自羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脫氫酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和?；?CoA合成酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非毒害植物的物質(zhì)與至少一種另外的物質(zhì)一起混合施用，所述另外的物質(zhì)選自安全劑、殺配子劑、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)物、細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)物、除草劑、肥料、殺線蟲劑、增效劑、殺蟲劑、殺真菌劑、激素、植物生長調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞色素P450抑制劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中葉面施用非毒害植物的物質(zhì)，且該非毒害植物的物質(zhì)是所述酶的韌皮部可移動(dòng)的和代謝穩(wěn)定的可氧化底物，其中該酶提供了做為來源于非毒害植物物質(zhì)的直接或間接產(chǎn)物的毒害植物的產(chǎn)物。
4.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中毒害植物的產(chǎn)物是以過氧化物和/或超氧陰離子形式產(chǎn)生的間接產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求3或4任一權(quán)利要求所述的方法，其中非毒害植物的物質(zhì)是D-α氨基酸，其選自D-丙氨酸、D-纈氨酸、D-甲硫氨酸、D-絲氨酸、D-亮氨酸和D-異亮氨酸，所述的酶是D-氨基酸氧化酶或氧化還原酶，其氧化所述氨基酸為2-酮酸，同時(shí)伴隨著氧原子還原為過氧化物陰離子。
6.如權(quán)利要求3或4任一權(quán)利要求所述的方法，其中非毒害植物的物質(zhì)是D-天冬氨酸或D-谷氨酸，所述酶是D-氨基酸氧化酶或氧化還原酶，其氧化所述的氨基酸為2-酮酸，同時(shí)伴隨氧還原為過氧化物陰離子。
7.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中酶是從纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)獲得的突變D-氨基酸氧化酶，該氧化酶與野生型序列相比，在位置213和/或238包含置換，或者是D-天冬氨酸氧化酶。
8.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中從紅酵母屬(Rhodotorula)獲得的氧化酶在位置213具有選自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有選自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。
9.如權(quán)利要求3-8任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述酶不靶向過氧化物酶體。
10.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述酶是羧酸酯酶，非毒害植物的物質(zhì)是咪草酸的酯或氟燕靈的酯。
11.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中非毒害植物的物質(zhì)是咪草酸甲酯，氟燕靈甲酯或氟燕靈異丙酯，植物是小麥或本身同樣對(duì)咪草酸甲酯，氟燕靈甲酯或氟燕靈異丙酯基本上不敏感的植物。
12.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述酶是D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脫氫酶或D-氨基酸消旋酶，非毒害植物的物質(zhì)是膦絲菌素的D對(duì)映體或雙丙氨酰膦的D對(duì)映體。
13.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中非毒害植物的物質(zhì)包含在混合物中，該混合物含有毒害植物的物質(zhì)，其中酶是D-氨基酸氧化酶或氧化還原酶，所述酶能將氨基酸氧化為2-酮酸，同時(shí)伴隨氧還原為過氧化物陰離子。
14.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中酶是從纖細(xì)紅酶母(Rhodotorula gracilis)獲得的突變D-氨基酸氧化酶，該氧化酶與野生型序列相比在位置213和/或238包含置換，或者是D-天冬氨酸氧化酶。
15.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中從紅酵母屬(Rhodotorula)獲得的氧化酶在位置213具有選自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有選自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。
16.如權(quán)利要求13-15任一權(quán)利要求所述的方法，其中混合物包含D和L膦絲菌素，并且植物材料基本上僅在綠色組織中和產(chǎn)生配子的花組織中表達(dá)PAT基因，該配子不是那些使得其沒有功能的配子。
17.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中酶選自2-芳基丙酰-CoA差向異構(gòu)酶、α-甲基?；?CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，其中非毒害植物的物質(zhì)是芳氧基苯氧丙酸類的S-對(duì)映體和芳氧基苯氧丙酸酯類的S-對(duì)映體。
18.如前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述的芳氧基苯氧丙酸的S-對(duì)映體選自S-吡氟禾草靈、S-喹禾靈、S-喔草酯、S-吡氟氯禾靈、S-噁唑禾草靈、S-氟甲草、S-Cyhalofop和S-炔草酯。
19.一種產(chǎn)生對(duì)映體純的D-膦絲菌素(D-PPT)的方法，包括步驟(a)提供包含酶的細(xì)胞，該酶具有選擇性N-?；疨PT的能力；(b)在含有D-L PTT的培養(yǎng)基中生長所述細(xì)胞以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基；(c)從(b)的條件培養(yǎng)基分離細(xì)胞；(d)可選地，在各種pH，用非水性、非混溶的溶劑萃取條件培養(yǎng)基，使得含有PPT的級(jí)份與含有水溶性比PPT大的分子的級(jí)份分離；(e)可選地，以足以從培養(yǎng)基吸附相當(dāng)比例除PTT外的陽離子的量和pH，混合質(zhì)子化形式的陽離子交換樹脂和條件培養(yǎng)基或步驟(d)的含有PPT的萃取培養(yǎng)基；(f)以足以結(jié)合培養(yǎng)基中大部分PPT的量和pH，混合質(zhì)子化形式陽離子交換樹脂和條件培養(yǎng)基、萃取培養(yǎng)基或來源于步驟(e)的培養(yǎng)基，(g)收集步驟(f)的PPT結(jié)合的陽離子離子交換樹脂，并且利用有足夠pH和離子強(qiáng)度的洗脫介質(zhì)從該樹脂選擇性洗脫P(yáng)PT，條件是所述洗脫介質(zhì)的pH不至于低到引起由此洗脫的PPT外消旋化。
20.具有至少98.5％對(duì)映體過量的D-PPT。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)雄性或雌性不育植物的方法，該方法包括步驟用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物材料，該多核苷酸編碼至少一種與非毒害植物的物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生毒害植物物質(zhì)的酶，再生這種轉(zhuǎn)化的材料為植物，其中不超過雄性或雌性配子形成和/或成熟的時(shí)期，向所述植物施用所述非毒害植物的物質(zhì)，由此，非毒害植物的物質(zhì)提供了毒害植物的物質(zhì)的產(chǎn)生，該毒害植物的物質(zhì)選擇性阻止了所述配子的形成或使其沒有功能，其中酶優(yōu)先在雄性或雌性生殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)，其特征在于(i)非毒害植物的物質(zhì)選自對(duì)非綠色組織有直接植物毒性的非膦酸酯除草劑的酯衍生物，D－α氨基酸，非蛋白質(zhì)D－α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸類的S－對(duì)映體和芳氧基苯氧丙酸的酯衍生物的S－對(duì)映體，和(ii)酶選自羧酸酯酶、D－氨基酸氧化酶、D－氨基酸脫氫酶、D－氨基酸消旋酶、2－芳基丙酰－CoA差向異構(gòu)酶、α－甲?；瑿oA消旋酶、硫酯酶和?；瑿oA合成酶。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1639344SQ03804625
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月26日
發(fā)明者T·R·豪克斯, G·米歇爾, S·T·哈德菲爾德, P·A·湯普森, R·維尼爾, 張雁 申請(qǐng)人:辛根塔有限公司