專利名稱：：賦予茄科植物抗蔓延疫霉(晚疫病)抗性的基因的制作方法由卵菌病原體(Oomycetepathogen)蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)導(dǎo)致的晚疫病(Lateblight)對于馬鈴薯栽培是世界范圍的破壞性最大的疾病。該疾病也威脅到番茄的產(chǎn)量。由于致病力更強的、更具有農(nóng)作物特異性的和對殺蟲劑更具抗性的病原體株正迅速出現(xiàn)，因此迫切需要獲得有具有抗性的栽培品種。防止作物歉收或減產(chǎn)的方法是應(yīng)用殺真菌劑，它可防止或治愈由蔓延疫霉導(dǎo)致的感染。但是，應(yīng)用農(nóng)作物防蟲劑被普遍地認為對于環(huán)境是一種負擔。因此，在某些西方國家，立法變得更加嚴格并部分地禁止應(yīng)用特異性殺真菌劑，導(dǎo)致對疾病進行化學(xué)控制更加困難。一種替代性方法是使用攜帶部分或完全抗晚疫病抗性的栽培品種。在馬鈴薯栽培中已經(jīng)描述和使用了兩種類型的抗晚疫病抗性。一種由一系列主要的顯性基因賦予，所述基因使宿主無法與病原體的特定的品種(races)相適應(yīng)(品種特異性抗性)。已經(jīng)鑒定了11個這樣的R基因(R1-R11)，認為它們來源于野生馬鈴薯品種Solanumdemissum，其原產(chǎn)于墨西哥，當?shù)氐牟≡w具有最多的遺傳變異性。這些R基因中有一些已經(jīng)在馬鈴薯的遺傳圖中被定位(見Gebhardt和Valkonen，2001Annu.Rev.Phytopathol.3979-102)。R1和R2分別位于染色體5和4，R3、R6和R7位于染色體11。在S.tuberosumsspandigena和S.berthaultii內(nèi)，也已經(jīng)描述了未知的傳遞品種特異性抗晚疫病抗性的R基因(Ewing等，2000Mol.Breeding625-36)。由于高水平的抗性和易于轉(zhuǎn)移，許多栽培品種含有S.demissum來源的抗性。不過，盡管由S.demissum產(chǎn)生的品種特異性抗性幾乎是完全的，但是并不持久。一旦最新種植的栽培品種在商業(yè)領(lǐng)域內(nèi)大規(guī)模生長，蔓延疫霉就出現(xiàn)新的致病性，使病原體能夠克服基因滲入的抗性(introgressedresistance)。第二種抗性，術(shù)語稱為野外抗性(fieldresistance)，本質(zhì)上是定量的(quantitative)，被認為不具有品種特異性，但更加持久。在一些墨西哥和中南美茄科品種(species)中可發(fā)現(xiàn)晚疫病的野外抗性(Rossi等，1986PNAS959750-9754)。墨西哥和危地馬拉的二倍體S.bulbocastanum是一種已知具有高水平抗晚疫病野外抗性的帶有塊莖的品種(Niederhauser和Mills，1953Phytopathology43456-457)。盡管胚乳平衡數(shù)(endospermbalancenumbers)不同，S.bulbocastanum抗性性狀的滲入已經(jīng)成功完成。通過倍數(shù)性操控(Ploidymanipulations)和一系列單調(diào)的過渡雜交(bridgecrosses)產(chǎn)生了S.bulbocastanum來源的晚疫病抗性生殖質(zhì)(germplasm)(Hermsen和Ramanna，1969Euphytica1827-35；1973Euphytica22457-466；Ramanna和Hermsen，1971Euphytica20470-481；Hermsen和DeBoer，1971Euphytica20171-180)。但是，在第一次雜交后幾乎40年，雖然荷蘭的馬鈴薯育種者努力用這種生殖質(zhì)進行密集不斷的栽培，但晚疫病抗性栽培品種仍然沒有引入市場。已經(jīng)報道成功產(chǎn)生了S.bulbocastanum和馬鈴薯(S.tuberosum)的體細胞雜種(Thieme等，1997Euphytica97(2)189-200；Helgeson等，1998TheorAppl.Genet96738-742)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些雜種和回交種生殖質(zhì)(backcrossedgermplasm)甚至在極度的疾病壓力下對晚疫病具有高度的抗性。盡管報道了抑制的重組，抗性在回交物中看起來在染色體8上的RFLP標記CP53和CT64之間大約6cM的間隔內(nèi)(Naess等，2000Theor.ApplGenet101697-704)。來源于番茄RFLP探針CT88的CAPS標記物與抗性共分離(cosegregatedwithresistance)。S.bulbocastanum和馬鈴薯染色體之間的重組的抑制，對于反復(fù)栽培的馬鈴薯生殖質(zhì)的成功重建以便達到符合最新種植的馬鈴薯栽培品種的標準的水平形成一種潛在的障礙。分離S.bulbocastanum中發(fā)現(xiàn)的編碼抗性的基因并隨后用這些基因轉(zhuǎn)化現(xiàn)有的栽培品種，與基因滲入培育相比，這是更加直接和快速的方法。對產(chǎn)生抗細菌、霉菌、病毒、線蟲和昆蟲的疾病抗性的許多植物R基因的克隆和分子特征的描述已經(jīng)確定植物R基因特有的結(jié)構(gòu)特征(綜述見Dangl和Jones，2001Nature411，826-833)。大多數(shù)是緊密連鎖多基因家族，且迄今為止，所有已經(jīng)被描述的R基因的成員，除了Pto以外，均編碼富亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR)，該結(jié)構(gòu)顯示參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。基于是否存在一種推定的三重核苷酸結(jié)合位點(NBS)，可將含有LRR的R基因分成2類。NBS-LRR類的R基因包含與動物凋亡調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)共享的基序(vanderBiezen等，1998CurrBiol.8，226-227；Aravind等，1999TrendsBiochem.Sci.24，47-53)，基于它們N端結(jié)構(gòu)域，其可被細分為2個亞組，其或者顯示與果蠅Toll蛋白和哺乳動物白細胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR-NBS-LRR)相似的序列，或者包含一種潛在的亮氨酸拉鏈或卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域(CC-NBS-LRR；Pan等，2000Genetics.155309-22)。沒有NBS的LRRR基因編碼跨膜蛋白質(zhì)，其胞外N末端區(qū)域由LRR組成(Jones等，1994Adv.Bot.Res.24，89-167)?；谑欠翊嬖谝环N胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，這些基因可被分成2個亞組(Song等，1995Science，270，1804-1806)。當前，已從馬鈴薯克隆了4個R基因。包括傳遞品種特異性抗晚疫病抗性的來源于S.demissum的R1基因在內(nèi)的所有4個基因?qū)儆谥参颮基因的CC-NBS-LRR類(Bendahmane等，1999PlantCell11，781-791；Bendahmane等，2000PlantJ.21，73-81；vanderVossen等，2000PlantJournal23，567-576；Ballvora等，2002PlantJournal30，361-371)。本發(fā)明提供了一種分離或重組的核酸，其包含編碼圖8的氨基酸序列的核酸或其功能片段或同源物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由所述氨基酸編碼的蛋白質(zhì)是系統(tǒng)發(fā)生樹分析確認的、由圖9的蛋白質(zhì)Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb組成的基因簇(在此也稱為Rpi-blb基因簇)的成員。如下進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析。首先，使用本領(lǐng)域內(nèi)標準應(yīng)用的CLUSTALW(http//www2.ebi.ac.uk/clustalw)分析核酸序列和/或優(yōu)選推導(dǎo)的基因氨基酸序列產(chǎn)生的多重序列對比。ClustalW生成一個.dnd文件，可由TREEVIEW(http//taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)讀取。圖9A描述的系統(tǒng)發(fā)生樹是一種系統(tǒng)發(fā)生譜圖(phylogram)。使用Saitou和Nei的鄰近相關(guān)法(Neighbour-Joiningmethod)(1987MolecularBiologyandEvolution4，406-425)，對Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb、RGC4-blb的推定的氨基酸序列和本領(lǐng)域不同品種來源的最相似的基因(由BLASTX定義)的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生進行研究，發(fā)現(xiàn)Rpi-blb基因簇相應(yīng)的基因或其功能性片段可被放置在一個單獨的分枝內(nèi)(圖9A)。在8005-8BAC克隆SPB4上鑒別的4個Rpi-blb基因簇成員之間的序列比較顯示，Rpi-blb基因簇內(nèi)的序列同源性在氨基酸序列水平上在70％和81％之間不等。推定的Rpi-blb氨基酸序列與RGC3-blb具有最高的總體同源性(81％氨基酸序列相同性；表4)。當比較不同的結(jié)構(gòu)域時，很清楚的顯示，存在于這些蛋白質(zhì)的N末端部分的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域(卷曲螺旋和NBS-ARC結(jié)構(gòu)域)比這些蛋白質(zhì)的被認為包含識別結(jié)構(gòu)域(LRR；71％氨基酸序列相同性)的C末端部分具有更高程度的同源性(91％序列相同性)。比較所有4個氨基酸序列顯示總共有104個Rpi-blb特異性氨基酸殘基(圖10)。多數(shù)的這些殘基位于LRR區(qū)域(80/104)。在后部的區(qū)域內(nèi)，這些特異性殘基被集中在LRR亞結(jié)構(gòu)域xxLxLxxxx內(nèi)。在LRR亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)的這些特異性氨基酸殘基的相對頻率(28.3％)比在LRR結(jié)構(gòu)域其余部分(12.3％)內(nèi)觀察到的高兩倍。位于共有序列xxLxxLxxxx中2個保守亮氨酸殘基周圍的殘基被認為是溶劑暴露的(solventexposed)并因此很可能涉及產(chǎn)生/維持抗性蛋白質(zhì)的識別特異性。Rpi-blb基因簇的另外的成員的序列可通過使用基于Rpi-blb基因特征序列引物，篩選基因組DNA或插入文庫如BAC文庫而獲得。用引物組A和/或B(表2和圖7)篩選不同茄科BAC文庫，鑒別了不同茄科品種來源的Rpi-blb同源物。將這些另外的序列與圖10呈現(xiàn)的那些序列進行對比將有助于鑒別造成蔓延疫霉抗性特異性的Rpi-blb基因簇的另外的成員及其特異性氨基酸殘基。此外，采用如上描述的系統(tǒng)發(fā)生樹分析法測試另外的序列，如使用Saitou和Nei的鄰近距離法(1987MolecularBiology和Evolution4，406-425)，可為屬于Rpi-blb基因簇的另外的基因提供鑒定。本發(fā)明涉及建立一種分離了品種非特異性抗晚疫病抗性的S.bulbocastanum的種內(nèi)作圖(intraspecificmapping)群體(population)?？剐晕挥谌旧w8，距離CT88末梢0.3cM的區(qū)域內(nèi)。由于抗性的品種非特異性的屬性，S.bulbocastanum晚疫病抗性始終被認為是R基因非依賴性的。但是，在本發(fā)明中我們首次證明，S.Bulbocastanum的品種非特異性抗性事實上是由一種與NBS-LRR型的R基因相似的基因所賦予的。本發(fā)明更進一步涉及對這個基因組區(qū)域進行分子分析以及通過基于圖譜的克隆而分離抗性親代的一種DNA片段，該DNA片段攜帶一種R基因，被稱為Rpi-blb。從一種大約80kb的細菌人工染色體(BAC)克隆中亞克隆這個DNA片段，該BAC克隆包含簇樣排列(cluster-likearrangement)的4個完整的R基因樣序列。用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)轉(zhuǎn)化一種易感的馬鈴薯栽培品種發(fā)現(xiàn)，上述4個R基因樣序列之一相應(yīng)于提供品種非特異性的抗晚疫病抗性的Rpi-blb基因。Rpi-blb基因的特征顯示它是植物R基因NBS-LRR類的成員之一?，F(xiàn)有技術(shù)中最接近的功能性特征序列是番茄內(nèi)I2抗性基因家族成員。這些序列與Rpi-blb序列具有大約32％的總體的氨基酸序列相同性。因此，在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種分離或重組核酸，所述核酸編碼一種具有Rpi-blb序列的基因產(chǎn)物或其功能性片段，其提供茄科成員品種非特異性的抗卵菌病原體的抗性。分離在此涉及的編碼所需的抗晚疫病抗性性狀的基因以及隨后使用這個基因轉(zhuǎn)化現(xiàn)有的馬鈴薯和番茄栽培品種提供了一種比基因滲入育種更簡單和快速的方法。在此提供的結(jié)果為更進一步研究植物病原體相互作用的分子原理和墨西哥野生馬鈴薯種內(nèi)R基因的生態(tài)學(xué)作用提供可能性，并對于發(fā)展通過遺傳修飾方法產(chǎn)生有抗性的馬鈴薯或番茄栽培品種是有用的。與迄今為止所克隆的和描述的R基因不同，我們在此涉及的基因是首次從一種品種非特異性抗疫霉病原體的茄科品種中分離的R基因。顯著地，本發(fā)明在此涉及一種核酸，其中所述具有所需的抗性的茄科品種包含馬鈴薯。具體而言，它是從一種在系統(tǒng)發(fā)生上與栽培的馬鈴薯不同的親緣植物即S.bulbocastanum中分離的第一個基因，通過互補分析(complementationassays)顯示，該基因在馬鈴薯內(nèi)具有功能。這些數(shù)據(jù)提示，Rpi-blb基因很容易應(yīng)用于馬鈴薯的生產(chǎn)，而不需要長時間和復(fù)雜的基因滲入育種。如下定義涉及用于如下描述和實施例中的術(shù)語。-核酸一種雙鏈或單鏈DNA或RNA分子。-寡核苷酸一種短單鏈核酸分子。-引物術(shù)語引物涉及一種可以起始核酸合成的寡核酸。-同源性同源性是用于生物學(xué)序列信息相似性或相同性的術(shù)語。同源性出現(xiàn)在核酸序列和/或編碼的氨基酸序列水平，使用默認參數(shù)的BLAST算法(Altschul等，1997Nucl.AcidsRes.253389-3402)，或使用默認參數(shù)的GAP算法計算相同性的百分率，它們都包括于WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDr.，Madison，Wisconsin，USA。BLAST研究假定蛋白質(zhì)可被模仿為隨機序列。但是，許多真實的蛋白質(zhì)包含非隨機序列區(qū)域，它們可能是同聚物序列段(homopolymerictracts)，短片段重復(fù)，或富含一種或多種氨基酸的區(qū)域。這樣的低復(fù)雜性區(qū)域可在無關(guān)蛋白質(zhì)之間構(gòu)成排列，即使蛋白質(zhì)的其它區(qū)域完全不同。許多低復(fù)雜性過濾程序可被執(zhí)行以減少這樣的低復(fù)雜性排列。例如，SEG(Wooten和Federhen，1993Comput.Chem.17149-163)和XNU(Claverie和States，1993Comput.Chem.17191-201)低復(fù)雜性過濾可被單獨或聯(lián)合執(zhí)行。在本文中使用的2個蛋白序列(或核苷酸序列)的“序列相同性”或“相同性”指的是，當排列通過一種特異性的比較窗口達到最大限度的符合程度時2個序列中相同的殘基。當序列相同性的百分比指的是蛋白質(zhì)時，已認可不同的殘基位置可通過保守氨基酸取代而不同，氨基酸被其他具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基所取代(例如，電荷或疏水性)并因此沒有改變分子的功能性質(zhì)。序列的保守的取代不同，序列相同性百分比可被上調(diào)校正取代的保守性質(zhì)。通過這樣的保守的取代而改變的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知進行這些校正的手段。代表性地，這包括評價一種保守的取代作為一種部分而不是一種全部的錯配，因此，增加序列相同性百分比。因而，例如，如果一種同樣的氨基酸獲得1分而一種非保守取代獲得零分，則一種保守的取代得分為0到1之間。例如，依據(jù)Meyers和Miller的算法，計算保守取代的得分(ComputerApplic.Biol.Sci.411-17，1988)。在此使用的“序列相同性百分比”指通過一種比較窗口比較2個最佳排列的序列，其中在比較窗口內(nèi)的部分氨基酸序列或核苷酸序列與所參比的序列進行2個序列的最佳對比時，可以包含添加或缺失(例如，缺口)。通過確定位置數(shù)計算比例，其中在所述的位置上相同的氨基酸或核酸堿基殘基出現(xiàn)在2個序列中以產(chǎn)生匹配的位置數(shù)，匹配的位置數(shù)被比較窗口的總位置數(shù)除且結(jié)果乘100以產(chǎn)生序列相同性百分比。優(yōu)選地，本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸序列與圖8描述的序列具有至少82％或更高的同源性。表4顯示，現(xiàn)有技術(shù)的最接近的功能性特征序列(番茄的12鐮刀霉(Fusarium)抗性基因簇成員)具有一種更低水平的氨基酸序列相同性(就Rpt-blb而言為32％)。本發(fā)明基因簇內(nèi)的同源性在氨基酸序列水平上在70％和81％之間不等。同源核酸序列是編碼一種如上所述相應(yīng)蛋白質(zhì)的核酸序列。這樣的核酸的實例如圖6A提供的序列。但是，有許多的編碼與圖8描述的蛋白質(zhì)100％相同的蛋白質(zhì)的序列。這是由于核苷酸三聯(lián)體內(nèi)的擺動(wobble)，不只一種三聯(lián)體可編碼同一種氨基酸。因此，編碼這個蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以充分地改變而不會對蛋白質(zhì)的氨基酸序列產(chǎn)生影響。已公認，編碼與所述蛋白質(zhì)不是100％相同的氨基酸序列的核苷酸序列可能包含更多的變異。因此，核酸序列水平的相同性百分比可具有更大范圍的改變而沒有脫離本發(fā)明。-啟動子術(shù)語“啟動子”的意思是一小段DNA序列，它與RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合，之后，啟動子與轉(zhuǎn)錄DNA功能性連接，允許轉(zhuǎn)錄發(fā)生。啟動子通常位于編碼序列(5′)上游，在它主要范圍內(nèi)，術(shù)語“啟動子”包括RNA聚合酶結(jié)合位點和位于從轉(zhuǎn)錄起始位點的幾百個堿基對內(nèi)，偶爾甚至更遠處的調(diào)節(jié)序列元件。這樣的調(diào)節(jié)序列是，例如，涉及結(jié)合在反應(yīng)于生理條件的控制轉(zhuǎn)錄起始效力的蛋白質(zhì)因子的序列。啟動子區(qū)域在宿主細胞內(nèi)是有功能的并且優(yōu)選相應(yīng)于Rpi-blb抗性基因的天然啟動子區(qū)域。但是，可以使用任何異源啟動子，只要在需要表達的宿主細胞中其是功能性的。異源啟動子可以是組成性的或可調(diào)節(jié)的，組織特異性或非特異性的。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知組成性啟動子如CaMV35S啟動子或T-DNA啟動子，其是基本上不受調(diào)節(jié)(例如誘導(dǎo)或抑制)的啟動子，但是，在所用生物體的活性細胞內(nèi)只要轉(zhuǎn)錄的其它要求滿足，它允許其功能性結(jié)合的DNA序列穩(wěn)定地和基本上不改變地轉(zhuǎn)錄。有可能使用一種組織特異性啟動子，它在易于感染病原體植物的部位驅(qū)動表達。在晚疫病中，可以使用在葉內(nèi)驅(qū)動表達的啟動子，例如使用鐵氧化還原蛋白啟動子。一種可調(diào)節(jié)的啟動子是其功能可由一種或多種因子調(diào)節(jié)的啟動子。這些因子可以是那些通過它們的存在確保相應(yīng)DNA序列的表達，或者是其存在抑制DNA序列表達因而它們的缺乏導(dǎo)致DNA序列的表達。因此，啟動子和與它任選地相關(guān)的調(diào)節(jié)序列可被影響本發(fā)明遺傳構(gòu)建的DNA序列轉(zhuǎn)錄的一種或多種因子的存在或缺乏激活。適當?shù)膯幼有蛄泻瞳@得一種增加轉(zhuǎn)錄和表達的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。-終止子轉(zhuǎn)錄終止子的作用是終止DNA轉(zhuǎn)錄為RNA并且優(yōu)選地，從本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的植物轉(zhuǎn)錄終止子序列、細菌轉(zhuǎn)錄終止子序列和植物病毒終止子序列組中選擇。-基因術(shù)語“基因”指一種產(chǎn)生多肽鏈的DNA序列，并且其包括前述的和如下的編碼區(qū)域(5′-上游和3′-下游序列)及被置于單個編碼片段之間(所謂的外顯子)或5′-上游或3′-下游區(qū)域之間的間隔序列，稱為內(nèi)含子。5′-上游區(qū)域包含一種控制基因表達的調(diào)節(jié)序列，代表性的如啟動子。3′-下游區(qū)域包含有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄終止的序列以及任選的負責(zé)轉(zhuǎn)錄物和3′-的非編碼區(qū)的聚腺苷酸的序列。術(shù)語“抗性基因”是本發(fā)明的分離核酸，所述核酸編碼一種基因產(chǎn)物，其能夠為植物提供抗病原體的抗性，更特異性的所述植物是茄科成員，更優(yōu)選馬鈴薯和番茄，更特異性的所述病原體是卵菌病原體，更特異性的是晚疫病，更特異性的是蔓延疫霉，所述核酸優(yōu)選包含如圖8描述的序列或其部分，或一種基本上具有相似的功能的和結(jié)構(gòu)特性的同源序列。這樣一種抗性基因或由本發(fā)明提供的核酸的功能性等價片段編碼一種如圖8描述的氨基酸序列的多肽片段，或其部分，或一種同源的和/或功能性等價多肽，所述片段當摻入和在植物或植物細胞中表達時顯示提供至少部分抗菌卵感染如蔓延疫霉導(dǎo)致的感染的抗性。-抗性基因產(chǎn)物具有如圖8所述的氨基酸序列的多肽或其部分，或一種同源的和/或功能性等價多肽，其在植物或植物細胞摻入和表達時提供至少部分抗如蔓延疫霉導(dǎo)致的菌卵感染的抗性。本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能性等價物是蛋白質(zhì)，其通過替代，添加和/或缺失圖8描述的蛋白質(zhì)一種或多種氨基酸，但仍然保留它們的抗病原體活性而獲得的蛋白質(zhì)和與其同源的蛋白質(zhì)。通過體內(nèi)蛋白質(zhì)工程很容易制備這樣的等價物，例如，通過改變能夠編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框，氨基酸序列因而受到影響。只要氨基酸序列的改變沒有完全地廢除所述蛋白質(zhì)的活性，此類等價物便包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，可以理解當保持生物活性時，圖8描述的蛋白質(zhì)可以衍生等價物，即等價的蛋白質(zhì)和圖8描述的蛋白質(zhì)之間所有或大部分中間物具有抗病原體活性。大部分指30％或更多的中間物，優(yōu)選40％或更多，更優(yōu)選50％或更多，更優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選70％或更多，更優(yōu)選80％或更多，更優(yōu)選90％或更多，更優(yōu)選95％或更多，更優(yōu)選99％或更多。優(yōu)選的等價物是含有與圖8描述的LRR區(qū)域具有高度同源性的富含亮氨酸重復(fù)區(qū)域的等價物。其它優(yōu)選的等價物是其N末端受體結(jié)構(gòu)域與Rpi-blb受體結(jié)構(gòu)域基本上相同的等價物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含一種不同的N末端受體結(jié)構(gòu)域和一種富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域。已知，保留這些區(qū)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)功能是必需的，雖然一些變異是被允許的。但是，蛋白質(zhì)的其它部分對于功能是不重要的，而且可能更容易改變。為了提供一種快速和簡單的實驗，以明確在此描述的修飾的蛋白質(zhì)和/或能夠表達所述修飾蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體，或任何那些通過閱讀本申請后對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的新的構(gòu)建體，是否確實可以產(chǎn)生一種抗性反應(yīng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行一種已知的快速的名為ATTA(根癌農(nóng)桿菌瞬時表達化驗)的瞬時表達實驗。在這個實驗(VandenAckerveken，G，等，Cell87，1307-1316，1996中有詳細的描述)中，編碼被檢測的修飾蛋白質(zhì)的核酸序列被置于CaMV35S啟動子的控制下，并被導(dǎo)入也用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方案的農(nóng)桿菌株中。將細菌用acetosyringon和或任何其它已知增強農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移的酚類化合物孵育后，注射1ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)液滲透入原位植物葉子(例如，來自于煙草或馬鈴薯或番茄植物)，然后植物被放置在溫室并被病原體，優(yōu)選蔓延疫霉感染。2-5天后，以葉子出現(xiàn)抗性癥狀進行評分。在本發(fā)明中，我們已經(jīng)鑒定和分離抗性基因Rpi-blb，它傳遞品種非特異性抗蔓延疫霉抗性。該基因克隆自抗蔓延疫霉的Solanumbulbocastanum基因型。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或任何其它已知的轉(zhuǎn)化方法，依據(jù)本發(fā)明分離的抗性基因可被轉(zhuǎn)化到一種易感的宿主植物，并且有關(guān)的傳遞宿主植物抗植物病原體的抗性，特別是抗蔓延疫霉。宿主植物可以是馬鈴薯，番茄或任何其它植物，特別是可被這樣的植物病原體感染的茄科成員之一。本發(fā)明也提供一種編碼這個蛋白質(zhì)或其功能性等價物的核酸序列，優(yōu)選包含圖6描述的Rpi-blb基因。依據(jù)本發(fā)明的Rpi-blb抗性蛋白質(zhì)或其功能性等價物片段，有了一種具有控制植物病原體的有效方法，因為編碼蛋白質(zhì)的基因可被用于轉(zhuǎn)化易感植物基因型，因此，產(chǎn)生的經(jīng)遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化的植物具有一種減低的易感性或優(yōu)選抗植物病原體的抗性。特別的，一種用本發(fā)明的Rpi-blb抗性基因的遺傳轉(zhuǎn)化的植物對蔓延疫霉具有一種減低的易感性。在優(yōu)選的實施方案中，Rpi-blb抗性基因包含圖6A提供的編碼序列或其任何同源序列或部分，其前有啟動子區(qū)域和/或后有終止子區(qū)域。在植物細胞中，啟動子區(qū)域具有功能性，并且優(yōu)選對應(yīng)于Rpi-blb基因的天然啟動子區(qū)域。但是，在植物細胞中具有功能性的不同啟動子區(qū)域也可與編碼序列聯(lián)合使用。另外，本發(fā)明涉及依據(jù)本發(fā)明由Rpi-blb基因編碼的Rpi-blb抗性蛋白質(zhì)并且其具有圖8提供的氨基酸序列，或其功能性等價物。引發(fā)抗性基因在野生型S.bulbocastanum或本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中表達的信號可能是由于存在病原體，更特異性的是由于存在蔓延疫霉。這樣的系統(tǒng)在其它病原體-植物相互作用中是已知的(Klement，Z.，InPhytopathogenicProkaryotes，Vol.2，eds.Mount，M.S.和Lacy，G.H.，NewYork，AcademicPress，1982，pp.149-177)，并且使用這個系統(tǒng)可增加抗性蛋白質(zhì)導(dǎo)致更多病原體抗性的實用性(見EP474857)。這個系統(tǒng)利用病原體來源的激發(fā)子(elicitor)化合物和相應(yīng)的抗性基因，其抗性基因由于激發(fā)子的存在而被激活將導(dǎo)致局部細胞死亡(超敏反應(yīng))。對于本發(fā)明的抗性基因，相應(yīng)的激發(fā)子成分還沒有被揭示，但是已確信這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可以完成。一旦激發(fā)子成分被分離，將有可能轉(zhuǎn)化編碼所述激發(fā)子的基因和編碼抗性蛋白質(zhì)的基因進入植物，所述基因之一被置于一種病原體-誘導(dǎo)的啟動子的控制下。這些啟動子是本領(lǐng)域熟知的(例如prpl，F(xiàn)isl，Betv1，Vstl，gstAI，和倍半萜烯環(huán)化酶(sesquiterpenecyclase)，但是可以使用病原體感染后啟動的任何病原體-誘導(dǎo)啟動子)。如果轉(zhuǎn)基因植物包含這樣一種系統(tǒng)，能夠引發(fā)病原體-誘導(dǎo)啟動子的病原體攻擊將產(chǎn)生所述啟動子控制下的成分，并且，這與其他組成型表達成分一起，將導(dǎo)致抗性反應(yīng)發(fā)生。也有可能突變抗性蛋白質(zhì)為活性狀態(tài)(見EP1060257)。因為這將總是導(dǎo)致抗性反應(yīng)發(fā)生，最終導(dǎo)致局部細胞死亡，注意不要組成型表達抗性蛋白質(zhì)。要實現(xiàn)此目的，可將突變的抗性蛋白質(zhì)置于一種病原體-誘導(dǎo)啟動子控制下，其不僅允許僅當病原體攻擊時表達活性抗性蛋白質(zhì)，而且也允許更大范圍病原體來誘導(dǎo)超敏反應(yīng)。蘇氨酸和絲氨酸殘基突變?yōu)樘於彼岷凸劝彼釟埢３．a(chǎn)生激活，如許多活性蛋白質(zhì)顯示被磷酸化作用調(diào)節(jié)，例如，MAPK-活性蛋白質(zhì)(Engel等，1995，J.Biol.Chem.270，27213-27221)和MAP-激酶-激酶蛋白質(zhì)(Huang等，1995Mol.Biol.Cell6，237-245)。同樣，這些蛋白質(zhì)C-和N-末端以及內(nèi)在缺失的突變體可以用于測試合適的突變體。鑒定組成活性被誘導(dǎo)的所需的突變體的一種間接方法是通過在所謂大腸桿菌突變基因株內(nèi)擴增編碼蛋白質(zhì)DNA。測試所有已制成的突變體以適宜引發(fā)一種超敏反應(yīng)的快速方法是通過所謂ATTA實驗(VandenAckerveken，G，等，Cell87，1307-1316，1996)。很容易篩選許多突變體以鑒別那些將在表達時引發(fā)HR的突變體。本發(fā)明也提供一種載體，其包含在此提供的核酸或一種分離或重組核酸的功能性等價物，所述核酸編碼能夠為茄科(Solanaceae)成員之一提供抗卵菌病原體抗性的基因產(chǎn)物，特別地，在此所述成員包含馬鈴薯或Lycopersiconesculentum。本發(fā)明也提供一種包含依據(jù)本發(fā)明的一種核酸或一種載體的宿主細胞。例如，在此舉例詳細描述的所述細胞。在一種詳細地實施方案中，所述宿主細胞包含一種植物細胞。作為一種植物細胞，來源于一種茄科成員的植物細胞為優(yōu)選，特別地，其中所述成員包含馬鈴薯或Lycopersiconesculentum。從這樣一種細胞，或原生質(zhì)體，或轉(zhuǎn)基因植物，可生產(chǎn)例如抗卵菌感染的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物或番茄植物。因此，本發(fā)明也提供一種植物，或塊莖根，果實或種子或部分或子代來源，其包含一種依據(jù)本發(fā)明的細胞。此外，本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)物質(zhì)，當在一種植物或植物細胞摻入和表達時，呈現(xiàn)至少部分抗例如蔓延疫霉導(dǎo)致的晚疫病卵菌感染抗性的特性。特別地，提供的這樣一種蛋白質(zhì)物質(zhì)由一種依據(jù)本發(fā)明的核酸編碼。在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種包含圖8描述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)物質(zhì)或其功能性等價物。優(yōu)選地，這樣一種功能性等價物將包含一種或更多的序列，其與RGC3-blb、RGC-blb和RGC4-blb比較，只與Rpl-blb唯一相關(guān)。在對比中可以發(fā)現(xiàn)這樣的序列(見圖10A)并且將是序列RPLLGEM，AKMEKEKLIS，KHSYTHMM，F(xiàn)FYTLPPLEKFI，GDSTFNK，NLYGSGMRS，LQYCTKLC，GSQSLTCM，NNFGPHI，TSLKIYGFRGIH，IIHECPFLTLS，RICYNKVA，和KYLTISRCN。已確信一種或多種這些序列可提供蛋白質(zhì)Rpl-blb的功能性特性。此外，本發(fā)明提供一種與本發(fā)明核酸結(jié)合的分子。例如，Rpl-blb基因可被用于設(shè)計互補于圖7和表2描述的單鏈DNA序列的寡核酸。在此提供的寡核酸用作篩選文庫的探針，Southern/Northern分析的雜交探針，PCR的引物，用于檢測疾病抗性診斷試劑盒等等。這樣的寡核酸是在此提供的分離或重組核酸的有用的片段，所述核酸編碼能夠為一種茄科成員提供抗卵菌抗性的一種基因產(chǎn)物，或一種分離或重組核酸的功能性等價物，特別地，在此所述成員包含馬鈴薯或Lycopersiconesculentum。它們很容易從圖6所描述的一種序列或其部分挑選，一種特別識別位點包含在此已鑒別的LRR結(jié)構(gòu)域。這樣一種本發(fā)明的結(jié)合分子被用作探針或引物，例如提供標記物，特別地，在此所述標記物包含一種用來檢測所述結(jié)合分子存在的可激發(fā)部分(excitablemoiety)。此外，本發(fā)明提供一種篩選植物或植物材料或其子代的抗卵菌感染的易感性或抗性的方法，包含檢測至少部分所述植物或植物材料或其子代存在或缺乏一種核酸，所述核酸編碼能夠為一種茄科成員提供抗卵菌抗性的一種基因產(chǎn)物，或檢測所述基因產(chǎn)物的存在，優(yōu)選的所述方法包含將至少部分所述植物或植物材料或其子代和本發(fā)明結(jié)合分子接觸并確定所述分子結(jié)合到所述部分。所述方法特別有用，其中所述卵菌包含蔓延疫霉，允許選擇抗晚疫病的植物或植物材料，例如，其中所述植物或材料包含馬鈴薯。如上討論由系統(tǒng)發(fā)生樹分析已確信，蛋白質(zhì)與Rpi-blb有高度同源性，將產(chǎn)生抗容易鑒定的植物病原體抗性。舉例，檢測三個高度同源的蛋白質(zhì)RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb，顯示沒有產(chǎn)生抗蔓延疫霉抗性，但是仍然已確信它們與植物的病原體抗性相關(guān)。同樣，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的一種核酸或載體或細胞或物質(zhì)或結(jié)合分子為一種植物或其子代提供至少部分抗卵菌感染的方法，特別地，在此所述卵菌包含蔓延疫霉，特別地，在此所述植物包含馬鈴薯，所述提供一種植物或其子代至少部分抗卵菌感染的方法包含為所述植物或其部分提供編碼一種抗性蛋白質(zhì)或其功能性片段的包含核酸的基因，所述抗性蛋白質(zhì)能夠為一種茄科成員提供抗卵菌抗性，或為所述植物或其部分提供依據(jù)本發(fā)明的一種核酸或一種載體或一種細胞或一種物質(zhì)。此外，本發(fā)明提供一種分離的S.bulbocastanum或其部分，例如一種塊莖或種子，其易感于蔓延疫霉導(dǎo)致的卵菌感染。本發(fā)明更進一步的詳細描述如下。圖1.墨西哥地理圖，指示用于分離Rpi-blb基因的Solanumbulbocastanum保藏物(accessions)的來源。字母a、b和c指示使用的S.bulbocastanum保藏物的相關(guān)的地理來源。圖2.S.bulbocastanum染色體8上Rpi-blb基因座的遺傳連鎖圖。水平線指示連接晚疫病抗性標記的相關(guān)位置。標記物之間的距離以厘摩(centimorgan)顯示。A.Rpi-blb基因座相對于標記物TG513、CT88和CT64(n＝508基因型)的遺傳位置。B.Rpi-blb基因座的高密度遺傳連鎖圖譜(n＝2109基因型)。圖3.Rpi-blb基因座的物理圖譜。A.包含Rpi-blb的S.bulbocastanum基因組區(qū)域的遺傳圖譜和物理圖譜。垂直箭頭指示連接抗性標記物的相關(guān)位置。橫線上的數(shù)指示在2109子代植物中位于側(cè)翼的標記物之間鑒定的重組體的數(shù)目。長方形表示細菌人工染色體(BAC)克隆。B.BACSPB4上抗晚疫病候選基因相關(guān)位置。C.Rpi-blb基因結(jié)構(gòu)示意圖。水平線指示外顯子。開放的框表示編碼序列。向下成角的線(Linesangleddownwards)指示一種678核苷酸長的內(nèi)含子序列的位置。圖4.Southern印跡分析BAC克隆生成的Rpi-blb基因座。每條線上的名稱代表BAC克隆的名稱。給出了Southern印跡之前用于消化BACDNA的限制性內(nèi)切酶的名稱。圖5.離脫葉疾病(Detachedleafdisease)分析。A.以蔓延疫霉包囊孢子小滴孵育后6天(6d.p.i)，在S.bulbocastanum繪圖的B8群體中發(fā)現(xiàn)抵抗表型(左)、中間表型(中間)和易感(右)表型。B.馬鈴薯晚疫病抗性的遺傳互補。以蔓延疫霉包囊孢子小滴孵育后6天的攜帶RGC1-blb、RGC2-blb、-blb或RGC4-blb的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物來源的葉的特征性疾病表型。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，攜帶RGC的遺傳構(gòu)建體被傳遞給易感馬鈴薯栽培品種Impala。C.番茄的晚疫病抗性遺傳互補。以蔓延疫霉包囊孢子小滴孵育后6天的攜帶Rpi-blb的轉(zhuǎn)基因番茄植物來源的番茄葉的特征性的疾病表型(左側(cè))。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，攜帶Rpi-blb的遺傳構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化到易感番茄栽培品種Moneymaker。圖6.Rpi-blb基因簇成員的核酸序列。A.編碼Rpi-blb基因的核酸序列。B.編碼包括內(nèi)含子序列(位于428-1106)在內(nèi)的Rpi-blb基因的核酸序列。C.存在于pRGC2-blb的S.bulbocastanumBACSPB4的5.2kbScaI基因組DNA片段序列，用于晚疫病抗性遺傳互補的遺傳構(gòu)建體。攜帶Rpi-blb基因的基因組片段包括正確表達基因必需的天然調(diào)節(jié)元件。起始密碼子(ATG位于1191-1193)和終止密碼子(TAA位于4781-4783)以下劃線表示。D.編碼包括內(nèi)含子序列(位于428-708)在內(nèi)的RGC1-blb的核酸序列。E.編碼包括內(nèi)含子序列(位于428-1458)在內(nèi)的RGC3-blb的核酸序列。F.編碼包括內(nèi)含子序列(位于434-510、543-618和743-1365)在內(nèi)的RGC4-blb的核酸序列。圖7.相關(guān)引物位置。水平條代表編碼Rpi-blb基因的序列。數(shù)字代表核苷酸位置。水平箭頭指示相關(guān)引物位置和方向。GSP1和GSP2代表用于3′RACE實驗的嵌套基因特異性引物。GSP3和GSP4代表用于5′RACE實驗的嵌套基因特異性引物。A(F)、A(R)、B(F)和B(R)是用于Rpi-blb同源物擴增的引物。用于Rpi-blb同源物之間結(jié)構(gòu)域交換的限制性位點NsiI的位置被指示出來。圖8.推定的Rpi-blb蛋白質(zhì)序列。從Rpi-blb的DNA序列推定的氨基酸序列被分成3個結(jié)構(gòu)域(A-C)，如實施例6描述。潛在的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的七肽重復(fù)域的第一個和第四個殘基形成結(jié)構(gòu)域A，其中疏水的殘基被下劃線標出。R蛋白質(zhì)的保守基序在結(jié)構(gòu)域B中以小寫的斜體字母表示。匹配LRR細胞質(zhì)共有序列的殘基在結(jié)構(gòu)域C中以粗體表示。在序列中引入圓點以便將序列與LRR細胞質(zhì)序列的共有LRR序列進行對比。圖9.系統(tǒng)發(fā)生樹分析。A.本領(lǐng)域序列系統(tǒng)發(fā)生樹的狀態(tài)，該序列與推定的Rpi-blb氨基酸序列以及它的基因簇成員RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb具有一定程度同源性。依據(jù)Saitou和Nei(1987MolecularBiologyandEvolution4，406-425)的鄰近距離法繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。星號表示基因已被指派功能。Rpi-blb基因簇被置于框內(nèi)。B.本領(lǐng)域序列系統(tǒng)發(fā)生樹的狀態(tài)，該序列與推定的Rpi-blb氨基酸序列具有一定程度同源性。包括在這個分析中的有Rpi-blb同源序列B149-blb、SH10-tub、SH20-tub和T118-tar，使用Rpi-blb基因簇特異性引物，通過PCR擴增鑒定序列。C.本領(lǐng)域DNA系統(tǒng)發(fā)生樹的狀態(tài)，該序列顯示出與部分Rua-bulb基因序列存在顯著的同源性。水平線代表同源序列的相關(guān)位置。每條線的右邊顯示同源性程度。在每條線上顯示同源序列的長度。圖10.預(yù)測的Rpi-blb基因產(chǎn)物與預(yù)測的Rpi-blb同源物蛋白質(zhì)序列的對比。A.由Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb編碼的推定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物排列。顯示全部的Rpi-blb氨基酸序列和RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb的氨基酸殘基與Rpi-blb內(nèi)相應(yīng)的殘基不同。破折號指示插入的缺口以維持最佳排列。當與RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb內(nèi)的相應(yīng)位置比較時，Rpi-blb特異性的氨基酸殘以突出粗體表示。符合共有序列L..L..L.L..C/N/S..a..aP的LRR區(qū)域被下劃線標出。NBS結(jié)構(gòu)域的保守基序以小寫字母表示。B.由Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb、RGC4-blb、B149-blb、SH10-tub、SH20-tub和T118-tar編碼的推定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物對比。圖11.在Rpi-blb和同源的RGC1-blb和RGC3-blb之間產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的示意圖。豎向虛線表示用于發(fā)生交互的NsiI位點的位置。R和S表示轉(zhuǎn)基因植物是否攜帶分別對抗或易感于晚疫病的特異性嵌合結(jié)構(gòu)。實驗部分為了Rpi-blb抗性基因作圖，建立了一種S.Bulbocastanum的種內(nèi)作圖群體。在這個過程中的一種關(guān)鍵步驟是鑒定易感的S.bulbocastanum基因型。為此目的，用離脫葉分析來分析來源于不同簇/不同墨西哥地域的一些S.bulbocastanum保藏物的抗蔓延疫霉抗性或易感性(表1和圖1)。已篩選的保藏物BGRC8008和BGRC7999B不含有易感基因型。但是，在保藏物BGRC8005、BGRC8006和BGRC7997中，分析種子發(fā)現(xiàn)，易感性分別是9％、7％和14％。隨后篩選出一種蔓延疫霉易感克隆保藏物BGRC8006，并與一種抗性克隆保藏物BGRC8005進行雜交。產(chǎn)生的F1群體被用于繪制Rpi-blb基因座并且此后稱為B8群體。在離脫葉分析中初步篩選抗蔓延疫霉抗性的42個B8基因型，提示通過一種單顯性R基因或一種緊密連鎖基因簇可在S.bulbocastanum保藏物8005P中產(chǎn)生晚疫病抗性。在測試的42個基因型中，在重復(fù)實驗中有22個被評分為抗性，16個為易感性。剩下的4個秧苗抗性表型仍不清楚。為了確定這個S.bulbocastanum抗性在染色體的位置，使用確定表型的B8基因型作為標記物分析。染色體8特異性標記物TG330(表2)在互斥相(repulsionphase)與抗性表型連鎖，因為在這個標記物和12B8基因型抗性之間只獲得一種重組體。此外，發(fā)現(xiàn)染色體8標記物CT88(表2)在互斥相與抗性完全連鎖，說明稱為Rpi-blb的位于染色體8的這個區(qū)域的基因座是產(chǎn)生抗性的原因。為此原因，番茄染色體8靠近CT88(TG513和CT64；Tanksley等，1992Genetics1321141-1160；Table2)末梢的特異性標記物被插入CAPS標記物并在512個B8基因型中測試已知抗性表型。在這個篩選中鑒定出共5個CT64-CT88重組體基因型和41個CT88-TG513重組體基因型(圖2A)。Rpi-blb抗性基因座被繪制為距標記物CT88遠端的1個重組體事件(圖2A)。完成帶有CAPS標記物的精細的Rpi-blb基因座作圖，CAPS標記物來源于由抗性S.bulbocastanum基因型BGRC8005-8制備的BAC文庫分離的左側(cè)(L)和右側(cè)(R)BAC邊界序列。使用標記CT88和CT64初篩BAC文庫。采用這些標記物鑒定的BAC克隆被用作種BAC以便隨后進行染色體步行(chromosomewalk)達到Rpi-blb基因座。對總共2109個B8基因型篩選標記物TG513和CT64之間的重組。隨后使用在CT88-CT64基因間隔內(nèi)所有的可得標記物篩選所有的重組基因型(219/2109)。這些數(shù)據(jù)連同通過離脫葉分析獲得的每個重組體的疾病抗性數(shù)據(jù)，將Rpi-blb基因座定位于標記物SPB33L和B149R之間，為一0.1cM的基因間隔(4/2109重組體)，被重疊的BAC克隆SPB4和B49(圖2b和3)物理性橫跨。在這個間隔內(nèi)，抗性與BAC末端標記物SPB42L發(fā)生共分離，其序列與部分番茄來源的NBS片段具有高度同源性(例如，Q194、Q137、Q152、Q153；Pan等，2000Genetics155309-322)。使用SPB42L標記物的32p-標記的PCR片段作為一種探針的Southern分析BAC克隆生成的SP33L-B149R間隔，顯示至少存在4個如Rpi-blb間隔內(nèi)序列樣的R基因拷貝(圖4)。此外，所用這些拷貝存在于BACSPB4上。測序和注釋這個完全插入的BAC克隆確實鑒定了4個完全的植物R基因NBS-LRR類的R基因候選物(RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb和RGC4-blb)。一種位于RGC1-blb和RGC4-blb之間的PCR標記物顯示蔓延疫霉抗性和RGC4-blb之間的重組，排除了RGC4-blb是Rpi-blb的可能性。盡管有這個發(fā)現(xiàn)，仍篩選所有4個RGC進行互補分析。從BACSPB4亞克隆大約10kb攜帶RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb的基因組片段進入雙重植物轉(zhuǎn)化載體pBINPLUS(vanEngelen等，1995Trans.Res.4，288-290)，并使用標準轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化一種易感性馬鈴薯栽培品種。檢測初步轉(zhuǎn)化體的蔓延疫霉抗性，如實施例1描述。只有攜帶RGC2-blb的遺傳構(gòu)建能夠補足易感的表型；86％的攜帶RGC2-blb初步轉(zhuǎn)化體有抗性(表3)，但是，所有包含RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb的初步轉(zhuǎn)化體完全易感于蔓延疫霉。包含抗RGC2-blb的轉(zhuǎn)化體顯示與S.bulbocastanum抗性親代類似的抗性表型(圖5)。因此，RGC2-blb被指定為Rpi-blb基因，圖6提供了其DNA序列。實施例1疾病分析通過離脫葉分析確定抗蔓延疫霉的S.bulbocastanum的表型和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的基因型。樹葉來源于在溫室中生長6到12個星期的植物，其被種在一片水飽和種花用泡沫塑料中，大約35×4×4cm，放置在底部穿孔的盤子中(40cm寬，60cm長，6cm高)。每片樹葉在離軸面接種2個或更多(每個25μl)包囊孢子小滴溶液。隨后，盤子被放入一種塑料袋，在每個盤子頂上放上一張水飽和的濾紙，17℃孵育16/18小時，白天/夜晚，使用熒光燈(PhilipsTLD50W/84HF)的光照周期。6天后，根據(jù)出現(xiàn)的蔓延疫霉疾病癥狀評價樹葉。植物的樹葉清晰地顯示孵育6天后形成孢子損傷，被認為是易感型表型，但是，植物的樹葉顯示在接種邊緣沒有可見的癥狀或壞死，缺乏顯著的孢子形成，被認為具有抗性。使用從植物研究國際組織BV(Wageningen，TheNetherlands)獲得的蔓延疫霉復(fù)合分離物655-2A(種1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11)進行分析。實施例2Rpi-blb抗性基因座作圖植物材料為了產(chǎn)生一種分離存在于S.bulbocastanum保藏物BGRC8005(CGN17692，PI275193)上的蔓延疫霉抗性基因的種內(nèi)作圖群體，需要一種易感的S.Bulbocastanum基因型。離脫葉分析從來源于不同簇/不同墨西哥地域的幾個S.bulbocastanunt保藏物的蔓延疫霉抗性或易感性(表1和圖1)。在保藏物BGRC8008和BGRC7999中沒有檢測到易感性。在保藏物BGRC8005，BGRC8006和BGRC7997中，分析秧苗的易感性分別只有9％，7％和14％。因此，只獲得少數(shù)易感的S.bulbocastanum基因型。將一種蔓延疫霉易感克隆保藏物BGRC8006與一種抗性克隆保藏物BGRC8005雜交產(chǎn)生S.bulbocastanum(B8)的種內(nèi)作圖群體。依據(jù)Doyle和Doyle(1989Focus12，13-15)從新生樹葉提取2109子代植物的DNA。CAPS標記物分析為進行PCR分析，準備15μl反應(yīng)混合物，包含0.5μgDNA，每個引物15ng，0.2mM每種dNTP，0.6單位的Taq-聚合酶(15U/l，SphaeroQ，Leiden，TheNetherlands)，10mMTris-HClpH9，1.5mMMgCl2，50mMKCl，0.1％TritonX-100和0.01％(w/v)凝膠。采用如下循環(huán)完成PCR94℃，DNA變性25秒，退火30秒(見表1)，72℃延伸40秒。在PCR擴增的第一步DNA94℃變性5分鐘，在最后步驟照，額外在72℃延伸5分鐘。在BiometraT-Gradient或BiometrasUno-II熱循環(huán)儀(Westburg，Leusden，TheNetherlands)上完成擴增反應(yīng)。依靠標記物，使用適當?shù)南拗菩悦赶疨CR產(chǎn)物。標記物的一般觀察，包含引物序列，退火溫度和限制性酶，在表2給出。隨后，瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳分析已消化的PCR產(chǎn)物。使用Clean凝膠DNA分析試劑盒和DNA銀染試劑盒(AmershamPharmaciaBiotechBenelux，Roosendaal，theNetherlands)進行丙烯酰胺凝膠分析。Rpi-blb基因座遺傳作圖最初，離脫葉分析篩選一小群B8群體的42個子代植物的蔓延疫霉抗性。植物樹葉清晰的顯示接種6天后形成孢子損害，被認為具有易感表型，然而當植物樹葉顯示缺少明顯的孢子形成時，在接種邊緣沒有可見癥狀或壞死，被認為具有抗性。42個秧苗中，22個被評分為抗性，16個為易感性。剩下的4個秧苗的表型在最初階段仍不清楚。這些數(shù)據(jù)說明抗性是由于一種單顯性基因或一種緊密連鎖基因簇。為了確定染色體位置，使用可靠表型的秧苗進行標記物分析。發(fā)現(xiàn)染色體8標記物TG330在互斥相與抗性表型連鎖，在12B8秧苗中的這個標記物和抗性之間只獲得一種重組體。此外，發(fā)現(xiàn)染色體8標記物CT88在互斥相與抗性完全連鎖，說明抗性基因位于染色體8上。隨后，已被作圖的靠近CT88(Tanksley等，1992Genetics1321141-1160)末端的染色體8特異性標記物發(fā)展為CAPS標記物。為了更精確繪制這些標記物，使用離脫葉疾病分析篩選另外的512個B8群體個體的晚疫病抗性。同時，評價植物的標記物CT64、CT88和TG513。有5個秧苗檢測到標記物CT64和CT88之間的重組，有41個秧苗檢測到在標記物CT88和TG513(圖2A)之間重組。在標記物CT64和CT88之間繪制抗性基因Rpi-blb。在這個時期，僅基于一種重組秧苗將Rpi-blb定位于與CT88鄰近的位置。為了更好的確定Rpi-blb相對于獲得的標記物的位置，生長和分析B8群體的另外1555個秧苗在標記物TG513和CT64之間的重組。因此，篩選B8群體的總共2109個個體子代克隆。在219個秧苗中檢測標記物TG513和CT64之間的重組(10.4cM)。利用離脫葉分析篩選所有這些重組體的標記物CT88和抗性特性的表型。與早期的結(jié)果一致，在標記物CT88和CT64之間(圖2B)繪制Rpi-blb基因。實施例3構(gòu)建一種S.BULBOCASTANUMBAC文庫以及構(gòu)建一種連續(xù)的橫跨Rpi-blb基因座的BAC重疊群BAC文庫構(gòu)建Rpi-blb基因座雜合的一種S.bulbocastanum(blb)保藏物BGRC8005(CGN17692，PI275193)的抗性克隆被用作構(gòu)建一種基因組BAC文庫的DNA來源，此后稱為8005-8BAC文庫。如RouppevanderVoort等(1999MPMI12197-206)描述完成高分子量DNA制備和BAC文庫構(gòu)建。最終獲得具有平均插入100kb大小的大約130,000克隆，其相應(yīng)于15個基因組等價物?？偣泊蠹s83,000單個克隆被儲存于216384-孔微量板(Invitrogen，TheNetherlands)，包含LB凍存緩沖液(在LB培養(yǎng)基中含36mMK2HPO4，13.2MmKH2PO4，1.7mM檸檬酸鹽，0.4mMMgSO4，6.8mM(NH4)2SO4，4.4％V/V甘油，12.5μg/ml氯霉素)，儲存于-80℃。另50,000克隆被儲存作為細菌庫，其包含大約1000個白色克隆。使用一種消毒的玻璃涂布器自這些瓊脂板中挑克隆放入包含18％甘油和12.5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中。這些所謂的超細菌庫也儲存于-80℃。篩選BAC文庫和構(gòu)建一種Rpi-blb基因座物理圖譜。使用CAPS標記物CT88和CT64初篩8005-8BAC文庫。按如下步驟完成。文庫的第一部分大約83,000克隆儲存在384孔微量板中，使用標準堿性裂解方法(Sambrooketal.，1989inMolecularcloningalaboratorymanual2ndedn，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NewYork)從每板細菌庫分離質(zhì)粒DNA產(chǎn)生216板細菌庫。PCR篩選培養(yǎng)板細菌庫鑒別攜帶CAPS標記物的單個BAC克隆。一旦一種單個培養(yǎng)板細菌庫被鑒定為特異性的CAPS標記物陽性，通過雙向PCR篩選確定陽性的行和列。為此目的，在含氯霉素(12.5μg/ml)的LB培養(yǎng)基中2次復(fù)制384孔母板。克隆37℃生長16小時后，一種培養(yǎng)板每行刮下24克隆，其他培養(yǎng)板每列刮下16克隆。每行或列的細菌以200μlTE緩沖液重懸。隨后，0.5μl細菌懸液分析CAPS標記物可鑒定單陽性BAC克隆。文庫第二部分，儲存大約50庫近1000個克隆，使用標準堿裂解方法從每個克隆庫分離質(zhì)粒DNA并且完成PCR鑒定陽性庫。相應(yīng)陽性庫的細菌被稀釋和種入含氯霉素(12.5μg/ml)的LB瓊脂板。隨后，單個白色克隆被挑進384孔微孔板，隨后，單陽性BAC克隆按如上描述鑒定。從超細菌庫中分離的BAC克隆的名稱帶有前綴SP(例如SPB33)。BAC克隆插入片段的大小如下評估。使用從2ml過夜培養(yǎng)物中(LB培養(yǎng)基補充12.5mg/ml氯霉素)使用標準堿裂解小量制備方法分離質(zhì)粒DNA分析陽性BAC克隆并重懸在20μlTE。質(zhì)粒DNA(10μl)使用5個單位NotI，37℃消化3個小時，從pBeloBAC11載體釋放基因組DNA。使用BIORADCHEFDRII系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories，USA)，150V，14秒恒定脈沖時間，1％瓊脂糖凝膠，0.5XTBE進行CHEF電泳16個小時，分離消化的DNA。篩選帶有標記物CT88的8005-8BAC文庫，鑒定2個陽性BAC克隆B139和B180，分別有130和120kb的馬鈴薯DNA插入(圖3A)。消化從這些BAC克隆產(chǎn)生的CT88PCR產(chǎn)物以及幾個抗性和易感性帶有MboI的B8群體的子代植物揭示帶有CT88等位基因的BAC139與抗性順式連鎖。為了鑒定BACB139相關(guān)的基因組位置，基于插入物的右邊(R)和左邊(L)末端設(shè)計一對PCR引物。如實施例4描述，使用0.5μgBACDNA為模板完成BAC末端測序。使用數(shù)種切割4-堿基的限制性內(nèi)切酶消化B8群體雙親基因型的PCR產(chǎn)物以及雙抗性和雙易感性子代基因型，建立多態(tài)性CAPS標記物(表2)。通過篩選37個CT88-CT64重組B8基因型將7個CT88-Rpi-blb重組體中的5個定位于CT88和B139R之間，說明標記物B139R比標記物CT88相對更靠近Rpi-blb基因座。以B139R篩選216個培養(yǎng)板細菌庫沒有鑒定出一種陽性BAC克隆。篩選50個超細菌庫，鑒定了分別插入85kb和75kbDNA的陽性BAC克隆SPB33和SPB42(圖3A)。篩選全部的SPB33LBAC庫鑒定陽性BAC克隆B149和SPB4。BAC克隆SPB4含SPB33L等位基因，它與抗性順式連鎖，然而BAC克隆B149沒有。但是，篩選B149R的CT88-CT64重組板顯示這個BAC橫跨Rpi-blb基因座。通過2個重組事件從Rpi-blb基因座分離B149R(圖3A)。篩選8005-8BAC庫B149R鑒定BAC克隆B49同樣具有B149R等位基因可與抗性順式連鎖。因此，這個BAC克隆與BAC克隆SPB4形成一種橫跨Rpi-blb基因座的BAC重疊群(圖3)。實施例4BACSPB4序列分析和Rpi-blb基因座的抗性候選基因的鑒定在SPB33L-B149R間隔內(nèi)，抗性與BAC和標記物SPB42L共分離，它的序列與番茄的部分NBS片段有高度同源性(如Q194，Q137，Q97，Q152，Q153；Pan等，2000Genetics155309-22)。使用一種32P標記的SPB42L標記物的PCR片段作為探針進行Southern分析BAC克隆生成的SPB33L-B149R間隔，揭示在Rpi-blb間隔內(nèi)至少存在4個R基因樣序列拷貝(圖4)。此外，所有這些拷貝存在于BACSPB4上。因此，通過鳥槍序列分析(shotgunsequenceanalysis)確定BAC克隆SPB4的DNA序列。產(chǎn)生一組隨機的平均插入1.5kb大小的亞克隆。10μgCsCl純化的DNA溶于200μlTE中，使用一種MSEsoniprep150超聲粉碎儀，6微伏在冰上剪切6秒。乙醇沉淀后重懸于20μlTE，使用T4DNA聚合酶修復(fù)DNA末端片段，11℃孵育25分鐘，50μl反應(yīng)混合液包含1xT4DNA聚合酶緩沖液(NewEnglandBioLabs，USA)1mMDTT，100μM所有4種dNTP′s和孵育65℃，15分鐘后，加入T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，USA)。隨后，使用1％SeaPlaqueLMP瓊脂糖凝膠(FMC)電泳分離剪切的DNA。從膠上切下1.5-2.5kb大小片段并在50mlTE中透析2小時，4℃。透析后的瓊脂糖片被轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管，70℃融化5分鐘，每100mg瓊脂糖使用1個單位GELASE(EpicentreTechnologies，USA)消化，45℃，1小時。隨后，沉淀DNA。使用EcoRV限制性內(nèi)切酶和去磷酸化的pBluescriptSK+vector(StratageneInc.)16℃，連接1.5-2.5kb片段。隨后，通過使用BioRadGenePulser的電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化ElectroMAXE.coliDH10B感受態(tài)細胞(LifeTechnologies，UK)。BioRadGenePulser的設(shè)置推薦使用操作手冊。細胞涂布在LuriaBroth(LB)瓊脂板上，其含有氨芐青霉素(100μg/ml)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，Xgal)(64μg/ml)和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside，IPTG)(32μg/ml)。平板在37℃孵育23小時。在96孔平底燒瓶中生長單個白色菌落(1.5mlTerrificBroth培養(yǎng)基，含有100μg/ml氨芐青霉素)。按照手冊使用QIAprep96TurboMiniprep系統(tǒng)和BioRobotTM9600(QIAGEN)分離質(zhì)粒DNA。按照手冊使用ABIPRISMBigDyeTMTerminatorcyclesequencing試劑盒(Stratagene)進行測序反應(yīng)。所用克隆使用通用引物雙向測序。測序產(chǎn)物使用PerkinElmerABI3700DNA分析儀毛細管電泳分離。使用Phred-Phrapprograms(Ewing和Green，1998GenomeResearch8，186-194；Ewing等，1998GenomeResearch8，175-185)完成鳥槍法自動集合讀數(shù)。提供覆蓋全部BAC序列5x的總共835個讀數(shù)。通過引物步行(primerwalking)或一種聯(lián)合PCR方法閉合重疊群之間的間隔。最終，序列在Phredquality40(每10,000nt，1個錯誤)上使用Gap4contigeditor手動觀察和再次測序所有低質(zhì)量區(qū)域的集合編輯序列。BACSPB4插入體的完整序列由77,283個核苷酸組成。使用電腦程序GENSCAN(Burge和Karlin，1997J.Mol.Biol268，78-94)，GENEMARK(Lukashin和Borodovsky，1998NAR26，1107-1115)和BLASTX(Altschul等，1990J.Mol.Biol.215，403-410)分析BACSPB4臨近的序列鑒定4個屬于植物R基因NBS-LRR類的完全R基因候選序列(RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb和RGC4-blb)。在RGC1-blb和RGC4-blb之間設(shè)計一種CAPS標記物，標記物RGC1-4顯示出蔓延疫霉抗性和RGC4-blb之間的重組，排除RGC4-blb是Rpi-blb的可能性(圖3A和B)。盡管有這個發(fā)現(xiàn)，仍篩選所有4個RGC進行互補分析。實施例5互補分析候選基因亞克隆并轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌大約10kb的攜帶RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb的基因組片段從BAC克隆SPB4亞克隆進入雙重植物轉(zhuǎn)化載體pBINPLUS(vanEngelen等，1995Trans.Res.4，288-290)。限制性內(nèi)切酶消化BAC克隆SPB4DNA并按如下方法完成隨后的大小篩選。使用1單位，0.1單位或0.01單位的Sau3AI限制性內(nèi)切酶消化部分大約1μgDNA，30分鐘。部分消化的BACDNA進行CHEF電泳，在4℃，0.5XTBE，使用一種1-10秒頻率的直流增加脈沖和磁場強度6V/cm，16小時。電泳后，用EB染色瓊脂糖凝膠定位大約10kb大小DNA片段的區(qū)域。使用玻璃蓋玻片(glasscoverslip)將這個區(qū)域從凝膠切下，在50mlTE中透析2小時，4℃。透析的凝膠碎片轉(zhuǎn)入一種1.5mlEppendorf管，70℃，融化5分鐘，每100mg瓊脂糖凝膠使用1單位GELASE(EpicentreTechnologies，USA)消化45℃，1小時。連接BamHI消化的篩選大小的DNA和去磷酸化的pBINPLUS，隨后，轉(zhuǎn)化連接的DNA到ElectroMAXE.ColiDH10B感受態(tài)細胞(LifeTechnologies，UK)，使用BioRad基因脈沖發(fā)生器電傳孔法如實施例5描述完成。細胞被涂布在含卡那霉素(50μg/ml)，Xgal(64μg/ml)和IPTG(32μg/ml)的LB瓊脂糖板上，板子在37℃孵育24小時，在96孔板中生長出單個白色克隆(100μlLB培養(yǎng)基包含50μg/ml卡那霉素)。使用引物SPB42LF和SPB42LR或RGC4F和RGC4R(表2)PCR篩選總共480個克隆的RGC存在。篩選的陽性克隆用于質(zhì)粒分離和更進一步的特性。對陽性克隆來源的SPB42LPCR片段測序完成攜帶RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb克隆的鑒定。對克隆末端測序確定RGC在一種亞克隆的相對位置并隨后比較這些序列與完全的BAC插入序列。最后，篩選出4個雙重質(zhì)粒pRGC1-blb、pRGC2-blb、pRGC3-blb和pRGC4-blb并使用BioRad基因脈沖發(fā)生器電穿孔法或通過結(jié)合轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進入根癌農(nóng)桿菌株AGLO(Lazo等，1991Bio/Technology9，963-967)，LBA4404(Hoekema等，1983Nature303179-180)或UIA143(Farrand等，1989J.ofBacteriology171，5314-5321)。BioRad基因脈沖發(fā)生器設(shè)置為說明書推薦的根癌農(nóng)桿菌株設(shè)置。按照Simon等(1983Bio/Tech.1，784-791)等的描述完成結(jié)合。細胞被涂布在含卡那霉素(100mg/l)和利福平(50mg/l)的LB瓊脂糖板上。板子在28℃孵育48小時。在含卡那霉素(100mg/l)和利福平(50mg/l)的LB培養(yǎng)基中進行篩選克隆的小量培養(yǎng)。如先前所述分離質(zhì)粒DNA并通過限制酶切分析從根癌農(nóng)桿菌再次分離和隨后的轉(zhuǎn)化到大腸桿菌來檢驗質(zhì)粒的完整。攜帶一種正確DNA序列模式質(zhì)粒的根癌培養(yǎng)物被用于轉(zhuǎn)化一種易感的馬鈴薯基因型。轉(zhuǎn)化易感的馬鈴薯栽培品種根癌農(nóng)桿菌株在20ml補充50mg/l利福平和25mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基，28℃，生長2天。隨后，0.2ml根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物被稀釋到含同樣抗生素的10mlLB培養(yǎng)基，生長過夜(28℃)。過夜的培養(yǎng)物離心(30min，2647xg)。沉淀重懸在補充有30mg/l蔗糖(MS30)的50mlMS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962Physiol.Plant.15，473-497)。馬鈴薯栽培品種Impala的合格種子被剝開并且表面在含0.1％Tween-20的1％次氯酸鈉溶液中滅菌30分鐘。然后，用大量無菌蒸餾水(4次，10分鐘)徹底沖洗塊莖。從corkborer制備的柱狀塊莖組織切下大約2mm厚，7mm直徑的圓片。塊莖圓片被轉(zhuǎn)入含根癌農(nóng)桿菌的MS30液體培養(yǎng)基，孵育15分鐘。去除根癌農(nóng)桿菌溶液后，塊莖圓片被轉(zhuǎn)入含MS30，0.9mg/lIAA，3.6mg/l玉米素核糖甙(zeatineriboside)和8g/l瓊脂(Hoekema等，1989Bio/Technology7，273-278)的再生培養(yǎng)基。培養(yǎng)盤在24℃孵育，16小時/每天(PhilipsTLD50W/84HF)。共同培養(yǎng)48小時后，塊莖圓片在含抗生素200mg/l萬古霉素，250mg/l頭孢噻肟和75mg/l卡那霉素的液體MS培養(yǎng)基中漂洗5分鐘，并被轉(zhuǎn)入補充同樣抗生素的再生培養(yǎng)基。培養(yǎng)盤在24℃孵育，16小時/每天(PhilipsTLD50W/84HF)。每3個星期，塊莖圓片被轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基。再生芽被轉(zhuǎn)入含75mg/l卡那霉素的MS30培養(yǎng)基。體外繁殖根芽，在3mlLB培養(yǎng)基孵育一片莖(3星期，37℃，400轉(zhuǎn))測試根癌農(nóng)桿菌細胞的缺乏。每種轉(zhuǎn)化再生體的一株植物被轉(zhuǎn)入溫室。馬鈴薯中易感表型的互補如實施例1描述檢測初代轉(zhuǎn)化體內(nèi)抗蔓延疫霉的抗性。只有攜帶RGC2-blb的遺傳構(gòu)建可以補足易感表型，包含初代轉(zhuǎn)化體的15/18的RGC2-blb具有抗性(表3)，因此，包含RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb的所有初代轉(zhuǎn)化體是完全易感于蔓延疫霉。RGC2-blb轉(zhuǎn)化體抗性顯示與S.Bulbocastanum抗性雙親類似的抗性表型(圖5)。因此，RGC2-blb被指定為Rpi-blb基因，圖6提供了其DNA序列。易感番茄的轉(zhuǎn)化易感番茄系Moneymaker的易感種子在70％乙醇中漂洗以溶解種子外衣并使用無菌水沖洗。隨后，使用1.5％次氯酸鈉將種子表面消毒15分鐘，用無菌水漂洗3次并被放置在裝有140mlMS培養(yǎng)基，pH6.0(Murashige和Skoog，1962Physiol.Plant.15，473-497)，補充了10g/l蔗糖(MS10)和160mlvermiculite的容器里。將這些種子留下發(fā)芽，生長8天，25℃，0.5W/M2光照。生長8天的舊子葉外植體在一種培養(yǎng)皿中預(yù)培養(yǎng)24小時，平皿包含一種生長2星期的種植在共同培養(yǎng)基中的煙草懸浮細胞舊飼養(yǎng)層(MS30pH5.8補充Nitsch維生素(DuchefaBiochemieBV，Haarlem，TheNetherlands)，0.5g/lMES緩沖液和8g/lDaichin瓊脂)培養(yǎng)皿中。將過夜培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌離心，沉淀重懸在包含200μM乙酰丁香酮到最終O.D.600為0.25的細胞懸浮培養(yǎng)基中(MS30pH5.8補充Nitsch維生素，0.5g/lMES緩沖液，pH5.8)。然后，外植體被稀釋的培養(yǎng)過夜的含有輔助質(zhì)粒pCH32(Hamilton等，1996PNAS93，9975-9979)和pRGC2-blb的根癌農(nóng)桿菌株UIA143(Farrand等，1989J.ofBacteriology171，5314-5321)感染25分鐘，印跡在無菌濾紙上干燥，在原始的飼養(yǎng)層板上共同培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)條件如上所述。共同培養(yǎng)之后，子葉外植體被轉(zhuǎn)化到裝有選擇性芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MSpH5.8，補充10g/l葡萄糖，包括Nitsch維生素，0.5g/lMES緩沖液，5g/l瓊脂凝膠，2mg/l玉米素核糖甙，400mg/l羧芐青霉素，100mg/l卡那霉素，0.1mg/lIAA)的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)25℃，3-5W/m2光照。外植體每3個星期傳代培養(yǎng)加入新鮮培養(yǎng)基。從下面的愈傷組織切下形成的芽并轉(zhuǎn)入裝有選擇性根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS10，pH5.8，補充Nitsch維生素，0.5g/lMES緩沖液，5g/l瓊脂凝膠，0.25mg/lIBA，200mg/l羧芐青霉素和100mg/l卡那霉素)的容器。番茄中易感表型的互補研究是否Rpi-blb能夠補充番茄中的易感表型，攜帶Rpi-blb基因構(gòu)建體的Moneymaker初級轉(zhuǎn)化體最初遇到蔓延疫霉分離群體IP0655-2A和IP0428來源的馬鈴薯的挑戰(zhàn)。7/9初級轉(zhuǎn)化體具有抗性(表3)。由于觀察到檢測馬鈴薯蔓延疫霉分離群體在番茄上比在馬鈴薯上具有更少的致病性，也對初級轉(zhuǎn)化體用易感的住宅花園番茄植物中收集獲得的蔓延疫霉分離群體進行測試。即使這個分離群體在Moneymaker上比先前測試的一種顯著地具有更高的致病性，所有7個初級轉(zhuǎn)化體保留抗性。這些結(jié)果闡明Rpi-blb基因的潛在效力不僅對抗馬鈴薯來源的復(fù)合分離群體也對抗番茄上的這些特異性的。分子分析初級轉(zhuǎn)化體RT-PCR分析為了制備DNA，變性19μl混合液(1分鐘，83℃)，包含1μg總或polyARNA，每個dNTP0.25mM，50mMTris-HClpH8.3，75mMKCl，3mMMgCl2，10mMDTT和530ngoligod(T)引物，將GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18變性1分鐘。隨后，混合液被放在42℃，加入1μl反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLVreversetranscriptase，PromegaBeneluxb.v.，Leiden，TheNetherlands)。60分鐘后，混合物加熱1分鐘，99℃，轉(zhuǎn)移到冰上。2μlDNA用于標準PCR?？焖贁U增cDNA末端。使用GeneRacerTM試劑盒(InvitrogenTM，TheNetherlands)快速擴增cDNAends(RACE)鑒定Rpi-blbcDNA的5′和3′末端。使用引物GSP1(5′-GAGGAATCCATCTCCCAGAG)和GSP2(5′-GTGCTTGAAGAGATGATAATTCACGAG)聯(lián)合使用GeneRacerTM3引物和GeneRaceTM3′嵌套引物完成3′RACE。使用引物GSP3(5′-GTCCATCTCACCAAGTAGTGG)，GSP4(5′-GAAATGCTCAGTAACTCTCTGG)和GSP5(5′-GGAGGACTGAAAGGTGTTGG)聯(lián)合使用GeneRacerTM5′和GeneRacerTM5′嵌套引物在cDNA合成上完成5′RACE。(圖7)實施例6Rpi-blb基因和相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比較由5′和3′快速擴增cDNA末端產(chǎn)生的cDNA片段插入pRGC2-blb來源的基因組序列，鑒定Rpi-blb基因的大小和結(jié)構(gòu)。RACE分別鑒定單一種類的5′和3′Rpi-blb特異性cDNA片段，提示基因組克隆編碼一種單Rpi-blb特異性轉(zhuǎn)錄。Rpi-blb轉(zhuǎn)錄的編碼序列是2913個核酸。推定的Rpi-blb轉(zhuǎn)錄估計有3138核苷酸(nt)和分別含有一種44和181nt長的5′-和3非翻譯區(qū)(UTR)。Rpi-blb基因含有一種位于基因的翻譯開始密碼子ATG之后，從428nt開始的678nt的單內(nèi)含子(圖3C)。推定的Rpi-blb基因開放閱讀框編碼一種預(yù)知其分子量約為110.3kD的970氨基酸多肽(圖8)。顯然，植物R基因的NBS-LRR類的R基因上的幾個功能性基序存在于編碼的被分為3個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中(A、B和C；圖8)。蛋白質(zhì)的N末端部分包含可能的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，七肽重復(fù)位于通常是疏水的第一和第四殘基(結(jié)構(gòu)域A)。攜帶NBS的結(jié)構(gòu)域B和其它基序組成R蛋白質(zhì)的NB-ARC結(jié)構(gòu)域(Apaf-1，R蛋白質(zhì)，和CED-4的ARC)和動物體內(nèi)的細胞死亡調(diào)節(jié)子(vanderBiezen和Jones，1998)。這個結(jié)構(gòu)域包括存在于真核和原核來源蛋白質(zhì)中的Ap-ATPase基序(Aravind等，1999TrendsBiochem.Sci.24，47-53)。Rpi-blb的C末端的一半包含一系列19-20不規(guī)則的LRR(結(jié)構(gòu)域C)。依據(jù)共有序列LxxLxxLxLxxC/N/SxxLxxLPxxa，LRR可被排列，x指任何殘基，“a”指脂肪族氨基酸的位置，其后跟隨一種變化的長度。這個重復(fù)形式近似細胞質(zhì)LRR的共有序列(Jones和Jones，1997Adv.Bot.Res.24，89-167)。實施例7Rpi-blb基因的天然同源物和人工變體天然同源物Rpi-blb基因的編碼DNA序列的BLASTN的同源性研究鑒定了許多序列與Rpi-blb基因短的序列段(shortstretches)有顯著的同源性(圖9C)。Rpi-blb基因編碼序列的核苷酸549-1245與部分番茄的NBS片段享有81-90％序列相同性(例如Q194，Q137，Q198和Q199；Pan等，2000Genetics.155309-22)。這些同源序列的長度在525和708核苷酸之間變化，它們是PCR片段，基于普遍存在的NBS基序使用(簡并)引物對系統(tǒng)掃描番茄基因組鑒定PCR片段(Pan等，2000Genetics.155309-22；Leister等，1996NatGenet.14421-429)。與現(xiàn)有技術(shù)顯著同源的Rpi-blb基因的另一種區(qū)域包含編碼序列的核苷酸76-805。這個729nt長的序列與馬鈴薯的EST(EMBL數(shù)據(jù)庫，保藏號BG890602；圖9C)有91％的序列相同性。Rpi-blb基因序列的下游核苷酸1245，包含LRR區(qū)域，與現(xiàn)有技術(shù)任何序列無顯著同源性。Rpi-blb基因編碼序列的BLASTX同源搜索揭示多種現(xiàn)有技術(shù)的序列的氨基酸序列同源性不超過36％的序列相同性(表4)。衍生自O(shè)ryzasativa的NBS-LRR基因獲得了最好BLASTX分數(shù)(36.5％氨基酸序列相同性)。與Rpi-blb具有27-36％氨基酸序列相同性的全部序列同源性的NBS-LRR基因可在鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、番茄(Lycopersiconesculentum)(鐮刀霉I2基因簇；Ori等，1997PlantCell，9，521-532；Simons等，1998PlantCell10，1055-1068)、玉蜀黍(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)和萵苣(Lactucasativa)中發(fā)現(xiàn)。使用Saitou和Nei的鄰近距離法(1987MolecularBiology和Evolution4，406-425)，Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb，RGC4-blb的推定氨基酸序列和衍生自多個品種的現(xiàn)有基因(BLASTX限定)的同源物的系統(tǒng)發(fā)生研究顯示Rpi-blb基因簇的成員可以置于一種分枝中(圖9)。在8005-8BAC克隆SPB4上鑒定的Rpi-blb基因簇的4個RGC的序列比較顯示Rpi-blb基因簇的序列同源性在氨基酸水平在70％和81％之間變化。Rpi-blb的推定氨基酸序列與RGC3-blb具有最高的全部同源性(81％氨基酸序列相同性；表4)。當比較不同的結(jié)構(gòu)域時，很清楚蛋白質(zhì)的N末端(卷曲螺旋和NB-ARC結(jié)構(gòu)域)(91％氨基酸序列相同性)比這些蛋白質(zhì)的C末端享有更高程度的同源性(LRR；71％氨基酸序列相同性)。NBS-LRR蛋白質(zhì)的N末端影響下游信號成分的需要，因此被認為是假定的受體結(jié)構(gòu)域(Feys和Parker，2000TrendsGenet16449-55)。通過遺傳研究，誘導(dǎo)物識別特異性提示了C末端的LRR區(qū)域，(Ellis等，2000TrendsPlantSci.5373-379；Dodds等，2001PlantCell13163-78)。比較所有4個氨基酸序列揭示總共104Rpi-blb特異性氨基酸殘基(圖4A)。這些中的多數(shù)位于LRR區(qū)域內(nèi)(80/104)。在后面的區(qū)域內(nèi)，這些特異性的殘基集中在LRR亞結(jié)構(gòu)域xxLxLxxxx內(nèi)。這些特異性的氨基酸殘基在LRR亞結(jié)構(gòu)域內(nèi)相關(guān)的頻率(28.3％)是其余LRR結(jié)構(gòu)域(12.3％)觀察到的2倍高。在共有序列xxLxxLxxxx內(nèi)位于2個保守亮氨酸殘基周圍的殘基被認為溶劑暴露并因此可能涉及創(chuàng)造/保持抗性蛋白質(zhì)識別特異性。通過篩選基因組DNA或插入文庫，獲得Rpi-blb基因另外的同源物序列，例如，基于Rpi-blb基因序列信號的BAC文庫的引物。篩選不同的茄科植物BAC文庫的引物組A和/或B(表2和圖7)鑒定其它茄科植物bulbocastanum(B149-blb)，馬鈴薯(SH10-tub和SH20-tub)和S.tarijense(T118-tar)來源的Rpi-blb同源物。比較所有8個蛋白質(zhì)序列減少特異性的氨基酸殘基數(shù)量到51(51/970；5.25％)(圖10B)。多數(shù)位于LRR區(qū)域內(nèi)(42/51；82％)。在LRR亞結(jié)構(gòu)域xxLxlxxxx內(nèi)這些特異性的氨基酸殘基的相關(guān)頻率是其余LRR結(jié)構(gòu)域觀察到的3.3倍高(分別是18.8％對5.7％)。這些數(shù)據(jù)清晰的顯示蔓延疫霉特異性抗性在Rpi-blb基因簇內(nèi)的發(fā)展主要通過轉(zhuǎn)變Rpi-blbLRR特異性的殘基。使用Saitou和Nei的鄰近距離法(1987MolecularBiology和Evolution4，406-425)，在上述系統(tǒng)發(fā)生樹分析中包含另外的Rpi-blb同源物，更加證明系統(tǒng)發(fā)生樹分析作為一種定義Rpi-blb同源物序列的方法(圖9B)。在氨基酸水平，具有至少70％序列相同性的任何功能性R基因產(chǎn)物，作為Rpi-blb基因簇的基因產(chǎn)物在同樣的分枝上結(jié)束，因此被定義為Rpi-blb的同源物。人工變體結(jié)構(gòu)域在不同同源物之間交換可確定不同序列在蔓延疫霉抗性中的作用。例如，限制性內(nèi)切酶NsiI，其識別存在于保守MHD基序內(nèi)的DNA序列ATGCAT，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，其可用于Rpi-blb與RGC1-blb或RGC3-blb之間交換完全的LRR結(jié)構(gòu)域。Rpi-blb基因嵌合的變體被制成，它編碼Rpi-blbN末端的一半，RGC1-blb或RGC3-blbC末端的一半和反之，即，RGC1-blb或RGC3-blb的N末端和Rpi-blb的C末端(圖11)。這些變體被轉(zhuǎn)化到易感的馬鈴薯基因型Impala，檢測蔓延疫霉抗性。嵌合RGC3-blb基因包含Rpi-blb的LRR結(jié)構(gòu)域，可對抗蔓延疫霉說明Rpi-blb基因的特異性由這部分基因所編碼。表1.蔓延疫霉易感性在不同S.bulbocastanum保藏物的概況S.bulbocastanum保藏物###％CGNBGRCPI植物RV易感性基因簇a176928005275193111019A8006275194161516A17693800827519819180B1768779972435053525414B176887999255518191900Ca字母a、b和c代表如圖1所示的有關(guān)的地理起源表2.用于Rpi-blb作圖的標記物的概況標記物方向a序列b退火溫度(℃)限制性酶cTG513FCGTAAACGCACCAAAAGCAG58a.s.RGATTCAAGCCAGGAACCGAGTG330FCAGCTGCCACAGCTCAAGC56TaqIRTACCTACATGTACAGTACTGCCT88FGGCAGAAGAGCTAGGAAGAG57MboIRATGGCGTGATACAATCCGAGFTTCAAGAGCTTGAAGACATAACA60a.s.RATGGCGTGATACAATCCGAGCT64FACTAGAGGATAGATTCTTGG56CfoIRCTGGATGCCTTTCTCTTATGTB139RFGATCAGAAGTGCCTTGAACC56TaqIRCAAGGAGCTTGGTCAGCAGSPB33LFATTGCACAGGAGCAGATCTG59HinflRTGTAAGAGAGCAAGAGGCACSPB42LFAGAGCAGTCTTGAAGGTTGG58CfoIRGATGGTAACTAAGCCTCAGGB149RFGACAGATTTCTCATAAACCTGC58MseI/XbaIRAATCGTGCATCACTAGAGCGRGC1-4FTGTGGAGTAAGAGAGGAAGG62SspI/MseIRTCAGCTGAGCAGTGTGTGGAFATGGCTGAAGCTTTCATTCAAGTTCTG60RTCACACCGCTTGATCAGTTGTGGACBFTRCATGAYCTMATCCATGATTTGC60RGMAATTTTGTGCCAGTCTTCTCCa引物方向，F(xiàn)正向，R反向b依據(jù)IUB編碼的引物序列.ca.s.等位基因特異性表3.在馬鈴薯和番茄中晚疫病易感性的互補基因型a含有RGA的植物/轉(zhuǎn)化體R植物/含有RGA的植物IMP(RGC1-blb)15/17b0/158/9d0/8IMP(RGC2-blb)6/31c6/612/14d9/12IMP(RGC3-blb)0/6c-5/5d0/5IMP(RGC4-blb)18/19b0/181/12C0/1IMP(vector)8/8b0/89/10d0/9MM(RGC2-blb)9/11d7/9a以含有Rpi-blb基因候選基因RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb的T-DNA構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)化易感馬鈴薯和番茄基因型Impala(IMP)和Moneymaker(MM)獲得的初級轉(zhuǎn)化體。根癌農(nóng)桿菌株AGL0b、LBA4404c或UIA143d被用于轉(zhuǎn)化。使用復(fù)合分離物IPO655-2A和IPO428-2，采用離脫葉分析檢測抗性。表4.比較核苷酸和氨基酸序列同源性a核苷酸(nt)和氨基酸(aa)序列相同性百分比。b分別比較蛋白質(zhì)序列N末端和C末端的部分。兩個部分的邊緣是DNA序列內(nèi)保守的NsiI限制性位點(位于Rpi-blb編碼序列的1417位)。權(quán)利要求1.一種分離的或重組的核酸，其包含一種編碼圖8的氨基酸序列或其功能性片段或同源物的核酸。2.權(quán)利要求1的片段，其編碼圖8的氨基酸序列的富含亮氨酸重復(fù)(LRR)片段。3.權(quán)利要求1或2的核酸，所述核酸編碼一種能夠為茄科(Solanaceae)成員提供抗卵菌病原體抗性的基因產(chǎn)物或其功能性等價物。4.權(quán)利要求3的核酸，其中所述茄科成員包含馬鈴薯(S.tuberosum)。5.權(quán)利要求3的核酸，其中所述抗性是品種非特異性的。6.權(quán)利要求1到5中任一項的核酸，其包含如圖6所示的Rpi-blb的序列或其部分。7.權(quán)利要求1到5中任一項的核酸，其至少包含一種LRR結(jié)構(gòu)域。8.包含權(quán)利要求1到7中任一項的核酸的載體。9.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求1到7中任一項的核酸或權(quán)利要求8的載體。10.權(quán)利要求9的細胞，包含植物細胞。11.權(quán)利要求10的細胞，其中所述植物包含一種茄科成員。12.一種植物，其包含權(quán)利要求9到11中任一項的細胞。13.來源于權(quán)利要求12的植物的一部分。14.權(quán)利要求13的一部分，其中所述塊莖包含馬鈴薯或所述果實包含番茄。15.權(quán)利要求12的植物的子代。16.由權(quán)利要求1到7中任一項的核酸編碼的蛋白質(zhì)物質(zhì)。17.一種蛋白質(zhì)物質(zhì)，其包含一種如圖8所示的氨基酸序列或其功能性等價物。18.一種針對權(quán)利要求1到7中任一項的核酸的結(jié)合分子。19.權(quán)利要求18的結(jié)合分子，其包含一種探針或引物。20.權(quán)利要求18或19的結(jié)合分子，其具有一種標記物。21.權(quán)利要求20的結(jié)合分子，其中所述標記物包含一種可激發(fā)部分。22.權(quán)利要求1到7中任一項的核酸或權(quán)利要求8的載體或權(quán)利要求9到11中任一項的細胞或權(quán)利要求16或17的物質(zhì)或權(quán)利要求18到21中任一項的結(jié)合分子在為一種植物或其子代提供抗卵菌感染抗性的方法中的應(yīng)用。23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述卵菌包含蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)。24.權(quán)利要求22或23的應(yīng)用，其中所述植物包含馬鈴薯。25.為一種植物或其子代提供至少部分抗卵菌感染抗性的方法，所述方法包括為所述植物或其部分提供一種基因或其功能性片段，其包含一種相應(yīng)于一個基因簇中的一種基因的核酸，該基因簇可經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生樹分析而鑒定為相應(yīng)于圖9的Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb基因簇，所述核酸編碼一種能夠為茄科植物的成員提供抗卵菌真菌抗性的基因產(chǎn)物，或者所述方法包括為所述植物或其部分提供權(quán)利要求1到7中任一項的核酸或權(quán)利要求8的載體或權(quán)利要求9到11中任一項的細胞或權(quán)利要求16或17的物質(zhì)。26.篩選植物或植物材料或其子代對于卵菌感染的易感性或抗性的方法，包含檢測至少部分所述植物或植物材料或其子代中一種相應(yīng)于一個基因簇中的一種基因的核酸的存在或缺失，該基因簇可經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生樹分析而鑒定為相應(yīng)于圖9的Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb基因簇，所述核酸編碼一種能夠為茄科植物的成員提供抗卵菌真菌抗性的基因產(chǎn)物。27.權(quán)利要求26的方法，包含將至少部分所述植物或植物材料或其子代與權(quán)利要求18到21中任一項的結(jié)合分子相接觸并確定所述分子結(jié)合到所述部分。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述卵菌包含蔓延疫霉。29.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述植物包含馬鈴薯。30.一種分離的S.bulbocastanum或其部分，其對由蔓延疫霉導(dǎo)致的卵菌感染具有易感性。全文摘要本發(fā)明涉及植物疾病領(lǐng)域，特別涉及卵菌感染如晚疫病，該疾病對于茄科植物如馬鈴薯和番茄栽培品種的生產(chǎn)具有重大意義。本發(fā)明提供了一種為植物或其子代提供抗卵菌感染抗性的方法，包含為所述植物或其部分提供一種基因或其功能性片段，所述基因或其功能性片段包含一種核酸，所述核酸編碼一種能夠為茄科植物的成員提供抗卵菌抗性的基因產(chǎn)物。文檔編號A01H5/00GK1646561SQ03807876公開日2005年7月27日申請日期2003年2月7日優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日發(fā)明者約瑟夫斯·雅各布斯·亨德里克斯·瑪麗亞·阿爾夫斯,埃德溫·安德瑞斯·赫拉德·范德沃森申請人:阿格里科培養(yǎng)與研究股份公司